專利名稱：用作酶抑制劑的3-氨基-2-氧代-1-哌啶乙酸衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一方面，本發(fā)明涉及作為凝血酶的強(qiáng)特異性抑制劑的化合物。另一方面，本發(fā)明涉及新的肽醛，它們的藥學(xué)上認(rèn)可的鹽，和它們的藥學(xué)上認(rèn)可的組合物，此類組合物可用作哺乳動(dòng)物體外和體內(nèi)血液凝固作用的強(qiáng)特異性抑制劑。此外，本發(fā)明還涉及將這些抑制劑用作治療哺乳動(dòng)物中以異常的血栓形成為特征的疾病的方法。
背景正常的止血作用是血凝塊形成(血液凝固)過程和血凝塊溶解(血纖維蛋白溶解)過程之間復(fù)雜平衡的結(jié)果。血細(xì)胞、特異性血漿蛋白和血管表面之間復(fù)雜的相互作用維持著血液的流動(dòng)性，除非發(fā)生損傷和失血。
血液凝固是一系列反應(yīng)擴(kuò)增至最大時(shí)的結(jié)果，其中，血漿中絲氨酸蛋白酶的幾種特異性酶原被限制性蛋白水解作用所激活。Nemerson，Y.和Nossel，H.L.，Ann.Rev.Med.，33479(1982)。由這一系列反應(yīng)形成穩(wěn)定初級止血栓所需的不溶性的血纖維蛋白基質(zhì)。通過血凝作用的外源性和內(nèi)源性路徑發(fā)生激活反應(yīng)的相互作用和擴(kuò)增。
這些路徑高度的相互依賴并集中到一種絲氨酸蛋白酶，即因子Xa的形成。因子Xa催化凝血作用級聯(lián)中的倒數(shù)第二步，此步驟產(chǎn)生絲氨酸蛋白酶凝血酶。此步驟發(fā)生于凝血酶原酶復(fù)合物組裝完成之后，此復(fù)合物由因子Xa、非酶輔因子Va和底物凝血酶原在被粘附的已活化的血小板或全身循環(huán)膜質(zhì)微粒表面組裝而成。
酶原因子X經(jīng)蛋白水解激活成為其有催化活性的形式Xa可以通過內(nèi)源性或外源性凝血路徑發(fā)生。
之所以稱“內(nèi)源性”路徑是因?yàn)槟璧母鞣N物質(zhì)都在血液之中。Saito，H.，“Normal Hemostatic Mechanisms”，Disorders of Hemostasis，pp.27-29，Grune & Stratton，Inc.(O.D.Ratnoff，M.D.和C.D.Forbes，M.D.編，1984)。此路徑包括絲氨酸蛋白酶原(因子IX和XI)和非酶輔因子(因子VIII)。內(nèi)源性路徑的引發(fā)將因子XI激活成XIa。因子XIa催化激活I(lǐng)X成為IXa，后者與位于合適的磷脂表面上的活性形式的因子VIII結(jié)合形成tenase復(fù)合物。此復(fù)合物也催化由酶原，因子X形成絲氨酸蛋白酶(因子Xa)，由后者形成血凝塊。
之所以稱“外源性”路徑是因?yàn)榕c因子VII結(jié)合并促使其激活的組織因子來自血液之外。Saito，同上。此路徑中的主要組份是絲氨酸蛋白酶原(因子VII)和膜結(jié)合蛋白(組織因子)。后者起此酶所必需的非酶輔因子的作用。此路徑的引發(fā)是通過微量的已激活的因子VII(因子VIIa)激活酶原因子VII的自催化作用，兩種因子都與血管損傷部位膜表面上新暴露的組織因子相結(jié)合。因子VIIa/組織因子復(fù)合物直接催化由酶原(因子X)形成絲氨酸蛋白酶(因子Xa)。血液與受傷組織接觸引發(fā)通過外源性路徑的凝血作用。
因子Xa在組裝成有催化活性的凝血酶原酶復(fù)合物后催化凝血酶的形成(參見Mann，K.G.等的綜述，“Surface-Dependent Reactions of the VitaminK-Dependent Enzyme Complexes”，blood，761-16(1990))。此復(fù)合物由因子Xa，非酶輔因子Va和底物凝血酶原在合適的磷脂表面上組裝而成。有效的催化作用需要大分子復(fù)合物使因子Xa不受天然抗凝血機(jī)制，例如肝素-抗凝血酶III介導(dǎo)的抑制作用的影響。Teite，J.M.和Rosenberg，R.D.，“Protectionof Factor Xa from neutralization by the heparin-antithrombin complex”，J.Clin.Invest.，711383-1391(1983)。此外，將因子Xa隱含在凝血酶原酶復(fù)合物內(nèi)部還使它能夠耐受外源肝素療法(也需要抗凝血酶III來產(chǎn)生抗凝血作用)的抑制作用。
凝血酶是血栓形成中的早期介體。凝血酶直接作用使循環(huán)的血纖維蛋白原形成不溶性的血纖維蛋白。此外，凝血酶將酶原因子XIII激活成活性轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶因子XIIIa，后者通過使血纖維蛋白鏈交聯(lián)來共價(jià)地穩(wěn)定形成中的血栓。Lorand，L.和Konishi，K.，Arch.Biochem.Biopys.，10558(1964)。除了在富血纖維蛋白血凝塊的形成和穩(wěn)定化中的直接作用之外，據(jù)報(bào)道，此酶還具有尚無解釋的對脈管系統(tǒng)和血液中許多細(xì)胞組份的生物調(diào)節(jié)作用。Shuman，M.A.，Ann.NY Acad.Sci.，405349(1986)。
凝血酶被認(rèn)為是血小板激活最有效的激動(dòng)劑，而且，它已被證明是血小板依賴性的動(dòng)脈血栓形成的早期病理生理介體。Edit，J.E.等，J.Clin.Invest.，8418(1989)。凝血酶介導(dǎo)的血小板激活引起配體介導(dǎo)的血小板相互凝聚，此凝聚主要是由于粘性配體(例如血纖維蛋白原和纖連蛋白)與血小板整合蛋白受體(例如糖蛋白IIb/IIIa)之間的二價(jià)相互反應(yīng)，它們在凝血酶激活后采取其活性構(gòu)象。Berndt，M.C.和Phillips，D.R.，Platelets in Biology and Pathalogy，pp.43-74，Elsevier/North Holland Biomedical Press(Gordon，J.L.編。1981)。凝血酶激活的血小板還可以通過在凝血酶分別介導(dǎo)的非酶輔因子V和VIII激活后，在完整的活性血小板和血小板衍生的微粒的膜表面組裝新的凝血酶原酶和tenase(因子IXa，因子VIIIa和因子X)催化復(fù)合物，支持進(jìn)一步產(chǎn)生凝血酶。Tans，G.等，Blood，772641(1991)。這一正反饋過程在血栓周圍局部產(chǎn)生高濃度的凝血酶，由此支持血栓進(jìn)一步的生長和擴(kuò)展。Mann，K.G.等，Blood，761(1990)。
和促血栓形成作用相對照，凝血酶還證明能影響止血作用的其它方面。這些包括其作為重要的生理抗凝劑的作用。凝血酶在與內(nèi)皮細(xì)胞膜糖蛋白血小板修飾蛋白(thrombomodulin)結(jié)合后表現(xiàn)出其抗凝血作用。這被認(rèn)為引起凝血酶底物特異性的改變，由此使其能夠識(shí)別并通過蛋白水解作用激活循環(huán)的蛋白C成為活性蛋白C(aPC)。Musci，G.等，Biochemistry，27769(1988)。aPC是一種絲氨酸蛋白酶，它選擇性地使非酶輔因子Va和VIIIa失活，這種失活作用分別通過凝血酶原酶和tenase催化復(fù)合物而對凝血酶的形成產(chǎn)生降調(diào)節(jié)作用。Es-mon，C.T.，Science，2351348(1987)。沒有血小板修飾蛋白時(shí)，凝血酶對蛋白C的激活作用很弱。
凝血酶還是多種細(xì)胞的有效的直接促細(xì)胞分裂劑，包括血管平滑肌細(xì)胞之類的來自間質(zhì)的細(xì)胞。Chen，L.B.和Buchanan，J.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，72131(1975)。凝血酶與血管平滑肌的直接相互作用還引起血管收縮。Walz，D.A.等，Proc.Soc.Expl.Biol.Med.，180518(1985)。凝血酶起著直接促分泌素的作用，誘導(dǎo)許多生物活性物質(zhì)由血管內(nèi)皮細(xì)胞中釋放，其中包括組織纖溶酶原激活物。Levin，E.G.等，Thromb.Haemost.，56115(1986)。除了這些對血管細(xì)胞的直接作用外，該酶能夠在凝血酶介導(dǎo)的激活作用后，通過從無粒血小板(patelet agranules)中釋放多種強(qiáng)生長因子(例如血小板衍生生長因子和表皮生長因子)，間接發(fā)揮對血管平滑肌細(xì)胞的強(qiáng)促有絲分裂活性。Ross，R.，N.Engl.J.Med.，314408(1986)。
