本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種采用分子生物學(xué)手段檢測微生物耐藥基因的方法，具體為一種用于檢測奶牛乳腺炎性金黃色葡萄球菌青霉素耐藥基因的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：金黃色葡萄球菌是葡萄球菌屬的代表菌，顯微鏡下觀察呈葡萄串狀排列，球形或略呈橢圓形，直徑0.5～1.5微米，平均0.8微米，革蘭氏染色陽性，凝固酶試驗(yàn)陽性，觸媒(過氧化氫酶)陽性，能分解甘露醇，無鞭毛，無芽孢，體外培養(yǎng)時一般不形成莢膜，有致病性，由于菌落呈金黃色得名。作為重要的化膿性病原菌，金黃色葡萄球菌能夠引起人的多種感染性疾病，如癤、毛囊炎、蜂窩織炎、葡萄球菌性心內(nèi)膜炎等，同時也是引起奶牛乳腺炎的主要病原菌，且金黃色葡萄球菌廣泛分布于自然界，在健康牛的皮膚、乳頭經(jīng)常能分離到金黃色葡萄球菌。雖然經(jīng)過一百多年的研究，金黃色葡萄球菌目前仍然是導(dǎo)致人類和動物感染性疾病最常見的病原菌之一。金黃色葡萄球菌對奶牛極易感、感染引起的臨床型乳腺炎可分為最急性感染、急性感染和慢性感染。最急性感染常見于圍產(chǎn)期的母?；蚋腥境醍a(chǎn)的母牛，表現(xiàn)為高熱(40～42℃)，精神沉郁、食欲不振、乳區(qū)腫脹、疼痛、觸摸堅實(shí)，常因避免腿摩擦乳房而出現(xiàn)跛行。金黃色葡萄球菌急性感染最易導(dǎo)致壞疽性乳腺炎，發(fā)病乳區(qū)嚴(yán)重腫脹、堅實(shí)，短時間內(nèi)(3～5小時)可由粉紅色變成紅色、紫色，甚至出現(xiàn)水皰，有漿液性滲出，乳房呈藍(lán)黑色觸摸手感冰涼；乳汁為血染漿液，混有凝乳塊及絮狀沉淀。此外，急性感染可發(fā)生于各個產(chǎn)奶期的母牛；病牛發(fā)熱、食欲不振，患病乳區(qū)微熱、腫脹、疼痛，觸診堅實(shí)；分泌的乳汁呈奶油狀，后為含有惡臭的膿塊，有時表現(xiàn)為稀薄的乳汁散布著凝塊和絮狀沉淀物。乳腺炎是造成奶牛養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)損失最主要的疾病，金黃色葡萄球菌是奶牛乳腺炎主要的傳染性病原菌之一。對我國90年代以來發(fā)表的關(guān)于乳腺炎流行病學(xué)的論文分析發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌在患病牛奶樣中的分離率高達(dá)30～50％。研究顯示，金黃色葡萄球菌可對目前使用的各種抗菌素產(chǎn)生耐藥；隨著抗菌素的廣泛應(yīng)用，金黃色葡萄球菌對抗菌素不僅已呈現(xiàn)出越來越普遍的耐藥，而且表現(xiàn)為多重耐藥，給奶牛乳腺炎的臨床治療帶來了很大困難；此外，由于耐藥性的產(chǎn)生和蔓延，在常用抗菌素?zé)o效的情況下，必須使用作用更強(qiáng)的新型抗菌藥物，這不僅會導(dǎo)致耐藥性問題越發(fā)嚴(yán)重，耐藥性不斷擴(kuò)散，而且使已有抗菌藥物使用壽命大大縮短。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，獲得一種有效分析我國牛源金黃色葡萄球菌耐藥機(jī)理的方法，為基層臨床獸醫(yī)在奶牛乳腺炎治療中合理用藥提供依據(jù)，本發(fā)明提供了一種用于檢測奶牛乳腺炎性金黃色葡萄球菌青霉素耐藥基因的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。技術(shù)方案：一種用于檢測奶牛乳腺炎性金黃色葡萄球菌青霉素耐藥基因的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。優(yōu)選的，所述分子標(biāo)記p1、p2和p3的上游引物5，端進(jìn)行氨基化修飾并附加10個堿基t。表1分子標(biāo)記序列名稱序列(5，-3，)seqidno.p1-fnh2-t(10)gtagcgacaataggtaatagt1p1-rgtaataacaataaacctccta2p2-fnh2-t(10)tgctatccaccctcaaacagg3p2-raacgttgtaaccaccccaaga4p3-fnh2-t(10)aagcggtaaaccccctga5p3-rttcggcaaatcccttctcaac6所述分子標(biāo)記在制備檢測奶牛乳腺炎性金黃色葡萄球菌青霉素耐藥基因試劑盒中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述試劑盒的組分包括：分子標(biāo)記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。優(yōu)選的，所述試劑盒檢測奶牛乳腺炎性金黃色葡萄球菌青霉素耐藥基因的步驟包括：(1)取樣：選取純化后的奶牛乳腺炎性金黃色葡萄球菌，劃線接種培養(yǎng)基，形成單個菌落，向無菌ep管中加入10～60μl60％的甘油，用接種針挑取單菌落于甘油中洗滌數(shù)次，-20℃保存；(2)以步驟(1)收集的菌體作為pcr模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；(3)取步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋100～500倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；(4)取第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，稀釋10～100倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴(kuò)增；(5)收集第三輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。優(yōu)選的，所述pcr擴(kuò)增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標(biāo)記1μl、雙蒸水15.5μl。優(yōu)選的，所述第一輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環(huán)；72℃，7min。優(yōu)選的，所述第二輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環(huán)；72℃，5min。優(yōu)選的，所述第三輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，58℃，30s，72℃，35s，35個循環(huán)；72℃，4min。有益效果：(1)本發(fā)明所述分子標(biāo)記具有重復(fù)性好、可比性強(qiáng)和分辨力高等優(yōu)點(diǎn)；(2)所述方法無需大量測序，應(yīng)用成本低。附圖說明圖1是實(shí)施例1～3檢測結(jié)果圖；其中，1為分子量為1500bp的maker；3為實(shí)施例1pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果；4為實(shí)施例2pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果；5為實(shí)施例3pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果。具體實(shí)施方式實(shí)施例1一種用于檢測奶牛乳腺炎性金黃色葡萄球菌青霉素耐藥基因的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述分子標(biāo)記p1、p2和p3的上游引物5，端進(jìn)行氨基化修飾并附加10個堿基t。所述分子標(biāo)記在制備檢測奶牛乳腺炎性金黃色葡萄球菌青霉素耐藥基因試劑盒中的應(yīng)用。所述試劑盒的組分包括：分子標(biāo)記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。