專利名稱：新型雙重靶定抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含有與抗體的重鏈或輕鏈的N-端融合的水溶性配體的新型雙重靶定抗體、編碼該雙重靶定抗體的DNA、包含該DNA的重組表達(dá)載體、由該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞、通過培養(yǎng)該宿主細(xì)胞制造該雙重靶定抗體的方法以及包含該雙重靶定抗體的藥物組合物。
背景技術(shù)：
血管發(fā)生是指通過內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和轉(zhuǎn)移，從既存的血管形成新的血管的機(jī)制。眾所周知，血管發(fā)生在創(chuàng)傷治愈以及女性的生理周期等正常生長(zhǎng)過程中起重要作用 (Risau, Nature, 386: 671，1997)，非正常的過度血管發(fā)生在腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，以及年齡相關(guān)性黃斑變性(ARMD)、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、干癬、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、慢性炎癥等疾病的發(fā)作中起關(guān)鍵作用(Carmeliet and Jain, Nature, 407: 249，2000)。1971年，J. Folkman博士提出假設(shè)，稱腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于血管發(fā)生，因此聚焦于抗血管發(fā)生的治療策略可能會(huì)得到新的實(shí)體癌癥的治療劑。此后，許多研究者對(duì)與血管發(fā)生機(jī)制的抑制相關(guān)的過度研究興趣漸增Perrara and Kerbel, Nature, 435: 967， 2005)。血管發(fā)生的進(jìn)展方式由血管發(fā)生誘發(fā)因子和血管發(fā)生抑制因子之間的綜合平衡所決定，并通過多步驟的復(fù)雜且相繼的過程發(fā)生。所述過程是指，首先，多種血管發(fā)生誘發(fā)因子(包括從有腫瘤或創(chuàng)傷的組織中分泌的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF))與在既存的血管內(nèi)皮細(xì)胞外圍的對(duì)應(yīng)受體相結(jié)合以激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而提高血管內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性。進(jìn)而， 通過分泌蛋白酶(例如基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP))來分解血管內(nèi)皮細(xì)胞周圍的基膜和細(xì)胞外基質(zhì)，因而血管內(nèi)皮細(xì)胞從既存的毛細(xì)血管離開并向分泌血管發(fā)生誘發(fā)因子的組織移動(dòng)/增殖。移動(dòng)/增殖的血管內(nèi)皮細(xì)胞在血管內(nèi)形成管狀結(jié)構(gòu)，隨著作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)性支持的周細(xì)胞流入管狀結(jié)構(gòu)，最終形成穩(wěn)定且成熟的血管。此時(shí)，從血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的血管生成素1 (Ang 1)通過與其受體Tie-2結(jié)合，在周細(xì)胞的流入和血管的穩(wěn)定中起重要作用(Suri et al. , Cell, 87:1171，1996)。同時(shí)，抑制Ang 1和Tie_2的相互作用的血管生成素2 (Ang 2)，相較于Ang 1表現(xiàn)出與Tie_2相似的親和性，因此Ang 2可競(jìng)爭(zhēng)性地抑制由 Ang 1 誘導(dǎo)的磷酸化過程(Maisonpierre et al.，Science, 277:55，1997)。然而， 已有報(bào)道指出，視乎細(xì)胞的形狀以及實(shí)驗(yàn)方法，Ang 2可用于誘導(dǎo)Tie-2的磷酸化(Kim et al., Oncogene, 19:4549, 2000)。并且，已有報(bào)道指出，在血管發(fā)生的初期階段，通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞的相互作用，血管變得不穩(wěn)定，血管內(nèi)皮細(xì)胞變得對(duì)VEGF等刺激敏感(Klagsbrun and Moses, Chem. Biol., 6:R217, 1999； Veikkola and Alitalo, Semin Cancer Biol. , 9:211，1999; Carmeliet and Jain, Nature, 407:249，2000)。特別地， Angl 在正常組織中表達(dá)相對(duì)廣泛(Maisonpierre et al.，Science, 277:55，1997)，而在腫瘤組織中表達(dá)很少(Hayes et al.，Br. J. Cancer, 83:1154，2000)。在另一方面， 從Ang2在血管發(fā)生潛力高的癌組織以及胎盤、子宮、卵巢等血管重造活躍的正常組織中過度表達(dá)的事實(shí)(Kong et al. , Cancer Res. , 61:6248，2001; Ahmad et al. , Cancer,92:1138, 2001)，可以推測(cè)當(dāng)Ang2的含量比Angl高時(shí)，腫瘤中血管發(fā)生開始。因此，可推測(cè)Ang2在Tie-2信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制中作為激動(dòng)劑?？傊?，由于血管生成素和Tie_2的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制尚未明確，所以還需要繼續(xù)研究信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。然而，Angl和Ang2被認(rèn)為在血管發(fā)生中起重要且不同的作用。血管生成素包括由約50個(gè)氨基酸組成的N-端結(jié)構(gòu)域(N-結(jié)構(gòu)域)、由215個(gè)氨基酸組成的曲卷螺旋結(jié)構(gòu)域(C-結(jié)構(gòu)域)和由約215個(gè)氨基酸組成的纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域(F-結(jié)構(gòu)域)。其中，N-結(jié)構(gòu)域和C-結(jié)構(gòu)域與血管生成素的聚合相關(guān)，F(xiàn)-結(jié)構(gòu)域與受體 Tie-2 的結(jié)合相關(guān)(Davis et al.，Nat. Strut. Biol.，10:38，2003)。誘導(dǎo) Tie_2 信號(hào)所需的磷酸化作用，與其他酪氨酸激酶受體一樣，通過受體的二聚化來達(dá)到。為達(dá)到此目的，需要將血管生成素多聚化(Procopio et al.，J. Biol. Chem.，274:30196, 1999; Schlessinger, Cell, 103:211，2000)，因此建議可將這些配體用作利用血管發(fā)生抑制的新藥研發(fā)的靶標(biāo)。特別地，Davis等主張，對(duì)于Tie-2的磷酸化作用，血管生成素的最小模塊是四聚體，這是利用基因工程技術(shù)測(cè)量得到的，并且當(dāng)該模塊由二聚體組成時(shí)，可用作拮抗劑(Davis et al. , Nat. Strut. Biol.，10:38，2003)。在另一研究中報(bào)道，Angl 二聚變體不能有效地進(jìn)行Tie-2的信號(hào)傳導(dǎo)(Cho et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 101:5547, 2004)。換言之，雖然并沒有Angl作為拮抗劑的報(bào)道，但通過改變分子的低聚模式而對(duì)Tie-2信號(hào)傳導(dǎo)的抑制表明，抑制血管生成素多聚化的策略可以用于阻礙Tie-2信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。根據(jù)已報(bào)道的血管生成素和Tie-2的結(jié)合結(jié)構(gòu)，可以看出在血管生成素中有 Tie-2結(jié)合部位，并且Angl和Tie_2的結(jié)合結(jié)構(gòu)與Ang2和Tie_2的結(jié)合結(jié)構(gòu)相似(Barton W. A. et al. , Nat. Struct. Biol.，13:524，2006)。因此，本發(fā)明的研究人員已嘗試通過構(gòu)造一個(gè)雙重靶定抗體來有效抑制血管發(fā)生，在該雙重靶定抗體中，血管生成素(特別是本發(fā)明的Ang2)的Tie-2結(jié)合部位被融合至既存的抗體。同時(shí)，作為抑制血管發(fā)生的另一個(gè)目標(biāo)，本發(fā)明還著眼于VEGF/VEGFR信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。已知VEGF在血管生成過程的多個(gè)步驟中有重要作用，其在腫瘤區(qū)域的缺氧部位廣泛分泌。1989年，Genentech公司的N. !^errara博士等人通過蛋白質(zhì)的分離和純化以及cDNA 克隆鑒定了 VEGF (Leung et al. , Science, 246:1306, 1989)。VEGF，亦稱作 VEGF-A，已知有4個(gè)同種型(VEGF121、VEGF165、VEGF189和VEGF206 )。其中，報(bào)道指出VEGF165在除胎盤外的全部人類組織中大量存在(Tisher et al.，J. Biol. Chem. , 266:11947, 1991)。 已知VEGF以極高的親和性與其受體VEGFR-I和VEGFR-2結(jié)合，但也通過VEGFR-2轉(zhuǎn)換信號(hào)， 誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移等與血管發(fā)生相關(guān)的機(jī)制。因此，VEGF和VEGFR-2被當(dāng)作抑制由VEGF誘導(dǎo)的血管發(fā)生機(jī)制的主要靶標(biāo)，許多與此相關(guān)內(nèi)容的文章已有報(bào)道(Ellis and Hicklin, Nature Rev. Cancer, 8:579，2008； Youssoufian et al., Clin. Cancer Res.，13:5544s, 2007)。例如，Genentech 公司的 Avastin 是一種靴定 VEGF-A 的人源化抗體(Ferrara et al.