許多重要的病況與異常的凝血有關(guān)。對于冠狀動(dòng)脈脈管系統(tǒng)，已形成的粥樣硬化斑塊的破裂造成的異常血栓形成是急性心肌梗塞和不穩(wěn)定型心絞痛的主要原因。而且，用血栓溶解療法或經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀血管成形術(shù)(PTCA)治療閉合性冠狀血栓通常伴有患病血管的急性血栓形成性再閉合，需要立刻溶解。對于靜脈脈管系統(tǒng)，接受下肢或腹部大手術(shù)的病人中有很高百分比發(fā)生靜脈脈管系統(tǒng)血栓形成，這會(huì)引起流向患病肢體的血流減少和肺栓塞的傾向。播散性血管內(nèi)凝血障礙通常在敗血性休克、某些病毒感染和癌癥時(shí)在血管系統(tǒng)中發(fā)生，其特點(diǎn)為凝血因子的迅速消耗和全身性凝血，引起在整個(gè)脈管系統(tǒng)中發(fā)生危及生命的血栓形成，引起廣泛的器官衰竭。
動(dòng)脈脈管系統(tǒng)中的病原性血栓形成是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的一個(gè)主要臨床問題。它是急性心肌梗塞(西方國家死亡率的主要原因之一)的主要原因。在閉塞的冠狀血管分別使用溶血栓劑或經(jīng)皮經(jīng)腔血管成形術(shù)(PTCA)經(jīng)酶法或機(jī)械再通之后，復(fù)發(fā)性動(dòng)脈血栓形成也仍然是衰竭的主要原因之一。Ross，A.M.，Throm-bosis in Cardiovascular Disorder，p.327，W.B.Saunders Co.(Fuster，V.和Verstraete，M.編，1991)。Califf，R.M.和Willerson，J.T.，同上，p389。與靜脈脈管系統(tǒng)中的血栓形成不同，動(dòng)脈血栓形成是血纖維蛋白形成(血液凝固級聯(lián)所引起)和細(xì)胞成份，尤其是構(gòu)成動(dòng)脈血栓主要部分的血小板之間復(fù)雜的相互作用的結(jié)果。肝素，使用最廣泛的抗凝血?jiǎng)?靜脈注射給藥)治療和防止急性動(dòng)脈血栓形成或血栓再形成尚未證明普遍有效。Prins，M.H.和Hirsh，J.，J.Am.Coll.Cardiol.，673A(1991)。
除了常發(fā)生在PTCA之后的無法預(yù)料的復(fù)發(fā)性血栓形成性再閉塞，在此手術(shù)后的1至6個(gè)月中，在30％至40％的病人中還發(fā)生再通血管的再狹窄(尚無解釋)。Califf，R.M.等，J.Am.Coll.Cardiol.，172B(1991)。這些病人需要再次進(jìn)行PTCA或冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)來進(jìn)一步治療，以緩解新形成的狹窄。機(jī)械損傷的血管的再狹窄不是血栓形成過程，而是周圍平滑肌細(xì)胞中過度增殖反應(yīng)的結(jié)果，這種增殖在長時(shí)間后造成因肌肉體積增加而減小了管腔直徑。同上書。至于動(dòng)脈血栓形成，目前沒有防止機(jī)械再通后血管再狹窄的有效的藥物治療方法。
在一個(gè)方面，對安全有效的治療用抗凝血?jiǎng)┑男枨笠褜⒆⒁饬性诮z氨酸蛋白酶凝血酶在血液凝固中的作用。
據(jù)報(bào)道，凝血酶最好的天然底物在P3識(shí)別亞部位具有一個(gè)不帶電的氨基酸。例如，作為凝血酶主要生理底物的血纖維蛋白原其Aα鏈上的凝血酶酶切部位，據(jù)報(bào)道，在此位置具有一個(gè)甘氨酸殘基，而在Bβ鏈上的酶切部位具有一個(gè)絲氨酸，如下所示P4 P3 P2 P1 P1′Gly-Gly-Val-Arg/Gly血纖維蛋白原Aα鏈Phe-Ser-Ala-Arg/Gly血纖維蛋白原Bβ鏈已有報(bào)道，在P3位具有不帶電殘基的肽基衍生物據(jù)說與凝血酶的活性部位結(jié)合，由此抑制血纖維蛋白原向血纖維蛋白的轉(zhuǎn)化以及細(xì)胞的激活。這些衍生物具有與P1氨基酸相關(guān)的一個(gè)醛、氯甲基酮或硼酸官能團(tuán)。例如，類似底物的肽基衍生物，例如D-苯丙氨酰-脯氨酰-精氨醛(D-Phe-Pro-Arg-al)，D-苯丙氨酰-脯氨酰-精氨酸-氯甲基酮(P-PACK)和乙酰-D-苯丙氨酰-脯氨酰-硼精氨酸(Ac-(D-Phe)-Pro-boroArg)已被報(bào)道能通過與此酶活性部位的直接結(jié)合來抑制凝血酶。Bajusz，S.，Symposia Biologica Hungarica，25277(1984)，Bajusz，S.等，J.Med.Chem.，331729(1990)和Bajusz，S.等，Int.J.Peptide ProteinRes.12217(1970)；Kettner，C.和Shaw，E.，Metods Enzymol.，80826(1987)，Kettner，C.等，EP293，881(于1988年12月7日公開)，Kettner，C.等，J.Biol.Chem.26518209(1990)。這些分子已被報(bào)道是防止富血小板的動(dòng)脈血栓形成的強(qiáng)抗凝血?jiǎng)?。Kelly，A.B.等，Thromb.Haemostas.，65736，摘要257(1991)。還提出或報(bào)道了其它用作凝血酶抑制劑的肽基醛。Bey，P.等，EP363，284(公開于1990年4月11日)和Balasubramanian，N.等，EP526，877(公開于1993年2月10日)。
據(jù)說是凝血酶活性部位的抑制劑，但其結(jié)構(gòu)不同于那些在P3識(shí)別亞部位具有不帶電氨基酸的化合物也已有所報(bào)道。
據(jù)報(bào)道，化合物Argatroban(又稱2R，4R-4-甲基-1-〔N-2-(3-甲基-1，2，3，4-四氫-8-喹啉磺酰)-L-精氨?！?2-哌啶羧酸)也直接與凝血酶的活性部位結(jié)合，而且被認(rèn)為是該酶的非肽基抑制劑類中最強(qiáng)且具有選擇性的化合物。Okamoto，S等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，101440(1981)。Argatroban據(jù)報(bào)道在幾種動(dòng)脈血栓形成實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭惺菑?qiáng)抗血栓形成劑。Jang，I.K.等，Circulation，81219(1990)和Circ.Res.，671552(1990)。
已報(bào)道了據(jù)說是凝血酶抑制劑、其作用方式被認(rèn)為是通過與酶的活性部位和另一部位結(jié)合的肽基化合物。已有報(bào)道，水蛭素和水蛭素的某些肽基衍生物通過同時(shí)與凝血酶的活性部位和外側(cè)部位結(jié)合，或只與外側(cè)部位結(jié)合同時(shí)抑制血纖維蛋白原向血纖維蛋白的轉(zhuǎn)化和血小板的激活。Markwardt，F(xiàn).，Thromb.Haemostas.，66141(1991)。據(jù)報(bào)道，水蛭素是一個(gè)65氨基酸的多肽，最早由水蛭的唾液腺提取物中分離得到。它被說成是已知最有效的凝血酶抑制劑。Mark-i，W.E.和Wallis，R.B.，Thromb.Haemostas.，64344(1990)。據(jù)報(bào)道，它通過同時(shí)與結(jié)合陰離子的外側(cè)部位和催化活性部位(兩者互不相同且相距很遠(yuǎn))結(jié)合來抑制凝血酶。Rydel，T.J.等，Science，249277(1990)。據(jù)報(bào)道，水蛭素是有效的體內(nèi)抗血栓形成劑。Markwardt，F(xiàn).等，Pharmazie，43202(1988)；Kelly，A.B.等，Blood，771(1991)。除了其抗血栓形成作用之外，據(jù)報(bào)道，水蛭素還能有效抑制粥樣硬化的兔股動(dòng)脈受機(jī)械損傷后的平滑肌增生及相關(guān)的再狹窄。Sarembock，I.J.等，Circulation，84232(1991)。
據(jù)報(bào)道，Hirugen是從水蛭素的陰離子羧基末端衍生的肽。據(jù)報(bào)道，它只與凝血酶結(jié)合陰離子的外側(cè)部位結(jié)合，因此抑制血纖維蛋白的形成但不抑制已與酶的未封閉的活性部位接近的小的合成底物的催化轉(zhuǎn)化。Maraganore，J.M.等，J.Biol.Chem.，2648692(1989)；Naski，M.C.等，J.Biol.Chem.，26513484(1990)。據(jù)報(bào)道，根據(jù)X線晶體分析，水蛭素中由Hirugen代表的結(jié)構(gòu)域直接與凝血酶的外側(cè)部位結(jié)合。Skrzypczak-Jankun，E.等，Thromb.Haemostas.，65830，abstract 507(1991)。而且，據(jù)報(bào)道，hirugen的結(jié)合加強(qiáng)了凝血酶對某些小的合成底物的催化轉(zhuǎn)化，這表明對外側(cè)位置的占據(jù)可能伴隨著酶活性部位的構(gòu)象變化。Liu，L.W.等，J.Biol.Chem.，26616977(1991)。據(jù)報(bào)道，hirugen還阻滯凝血酶介導(dǎo)的血小板凝聚。Jakubowski，J.A.和Maraganore，J.M.，Blood，75399(1990)。