所述試劑盒檢測奶牛乳腺炎性金黃色葡萄球菌青霉素耐藥基因的步驟包括：(1)取樣：選取純化后的奶牛乳腺炎性金黃色葡萄球菌，劃線接種培養(yǎng)基，形成單個菌落，向無菌ep管中加入10μl60％的甘油，用接種針挑取單菌落于甘油中洗滌數(shù)次，-20℃保存；(2)以步驟(1)收集的菌體作為pcr模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；(3)取步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋100倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；(4)取第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，稀釋10倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴(kuò)增；(5)收集第三輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述pcr擴(kuò)增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標(biāo)記1μl、雙蒸水15.5μl。所述第一輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環(huán)；72℃，7min。所述第二輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環(huán)；72℃，5min。所述第三輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，58℃，30s，72℃，35s，35個循環(huán)；72℃，4min。實(shí)施例2一種用于檢測奶牛乳腺炎性金黃色葡萄球菌青霉素耐藥基因的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述分子標(biāo)記p1、p2和p3的上游引物5，端進(jìn)行氨基化修飾并附加10個堿基t。所述分子標(biāo)記在制備檢測奶牛乳腺炎性金黃色葡萄球菌青霉素耐藥基因試劑盒中的應(yīng)用。所述試劑盒的組分包括：分子標(biāo)記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。所述試劑盒檢測奶牛乳腺炎性金黃色葡萄球菌青霉素耐藥基因的步驟包括：(1)取樣：選取純化后的奶牛乳腺炎性金黃色葡萄球菌，劃線接種培養(yǎng)基，形成單個菌落，向無菌ep管中加入30μl60％的甘油，用接種針挑取單菌落于甘油中洗滌數(shù)次，-20℃保存；(2)以步驟(1)收集的菌體作為pcr模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；(3)取步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋200倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；(4)取第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，稀釋20倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴(kuò)增；(5)收集第三輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述pcr擴(kuò)增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標(biāo)記1μl、雙蒸水15.5μl。所述第一輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環(huán)；72℃，7min。所述第二輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環(huán)；72℃，5min。所述第三輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，58℃，30s，72℃，35s，35個循環(huán)；72℃，4min。實(shí)施例3一種用于檢測奶牛乳腺炎性金黃色葡萄球菌青霉素耐藥基因的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述分子標(biāo)記p1、p2和p3的上游引物5，端進(jìn)行氨基化修飾并附加10個堿基t。所述分子標(biāo)記在制備檢測奶牛乳腺炎性金黃色葡萄球菌青霉素耐藥基因試劑盒中的應(yīng)用。所述試劑盒的組分包括：分子標(biāo)記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。所述試劑盒檢測奶牛乳腺炎性金黃色葡萄球菌青霉素耐藥基因的步驟包括：(1)取樣：選取純化后的奶牛乳腺炎性金黃色葡萄球菌，劃線接種培養(yǎng)基，形成單個菌落，向無菌ep管中加入60μl60％的甘油，用接種針挑取單菌落于甘油中洗滌數(shù)次，-20℃保存；(2)以步驟(1)收集的菌體作為pcr模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；(3)取步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋500倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；(4)取第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，稀釋100倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴(kuò)增；(5)收集第三輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述pcr擴(kuò)增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標(biāo)記1μl、雙蒸水15.5μl。所述第一輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環(huán)；72℃，7min。所述第二輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環(huán)；72℃，5min。所述第三輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，58℃，30s，72℃，35s，35個循環(huán)；72℃，4min。sequencelisting<110>蘇州喬納森新材料科技有限公司<120>一種用于檢測奶牛乳腺炎性金黃色葡萄球菌青霉素耐藥基因的分子標(biāo)記及其應(yīng)用<130><160>6<170>patentinversion3.3<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列<400>1gtagcgacaataggtaatagt21<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列<400>2gtaataacaataaacctccta21<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列<400>3tgctatccaccctcaaacagg21<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列<400>4aacgttgtaaccaccccaaga21<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列<400>5aagcggtaaaccccctga18<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列<400>6ttcggcaaatcccttctcaac21當(dāng)前第1頁12