，Biochem. Biophy. Res. Comm. , 333:328，2005)并已被美國(guó)食品與藥品管理局(FDA)分別在2004年批準(zhǔn)用于轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌、在2006年批準(zhǔn)用于非小細(xì)胞性肺癌和在2008年批準(zhǔn)用于Her-2陰性轉(zhuǎn)移性乳腺癌，并進(jìn)入市場(chǎng)。近年，進(jìn)行了大量對(duì)各種實(shí)體腫瘤的臨床試驗(yàn)以擴(kuò)大其適應(yīng)癥。此外，可從該公司購(gòu)得的Lucentis是一種通過消化Avastin的僅一個(gè)Fab片斷而產(chǎn)生的抗體，能提高當(dāng)Lucentis被注射入視網(wǎng)膜時(shí)的滲透性，從而抑制作為老年性黃斑變性的主要癥狀的黃斑下過度血管發(fā)生(Eter et al.,Biodrgus, 20:167, 2006)，其在2006年被美國(guó)FDA批準(zhǔn)作為治療濕性年齡相關(guān)性黃斑變性(濕性-ARMD)的治療劑。另一個(gè)靶定VEGF的治療用抗體是Regeneron公司的VEGF-trap (Holash et al.，PNAS, 99:11393，2002)。這是一種將 VEGFR-I 的第二免疫球蛋白域和 VEGFR-2的第三免疫球蛋白域融合于人類Fc獲得的水溶性“誘餌受體”，尚未獲得美國(guó)FDA 批準(zhǔn)，其對(duì)轉(zhuǎn)移性乳腺癌、轉(zhuǎn)移性肺癌、轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌和激素難治性前列腺癌的III期臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中。靶定VEGF的受體VEGFR-2的血管發(fā)生抑制抗體包括Imclone公司的IMC-1121B (EP 1916001A2)、UCB公司的CDP-791 (PCT/GB02/04619)和本發(fā)明研究人員開發(fā)的 TTAC-OOO1 (PCT/KR07/003077)。IMC-1121B是一種由完整人類Fab文庫(kù)篩選的單克隆抗體，其對(duì)轉(zhuǎn)移性乳腺癌的III期臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中，對(duì)胃癌的III期臨床試驗(yàn)安排在2009 年進(jìn)行。UCB公司的⑶P-791是一種人源化抗體，其PEGylated Di-Fab形式對(duì)非小細(xì)胞肺癌的II期臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中。由于該抗體不包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域，因此不能期待抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用或補(bǔ)體依賴性的細(xì)胞毒作用。最后，本發(fā)明研究人員開發(fā)并在前臨床階段研究的TTAC-0001是一種由完整人類kFv文庫(kù)篩選的單克隆抗體。這是唯一的對(duì)來源于小鼠或大鼠的flk-1 (VEGFR-2類似物)呈現(xiàn)出活性同時(shí)靶定VEGFR-2的抗體，這是與 Lnclone公司的IMC-1121B區(qū)別的重要特征之一(PCT/KR07/003077)。特別地，TTAC-0001的跨物種交叉反應(yīng)使在動(dòng)物疾病模型的研究可行，有助于將來開發(fā)治療特定腫瘤的抗癌劑， 并能更容易地完成相關(guān)研究。因此，針對(duì)VEGF和VEGFR-2的研究在近5年取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，通過市場(chǎng)和臨床研究開發(fā)了多種治療劑。除了利用血管發(fā)生抑制開發(fā)治療用抗體，許多對(duì)一種疾病利用單個(gè)靶標(biāo)的抗體治療劑被FDA批準(zhǔn)并進(jìn)入市場(chǎng)。比如，在全世界單克隆抗體市場(chǎng)領(lǐng)先的主要抗體治療劑包括靶定表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)并被作為轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌治療劑而銷售的 Eribitux (Imclone)、靶定Her-2/neu并被作為轉(zhuǎn)移性乳腺癌治療劑而銷售的Here印tin (Genentech)和靶定CD-20并被作為非霍奇金淋巴瘤治療劑而銷售的Rituxan TM。同時(shí)，根據(jù)近期抗體市場(chǎng)的趨勢(shì)，除了開發(fā)具有單個(gè)靶標(biāo)的功能性的抗體，還積極進(jìn)行了大量著眼于開發(fā)同時(shí)擁有兩個(gè)或多個(gè)靶標(biāo)的所謂的雙重靶定抗體(雙特異性抗體) 或多重靶定抗體(多特異性抗體)的研究(Van Spriel et al.，Immunol. Today, 21:391， 2000; Kufer et al. , Trend in Biotechnol. , 22:238, 2004; Marvin and Zhu, Curr. Opin. Drug Discovery Dev. , 9:184，2006)。在這類抗體當(dāng)中，沒有任何抗體被FDA批準(zhǔn)并且以商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。但是，基于持續(xù)的興趣和潛能，這些抗體在實(shí)驗(yàn)室和臨床水平上被持續(xù)地研究著。這類抗體主要屬于(1)基于^Fv的抗體、(2)基于Fab的抗體和(3)基于 IgG的抗體等。首先，對(duì)于基的多重靶定抗體，通過結(jié)合不同kFv的VL和VH獲得了具有異質(zhì)二聚體形式的雜合的雙抗體(Holliger et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.，90:6444, 1993)。然而，這樣的抗體由于對(duì)異源二聚體結(jié)合力的原因而具有穩(wěn)定性差的問題。并且，分別已報(bào)道了將不同^Fv彼此連接而得到的串KkFv (Kipriyanov et al., J. Mol. Biol. , 293:41，1999; Robinson et al., Brit. J. Cancer, 99:1415， 2008)、通過表達(dá)對(duì)不同kFv的末端有結(jié)合潛能的Jim和Fos而獲得的異質(zhì)二聚體RFv (DeKruifandLogtenberg, J. Biol. Chem. , 271:7630，1996)、通過表達(dá) kFv 末端的Fab 的 CHl 和 CL 而獲得的二聚微型抗體(Muller et al.，F(xiàn)EBS lett. , 432:45，1998)和一種構(gòu)建異質(zhì)二聚ScFv形式的微型抗體的方法(Merchant et al.，Nat. Biotechnol., 16:677, 1998)。其中，構(gòu)建微型抗體的方法包括替換作為Fc的同型二聚體域的CH3結(jié)構(gòu)域的一些氨基酸，而將異質(zhì)二聚體結(jié)構(gòu)改變成“knob into hole”形式，并分別從kFv末端表達(dá)這些改造的CH3結(jié)構(gòu)域。另外，科學(xué)文獻(xiàn)報(bào)道了多種基于kFv的類似物(Kipriyanov and Le Gall, Curr. Opin. Drug Discovery Dev. , 7:233，2004)，并且科學(xué)文獻(xiàn)還報(bào)道了利用三抗體的三靶標(biāo)和利用四抗體的四靶(Hudson and Kortt, J. Immunol. Methods, 231:177， 1999)。第二，基于Fab的多重靶定抗體，其形式主要為用二硫鍵或媒介物將針對(duì)特定抗原的單獨(dú)的Fab’彼此結(jié)合而獲得的異質(zhì)二聚體Fab(Brennan et al.，Science, 229:81, 1985; Kostelny et al. , J. Immunol. , 148:1547，1992)。同時(shí)，已有報(bào)道稱，具有兩個(gè)抗原結(jié)合價(jià)的雙重靶定抗體通過從特定Fab的重鏈或輕鏈的末端表達(dá)針對(duì)不同抗原的kFv 制得(Schoonjans et al. , J. Immunol. , 165:7050，2000； Lu et al. , J. Immunol. Methods, 267:213, 2002)，并且通過在Fab和kFv之間插入鉸鏈區(qū)可以獲得有四個(gè)抗原結(jié)合價(jià)的同型二聚體形態(tài)的雙重靶定抗體(Coloma and Morrison, Nat. Biotechnol., 15:159, 1997)。而且，科學(xué)文獻(xiàn)還報(bào)道了將針對(duì)不同抗原的kFv與Fab的輕鏈和重鏈的末端融合可制得有三個(gè)抗原結(jié)合價(jià)的雙重靶定抗體，將不同的^Fv分別與Fab的輕鏈和重鏈的末端融合可制得有三個(gè)抗原結(jié)合價(jià)的三靶定抗體(Schoonjans et al. , J. Immunol., 165:7050, 2000)。再者，還報(bào)道了通過化學(xué)結(jié)合三個(gè)不同的Fab可制得簡(jiǎn)單形狀的三靶定抗體 F(ab，)3 (Tutt et al. , J. Immunol. , 147:60，1991)。第三，基于IgG的多重靶定抗體，通過將小鼠與大鼠的雜交瘤細(xì)胞雜交，Trion Wiarma公司獲得了稱為四源雜交瘤的、可產(chǎn)生雙重靶定抗體的混合雜交瘤細(xì)胞。由該公司生產(chǎn)的雙重靶定抗體Ertumaxomab (抗原Her-2/neu，⑶幻對(duì)轉(zhuǎn)移性乳腺癌進(jìn)行到了 II 期臨床試驗(yàn)(Kiewe and Thiel, Expert Opin. Investig. Drugs, 17:1553， 2008), Catumaxomab (抗原EpCAM，⑶3)對(duì)胃癌和卵巢癌進(jìn)行到了 II期臨床試驗(yàn)， 對(duì)惡性腹水到了 III 期臨床試驗(yàn)(Shen and Zhu, Curr. Opin. Mol. Ther. , 10:273, 2008)。但是，這些抗體都不能排除由重復(fù)給藥引起的人抗小鼠抗體(HAMA)反應(yīng)或人抗大鼠抗體(HARA)反應(yīng)。同時(shí)，還報(bào)道了通過改變不同重鏈的Fc的CH3同型二聚體域的某些氨基酸但共有輕鏈結(jié)構(gòu)域而制得了異質(zhì)二聚體形式的“Holes and Knob”雙重靶定抗體 (Merchant et al.，Nat. Biotechnol. , 16:677，1998)。