現(xiàn)已有一組合成的嵌合分子被命名為hirulog，它們由甘氨酸間隔區(qū)連接到肽D-苯丙氨酰-脯氨酰-精氨酸的hirugen樣序列構(gòu)成，這是根據(jù)凝血酶的一個(gè)最佳底物識(shí)別部位合成的。Maraganore等，U.S.專利5,196,404(March 23，1993)。據(jù)說，hirugen樣序列通過該肽的C末端與肽連接。Maraganone，J.M.等，Biochemistry 297095(1990)。已有報(bào)道，hirulog類是防止富血纖維蛋白和富血小板性血栓形成的有效抗血栓形成劑。Maraganone，J.M.等，Thromb.Haemostas.，65651，abastract 17(1991)。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及新的肽精氨醛類化合物，其中包括內(nèi)酰胺基，它們是有效的體內(nèi)和體外凝血酶抑制劑。
所以，一方面，本發(fā)明涉及具有以下結(jié)構(gòu)式的化合物 其中(a)X選自-S(O)2-、-N(R′)-S(O)2-、-C(＝O)-、-OC(＝O)-、-NH-C(＝O)-、-P(O)(R″)-和直接連接鍵，其中的R′是氫原子、1至約4個(gè)碳原子的烷基、約6至14個(gè)碳原子的芳基或約6至16個(gè)碳原子的芳烷基，R″是NR′、OR′、R′、或SR′，條件是R″不是NH、OH、H或SH；(b)R1選自(1)1至約12個(gè)碳原子的烷基，(2)經(jīng)約5至8個(gè)碳原子的環(huán)烷基取代的1至約3個(gè)碳原子的烷基，環(huán)碳原子可以可選性地被羥基、氨基、胍基、脒基或1至約3個(gè)碳原子的烷氧基或烷基所取代，(3)3至約15個(gè)碳原子的環(huán)烷基，環(huán)碳原子可以可選性地被羥基、氨基、胍基、脒基或1至約3個(gè)碳原子的烷氧基或烷基所取代，(4)4至約10個(gè)環(huán)原子的雜環(huán)烷基，環(huán)原子選自碳原子和雜原子，其中的雜原子選自氧、氮和S(O)i，其中的i是0、1或2，環(huán)碳原子可以可選性地被羥基、1至約3個(gè)碳原子的烷氧基或烷基、氨基、胍基或脒基取代，(5)4至約10個(gè)環(huán)原子的雜環(huán)基，環(huán)原子選自碳原子和雜原子，其中的雜原子選自氧、氮和S(O)i，其中的i是0、1或2，環(huán)碳原子可以可選性地被羥基、1至約3個(gè)碳原子的烷氧基或烷基、氨基、胍基或脒基取代，(6)可以經(jīng)約5至8個(gè)碳原子的環(huán)烷基取代的約3至6個(gè)碳原子的鏈烯基，環(huán)碳原子可以被羥基、氨基、胍基、脒基或1至約3個(gè)碳原子的烷氧基或烷基取代，(7)約6至約14個(gè)碳原子的芳基，可以分別被Y1、Y2和/或Y3單取代、二取代或三取代，(8)5至14個(gè)原子的雜芳基，環(huán)原子選自碳原子和雜原子，其中的雜原子選自氧、氮和S(O)i，其中的i是0、1或2，可以分別被Y1、Y2和/或Y3單取代、二取代或三取代，(9)芳環(huán)上可以分別被Y1、Y2和/或Y3單取代、二取代或三取代的約7至15個(gè)碳原子的芳烷基，(10)6至11個(gè)原子的雜芳烷基，環(huán)原子選自碳原子和雜原子，其中的雜原子選自氧、氮和S(O)i，其中的i是0、1或2，可以分別被Y1、Y2和/或Y3單取代、二取代或三取代，(11)芳環(huán)上可以分別被Y1、Y2和/或Y3單取代、二取代或三取代的約8至15個(gè)碳原子的芳鏈烯基，(12)7至12個(gè)原子的雜芳鏈烯基，環(huán)原子選自碳原子和雜原子，其中的雜原子選自氧、氮、和S(O)i，其中的i是0、1或2，可以分別被Y1、Y2和/或Y3單取代、二取代或三取代， (17)1至約12個(gè)碳原子的全氟烷基，(18)約6至約14個(gè)碳原子的全氟芳基，(19)約7至15個(gè)碳原子的全氟芳烷基，(20)氫原子，和(21) ，其中 是具有3至6個(gè)環(huán)碳原子的5至7元的雜環(huán)，其中的V是-CH2-、-O-、-S(＝O)-、-S(O)2-或-S-，其中的Y1、Y2和Y3是(i)各自選自氫原子、鹵原子、氰基、四唑基、氨基、胍基、脒基、甲基氨基和甲基胍基，-CF3、-CF2H、-CF2CF3、-CH(CF3)2，-C(OH)(CF3)2，-OCF3、-OCF2CF3、-OC(O)NH2、-OC(O)NHZ1、-OC(O)NZ1Z2、-NHC(O)Z1、-NHC(O)NH2、-NHC(O)NHZ1、-NHC(O)NZ1Z2、-C(O)OH、-C(O)NH2、-C(O)NHZ1、-C(O)OZ1、-P(O)3H、-P(O)3H2、-P(O)3(Z1)2、-S(O)3H、-S(O)mZ1、-Z1、-OZ1、-OH、-NH2、-NHZ1和-NZ1Z2，其中m是0、1或2，Z1和Z2各自選自1至約12個(gè)碳原子的烷基、約6至14個(gè)碳原子的芳基、其中有1至約9個(gè)碳原子的約5至14個(gè)原子的雜芳基、約7至15個(gè)碳原子的芳烷基和約6至11個(gè)原子的雜芳烷基(其中有約3至9個(gè)碳原子)，或(ii)Y1和Y2同為-OC(Z3)(Z4)O-，其中Z3和Z4各自選自氫原子、1至約12個(gè)碳原子的烷基、約6至14個(gè)碳原子的芳基、具有1至約9個(gè)碳原子的約5至約14個(gè)原子的雜芳基、約7至15個(gè)碳原子的芳烷基、約6至約11個(gè)原子的雜芳烷基(其中有約3至9個(gè)碳原子)，(c)Q是-(CH2)n-(其中n是整數(shù)1至4)，或-(CH2)qR4-，其中q是1或2，R4是-S(O)p-、-O-、-N(R5)-，其中p是0、1或2，R5選自氫原子、1至4個(gè)碳原子的烷基和1至4個(gè)碳原子的?；?；(d)R2選自氫原子、1至4個(gè)碳原子的烷基或2至4個(gè)碳原子的鏈烯基；和(e)Y選自R1取代基，條件是Y不是 以及它們的藥學(xué)上認(rèn)可的鹽。
在諸多因素中，本發(fā)明是基于我們的發(fā)現(xiàn)，即本發(fā)明的新化合物作為體內(nèi)和體外凝血酶選擇性抑制劑具有活性。此外，我們發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的某些化合物顯示特別好的選擇性，它們是凝血酶的高效抑制劑，但在抑制血纖維蛋白溶酶方面沒有活性或活性明顯較低(低幾個(gè)數(shù)量級)并且其抑制胰蛋白酶的活性明顯較低。這種抑制凝血酶的選擇性使得這些化合物在治療或預(yù)防可能有異常血栓形成的情況的哺乳動(dòng)物體內(nèi)的血栓形成方面具有突出的治療優(yōu)點(diǎn)。
已有報(bào)道，肽基精氨醛以平衡結(jié)構(gòu)存在于水溶液中。BajHsz，S.等，J.Med.Chem.，331729(1990)。這些結(jié)構(gòu)，見下文，包括精氨醛A，水合醛B，和兩個(gè)氨基環(huán)醇形式，C和D。R基團(tuán)代表本發(fā)明某一給定的具體化合物的其余部分。本發(fā)明的肽醛包括其定義內(nèi)的所有平衡形式。 另一方面，本發(fā)明涉及含有治療有效量的本發(fā)明的化合物和藥學(xué)上認(rèn)可的載體的藥物組合物。
再一方面，本發(fā)明涉及使用本發(fā)明的化合物和藥物組合物預(yù)防可能有異常血栓形成的情況的哺乳動(dòng)物體內(nèi)的血栓形成的方法，此方法包括對所述哺乳動(dòng)物給以治療有效量的本發(fā)明化合物或含有此化合物的藥物組合物。定義根據(jù)本發(fā)明，在本文中，除非另作說明，以下術(shù)語具有以下定義，“鏈烯基”指具有至少一個(gè)雙鍵的不飽和脂肪族基團(tuán)。
“烷基”指直鏈、支鏈或環(huán)狀的飽和脂肪族基團(tuán)。
“烷基氧”和“烷氧基”指結(jié)構(gòu)式為R-O-的基團(tuán)，其中的R是烷基。
“烷氧羰基”指-C(O)OR，其中的R是烷基。
“芳鏈烯基”指經(jīng)芳基取代的鏈烯基。
“芳烷基”指經(jīng)芳基取代的烷基。合適的芳烷基有芐基、吡啶甲基等，它們可以是經(jīng)取代的。
“芳基”指具有至少一個(gè)有共軛π電子體系的環(huán)的芳香族基團(tuán)，包括碳環(huán)芳基、雜環(huán)芳基和聯(lián)芳基，它們都可以是經(jīng)取代的。
“芳氧基”指結(jié)構(gòu)式為R-O-的基團(tuán)，其中的R是芳基。
“芳烷氧基”指結(jié)構(gòu)式為R-O-的基團(tuán)，其中的R是芳烷基。
“氨基酸”指天然氨基酸、非天然氨基酸，和具有立體異構(gòu)體的氨基酸的D型和L型立體異構(gòu)體類似物。天然氨基酸為丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、賴氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和纈氨酸(Val)。非天然氨基酸包括但不限于氮雜環(huán)丁烷羧酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基異丁酸、3-氨基異丁酸、2-氨基庚二酸、2，4-二氨基異丁酸、鎖鏈賴氨素、2，2′-二氨基庚二酸、2，3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羥基賴氨酸、別羥基賴氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸、異鎖鏈賴氨素、別異亮氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基異亮氨酸、N-甲基纈氨酸、正纈氨酸、正亮氨酸、鳥氨酸和2-哌啶酸。氨基酸類似物包括被可逆或不可逆地化學(xué)保護(hù)的，或在N末端氨基或側(cè)鏈基團(tuán)被修飾的天然和非天然氨基酸，例如甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸砜、S-(羧基甲基)-半胱氨酸、S-(羧基甲基)-半胱氨酸亞砜和S-(羧基甲基)-半胱氨酸砜。
“氨基酸類似物”指C末端羧基或N末端氨基，或者側(cè)鏈官能團(tuán)被修飾成其它官能團(tuán)的氨基酸。例如，天冬氨酸-(β-甲基酯)是天冬氨酸的氨基酸類似物；N-乙基甘氨酸是甘氨酸的氨基酸類似物；或丙氨酸羧酰胺是丙氨酸的氨基酸類似物。
“氨基酸殘基”指如下結(jié)構(gòu)式的基團(tuán)(1)-C(O)-R-NH-，其中的R通常是-CH(R′)-，其中的R′是H或含碳的取代基；或(2) ，其中p是1、2或3，分別表示氮雜環(huán)丁烷羧酸、脯氨酸或2-哌啶酸基。
“聯(lián)芳基”指在與苯環(huán)連接點(diǎn)的鄰位、間位或?qū)ξ槐辉诖硕x的碳環(huán)或雜環(huán)芳基取代的苯基。
“鹽水”指氯化鈉飽和水溶液。
“碳環(huán)芳基”指芳香環(huán)上的環(huán)原子是碳原子的芳香族基團(tuán)。碳環(huán)芳基包括單環(huán)碳環(huán)芳基和萘基，都可以是經(jīng)取代的。合適的碳環(huán)芳基為苯基和萘基。合適的取代碳環(huán)芳基為被1至2個(gè)取代基(以低級烷基、羥基、低級烷氧基、低級烷氧基羰基、鹵原子、三氟甲基、硝基和氰基為宜)取代的茚和苯基。取代萘基指被低級烷基、低級烷氧基或鹵原子取代的1-或2-萘基。
“環(huán)烯基”指環(huán)狀烯基。合適的環(huán)烯基有，例如環(huán)戊烯基和環(huán)己烯基。
“環(huán)烷基”指環(huán)狀烷基。合適的環(huán)烷基有，例如環(huán)己基、環(huán)丙基、環(huán)戊基和環(huán)庚基。
“環(huán)己基甲基”指與CH2連接的環(huán)己基。
“鹵原子”指氟、氯、溴和碘。
“雜芳基鏈烯基”指被雜芳基取代的鏈烯基，并且包括“Handbook of Chem-istry and Physics”，第49版，1968，R.C.Weast編；The Chemical Rubber Co.，Cleveland，OH中所述的那些雜環(huán)體系。特別參見Rules for Naming OrganicCompounds，B.Fundamental Heterocyclic Systems中的C部分。
“雜芳烷基”指被雜芳基取代的烷基，并包括“Handbook of Chemistry andPhysics”，第49版，1968，R.C.Weast編；The Chemical Rubber Co.，Cleve-land，OH中所述的那些雜環(huán)體系。特別參見Rules for Naming Organic Com-pounds，B.Fundamental Heterocyclic Systems中的C部分。
“雜芳基”指具有1至9個(gè)碳原子，而其它原子為雜原子的芳基，并包括“Handbook of Chemistry and Physics”，第49版，1968，R.C.Weast編；TheChemical Rubber Co.，Cleveland，OH中所述的那些雜環(huán)體系。特別參見Rules for Naming Organic Compounds，B.Fundamental Heterocyclic Systems中的C部分。合適的雜原子為氧、氮、S(O)i，其中的i是0、1或2，合適的雜環(huán)芳基為呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基等。
“雜環(huán)”指由碳原子、氮原子、氧原子和/或硫原子構(gòu)成的被還原的雜環(huán)體系，并包括“Handbook of Chemistry and Physics”，第49版，1968，R.C.Weast編；The Chemical Rubber Co.，Cleveland，OH中所述的那些雜環(huán)體系。特別參見Rules for Naming Organic Compounds，B.Fundamental Heterocyclic Systems中的C部分。
“雜環(huán)烷基”指被雜環(huán)取代的烷基，并包括“Handbook of Chemistry andPhysics”，第49版，1968，R.C.Weast編；The Chemical Rubber Co.，Cleve-land，OH中所述的那些雜環(huán)體系。特別參見Rules for Naming Organic Com-pounds，B.Fundamental Heterocyclic Systems中的C部分。
“低級”在此指有機(jī)基團(tuán)或化合物含有少于等于5，以少于等于4為佳，最好是1個(gè)或2個(gè)碳原子。這種基團(tuán)可以是直鏈或支鏈的。
“全氟烷基”指每一個(gè)氫原子都被氟原子取代的烷基。
“全氟芳基”指每一個(gè)氫原子都被氟原子取代的芳基。
“全氟芳烷基”指其中芳基部分的每一個(gè)氫原子都被氟原子取代的芳烷基中。
“藥學(xué)上認(rèn)可的鹽”指本發(fā)明化合物與某有機(jī)酸或無機(jī)酸組合而成的鹽。實(shí)際上，使用鹽形式即使用堿形式。本發(fā)明化合物的游離堿形式和鹽形式都可用，兩種形式都被認(rèn)為包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
“Arg-al”指結(jié)構(gòu)式如下的L-精氨醛殘基 “Arg-ol”指結(jié)構(gòu)式如下的L-精氨醇?xì)埢?“鹽酸(S)-Ng-硝基精氨醇”指結(jié)構(gòu)式如下的化合物 “N-α-叔丁氧基羰基-Ng-硝基-L-精氨酸”指結(jié)構(gòu)式如下的化合物
“高Ala(環(huán))-Gly”指結(jié)構(gòu)式如下的(S)-3-氨基-2-氧代-1-吡咯烷乙酸殘基 “正Val(環(huán))-Gly”指結(jié)構(gòu)式如下的(S)-3-氨基-2-氧代-1-哌啶乙酸殘基 “正Leu(環(huán))-Gly”指結(jié)構(gòu)式如下的(R)-或(S)-3-氨基-2-氧代-六氫-1-氮雜乙酸殘基 此外，以下縮寫的意義分別為“Boc”指叔丁氧基羰基。
“BzlSO2”指芐基磺?；?。
“Cbz”指芐氧基羰基。
“DCC”指N，N′-二環(huán)己基碳化二亞胺。
“EDC”指1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽。
“HBTU”指2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓(uronium)六氟磷酸鹽。
“HCl”指鹽酸。
“HPLC”指高壓液相色譜。
“HOBt”指一水合1-羥基苯并三唑。
“i-Pr”指異丙基。
“LiAlH4”指氫化鋰鋁。
“LiAlH2(OEt)2”指二乙氧基二氫化鋰鋁。
“Me”指甲基。
“Oet”指乙氧基。
“THF”指四氫呋喃。
“TLC”指薄層色譜。


圖1是制備用于合成本發(fā)明化合物的一中間體的反應(yīng)圖解。圖中，“i”到“iv”是i)氫氣，10％鈀碳；ii)二羥乙酸；iii)氫氣，10％鈀碳；iv)50-60℃，N，N-二甲基甲酰胺。
圖2是制備用于合成本發(fā)明化合物的一中間體的反應(yīng)圖解。圖中，“i”到“iii”是i)HOBt，DCC和三乙胺；ii)甲基碘；iii)依次為氫化鈉、乙酸乙酯和水。