除了異質(zhì)二聚體形式的雙重靶定抗體，已有報(bào)道(ScFv) 4-IgG (抗原EGFR，IGF-1R)可通過將兩個(gè)不同的kFv融合到IgG的輕鏈和重鏈的恒定區(qū)而不是可變區(qū)來以同型二聚體的形式表達(dá)(Lu et al., J. Biol. Chem. , 279:2856, 2004)。然而，該抗體有產(chǎn)率很低的問題，但是同一研發(fā)團(tuán)隊(duì)通過解決(kFv)4-IgG的這一問題而研發(fā)了針對(duì)同一靶標(biāo)的提高了產(chǎn)率的二重雙抗體 (di-diabody)，并確認(rèn)了其潛能(Lu et al.，J. Biol. Chem. , 280:19665, 2005)。但是， 這樣的抗體沒有克服雙抗體穩(wěn)定性差的問題。并且，Imclone公司的Sien等人通過僅將小鼠血小板來源的生長(zhǎng)因子受體-α (PDGFR- α )的一個(gè)可變區(qū)與針對(duì)人類VEGFR-2的嵌合型單克隆抗體IMC-ICll的輕鏈的N-端融合，研發(fā)了雙重靶定抗體，并報(bào)道了其潛能(Shen et al.，J. Biol. Chem.， 281:10706， 2006 ； Shen et al.， J. Immunol. Methods,318:65，2007)。近期，Rossi等人利用蛋白激酶A (PKA)的R亞基的二聚與對(duì)接域(DDD) 和PKA的錨定域(anchoring domain)，通過名為“dock and lock (DNL) ”的方法，提出了一種具有對(duì)CD20的多抗原結(jié)合價(jià)的抗體(Rossi et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103:6841，2006; Rossi et al.，Cancer Res., 68:8384，2008)，同一研究團(tuán)隊(duì)還報(bào)道了基于這一技術(shù)的雙重靴定抗體(Chang et al.，Clin. Cancer Res. , 13:5586，2007)。已知利用DNL方法的抗體有易于應(yīng)用、因通過模塊形式(module type)生產(chǎn)從而易于以不同形式組合和體內(nèi)穩(wěn)定性優(yōu)異的優(yōu)點(diǎn)，但也有可能被體內(nèi)蛋白酶分解以及免疫原性相關(guān)的問題。目前為止在科學(xué)文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道了多種雙重靶定抗體或多重靶定抗體，基于其預(yù)期用途、視乎形態(tài)特點(diǎn)這些抗體表現(xiàn)出功能性優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。特別地，大量著眼于開發(fā)治療用雙重靶定和多重靶定抗體以治療癌癥的研究正在開展。但是，選擇通過這些研究獲得的抗體靶定的抗原非常重要，以使這些抗體可以表現(xiàn)出正常的功能。

發(fā)明內(nèi)容
因此，為了開發(fā)利用血管發(fā)生抑制而用于抗癌治療的雙重靶定抗體，本發(fā)明的發(fā)明人制造了一種雙重靶定抗體，能夠使與血管發(fā)生機(jī)制密切聯(lián)系的VEGFR-2和Tie-2兩個(gè)受體中和，呈現(xiàn)出至今還未被報(bào)道的新形式，確認(rèn)了該抗體與針對(duì)VEGFR-2或Tie-2的單靶定抗體相比，在體內(nèi)及細(xì)胞水平均表現(xiàn)出等同或更好的抗癌功效。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種含有與抗體的重鏈或輕鏈的N-端融合的水溶性配體的新型雙重靶定抗體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供編碼所述雙重靶定抗體的DNA。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供含有所述DNA的重組表達(dá)載體。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種由所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種通過培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞來制造所述雙重靶定抗體的方法。本發(fā)明的更進(jìn)一步目的是提供一種包含所述雙重靶定抗體的藥物組合物。本發(fā)明提供了一種含有與抗體的重鏈或輕鏈的N-端融合的水溶性配體的新型雙重靶定抗體。本發(fā)明的說明書中所使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”是指由B細(xì)胞產(chǎn)生的、特異地識(shí)別各種抗原并擔(dān)當(dāng)B細(xì)胞的抗原受體的蛋白質(zhì)分子。該分子呈Y狀，由兩條相同的輕鏈和兩條相同的重鏈組成。所有輕鏈和重鏈都含有可變區(qū)與恒定區(qū)。四條鏈由位于的重鏈可變區(qū)的二硫鍵所固定，亦稱作鉸鏈區(qū)。重鏈與輕鏈的可變區(qū)相互結(jié)合形成兩個(gè)相同的抗原結(jié)合部位。根據(jù)重鏈恒定區(qū)，抗體可以分為五類=A(IgA)、D(IgD)、E(IgE)、G(IgG)和M(IgM)。每一類都被稱作一種同種型，并且具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征和不同的生物特性。本發(fā)明包括所有同種型的抗體，優(yōu)選使用IgG。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體包括針對(duì)在腫瘤細(xì)胞、癌基質(zhì)細(xì)胞、腫瘤相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞、 腫瘤相關(guān)的內(nèi)皮祖細(xì)胞、腫瘤相關(guān)的循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞、癌癥干細(xì)胞等中特異表達(dá)的抗原的抗體，但本發(fā)明并不限于此。更具體地，本發(fā)明的抗體包括針對(duì)在細(xì)胞的表面表達(dá)的蛋白質(zhì)的抗體，所述蛋白質(zhì)例如是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-1 (VEGFR-I )、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2 (VEGFR-2)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-3(VEGFR-3)、FMS樣酪氨酸激酶3 (FLT3)、c_FMS/菌落刺激因子1受體 (CSF1R)、轉(zhuǎn)染中重排(RET)細(xì)胞、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)型因子(c-Met)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、 Her2/neu, HER3、HER4、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(FGFR)、胰島素樣生長(zhǎng)因子受體(IGFR)、 血小板源生長(zhǎng)因子受體(PDGFR)、干細(xì)胞因子受體(c-KIT)、斷點(diǎn)簇區(qū)(BCR)、整聯(lián)蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)等，但本發(fā)明并不限于此。本發(fā)明的抗體可以是“多克隆”或“單克隆”抗體，優(yōu)選單克隆抗體。單克隆抗體是指從本質(zhì)上同質(zhì)的抗體群落中獲得的抗體。亦即，除了少量存在的、可能自然發(fā)生的突變，構(gòu)成這樣的群落的單獨(dú)抗體是相同的。單克隆抗體對(duì)單個(gè)抗原部位高度特異。而且， 與多克隆抗體(包括針對(duì)不同抗原表位的不同抗體)不同，每個(gè)單克隆抗體被誘導(dǎo)針對(duì)單一抗原表位。不應(yīng)以任何特定方式解釋為，單克隆對(duì)于生成抗體是必要的。例如，本發(fā)明可用的單克隆抗體可以通過Kohler et al.，Nature, 256:495(1975)中描述的雜交瘤方法生成，或由重組DNA方法(見美國(guó)專利號(hào)4，816，567)生成。而且，單克隆抗體例如可以通過 Clackson et al.，Nature, 352:624-628(1991); Marks et al.，J. Mol. Biol., 222:581-597(1991)中描述的技術(shù)從噬菌體抗體文庫(kù)中分離。本發(fā)明的抗體優(yōu)選“人源化抗體”。“人源化抗體”是指通過改變含有非人類互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的抗體的序列，包含部分或全部從人類抗體種系獲得的氨基酸序列的抗體。通過該改變方法，最簡(jiǎn)單的方法是用人抗體的恒定區(qū)替換鼠科動(dòng)物的恒定區(qū)。因此，產(chǎn)生了可以充分降低免疫原性至醫(yī)藥應(yīng)用允許的程度的人/鼠嵌合體。但是，優(yōu)選用公知的技術(shù)人源化抗體的可變區(qū)和CDR。可變區(qū)的框架區(qū)被用對(duì)應(yīng)的人框架區(qū)替換，而非人類CDR實(shí)質(zhì)上維持完好或該CDR被與從人基因組獲得的序列交換。完好的人抗體在免疫系統(tǒng)被更改為對(duì)應(yīng)人類免疫系統(tǒng)的基因改造的小鼠中生成。本發(fā)明的抗體特別優(yōu)選為“人抗體”。人抗體是含有與通過任何用來制造由人或人抗體制造的抗體的技術(shù)而制造的抗體的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的氨基酸序列的抗體。人抗體可以由公知的多種技術(shù)制造。根據(jù)一個(gè)實(shí)例，人抗體從表達(dá)人抗體的噬菌體文庫(kù)中篩選而得((Vaughan et al. Nature Biotechnology 14:309-314(1996): Sheets et al. PNAS (USA) 95:6157-6162(1998)； Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991)； Marks et al. J. Mol. Biol. 222:581 (1991)))。人抗體可以通過將人免疫球蛋白基因座引入到轉(zhuǎn)化的動(dòng)物(例如在內(nèi)源性免疫球蛋白基因被部分或全部失活的小鼠)中而制得。在該過程中，可觀察到產(chǎn)生了人抗體，這與在人類基因重組、裝配和抗體譜的各方面觀察到的情況高度相似。這些方法在比如美國(guó)專利號(hào)5，545，807,5, 545，806,5, 569，825,5, 625，126、 5，633，425、5，661，016和文獻(xiàn)Marks et al. Biotechnology 10:779-783(1992); Lonberg et al. Nature 368:856-859(1994); Morrison, Nature 368:812-13(1994); Fishwild et al. Nature Biotechnology 14:845-51 (1996)； Neuberger, Nature Biotechnology 14:826(1996) ； Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)中已有描述。在另一方法中，人抗體可以通過使產(chǎn)生針對(duì)靶標(biāo)抗原而誘導(dǎo)的抗體的人B淋巴細(xì)胞(例如，從細(xì)胞群回收的或體外免疫化的B淋巴細(xì)胞)永生化而獲得(Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss, p. 77(1985)； Boerner et al. J. Immunol. , 147(1) :86-95(1991)；和美國(guó)專利 No. 5，750，373)。