圖3是合成本發(fā)明某些化合物的一較好的反應(yīng)圖解。圖中，“i”到“v”是i)HOBt，EDC和4-甲基嗎啉；ii)1N溶于乙酸乙酯的HCl；iii)碳酸鉀，R1-SO2Cl，其中的R1如本文所定義；iv)氫氣，10％鈀碳；v)二甲基亞砜，甲苯，二氯乙酸和EDC。
圖4是合成本發(fā)明某些化合物的一較好的反應(yīng)圖解。圖中，“i”到“vi”是i)HCl飽和的甲醇；ii)三乙胺，R-SO2Cl，其中的R是烷基、芳基或芳烷基；iii)1.0M的氫氧化鋰；iv)HOBt，N，N-二異丙基乙基胺，EDC；v)氫氣，10％鈀碳；vi)3N的HCl。
圖5表示的是利用活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)測定法在加檸檬酸鹽的大鼠(●)和人(m)血漿中測定的BzlSO2-正Val(環(huán))-Gly-Arg-al的抗凝血作用。鼠和人血漿的對照凝固時(shí)間(0抑制劑)分別是20秒和28秒。在大鼠和人血漿中使對照凝固時(shí)間增加一倍的BzlSO2-正Val(環(huán))-Gly-Arg-al濃度分別是22.1μM和12.8μM。其中的數(shù)據(jù)是兩次獨(dú)立測定的平均值。
圖6是制備本發(fā)明化合物的一個(gè)較好的反應(yīng)圖解。圖中，i)-x)是i)在四氫呋喃和水中的二碳酸二叔丁酯，碳酸氫鈉；ii)雙(三甲基甲硅烷基)胺基鋰和四氫呋喃；iii)溴乙酸芐酯；iv)氯化銨；v)HCl和乙酸乙酯；vi)三乙胺，乙腈和R1-SO2-Cl，其中的R1定義同上；vii)氫、鈀碳和乙醇；viii)乙腈，Ng-硝基-L-精氨醛乙基環(huán)醇鹽酸鹽，一水合1-羥基苯并三唑，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽和N，N-二異丙基乙基胺；ix)氫氣，鈀碳，乙醇，乙酸和水；x)3N的HCl和HPLC純化。
圖7表示利用活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)測定法在加檸檬酸鹽的人血漿中[實(shí)心圓(●)]測定的N-(BnSO2-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛的抗凝血作用。人血漿的對照凝固時(shí)間(O抑制劑)為29秒。在人血漿中使對照凝固時(shí)間增加一倍的N-(BnSO2-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛濃度是4.5μM。其中的數(shù)據(jù)是兩次獨(dú)立測定的平均值。
圖8是一制備本發(fā)明某些化合物的較好的反應(yīng)圖解。圖中，i)-v)是i)氫氣和鈀碳；ii)Ng-硝基-L-精氨醛乙基環(huán)醇鹽酸鹽，一水合1-羥基苯并三唑，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽和N，N-二異丙基胺；iii)氫氣和乙醇中的鈀碳，乙酸和水；iv)3N的HCl；v)HPLC純化，以三氟乙酸在乙腈和水中的0.1％溶液洗脫。
圖9是制備本發(fā)明某些化合物的較好的反應(yīng)圖解。圖中，i)-vii)是i)氫化鈉；ii)甲基碘；iii)氫氣和鈀碳；iv)Ng-硝基-L-精氨醛乙基環(huán)醇鹽酸鹽，一水合1-羥基苯并三唑，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽和N，N-二異丙基胺；v)氫氣和乙醇中的鈀碳，乙酸和水；vi)3N的HCl；vii)HPLC純化，以三氟乙酸在乙腈和水中的0.1％溶液洗脫。
圖10是實(shí)施例46至55所述，制備化合物30的較好的反應(yīng)圖解。圖中，各步驟為由(20)合成(21)中1.H2，Pd/C，35PSI，MeOH，H2O，HOAc，2.5小時(shí)；2.OHCCO2H，室溫，20小時(shí)；3.H2，Pd/C，40PSI，37小時(shí)；4.DMF，50-60℃，2.5小時(shí)；5.提取，總得率67％。由(21)合成(23)中1.EtOH，HCl，0℃至室溫，定量得率的(22)；2.PhCHO，Et3N，MgSO4，CH2Cl2，0℃至室溫，(23)的得率為89％。由(23)合成(24)中KOtBu，THF，BnBr，于室溫左右，得率89％。由(24)合成(26)1.1N的HCl，室溫下2-4小時(shí)；2.EtOH，HCl，0℃至室溫，(25)的得率為96％；3.Boc2O，NaHCO3，THF，H2O，(26)得率77％。由(26)合成(27)1.LiOH，EtOH，H2O，0℃至室溫；2.Dowex H+，(27)得率98％。由(27)合成(29)1.H-Arg(NO2)OEt胺醛，EDC，HOBt，DIPEA，CH3CN，(28)得率67％；2.H2，Pd/C，60PSI，(29)得率為定量。由(29)合成(30)1.3N的HCl，室溫，3小時(shí)；2.HPLC，(30)得率12％。
圖11是實(shí)施例56至64所述，制備化合物(39)較好的反應(yīng)圖解。圖中，各步驟如下合成(32)1.PhCHO，苯，回流，脫H2O，(31)得率為定量得率；2.LiN(TMS)2，THF，室溫，2小時(shí)；3.BnBr，0℃至室溫，22小時(shí)，重結(jié)晶得48％。由(32)合成(34)1.1N的HCl，室溫，5小時(shí)，得(33)；2.Cbz-OSu，NaHCO3，THF，H2O，0℃至室溫，14小時(shí)，總得率79％。由(34)合成(35)1.LiN(TMS)2，THF，室溫，30分鐘；2.BrCH2CO2t-Bu，室溫，20小時(shí)；3.NH4Cl，H2O，(35)得率60％。由(35)合成(38)1.TFA，CH2Cl2，0℃至室溫，得率80％；2.HCl-Arg(NO2)OEt胺醛，EDC，HOBT，DIPEA，室溫，CH3CN，18小時(shí)，(37)得率73％；3.H2，Pd/C，55PSI，EtOH，HOAc，H2O，(38)得率99％。由(38)合成(39)1.3N的HCl，室溫，3小時(shí)；2.HPLC，(39)得率36％。
圖12是實(shí)施例65至72所述，制備化合物(47)的較好的反應(yīng)圖解。圖中，各步驟如下由(21)合成(41)1.BnBr，K2CO3，DMF，CH3CN，回流，得率96％；2.5N的HCl，EtOAc，室溫，3小時(shí)，(41)得率為定量。由(41)合成(42)PhCH2CHO，Na(OAc)3BH，三乙胺，DCE，室溫，(42)得率66％。由(42)合成(44)1.Boc2O，NaHCO3，THF，H2O，室溫，1.5小時(shí)，(43)得率70％；2.H2，Pd/C，MeOH，45PSI，2小時(shí)，(44)得率98％。由(44)合成(45)H-Arg(NO2)OEt胺醛，EDC，HOBt，DIPEA，CH3CN，室溫，20小時(shí)，(45)得率99％。由(45)合成(47)1.H2，Pd/C，EtOH，HOAc，H2O，45PSI，得(46)；2.3N的HCl，室溫，3小時(shí)；3.HPLC得(47)。
圖13是實(shí)施例73至80所述，制備化合物(56)的較好的反應(yīng)圖解。圖中，各步驟如下由(48)合成(50)1.LiN(TMS)2，THF，室溫；2.BrCH2CO2Et，室溫，18小時(shí)，(49)得率83％；3.HCl，EtOH，0℃至室溫，(50)得率96％。由(50)合成(51)PhCH2CHO，Na(OAc)3BH，Et3N，室溫，(51)得率69％。由(51)合成(53)1.Boc2O，NaHCO3，THF，H2O，(52)得率84％；2.LiOH，EtOH，H2O，0℃至室溫；3.Dowex H+，(53)得率94％。由(53)合成(54)H-Arg(NO2)OEt胺醛，EDC，HOBt，DIPEA，CH3CN，室溫，18小時(shí)，(54)得率71％。由(54)合成(56)1.H2，Pd/C，EtOH，HOAc，H2O，50PSI，(55)得率為定量；2.3N的HCl，室溫，3小時(shí)；3.HPLC，(56)得率77％。
詳細(xì)說明1.優(yōu)選化合物本發(fā)明化合物具有以下結(jié)構(gòu)式 其中(a)X選自-S(O)2-、-N(R′)-S(O)2-、-C(＝O)-、-OC(＝O)-、-NH-C(＝O)-、-P(O)(R″)-和直接連接鍵，其中的R′是氫原子、1至約4個(gè)碳原子的烷基、約6至14個(gè)碳原子的芳基或約6至16個(gè)碳原子的芳烷基，R″是NR′、OR′、R′、或SR′，條件是R“不是NH、OH、H或SH；(b)R1選自(1)1至約12個(gè)碳原子的烷基，(2)經(jīng)約5至8個(gè)碳原子的環(huán)烷基取代的l至約3個(gè)碳原子的烷基，環(huán)碳原子可以可選性地被羥基、氨基、胍基、脒基或1至約3個(gè)碳原子的烷氧基或烷基所取代，(3)3至約15個(gè)碳原子的環(huán)烷基，環(huán)碳原子可以可選性地被羥基、氨基、胍基、脒基或1至約3個(gè)碳原子的烷氧基或烷基所取代，(4)4至約10個(gè)環(huán)原子的雜環(huán)烷基，環(huán)原子選自碳原子和雜原子，其中的雜原子選自氧、氮和S(O)i，其中的i是0、1或2，環(huán)碳原子可以可選性地被羥基、1至約3個(gè)碳原子的烷氧基或烷基、氨基、胍基或脒基取代，(5)4至約10個(gè)環(huán)原子的雜環(huán)基，環(huán)原子選自碳原子和雜原子，其中的雜原子選自氧、氮和S(O)i，其中的i是0、1或2，環(huán)碳原子可以可選性地被羥基、1至約3個(gè)碳原子的烷氧基或烷基、氨基、胍基或脒基取代，(6)可以經(jīng)約5至8個(gè)碳原子的環(huán)烷基取代的約3至6個(gè)碳原子的鏈烯基，環(huán)碳原子可以被羥基、氨基、胍基、脒基或1至約3個(gè)碳原子的烷氧基或烷基取代，(7)約6至約14個(gè)碳原子的芳基，可以分別被Y1、Y2和/或Y3單取代、二取代或三取代，(8)5至14個(gè)原子的雜芳基，環(huán)原子選自碳原子和雜原子，其中的雜原子選自氧、氮和S(O)i，其中的i是0、1或2，可以分別被Y1、Y2和/或Y3單取代、二取代或三取代，(9)芳環(huán)可以分別被Y1、Y2和/或Y3單取代、二取代或三取代的約7至15個(gè)碳原子的芳烷基，(10)6至11個(gè)原子的雜芳烷基，環(huán)原子為碳原子和雜原子，其中的雜原子選自氧、氮和S(O)i，其中的i是0、1或2，可以分別被Y1、Y2和/或Y3單取代、二取代或三取代，(11)芳環(huán)可以分別被Y1、Y2和/或Y3單取代、二取代或三取代的約8至15個(gè)碳原子的芳鏈烯基，(12)7至12個(gè)原子的雜芳鏈烯基，環(huán)原子為碳原子和雜原子，其中的雜原子選自氧、氮、和S(O)i，其中的i是0、1或2，可以分別被Y1、Y2和/或Y3單取代、二取代或三取代， (17)1至約12個(gè)碳原子的全氟烷基，(18)約6至約14個(gè)碳原子的全氟芳基，(19)約7至15個(gè)碳原子的全氟芳烷基，(20)氫原子，和(21) 其中 是具有3至6個(gè)環(huán)碳原子的5至7元的雜環(huán)，其中的V是-CH2-、-O-、-S(＝O)-、-S(O)2-或-S-，其中的Y1、Y2和Y3是(i)各自選自氫原子、鹵原子、氰基、四唑基、氨基、胍基、脒基、甲基氨基和甲基胍基，-CF3、-CF2H、-CF2CF3、-CH(CF3)2，-C(OH)(CF3)2、-OCF3、-OCF2CF3、-OC(O)NH2、-OC(O)NHZ1、-OC(O)NZ1Z2、-NHC(O)Z1、-NHC(O)NH2、-NHC(O)NHZ1、-NHC(O)NZ1Z2、-C(O)OH、-C(O)NH2、-C(O)NHZ1、-C(O)OZ1、-P(O)3H、-P(O)3H2、-P(O)3(Z1)2、-S(O)3H、-S(O)mZ1、-Z1、-OZ1、-OH、-NH2、-NHZ1和-NZ1Z2，其中m是0、1或2，Z1和Z2各自選自1至約12個(gè)碳原子的烷基、約6至14個(gè)碳原子的芳基、其中有1至約9個(gè)碳原子的約5至14個(gè)原子的雜芳基、約7至15個(gè)碳原子的芳烷基和約6至11個(gè)原子的雜芳烷基(其中有約3至9個(gè)碳原子)，或(ii)Y1和Y2同為-OC(Z3)(Z4)O-，其中Z3和Z4各自選自氫原子、1至約12個(gè)碳原子的烷基、約6至14個(gè)碳原子的芳基、具有1至約9個(gè)碳原子的約5至約14個(gè)原子的雜芳基、約7至15個(gè)碳原子的芳烷基、約6至約11個(gè)原子的雜芳烷基(其中有約3至9個(gè)碳原子)，(c)Q是-(CH2)n-(其中n是整數(shù)1至4)，或-(CH2)qR4-，其中q是1或2，R4是-S(O)p-、-O-、-N(R5)-，其中p是0、1或2，R5選自氫原子、1至4個(gè)碳原子的烷基和1至4個(gè)碳原子的酰基；(d)R2選自氫原子、1至4個(gè)碳原子的烷基或2至4個(gè)碳原子的鏈烯基；和(e)Y選自R1取代基，條件是Y不是 以及它們的藥學(xué)上認(rèn)可的鹽。
較好的X基團(tuán)有直接連接鍵，-SO2-，-NH-S(O)2-，和-N(R′)-S(O)2-。特別好的X基團(tuán)是直接連接鍵和-SO2-。
較好的R1基團(tuán)是烷基、芳烷基和芳基。合適的芳基包括取代或未取代的苯基和萘基。較好的芳環(huán)取代基是-C(O)OH，-C(O)OZ1，-CH3，-OCH3和-CF。以間位和/或鄰位的取代為佳。特別好的R1基團(tuán)是芳烷基。具體的較好的R1基團(tuán)包括取代或未取代的芐基。環(huán)己基和環(huán)己基甲基是尤其好的R1基團(tuán)。
較好的化合物中Q是-(CH2)2-或-(CH2)3-。較好的R2基團(tuán)包括氫原子。
較好的Y基團(tuán)選自(1)氫原子，(2)苯基-(CH2)i-，其中的i是整數(shù)O至3，苯基可以如前所述分別被Y1，Y2和/或Y3單取代、二取代或三取代，(3)雜芳基-(CH2)i-，其中的i是整數(shù)0至3，雜芳基可以如前所述分別被Y1，Y2和/或Y3單取代、二取代或三取代，(4)雜環(huán)烷基-(CH2)i-，其中的i是整數(shù)0至3，雜環(huán)烷基可以被羥基、1至約3個(gè)碳原子的烷氧基或烷基取代，(5)C5至C8環(huán)烯基，可以被如下所述的Z5，Z6和/或Z7取代，(6)C5至C8環(huán)烷基，可以分別被Z5，Z6和/或Z7單取代、二取代或三取代，其中Z5，Z6和/或Z7各自選自-R6，OR6，和-CO2R6，其中的R6選自氫原子、甲基或1-3個(gè)碳原子的烷基，(7)-(CH2)b-Z5，其中的b是整數(shù)0至6，Z5如上定義。
更好的Y基有芳烷基和環(huán)烷基。特別好的是經(jīng)取代或未取代的芐基和1-萘基甲基。較好的芳環(huán)取代基有-C(O)OH，-C(O)OZ1，-CH3，-OCH3和-CF3。以間位和/或鄰位的取代為佳。較好的環(huán)烷基具有5-8個(gè)環(huán)碳原子。較好的環(huán)烷基取代基有-C(O)OH，-C(O)OZ1，-CH3，-OCH3。
一類特別好的結(jié)構(gòu)式I化合物中，X是-S(O)2-，R1是取代或未取代的芳烷基，Q是-(CH2)2-，R2是氫原子。一類很好的化合物中R1是取代或未取代的芐基。
另一類特別好的化合物中，X是-S(O)2-，R1是取代或未取代的芳烷基，Q是-(CH2)3-，R2是氫原子。一類很好的化合物中R1是取代或未取代的芐基。
實(shí)施例8(和18)，26，34，36(a)至36(y)，40(b)，55，64，72(a)至72(b)，80和82(a)至28(f)中描述了本發(fā)明優(yōu)選化合物的合成方法。
尤其好的本發(fā)明化合物有N-芐基磺酰-正Val(環(huán))-Gly-L-精氨醛(實(shí)施例8，18)，N-(正Val(環(huán))-Gly)-L-精氨醛(實(shí)施例40(b))，D，L-α-芐基-正Val(環(huán))-Gly-L-精氨醛(實(shí)施例55)，D，L-α-芐基-正Leu(環(huán))-Gly-L-精氨醛(實(shí)施例64)，N-(1-萘基-SO2-正Val(環(huán))-Gly-L-精氨醛(實(shí)施例82a)，N-(BnSO2-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛(實(shí)施例34)，N-(2-甲氧羰基芐基-SO2-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛(實(shí)施例36(e))，N-(2-三氟甲基芐基-SO2-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛(實(shí)施例36(g))，N-(環(huán)己基甲基-SO2-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛(實(shí)施例36(i))，N-(2-噻吩甲基-SO2-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛(實(shí)施例36(k))，N-(苯基氨基-SO2-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛(實(shí)施例36(n))，N-(3-甲氧羰基芐基-SO2-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛(實(shí)施例36(o))，N-(3-三氟甲基芐基-SO2-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛(實(shí)施例36(p))，N-(2-甲基芐基-SO2-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛(實(shí)施例36(q))，N-(3-甲基芐基-SO2-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛(實(shí)施例36(r))，N-(3-甲氧基芐基-SO2-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛(實(shí)施例36(t))，N-(2-氯芐基-SO2-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛(實(shí)施例36(u))，N-(2-甲基-5-氟芐基-SO2-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛(實(shí)施例36(w))，N-(2-甲基-5-甲氧基芐基-SO2-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛(實(shí)施例36(x))，N-〔(S)-3-N-苯基乙基氨基-2-氧代-1-哌啶乙酰〕-L-精氨醛(實(shí)施例72a)，N-〔(S)-3-N-苯基丙基氨基-2-氧代-1-哌啶乙?！?L-精氨醛(實(shí)施例72b)，N-〔(S)-3-N-苯基乙基氨基-六氫-2-氧代-氮雜-1-乙酰〕-L-精氨醛(實(shí)施例80)。
另一方面，本發(fā)明涉及結(jié)構(gòu)式I化合物的鹽?！胞}”根據(jù)其定義包括由本發(fā)明的化合物與某有機(jī)酸或無機(jī)酸組合而成的本發(fā)明化合物的鹽。實(shí)際上，使用鹽形式即使用堿形式。本發(fā)明化合物既可以以游離堿的形式使用也可以以鹽形式使用，兩種形式都被認(rèn)為包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。這些鹽包括酸加成鹽，例如三氟乙酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、乙酸鹽、苯磺酸鹽以及其它合適的酸加成鹽。
結(jié)構(gòu)式I中，帶有R2和Y基團(tuán)的碳原子能夠形成立體異構(gòu)體。本發(fā)明將兩類立體異構(gòu)體都考慮在內(nèi)。2.優(yōu)選化合物的制備某些特定的本發(fā)明的中間體被用于制備本發(fā)明的化合物。例如，實(shí)施例1的(S)-3-〔(叔丁氧基羰基)氨基〕-2-氧代-1-哌啶乙酸，實(shí)施例21的(S)-3-〔(叔丁氧基羰基)氨基〕-2-氧代-1-吡咯烷乙酸，和實(shí)施例28的(S)-3-〔(叔丁氧基羰基)氨基〕-2-氧代-1-六氫氮雜乙酸芐酯。
圖1例舉了制備用于制備本發(fā)明化合物的優(yōu)選中間體3的優(yōu)選反應(yīng)圖解。實(shí)施例提供了此圖解的具體細(xì)節(jié)。
如圖1所示，N-α-Boc-N-δ-芐氧基羰基-L-鳥氨酸1經(jīng)氫氣和鈀碳加氫生成2，然后2與二羥乙酸反應(yīng)，用氫氣和鈀碳加氫，并加熱至高溫，生成3。
圖2例舉了制備用于制備本發(fā)明化合物的優(yōu)選中間體2-5的優(yōu)選反應(yīng)圖解。實(shí)施例19至21提供了該圖解的細(xì)節(jié)。
如圖2所示，利用碳化二亞胺和HOBt將N-α-Boc-L-甲硫氨酸2-1與鹽酸甘氨酸甲酯2-2偶聯(lián)成2-3。利用甲基碘烷基化2-3甲硫氨酸側(cè)鏈上的硫原子，生成2-4。最后，2-4與氫化鈉反應(yīng)而環(huán)化成2-5。
可以利用圖3和圖4中的優(yōu)選反應(yīng)圖解來制備本發(fā)明的化合物。實(shí)施例2至8提供了圖3的細(xì)節(jié)，實(shí)施例9至18提供了圖4的細(xì)節(jié)。
在兩張圖解中，中間體，包括圖1和圖2中的2-3和2-5，分別與精氨醛基團(tuán)偶聯(lián)，最終生成本發(fā)明化合物。
例如，如圖3所示，3-3利用碳化二亞胺與鹽酸(S)-Ng-硝基精氨醇3-4(如實(shí)施例2至3所述，由(S)-N-α-Boc-Ng-硝基精氨酸制得)偶聯(lián)，生成3-5。3-5與氯化氫反應(yīng)，去除Boc基團(tuán)，得鹽酸鹽3-6，然后3-6與磺酰氯(R1-S(O)2-Cl)反應(yīng)得3-7。R1定義見文中。3-7經(jīng)氫氣和鈀碳加氫脫去Ng-硝基基團(tuán)，然后用二甲基亞砜、二氯乙酸、甲苯和EDC氧化羥基，得3-8。
或者，如圖4所示，3-3在醇中與飽和的HCl反應(yīng)脫去其Boc基團(tuán)并將其羧基轉(zhuǎn)化為酯，然后其游離的氨基與磺酰氯(Ri-S(O)2-Cl)反應(yīng)得4-9。R1定義見前文。4-9堿水解生成具有一游離羧基的4-10。利用碳化二亞胺將4-10與4-11(制備見實(shí)施例12至15)偶聯(lián)得4-12。4-12經(jīng)氫氣和鈀碳加氫得4-13。4-13在酸水溶液中水解也得到3-8。
優(yōu)選的化學(xué)偶聯(lián)方法(例如，圖3中的2-3至3-5偶聯(lián)或圖4中的4-10至4-12偶聯(lián))即本領(lǐng)域已知的利用常規(guī)偶聯(lián)劑形成肽鍵。參見Bodanszky，N.，Peptide Chemistry，pp.55-73，Springer-Verlag，New York(1988)和在此引用的參考文獻(xiàn)?；瘜W(xué)偶聯(lián)可以是一步偶聯(lián)也可以是兩步偶聯(lián)。在一步偶聯(lián)中，兩部分直接偶聯(lián)。用于一步偶聯(lián)的較好的偶聯(lián)劑有DCC和HOBt，EDC和HOBt，HBTU或TBTU。在兩步偶聯(lián)中，在與偶聯(lián)的另一方偶聯(lián)之前，先由偶聯(lián)一方的C末端羧基形成被活化的酯或酸酐。
還可以由圖6中的優(yōu)選反應(yīng)圖解來制備本發(fā)明的化合物。實(shí)施例12至15和27至34提供了此優(yōu)選圖解的細(xì)節(jié)。
如圖6所示，D-(α)-或L-(-)-α-氨基-ε-己內(nèi)酰胺6-1通過與二碳酸二叔丁酯和碳酸氫鈉在THF和水中反應(yīng)，保護(hù)其中的胺，生成6-2，6-2然后在THF中與雙(三甲基甲硅烷基)胺基鋰反應(yīng)，接著再與溴乙酸芐酯反應(yīng)。此反應(yīng)以飽和氯化銨溶液終止，得6-3。
6-3在乙酸乙酯中與5N的HCl反應(yīng)脫去其Boc保護(hù)基，得鹽酸鹽6-4，6-4然后在乙腈中與三乙胺和R1SO2Cl反應(yīng)，得磺酰胺6-5。然后，6-5在Parr振蕩器中經(jīng)氫氣和鈀碳加氫得6-6。6-6用碳化二亞胺與Ng-硝基-L-精氨醛乙基環(huán)醇鹽酸鹽(制備見實(shí)施例12至15)偶聯(lián)得6-7。
然后在乙醇、水和乙酸中經(jīng)氫氣和鈀碳加氫脫去6-7的Ng-硝基得6-8。然后，6-8與3N的HCl反應(yīng)得6-9。
圖8和圖9是合成本發(fā)明化合物的一優(yōu)選反應(yīng)圖解，其中的X是一直接連接鍵，由此在結(jié)構(gòu)式II中R1與氮原子直接連接。如圖8所示，(S)-3-〔(叔丁氧基羰基)氨基〕-2-氧代-六氫-1-氮雜乙酸芐酯6-3通過在Parr振蕩器中于40PSI反應(yīng)而去保護(hù)得酸8-10。利用一水合1-羥基苯并三唑，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽，然后是N，N-二異丙基胺將8-10與Ng-硝基-L-精氨醛乙基環(huán)醇偶聯(lián)，得8-11。用氫氣和鈀碳在乙醇、水和乙酸中在50PSI脫去8-11的Ng-硝基。此反應(yīng)生成乙酸鹽8-12。8-12的乙基環(huán)醇基經(jīng)3N的HCl水解，再用0.1％三氟乙酸的乙腈和水的溶液經(jīng)HPLC純化得8-13。圖9的區(qū)別在于(S)-3-〔(叔丁氧基羰基)氨基〕-2-氧代-六氫-1-氮雜乙酸芐酯首先與氫化鈉再與甲基碘反應(yīng)生成烷基化Boc保護(hù)的胺14。14再經(jīng)去保護(hù)得15，15再與圖8中的酸8-10一樣進(jìn)行相同的反應(yīng)。圖9中的方法說明的是制備X直接與R1成鍵，R1不是氫原子的化合物的方法。