本發(fā)明所述的“水溶性配體”是指特異性地結(jié)合到細(xì)胞中存在的(特別是細(xì)胞表面的)受體并且表現(xiàn)出水溶特性從而可在水中溶解的蛋白質(zhì)的部分或全部。例如，水溶性配體包括但并不限于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、胎盤生長(zhǎng)因子(P1GF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、血小板源生長(zhǎng)因子(PDGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、血管生成素寸。在本發(fā)明的新型雙重靶定抗體中，抗體和配體有它們獨(dú)特的作用。但是，雙重靶定抗體可以同時(shí)抑制或放大兩個(gè)信號(hào)，因此相對(duì)只抑制或放大一個(gè)信號(hào)更有效。與每個(gè)信號(hào)都使用一個(gè)信號(hào)抑制劑處理相比，可以施用較低的劑量，并且兩個(gè)信號(hào)能被同時(shí)同地抑制或放大。在本發(fā)明中，優(yōu)選通過一個(gè)連接體將抗體與水溶性配體融合。在本發(fā)明中，“連接體”是指連接融合蛋白的兩個(gè)部分的肽片段。在本發(fā)明中，合適的連接體包括含有5至25 個(gè)氨基酸，優(yōu)選10至20個(gè)氨基酸，更優(yōu)選10至15個(gè)氨基酸的肽。為了制造本發(fā)明的雙重靶定抗體，制造了編碼所述雙重靶定抗體的核酸序列。該核酸序列可以通過將編碼水溶性配體的核酸序列的3’末端融合至編碼抗體的重鏈或輕鏈的核酸序列的5’末端構(gòu)建而成。在一個(gè)方面，編碼經(jīng)由連接體融合的該雙重靶定抗體的核酸序列可以通過將連接體的核酸序列設(shè)計(jì)成包含于引物內(nèi)并進(jìn)行PCR而獲得。將這樣獲得的雙重靶定抗體的編碼基因插入載體中來制備重組表達(dá)質(zhì)粒，將質(zhì)粒引入宿主細(xì)胞來制備轉(zhuǎn)染子或轉(zhuǎn)化細(xì)胞，將宿主細(xì)胞放大并培養(yǎng)，再將雙重靶定抗體分離提純，從而獲得所需的雙重靶定抗體。在本發(fā)明中，用于表達(dá)該雙重靶定抗體的宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。 并且，通常使用高效率引入DNA和高效率表達(dá)引入的DNA的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞的例子包括已知的真核和原核宿主(例如大腸桿菌、假單胞菌、芽孢桿菌、鏈霉菌)、細(xì)菌和酵母菌、昆蟲細(xì)胞(例如草地貪夜蛾9 (SF9))、動(dòng)物細(xì)胞(例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)和小鼠細(xì)胞、 C0S1、C0S7、人胚腎293細(xì)胞)、非洲綠猴細(xì)胞(例如BSC UBSC 40和BMT 10)，和組織培養(yǎng)的人類細(xì)胞。在本發(fā)明中，可以使用多種表達(dá)宿主/載體的組合來表達(dá)該雙重靶定抗體。例如，真核宿主適用的表達(dá)載體包括SV40、牛乳頭瘤病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、巨細(xì)胞病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒?？捎糜诩?xì)菌宿主的表達(dá)載體包括細(xì)菌質(zhì)粒(例如pBluescript、pGEX2T、pUC、 pCRl、pBR322、pMB9及它們的派生物)、含有較廣宿主范圍的質(zhì)粒(例如RP4)、λ gtlO和 λ 11、噬菌體DNA (以多種噬菌體λ派生物為代表，例如匪989)，和其他DNA噬菌體(例如 Μ13和絲狀單鏈DNA噬菌體)。用于酵母細(xì)胞的表達(dá)載體包括2 μ質(zhì)粒及其派生物。用于昆蟲細(xì)胞的載體可以是PVL941。重組表達(dá)載體向宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化包括，如DEAE-右旋糖酐介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、磷酸鈣轉(zhuǎn)染、陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、刮除加載(scrape loading)和感染。在本發(fā)明中，宿主細(xì)胞可在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基和適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)，所述適當(dāng)?shù)臈l件是指允許在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)用發(fā)酵槽內(nèi)使用小范圍或大范圍發(fā)酵和搖瓶培養(yǎng)而表達(dá)和/或分離雙重靶定抗體。培養(yǎng)可以在含有碳源、氮源和無機(jī)鹽的合適培養(yǎng)基中用已知技術(shù)進(jìn)行。 合適的培養(yǎng)基可以商業(yè)獲得，并且例如可以通過美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏(ATCC)的目錄中記載的組分及其配比制備而得。
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雙重靶定抗體可以通過本領(lǐng)域已知的方法從發(fā)酵液中分離。例如，可以使用常規(guī)方法從發(fā)酵液中分離雙重靶定抗體，這些方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、 蒸發(fā)或沉淀。此外，雙重靶定抗體可以利用多種本領(lǐng)域已知方法提純，包括色譜分析法 (即離子交換色譜、親和色譜、疏水作用色譜和尺寸排阻色譜)、電泳、分級(jí)(即硫酸銨沉淀)、 SDS-PAGE或提取。本發(fā)明的組合物可以通過任意合適途徑施用進(jìn)特定分子。本發(fā)明的組合物可以使用任意合適方法直接地(如局部注射、皮下注射或局部施用進(jìn)組織部位)或全身地(如非口服或口服地)向包括人類的動(dòng)物提供。當(dāng)非口服地提供本發(fā)明的組合物時(shí)，例如靜脈內(nèi)、皮下、眼內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、□腔、直腸、陰道、眼眶內(nèi)、大腦內(nèi)、脊髓內(nèi)、心室內(nèi)、膜內(nèi)、小腦內(nèi)、 膀胱內(nèi)、鼻內(nèi)或噴霧形式，組合物優(yōu)選包含水性的或者生理相容性流體的懸浮液或溶液的部分。因此，由于載體或賦形劑是生理可用的，除了向病人輸送所需成分之外，不應(yīng)對(duì)病人的電解質(zhì)和/或容量平衡造成不利影響。含有本發(fā)明的雙重靶定抗體的藥物組合物可以根據(jù)會(huì)在后面使用的常規(guī)方法制備成口服制劑(例如粉末、顆粒、片劑、膠囊、懸浮液、乳狀液、糖漿或噴霧劑)、無菌注射液、 栓劑和經(jīng)皮制劑等形式。組合物中可能含有的載體、賦形劑和稀釋劑可以包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藻糖醇、麥芽糖醇、淀粉、阿拉伯膠、藻酸鹽、明膠、 磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、無定形纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油。有需要時(shí)，組合物可以和填充物、擴(kuò)展劑、粘結(jié)劑、潤(rùn)濕劑、崩解劑或表面活性劑等稀釋劑或賦形劑一起形成制劑。在一個(gè)方面，本發(fā)明所述的雙重靶定抗體可以形成口服固體制劑。口服給藥的固體制劑包括片劑、丸劑、粉末、顆粒、膠囊等。這里的固體制劑可以通過將提取物與至少一種賦形劑(例如淀粉、碳酸鈣、蔗糖、乳糖或明膠)混合而制備。除了簡(jiǎn)單的賦形劑，也可以使用硬脂酸鎂和滑石等潤(rùn)滑劑。在另一個(gè)方面，含有本發(fā)明的雙重靶定抗體的藥物組合物可以形成口服給藥的液體制劑?？诜o藥的液體制劑包括懸浮液、體內(nèi)使用的液體、乳狀液、糖漿等。這樣的液體制劑除了普遍使用的惰性稀釋劑(例如蒸餾水、乙醇、液體石蠟)之外，還可以包括如潤(rùn)濕劑、 甜味劑、芳香劑、防腐劑等多種賦形劑。在另一個(gè)方面，含有本發(fā)明的雙重靶定抗體的藥物組合物可以形成用于非口服給藥的制劑，優(yōu)選是用于腹膜內(nèi)給藥的制劑。非口服給藥的制劑包括無菌水溶液、非水溶劑、 懸浮液、乳狀液、凍干制劑和栓劑。這里可以使用的無菌水溶液包括Hank氏溶液、Ringer 氏溶液或合適的緩沖溶液(例如物理緩沖液)，并且這里可以使用的用作非水溶劑的懸浮液包括植物油(例如丙二醇、聚乙二醇或橄欖油)或可注射的酯(例如油酸乙酯)。有需要時(shí)，可以使用防腐劑、穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕劑或乳化劑、以及調(diào)節(jié)滲透壓的鹽和/或緩沖劑。同時(shí)，對(duì)于栓劑，可以使用Wit印sol、Macrogol, Tween 61、可可油、勞林黃油或甘油膠等常規(guī)基質(zhì)。本發(fā)明的雙重靶定抗體最優(yōu)選為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例制造的DIG 0001。基于國(guó)際公開號(hào)PCT/KR07/003077描述的TTAC0001，本發(fā)明的雙重靶定抗體DIG 0001通過在抗體輕鏈的氨基端區(qū)域融合經(jīng)特定連接體與Tie-2結(jié)合的Ang2的結(jié)合域而制得(實(shí)施例1和2)。如此制得的雙重靶定抗體DIG 0001通過如SDS-PAGE和蛋白印跡法等方法確認(rèn)固定性(immobility)，并且為了進(jìn)一步的驗(yàn)證，只將一種抗體固定，該抗體使用蛋白A親和層析柱、SP-瓊脂糖柱或尺寸排阻柱，通過快速蛋白液相色譜法(FPLC)被純化至至少95%的純度(實(shí)施例3)。如上所述的純化的雙重靶定抗體DIG 0001通過使用ELISA的結(jié)合實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了對(duì) VEGFR-2 D1 D3-Fc和Tie-2-Fc的結(jié)合親和力，并用ELISA方法進(jìn)行了關(guān)于VEGF165和Ang2 的競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)了作為雙重靶定抗體的功能(實(shí)施例4)。根據(jù)本發(fā)明，通過對(duì)原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)進(jìn)行的細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)了雙重靶定抗體DIG 0001能夠抑制VEGF或Angl誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞的存活率，也能夠有效抑制VEGF和Angl同時(shí)誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞的存活率(實(shí)施例5)。通過細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)了本發(fā)明的雙重靶定抗體DIG 0001能夠抑制VEGF或 Angl誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞的移動(dòng)性，也能夠有效抑制VEGF和Angl同時(shí)誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞的移動(dòng)性(實(shí)施例6)。通過蛋白印跡法，確認(rèn)了本發(fā)明的雙重靶定抗體DIG 0001能夠抑制Angl誘導(dǎo)的 Tie-2的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制和VEGF誘導(dǎo)的VEGFR-2的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，使用蛋白印跡法還確認(rèn)了雙重靶定抗體DIG 0001能夠抑制Angl和VEGF同時(shí)誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制(實(shí)施例7)。特別地，確認(rèn)了當(dāng)本發(fā)明的雙重靶定抗體DIG 0001被施用至成膠質(zhì)細(xì)胞瘤動(dòng)物模型時(shí)，腫瘤的體積顯著降低(實(shí)施例8)。上述抗體使用如下方法制得。首先，通過PCR擴(kuò)增Tie-2的Ang2結(jié)合域的DNA序列(可用作Tie-2的拮抗劑)。此時(shí)，抗體被設(shè)計(jì)成在擴(kuò)增的DNA片段的3’ -末端含有一個(gè)連接DNA。通過在含有連接DNA的一部分的TTAC0001的輕鏈DNA序列的5’ -末端上融合該 DNA片段，從而產(chǎn)生能夠特異地結(jié)合至VEGFR-2和Tie_2的雙重靶定抗體。本發(fā)明的雙重靶定抗體DIG 0001可以通過抑制血管發(fā)生而被用于治療血管發(fā)生相關(guān)的疾病。根據(jù)本發(fā)明，“血管發(fā)生相關(guān)的疾病”包括但不限于癌癥、年齡相關(guān)性黃斑變性、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、銀屑病和慢性炎癥。根據(jù)本發(fā)明，癌癥包括但不限于胃癌、肝癌、肺癌、甲狀腺癌、乳腺癌、子宮頸癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、直腸癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、腎癌、黑色素瘤、源自前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移癌、卵巢癌和血癌?？梢允┯贸渥銊┝康谋景l(fā)明的雙重靶定抗體來阻止、抑制或緩解腫瘤進(jìn)展，例如腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移和(或)復(fù)發(fā)以治療癌癥病人。為了達(dá)到此目的，合適的劑量被定義為治療有效量。本申請(qǐng)的有效量將取決于疾病的嚴(yán)重度和病人自身免疫系統(tǒng)的一般狀態(tài)。本發(fā)明的優(yōu)選劑量為0. 01 mg/kg至100 mg/kg，更優(yōu)選為0. 1 mg/m2至10 mg/m2。但是，最佳劑量會(huì)根據(jù)需治療的疾病和副作用的存在而變化，并且可通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)來確定?？赏ㄟ^來定期藥劑注射，或自來自外部存儲(chǔ)容器(如靜脈袋)或內(nèi)部?jī)?chǔ)存容器(如可生物降解的植入體)的持續(xù)靜脈或腹腔注射，來施用抗體。而且，根據(jù)本發(fā)明的抗體蛋白質(zhì)可以與各種不同的生物活性分子組合施用。但是，通過基于本領(lǐng)域技術(shù)人員技術(shù)水平的常規(guī)實(shí)驗(yàn)可以確定抗體蛋白質(zhì)和其他分子的最佳組合、施用方法和劑量。根據(jù)本發(fā)明的組合物可以與其他治療劑組合使用或與其他治療劑混合。當(dāng)本發(fā)明的雙重靶定抗體與化療藥物、放射或另外的受體拮抗劑或其組合一起治療包括人類腫瘤在內(nèi)的腫瘤時(shí)，可達(dá)到協(xié)同作用。亦即，當(dāng)與化療藥物、放射或另外的受體拮抗劑或其組合一起使用時(shí)，由本發(fā)明的雙重靶定抗體引起的腫瘤生長(zhǎng)抑制會(huì)意外地增強(qiáng)。例如，與本發(fā)明的雙重靶定抗體和化療藥物、放射或另外的受體拮抗劑的治療相比，使用組合治療其預(yù)期的腫瘤生長(zhǎng)抑制更高，可以例證其協(xié)同作用。優(yōu)選地，本發(fā)明的雙重靶定抗體和化療藥物或另外的受體拮抗劑的組合治療緩解了預(yù)期不會(huì)緩解的癌癥，可以證明協(xié)同作用。在化療或放療開始前、在這些療法開始后、以及其組合(即化療和/或放療)開始前和開始期間、這些療法開始之前和之后、這些療法開始期間和之后、或這些療法開始前、開始期間和開始后，施用本發(fā)明的雙重靶定抗體。例如，通常在放療和/或化療開始前1至30 日，優(yōu)選3至20日，更優(yōu)選5至12日施用DIG 0001抗體。因此，本發(fā)明的抗體可以在體內(nèi)和體外用于本領(lǐng)域廣泛公知的研究、預(yù)防或治療。 當(dāng)然，顯然此處描述的本發(fā)明的原理可以被本領(lǐng)域技術(shù)人員改變和修改，這些多種的改變和修改并不脫離本發(fā)明的范圍。本發(fā)明提供了來源于人類單克隆抗體的雙重靶定抗體，和包括該雙重靶定抗體的用于抑制血管發(fā)生和治療癌癥的組合物，所述雙重靶定抗體通過同時(shí)中和與血管發(fā)生相關(guān)的受體VEGFR-2和Tie-2，能有效抑制血管發(fā)生相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。本發(fā)明的雙重靶定抗體通過同時(shí)中和與血管發(fā)生相關(guān)的兩個(gè)受體，與已存在的單靶定抗體相比，表現(xiàn)出卓越的中和潛能，也能有效治療癌癥。因?yàn)檫@兩個(gè)抗體彼此互相關(guān)聯(lián)，通過構(gòu)造本發(fā)明人設(shè)計(jì)的新型雙重靶定抗體，與使用單靶定抗體治療產(chǎn)生的實(shí)際效益相比，能夠期待更好的效果。


本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例的各種特征、方面和優(yōu)點(diǎn)在如下參考附圖的詳細(xì)描述中能更充分地說明。圖 1 顯示了插入PIgGLD-mAng2-TTAC0001 Igt載體的基因的DNA序列(SEQ ID NO: 6)和功能。圖2示意性地顯示了構(gòu)建本發(fā)明的PIgGLD-mAng2-TTAC0001 Igt載體的方法。圖3顯示了在CH0-DG44細(xì)胞中隨機(jī)表達(dá)本發(fā)明的載體的結(jié)果以及通過蛋白印跡法確認(rèn)雙重靶定抗體DIG 0001的結(jié)果。圖4顯示了為了建立本發(fā)明的高產(chǎn)率細(xì)胞系，通過重復(fù)MTX處理(最高達(dá)700 nM) 篩選高產(chǎn)率克隆體的結(jié)果。圖5顯示了純化的DIG 0001的SDS-PAGE結(jié)果。圖6顯示了使用DIG 0001、通過ELISA方法分析VEGF和Ang-2-Fc的競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖7顯示了證明根據(jù)本發(fā)明的DIG 0001在HUVEC上的存活率的生存實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖8顯示了證明根據(jù)本發(fā)明的DIG 0001在HUVEC上的遷移能力的遷移實(shí)驗(yàn)的結(jié)^ ο圖9顯示的結(jié)果證實(shí)了本發(fā)明的雙重靶定抗體DIG 0001的VEGF對(duì)VEGFR-2和 ERK的磷酸化的抑制活性，以及該抗體的Angl對(duì)Tie-2、ERK和AKT的磷酸化的抑制活性。圖10顯示了在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤小鼠模型中，本發(fā)明的DIG 0001對(duì)腫瘤生長(zhǎng)抑制的效果。
具體實(shí)施例方式在下文中，以下實(shí)施例僅僅被描述來更具體地說明本發(fā)明，根據(jù)本發(fā)明的目的，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)清楚屬于本發(fā)明的范圍并不受限于實(shí)施例。實(shí)施例1 用于制造DIG 0001的表達(dá)載體的構(gòu)建
通過PCR擴(kuò)增與Tie-2結(jié)合的Ang2的結(jié)合域相關(guān)DNA。為了這一目的，由美國(guó)紀(jì)念斯隆-凱特林癌癥中心(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center)的 Dimitar B. Nikolov 博士提供了制造人類 Ang2-RBD 的 HEK293 細(xì)胞系(Barton et al.，Structure, 13:825，2005)，并且提取出用作模板的基因組DNA。為了僅從提取的DNA中擴(kuò)增Ang2結(jié)合域(M81-F496)，在以下條件實(shí)施PCR: 94°C下4分鐘循環(huán)1次、(94°C下45秒/ 50°C下 45秒/ 72°C下1分鐘)循環(huán)30次，72°C下7分鐘循環(huán)1次，4°C下保存。這里使用的反應(yīng)物組分如下:2μ 1 (10 pmole/μ 1)含有BstXI限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的引物F-kswOOl (5，-CAC TCC AGC GGT GTG GGT TCC TTC AGA GAC TGT GCT GM GTA TTC, SEQ ID NO: 1)、 2 μ 1 (10 pmole/μ 1)反向引物R，—kswOOl (5，-ACT ACC TCC GCC TCC TGA GAA ATC TGC TGG TCG GAT CAT CAT GGT TG, SEQ ID NO: 2)、1 μ 1 (100 ng/μ )用作模板 DNA 的基因組 DNA、2. 5U 用作聚合酶的 i-Max II Taq (Intron #25261,韓國(guó))、5μ1 10Χ 緩沖液、 2 μ (每個(gè)都為2. 5 mM) dNTP、和37. 5 μ 1蒸餾水。通過PCR獲得的產(chǎn)品通過1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，然后使用HiYield Gel/PCR DNA提取試劑盒(RBC Bioscience #YDF300， 臺(tái)灣)分離低于700 bp的模糊條帶。利用分離的DNA作為模板再進(jìn)行PCR來獲得融合有連接體的Ang2結(jié)合域片段(命名為“mAng2”)。這里使用的PCR方法，除了用作反向引物的 R-ksw001 (5，-GGA GCC TCC TCC GCC ACT ACC TCC GCC TCC TGA GAA ATC TGC TGG TCG GAT CAT CAT GGT TG, SEQ ID NO: 3)之外，其方式與前述方法相同。同時(shí)，通過在如下條件進(jìn)行PCR來擴(kuò)增用于與Ang2結(jié)合域融合的TTAC0001的輕鏈區(qū)94°C下4分鐘循環(huán)1次，(94°C下30秒/ 50°C下30秒/ 72°C下30秒)循環(huán) 30次，72°C下5分鐘循環(huán)1次，4°C下保存。這里使用的PCR反應(yīng)物組分如下2 μ 1 (10 pmole/μ 1)加入了一些連接體的引物 F_ksw002 (5，-AGT GGC GGA GGA GGC TCC GGT TCC AAT TTT ATG CTG ACT CAG, SEQ ID NO: 4)、2μ1 (10 pmole/μ 1)含有BstXI 限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的引物 R_ksw002 (5，-CAG ATC TTT CCA CGA GGC TGG CTC CTC, SEQ ID NO: 5),10 ng 用作模板 DNA WpIgGLD-TTACOOOl Lgt (PCT/KR07/003077)、2. 5U 用作聚合酶的 i-Max II Taq (Intron #25261,韓國(guó))、5μ1 10Χ 緩沖液、2 μ 1 (每個(gè)都為 2. 5 mM) dNTP、和37. 5μ 1蒸餾水。通過PCR獲得的產(chǎn)品通過1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，然后使用 HiYield Gel/PCR DNA 提取試劑盒(RBC Bioscience #YDF300,臺(tái)灣)分離相當(dāng)于約；350 bp 的 TTAC0001 輕鏈片段(命名為 “TTAC0001 lgt”)。使用SOE-PCR將TTAC0001輕鏈區(qū)(TTAC0001_lgt)融合至通過PCR獲得的Ang2片段區(qū)(mAng2)。這里使用的PCR條件如下94°C下4分鐘循環(huán)1次，(94°C下45秒/50°C 下45秒/ 72°C下1分鐘)循環(huán)30次，72°C下7分鐘循環(huán)1次，4°C下保存。而且，這里使用的PCR反應(yīng)物組分如下2 μ 1 (10 pmole/ μ 1)含有BstXI限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的引物 F-ksw001、2y 1 (10 pmole/μ 1)引物 R_ksw002、各 10 ng 作為模板 DNA 的 mAng2 禾口TTAC0001、2. 5U用作聚合酶的 i-Max II Taq (Intron #25洸1，韓國(guó))、5μ1 IOX緩沖液、2 μ 1 (每個(gè)都為2. 5 mM) dNTP、和37. 5 μ 1蒸餾水。通過PCR獲得的產(chǎn)品通過1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，然后使用HiYield Gel/PCR DNA提取試劑盒(RBC Bioscience #YDF300，臺(tái)灣) 分離相當(dāng)于約1 kp的融合了 mAng2-TTAC0001 Igt的PCR產(chǎn)物(命名為“mAng2-TTAC0001 lgt”)。使用TOPcloner TA克隆試劑盒(Enzymonics #EZ111,韓國(guó))將分離的PCR產(chǎn)品插入T-載體，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α中。然后，小量制備轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，并用限制性內(nèi)切酶BstXI處理。此后，將含有約11Λ的目標(biāo)DNA的載體外包測(cè)序以確認(rèn)了其DNA堿基序列(圖 1 和 SEQ ID NO: 6)。構(gòu)造表達(dá)雙重靶定抗體DIG 0001的輕鏈表達(dá)載體的方法如下(圖2)首先，使用 BstXI消化本發(fā)明研究人員持有的TTAC0001輕鏈表達(dá)載體plgGLD-TTACOOOl Lgt (PCT/ KR07/003077)，通過電泳從1%瓊脂糖凝膠分離可用作載體的片段。然后，使用BstXI消化插入有mAng2-TTAC0001 Igt的T-載體，通過電泳從1%瓊脂糖凝膠分離僅有的消化片段。 此后，兩個(gè)分離的片段在4°C在T4 DNA連接酶(Enzynomics #M001S,韓國(guó))的存在下，保存約12小時(shí)來構(gòu)建一個(gè)完整的載體。然后，使用構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci，并且小量制備轉(zhuǎn)化的載體后，使用BstXI消化，來確認(rèn)mAng2-TTAC0001 Igt有否插入到構(gòu)建的載體中。確認(rèn)的重組載體命名為“pIgGLD-mAng2-TTAC0001 Lgt”。實(shí)施例2 =DIG 0001的制造與鑒定
將構(gòu)建的輕鏈表達(dá)載體PI gGLD-mAng2-TTAC0001 Lgt和已存在的重鏈表達(dá)載體 ρIgGHD-TTACOOOl Hvy (PCT/KR07/003077)共轉(zhuǎn)導(dǎo) CH0-DG44 (dhfr 缺陷型 CH0)細(xì)胞來誘導(dǎo)其主動(dòng)表達(dá)，并用SDS-PAGE和蛋白印跡法來確認(rèn)表達(dá)。使用lipofectamine 2000 (Invitrogen #11668-019,美國(guó))來進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，其過程根據(jù)制造商的說明進(jìn)行。大體上，將 5 χ IO5 CH0-DG44細(xì)胞接種于包含α MEM培養(yǎng)基(Weigene,韓國(guó))的6孔平板的每一個(gè)孔中，并且通過將CH0-DG44細(xì)胞在含有水氣的(X)2 (5%)孵化器中在37°C下放置M小時(shí)，密集培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到約80%至90%。將3 μ g重組載體(1. 5 μ g ρIgGHD-TTACOOOl Hvy 和 1.5 μ g pIgGLD-mAng2-TTAC0001 Lgt)和 6 μ 1 lipofectamine 2000 各自在 250 μ 1 無血清α MEM培養(yǎng)基中稀釋，室溫放置5分鐘?；旌螪NA稀釋溶液和lipofectamine 2000 稀釋溶液并在室溫下反應(yīng)20分鐘形成DNA- lipofectamine 2000復(fù)合物。從培養(yǎng)的細(xì)胞中移除已存在的培養(yǎng)基，每個(gè)孔中加入500 μ 1 DNA- lipofectamine 2000復(fù)合物和500 μ 1無血清α MEM培養(yǎng)基，在(X)2孵化器中在37°C下培養(yǎng)6小時(shí)。加入1 ml含有20%透析胎牛血清的α MEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)48至72小時(shí)。此后，只分離上清液，并用SDS-PAGE和蛋白印跡法來確認(rèn)抗體的表達(dá)(圖3)。SDS-PAGE和蛋白印跡法根據(jù)本領(lǐng)域廣泛使用的方法進(jìn)行，使用的樣本如下1 SDS-聚丙烯酰胺凝膠、PVDF膜(Millipore #IPVH00010,美國(guó))、 HRP偶聯(lián)的羊抗人IgG (κ)抗體和HRP偶聯(lián)的羊抗類IgG (Fe)抗體(Pierce，美國(guó))。實(shí)施例3 制造DIG 0001的細(xì)胞系的建立和抗體的分離與純化
使用CH0-DG44 (dhfr缺陷型CH0)細(xì)胞建立制造DIG 0001的細(xì)胞系。建立重組抗體表達(dá)CH0-DG44細(xì)胞系的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程如上述方法進(jìn)行。為了篩選轉(zhuǎn)導(dǎo)的CH0-DG44細(xì)胞(dhfr 陽(yáng)性)，使用了不含次黃嘌呤和胸苷的α MEM培養(yǎng)基，并使用作為選擇標(biāo)記的500 μ g/ml的 G418 (Sigma-aldrich，美國(guó))和 400 μ g/ ml 的 zeocine (Invitrogen,美國(guó))初步篩選轉(zhuǎn)導(dǎo)的CH0-DG44細(xì)胞。為了得到表達(dá)重組抗體的單克隆抗體，稀釋初步篩選的細(xì)胞至10個(gè)細(xì)
14胞/ml的密度，并接種于96孔平板(Nunc，美國(guó))。然后，將稀釋的細(xì)胞培養(yǎng)2周，分離從單個(gè)細(xì)胞分化的單個(gè)集落，以建立母細(xì)胞克隆體。為了獲得高表達(dá)的細(xì)胞系，將母細(xì)胞克隆體在添加有多種濃度(40 nM、80 nM、160 nM、320 nM和700 nM)的甲氨蝶呤的培養(yǎng)基中進(jìn)行3 至5次連續(xù)繼代培養(yǎng)，并使用ELISA確認(rèn)其表達(dá)水平。為了這個(gè)目的，以100 μ 的濃度向 96孔平板中加入2 μ g/ml的第一抗體，即羊抗人IgG (Fe) (Pierce,美國(guó))，并在4°C下放置12小時(shí)來完成包被步驟。然后，丟棄留在每個(gè)孔中的溶液，往每個(gè)孔中加入200μ 1含有21脫脂牛奶的Ix PBS封閉液，在37°C下放置1小時(shí)。將每個(gè)孔用含有0. 05% Tween-20 的Ix PBS洗滌緩沖液重復(fù)洗滌3次，然后加入100 μ 從表達(dá)抗體的CH0-DG44細(xì)胞系獲得的細(xì)胞培養(yǎng)液，在室溫中反應(yīng)1小時(shí)。將每個(gè)孔再次用洗滌緩沖液洗滌3次，將第二抗體， 即HRP偶聯(lián)的的羊抗人IgG (κ )，用洗滌緩沖液以1:5000比例稀釋，將100 μ 1的得到的抗體溶液在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。將每個(gè)孔再次用洗滌緩沖液洗滌3次，加入100 μ 1 TMB底物試劑(BD biosciences,美國(guó))，反應(yīng)5 10分鐘。然后加入50 μ 1的2N硫酸(&S04)來停止顯色反應(yīng)。用酶標(biāo)儀(Tecan，瑞士)在450至650nm測(cè)量光密度(0. D)值。為了再次確認(rèn)結(jié)果，使用作為第一抗體的VEGFR-2和Tie-2和作為第二抗體的HRP偶聯(lián)的羊抗人IgG (κ)，在同樣條件下進(jìn)行ELISA。最后，建立了作為高表達(dá)細(xì)胞系的、在700 nM MTX表現(xiàn)出高表達(dá)率的克隆體(圖4)。在添加有10%透析胎牛血清(KDR，韓國(guó))、100單位/ml的青霉素(Hyclone，美國(guó))和100 μ g/ml的鏈霉素(Hyclone，美國(guó))的α MEM培養(yǎng)基(Welgene， 韓國(guó))中進(jìn)行高表達(dá)細(xì)胞系的培養(yǎng)，在37°C的孵化器中和含水氣的5% CO2混合空氣條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。將從高表達(dá)細(xì)胞系的培養(yǎng)中獲得的雙重靶定抗體DIG 0001進(jìn)行FPLC處理，F(xiàn)PLC 具有蛋白A親和層析柱、SP-瓊脂糖柱或尺寸排阻柱以固定僅一種抗體，該抗體被純化至至少95%的純度以進(jìn)行進(jìn)一步的測(cè)試(圖5)。首先，將培養(yǎng)液離心以分離細(xì)胞團(tuán)塊(cell pellet)和培養(yǎng)基，使用截留分子量不大于10000 Da的UF膜(Millipore，美國(guó))濃縮培養(yǎng)基中的DIG 0001。使用蛋白A親和層析初步純化使用UF膜過濾的培養(yǎng)基。該步驟簡(jiǎn)要說明如下。將使用UF膜過濾的培養(yǎng)基放入使用20 mM磷酸鈉(pH 7.0)固定的含0.1 M NaCl 的蛋白A柱，用同樣的緩沖液洗滌未結(jié)合的蛋白質(zhì)。然后，使用20 mM含有0.5 M NaCl的磷酸鈉(PH 7.0)緩沖溶液再次洗滌非特異結(jié)合于蛋白A柱的蛋白質(zhì)。用0.1 M含有0.1 M NaCl的Glycine-Cl (pH 3. 5)緩沖液洗提特異結(jié)合蛋白-A的蛋白質(zhì)，并用1 M Tris溶液將樣本中和至PH 6.0。為了防止可能留在通過親和層析柱分餾的樣本中的DNA、內(nèi)毒素和蛋白-A的污染，通過如下方法進(jìn)行陽(yáng)離子交換層析。首先，將從蛋白-A柱洗提的樣本與同樣體積的20 mM磷酸鈉(pH 6.0)緩沖液混合。此后，用含有50 mM NaCl的10 mM磷酸鈉 (pH 6.0)緩沖液穩(wěn)定SP-瓊脂糖(5 ml, GE healthcare)，并加入樣本，洗去未結(jié)合的DNA 和內(nèi)毒素。用PH值和鹽濃度梯度(50 mM磷酸鈉(pH 7.0)，1 M NaCl)洗提與樹脂結(jié)合的抗體分子。最后，為了去除多聚抗體，將樣本放進(jìn)用PBS穩(wěn)定的Superdex 200 (16 mm χ 60 cm, GE healthcare)柱，并進(jìn)行尺寸排除色譜法。這樣經(jīng)過純化步驟的抗體可用于進(jìn)行細(xì)胞及體內(nèi)分析。實(shí)施例4 DIG 0001的競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)
使用ELISA進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)來確定雙重靶定抗體DIG 0001是否與VEGF和Ang2競(jìng)爭(zhēng) VEGFR-2和Tie-2。為了這一目的，分別將VEGF165和Ang2_RBD以200 ng的濃度注入96孔平板中，并且平板在室溫下包被一天。然后，用洲脫脂牛奶/PBS在37°C反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)完成后，用PBS洗滌96孔平板，將在室溫下預(yù)先反應(yīng)1小時(shí)的混合物組A(通過混合多種濃度(0 250 nM)的 DIG 0001 和切除了 100 ng Fc 的 VEGFR-2 (ECD1-3)得到)放入用 VEGF165 包被的每個(gè)孔中，并在室溫下反應(yīng)2小時(shí)。然后，將在室溫下預(yù)先反應(yīng)1小時(shí)的混合物組B (通過混合多種濃度(0 250 nM)的DIG 0001和500 ng Tie-2-Fc獲得)放入用上述同樣方法用Ang2-RBD包被的每個(gè)孔中，并在室溫下反應(yīng)2小時(shí)。當(dāng)2小時(shí)的反應(yīng)完成后，用PBS 洗滌96孔平板，將作為第一反應(yīng)抗體的5 μ g/ml抗-VEGFR-2小鼠抗體(Reliatech，德國(guó))加入用VEGF165包被的每個(gè)孔中，在37°C反應(yīng)1小時(shí)。用PBS洗滌用Ang2_RBD包被的每個(gè)孔后，在每個(gè)孔中加入作為第一抗體的5 μ g/ml抗-Tie-2小鼠抗體(Abcam，英國(guó))， 并用上述方法在37°C反應(yīng)1小時(shí)。此后，以1:5000的比例將HRP偶聯(lián)的羊抗鼠IgG抗體 (Abeam, England)稀釋，將其作為第二抗體加入用VEGF165和Ang2_RBD包被的兩種孔中， 在37°C反應(yīng)1小時(shí)。然后，用TMB底物試劑(BD Biosciences #555214,美國(guó))誘導(dǎo)顯色反應(yīng)，再加入50 μ 1 2Ν硫酸(H2SO4)來停止顯色反應(yīng)。用酶標(biāo)儀(Tecan，瑞士)在450 nm 和650 nm的吸光率下測(cè)量顯色反應(yīng)(圖6)。實(shí)施例5 經(jīng)DIG 0001處理后的HUVEC的生存能力實(shí)驗(yàn)
為了檢驗(yàn)經(jīng)DIG 0001處理后的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的存活率的變化，進(jìn)行了細(xì)胞生存能力實(shí)驗(yàn)。在添加有20%胎牛血清(Hyclone，美國(guó))、100單位/ml青霉素(Hyclone， 美國(guó))、100 yg/ml鏈霉素(Hyclone，美國(guó))、3 ng/ml成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Upstate Biotechnology,美國(guó))和5單位/ml肝素(Sigma-Aldrich, USA)的無酚紅M199培養(yǎng)基 (Invitrogen,美國(guó))中進(jìn)行HUVEC的培養(yǎng)，在37°C的孵化器中和含水氣的5% CO2混合空氣條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。為了進(jìn)行血管內(nèi)皮細(xì)胞的生存能力實(shí)驗(yàn)，將這些細(xì)胞放進(jìn)M孔平板中并培養(yǎng)24小時(shí)，至細(xì)胞密度達(dá)到2xl04細(xì)胞/孔。此后，用M199培養(yǎng)基洗滌M孔平板2次，并在添加有1%胎牛血清(Hyclone，美國(guó))的M199培養(yǎng)基中，在低血清濃度條件下，將細(xì)胞培養(yǎng)6小時(shí)。將細(xì)胞用多種濃度的抗體預(yù)先處理30分鐘，然后用10 ng/ml VEGF (R&D systems,美國(guó))和 100 ng/ml Angl (R&D systems, USA)處理。在 48 小時(shí)培養(yǎng)后， 用WST-8 (Dojindo,日本)處理細(xì)胞2小時(shí)，在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)量細(xì)胞培養(yǎng)物的吸光率。 然后，比較各個(gè)條件下獲得的細(xì)胞存活率(圖7)。實(shí)施例6 經(jīng)DIG 0001處理后的HUVEC的遷移實(shí)驗(yàn)
為了檢驗(yàn)DIG 0001對(duì)HUVEC的移動(dòng)性(趨化性)的抑制，進(jìn)行了細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。為了進(jìn)行HUVEC的遷移實(shí)驗(yàn)，使用了 8-μ m孔大小的聚碳酸酯過濾穿孔板(transwell) (Corning, 美國(guó))。在使用之前，用10 yg明膠將過濾膜底面包被，并干燥。在包含添加有1%胎牛血清的M199培養(yǎng)基的較低的孔中加入10 ng/ml VEGF和100 ng/ml Angl。將在低血清濃度條件下培養(yǎng)了 6小時(shí)的血管內(nèi)皮細(xì)胞用胰蛋白酶處理分離后，在添加有1%胎牛血清的 M199培養(yǎng)基中懸浮至細(xì)胞密度達(dá)到IxlO6細(xì)胞/ ml。將用多種濃度的抗體預(yù)先處理了 30 分鐘的血管內(nèi)皮細(xì)胞以100 μ 1的濃度均一分布在較高的穿孔中，并在37°C的細(xì)胞孵化器中培養(yǎng)3. 5小時(shí)。用蘇木素伊紅(Sigma，美國(guó))或結(jié)晶紫(Sigma，美國(guó))將培養(yǎng)細(xì)胞染色，用拭子除去附在過濾器上表面的未遷移的細(xì)胞，剩下附在過濾器下表面的遷移了的細(xì)胞。用裝有數(shù)碼相機(jī)的光學(xué)顯微鏡(Olympus，1X71，日本)在100倍率下對(duì)細(xì)胞拍照，來比較遷移了的細(xì)胞的數(shù)量，計(jì)算并分析了各個(gè)條件下獲得的10張圖像(圖8)。
實(shí)施例7 用免疫沉淀反應(yīng)和蛋白印跡法對(duì)細(xì)胞中VEGFR-2和Tie_2磷酸化抑制的分析
為了檢驗(yàn)雙重靶定抗體DIG 0001對(duì)VEGFR-2和Tie_2的磷酸化抑制，進(jìn)行了免疫沉淀反應(yīng)和蛋白印跡法。將培養(yǎng)了 M小時(shí)的血管內(nèi)皮細(xì)胞在添加有1%胎牛血清的M199培養(yǎng)基中培養(yǎng)6小時(shí)，然后用沈.7 yg/ml DIG 0001抗體預(yù)先處理30分鐘。此后，用10 ng/ml VEGF和100 ng/ml Angl處理血管內(nèi)皮細(xì)胞15分鐘。對(duì)于用免疫沉淀反應(yīng)分析，將血管內(nèi)皮細(xì)胞用冷的PBS洗滌，并用500 μ 1免疫沉淀反應(yīng)用緩沖溶液(1% Triton X-100, 0. 5% Nonidet Ρ-40, 50 mM Tris/HCl (pH 7.4)，150 mM NaCl, 2 mM 釩酸鈉，2 mM EGTA, 2 mM EDTA, 1 mM苯甲基磺酰氟和1 mM氟化鈉)處理。將用刮子收集的溶解物數(shù)次通過沈號(hào)注射器，充分溶解，并以12，000 g用離心機(jī)離心10分鐘，回收上清液。在300 yg溶解物中加入2 yg抗Tie-2 (R&D systems,美國(guó))免疫沉淀用抗體，并反應(yīng)8小時(shí)。然后，加入蛋白A/G+瓊脂糖(Santa Cruz Biotechnology,美國(guó))，并與免疫沉淀用抗體結(jié)合。將獲得的與蛋白A/G+瓊脂糖結(jié)合的免疫復(fù)合物離心，并用緩沖溶液反復(fù)洗滌3至5次。然后， 加入SDS樣本緩沖液，煮沸，然后離心來去除瓊脂糖沉淀。對(duì)于用蛋白印跡法分析，用裂解緩沖液(1% (w/v) SDS, 10 mM Tris (pH 7. 4)， 2mM釩酸鈉，2 mM EGTA, 2 mM EDTA, 1 mM苯甲基磺酰氟和mM氟化鈉)處理血管內(nèi)皮細(xì)胞來獲得溶解物，并將溶解物煮沸，在4°C以10000 g離心5分鐘，去除不可溶沉淀。將上清液與SDS樣本緩沖液混合，煮沸10分鐘。根據(jù)本領(lǐng)域廣泛運(yùn)用的方法進(jìn)行SDS-PAGE和蛋白印跡法，使用的樣本如下12% SDS-聚丙烯酰胺膠，PVDF膜(Millipore #IPVH00010, 美國(guó))，用作用于Tie-2磷酸化抑制活性分的第一抗體的抗Tie-2抗體(abcam，英國(guó))和抗磷酸酪氨酸抗體(Upstate Biotechnology,美國(guó))，抗 p44/42 抗體(Cell Signaling technology,美國(guó))和抗磷p44/42抗體(Cell Signaling technology,美國(guó))；抗AKT 抗體(Cell Signaling technology,美國(guó))禾口抗憐 AKT 抗體(Cell Signaling technology, 美國(guó))；用作用于VEGFR-2磷酸化抑制活性分析的第一抗體的抗VEGFR-2抗體(Cell Signaling technology,美國(guó))禾口抗憐 VEGFR-2 抗體(Cell Signaling technology,美國(guó))；抗 AKT 抗體(Cell Signaling technology,美國(guó))和抗 phospho AKT 抗體(Cell Signaling technology,美國(guó))；和用作結(jié)合化學(xué)發(fā)光法用第一抗體的第二抗體的HRP 偶聯(lián)的羊抗鼠IgG抗體(Santa Cruze Biotechnology,美國(guó))和HRP偶聯(lián)的羊抗兔IgG (Santa Cruze Biotechnology,美國(guó))(圖 9)。實(shí)施例8 在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤動(dòng)物模型中DIG-0001對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制
為了在正常位置生長(zhǎng)成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，使用了去除了特定病原體的雄性Balb/c-nu小鼠 (Japan SLC)。根據(jù)已知方法進(jìn)行U-87MG成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(2xl05細(xì)胞，美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏機(jī)構(gòu))的腦內(nèi)移植。成膠質(zhì)細(xì)胞瘤腦內(nèi)移植后第二日，將小鼠分成兩組(η =4)并作如下治療(a)腹腔注射PBS，(b)腹腔注射0. 5mg/kg DIG-0001。所有治療進(jìn)行5次(接種腫瘤細(xì)胞后15、18、21、對(duì)和27日)。腫瘤細(xì)胞移植后四日，殺死小鼠，移除其大腦，并進(jìn)行冠狀切片。將一個(gè)片段用10%緩沖的福爾馬林固定并用福爾馬林包埋，剩余片段用OCT化合物包埋。通過測(cè)定含有最大腫瘤區(qū)域的片段的體積獲得腫瘤體積，并用如下等式計(jì)算寬度 2 χ 長(zhǎng)度 χ 0.5 (圖 10)。本發(fā)明的組合物可以用于治療血管發(fā)生相關(guān)的疾病，特別是癌癥。
說明和描述本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例時(shí)，本領(lǐng)域一般技術(shù)人員應(yīng)該理解在本發(fā)明較廣泛的方面之內(nèi)可以進(jìn)行改動(dòng)及其他修改。在權(quán)利要求書中詳盡解釋了本發(fā)明的各種特征。
權(quán)利要求
1.一種雙重靶定抗體，其具有融合至抗體的重鏈或輕鏈的N-端的水溶性配體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙重靶定抗體，其中所述抗體是針對(duì)在以下細(xì)胞中特異表達(dá)的抗原的抗體，所述細(xì)胞選自腫瘤細(xì)胞、癌癥基質(zhì)細(xì)胞、腫瘤相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤相關(guān)的內(nèi)皮祖細(xì)胞、腫瘤相關(guān)循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞和癌癥干細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雙重靶定抗體，其中所述抗原選自VEGFR-1、VEGFR-2、 VEGFR-3、FLT3、c-FMS/CSFIR、RET、c_Met、EGFR、Her2/neu、HER3、HER4、FGFR、IGFR、PDGFR、 c-KIT、BCR、整聯(lián)蛋白和MMP。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙重靶定抗體，其中所述抗體是針對(duì)VEGFR-2/KDR的中和抗體 TTAC 0001。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙重靶定抗體，其中所述水溶性配體選自VEGF、EGF、PlGF, FGF, PDGF, HGF和血管生成素。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙重靶定抗體，其中所述水溶性配體是血管生成素2的 Tie-2結(jié)合域。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙重靶定抗體，其中所述水溶性配體通過連接體與抗體的重鏈或輕鏈的N-端融合。
8.編碼權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的雙重靶定抗體的DNA。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的DNA，其中所述抗體的輕鏈和水溶性配體的堿基序列如SEQ ID NO: 6 所示。
10.含有權(quán)利要求8所述的DNA的重組表達(dá)載體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的重組表達(dá)載體，其中所述重組表達(dá)載體包含具有如圖2所示酶切圖譜的 pIgGLD-mAng2-TTAC0001 Lgt。
12.使用權(quán)利要求10所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
13.—種制造雙重靶定抗體的方法，其包括培養(yǎng)權(quán)利要求12所述的宿主細(xì)胞；以及從宿主細(xì)胞的培養(yǎng)液中分離雙重靶定抗體。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中使用具有蛋白A親和層析柱、SP-瓊脂糖柱和尺寸排阻柱的快速蛋白液相色譜法(FPLC)進(jìn)一步純化所述雙重靶定抗體。
15.含有權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的雙重靶定抗體的藥物組合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的藥物組合物，所述藥物組合物用于治療血管發(fā)生相關(guān)的疾病。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的藥物組合物，其中所述血管發(fā)生相關(guān)的疾病選自癌癥、年齡相關(guān)性黃斑變性、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、銀屑病和慢性炎癥。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的藥品組分，其中所述癌癥選自胃癌、肝癌、肺癌、甲狀腺癌、 乳腺癌、子宮頸癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、直腸癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、腎癌、黑色素瘤、源自前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移癌、卵巢癌和血癌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新型雙重靶定抗體，其具有融合至抗體的重鏈或輕鏈的N-端的水溶性配體；編碼該雙重靶定抗體的DNA；包含該DNA的重組表達(dá)載體；由該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；通過培養(yǎng)該宿主細(xì)胞制造該雙重靶定抗體的方法以及包含該雙重靶定抗體的藥物組合。
文檔編號(hào)C07K19/00GK102428104SQ200980159382
公開日2012年4月25日 申請(qǐng)日期2009年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月20日
發(fā)明者李元燮, 柳珍山, 沈相烈, 金圣祐 申請(qǐng)人:藥物抗體公司