圖10是一個(gè)優(yōu)選化合物的合成方法。中間體20經(jīng)催化加氫，與二羥乙酸縮合，催化再加氫，形成的中間體再在溫?zé)岬亩谆柞０分袩崦撍?，得?nèi)酰胺21。21與干燥氯化氫在乙醇中反應(yīng)，除去Boc保護(hù)基團(tuán)的同時(shí)羧基酯化，生成氨基酯鹽酸鹽22。在三乙胺之類的堿存在下，使用硫酸鎂之類的脫水劑，22與苯甲醛縮合得亞胺衍生物23。用選擇性堿，例如叔丁醇鉀、N，N-二異丙基胺基鋰或雙(三甲基甲硅烷基)胺基鋰使中間體23去質(zhì)子化，再與芐基溴反應(yīng)得烷基化化合物24。24在環(huán)境溫度下用稀鹽酸水解2至4小時(shí)，并用無水乙醇和干燥氯化氫部分酯化，得25。在THF中，在飽和碳酸氫鈉存在下用二碳酸二叔丁酯重新保護(hù)25的游離氨基，得26。在醇的水溶液中，用強(qiáng)堿，例如氫氧化鋰、氫氧化鈉或氫氧化鉀水解26，再用強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂，例如Dowex(注冊商標(biāo))50WX8-400質(zhì)子化，得N-Boc-保護(hù)的內(nèi)酰胺羧酸中間體27。在乙腈之類的惰性溶劑中，在環(huán)境溫度下，利用EDC、HOBt和N，N-二異丙基乙基胺進(jìn)行27與Ng-硝基-精氨醛乙基環(huán)醇的標(biāo)準(zhǔn)肽偶聯(lián)，得28。在乙醇、乙酸和水中，利用鈀碳催化劑對28催化加氫，得乙酸鹽前體29。最后，在環(huán)境溫度下用稀鹽酸水解，再經(jīng)HPLC純化得新的目標(biāo)化合物30。
圖11顯示一個(gè)優(yōu)選化合物的合成方法，它是化合物30的7元環(huán)類似物。α-氨基-ε-己內(nèi)酰胺在共沸回流的苯溶液中與苯甲醛縮合得亞胺31。用選擇性堿，例如叔丁醇鉀、N，N-二異丙基胺基鋰或雙(三甲基甲硅烷基)胺基鋰將31去質(zhì)子化，然后與芐基溴反應(yīng)得烷基化化合物32。在環(huán)境溫度下用稀鹽酸水解32得胺鹽酸鹽33。33在THF水溶液中與N-(芐基氧羰基氧)-琥珀酰亞胺和碳酸氫鈉反應(yīng)以保護(hù)氨基，得N-Cbz-內(nèi)酰胺中間體34。使用有位阻的堿，例如雙-(三甲基甲硅烷基)胺基鋰，并加入溴乙酸叔丁酯，對34選擇性地去質(zhì)子化20小時(shí)，然后用氯化銨終止反應(yīng)，得產(chǎn)物35。在0℃至室溫，在二氯甲烷中，用三氟乙酸切除35中的叔丁酯部分，得羧酸衍生物36。在乙腈之類的惰性溶劑中，在環(huán)境溫度下，利用EDC、HOBt和N，N-二異丙基乙基胺進(jìn)行36與Ng-硝基-精氨醛乙基環(huán)醇的標(biāo)準(zhǔn)肽偶聯(lián)，得37。在乙醇、乙酸和水中，利用鈀碳催化劑對37催化加氫，得乙酸鹽前體38。最后，在環(huán)境溫度下，用稀鹽酸水解38，再經(jīng)HPLC純化得新的目標(biāo)化合物39。
圖12顯示了結(jié)構(gòu)式I為基礎(chǔ)的另一種結(jié)構(gòu)的實(shí)例的合成方法?；衔?1，制備見前文，在回流乙腈中與無水碳酸鉀和芐基溴反應(yīng)而酯化得40。在乙酸乙酯中與無水氯化氫反應(yīng)，選擇性地切除40的Boc保護(hù)基，得鹽酸胺41。在惰性溶劑，如1，2-二氯乙烷中，用三乙酰氧基硼氫化鈉和三乙胺進(jìn)行鹽41和苯基乙醛的還原胺化反應(yīng)生成胺衍生物42。在THF中，在飽和碳酸氫鈉存在下，與二碳酸二叔丁酯反應(yīng)以保護(hù)42的氨基，得43。利用鈀碳對43催化加氫得羧酸44。在乙腈之類的惰性溶劑中，在環(huán)境溫度下，利用EDC、HOBt和N，N-二異丙基乙基胺進(jìn)行44與Ng-硝基-精氨醛乙基環(huán)醇的標(biāo)準(zhǔn)肽偶聯(lián)，得45。在乙醇、乙酸和水中，利用鈀碳催化劑對45催化加氫，得乙酸鹽前體46。最后，在環(huán)境溫度下，用稀鹽酸水解46，再經(jīng)HPLC純化得新的目標(biāo)化合物47。
圖13描繪一個(gè)優(yōu)選化合物的合成方法，它是目標(biāo)化合物47的7元環(huán)類似物?；衔?8，制備見前文(相當(dāng)于圖6中的6-2)，與有位阻的堿，例如雙-(三甲基甲硅烷基)胺基鋰反應(yīng)，并用溴乙酸乙酯烷化得49。在乙醇中用氯化氫切除49的Boc基團(tuán)，得胺鹽酸鹽衍生物50。在惰性溶劑，如1，2-二氯乙烷中，用三乙酰氧基硼氫化鈉和三乙胺進(jìn)行的50和苯基乙醛的還原胺化反應(yīng)生成胺衍生物51。在THF中，在飽和碳酸氫鈉存在下，與二碳酸二叔丁酯反應(yīng)保護(hù)51中的氨基，得52。在醇水溶液中，用強(qiáng)堿，例如氫氧化鋰、氫氧化鈉或氫氧化鉀水解52，再用強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂，例如Dowex(注冊商標(biāo))50WX8-400質(zhì)子化，得N-Boc-保護(hù)的內(nèi)酰胺羧酸中間體53。在乙腈之類的惰性溶劑中，在環(huán)境溫度下，利用EDC、HOBt和N，N-二異丙基乙基胺進(jìn)行53與Ng-硝基-精氨醛乙基環(huán)醇的標(biāo)準(zhǔn)肽偶聯(lián)，得54。在乙醇、乙酸和水中，利用鈀碳催化劑對54催化加氫，得乙酸鹽前體55。最后，在環(huán)境溫度下，用稀鹽酸水解55，再經(jīng)HPLC純化得新的目標(biāo)化合物56。
對于本發(fā)明中具有被鹵原子，氰基、硝基或-S-Z1取代的鏈烯基、雜環(huán)基或芳基的化合物，最好避免使用氫氣和鈀碳。取而代之的是，最好使用三(三氟乙酸)硼(B(OCOCF3)3)來切除精氨酸基團(tuán)中的Ng-硝基。此試劑由BBr3和CF3COOH在二氯甲烷中在0℃反應(yīng)制備。此試劑也可購置。通常，Ng-硝基化合物與三(三氟乙酸)硼在0℃，在三氟乙酸中反應(yīng)。Fieser，M.和Fieser，L.F.，Reagents for Organic Synthesis，p.46，John Wiley & Sons，New York(1974)；Pless，J.，和Bauer，W.Angew.Chem.，Internat.Ed.，12，147(1973)。
此外，選擇性切除硝基的另一種較好的試劑是三氯化鈦。此試劑是可購置的。Ng-硝基化合物與三氯化鈦在含乙酸銨緩沖液的甲醇水溶液中反應(yīng)，再令此反應(yīng)混合物與空氣或二甲基亞砜接觸。Freidinger，R.M.，Hirschmann，R.，和Veber，D.F.，J.Org.Chem.，43，4800(1978)。
更好的方法是，L-精氨醛使用二-N-叔丁氧基羰基保護(hù)基保護(hù)不適應(yīng)用鈀碳進(jìn)行加氫的基團(tuán)。例如，α-N-芐氧基羰基-ω，ω′-二-N-叔丁氧基羰基精氨酸溶于乙腈，與羥基苯并三唑和1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽反應(yīng)生成α-N-芐氧基羰基-ω，ω′-二-N-叔丁氧基羰基-L-精氨酸內(nèi)酰胺。此內(nèi)酰胺在-70℃，在THF中，被LiAlH4還原成α-N-芐氧基羰基-ω，ω′-二-N-叔丁氧基羰基-L-精氨醛。此醛與乙醇和HCl反應(yīng)，被以醛縮二乙醇的形式保護(hù)。用氫氣和鈀碳去除N-芐氧基羰基保護(hù)基，得ω，ω′-二-N-叔丁氧基羰基-L-精氨醛縮二乙醇HCl鹽。然后可通過與N-羥基苯并三唑和1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳化二亞胺HCl鹽反應(yīng)將保護(hù)后的L-精氨醛部分與要求的羧酸偶聯(lián)。在0℃，在乙腈中與六氟磷酸反應(yīng)，脫去醛縮二乙醇和二Boc保護(hù)基。加2.5M乙酸鈉水溶液，直至pH4，終止此反應(yīng)。將混合物濾過2微米的濾膜。以10-40％乙腈水溶液-0.1％CF3COOH經(jīng)制備HPLC，得按要求取代的L-精氨醛化合物的三氟乙酸鹽。3.優(yōu)選混合物的篩選如下文所述，本發(fā)明的化合物就其抑制凝血酶、血纖維蛋白溶酶、重組組織血纖維蛋白溶酶原活化劑(rt-PA)、活性蛋白C(aPC)、胰凝乳蛋白酶、fXa和胰蛋白酶的能力進(jìn)行篩選。某些優(yōu)選化合物的特殊之處在于它們能夠抑制凝血酶，而基本上不抑制血纖維蛋白溶酶、t-PA、aPC、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶。對凝血酶及這里所用的其他酶，本文中“基本上不抑制”指給定化合物對血纖維蛋白溶酶、t-PA、aPC、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的IC50(或Ki)大于或等于它對凝血酶的IC50(或Ki)。
將本發(fā)明化合物溶解在緩沖液中，形成0至100μM的試驗(yàn)濃度。在凝血酶、血纖維蛋白溶酶、t-PA、aPC、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的試驗(yàn)中，在含有待測化合物的溶液中加入生色合成底物，利用分光光度法測定靶酶及其殘留催化活性。由被測的特異性酶引起的底物轉(zhuǎn)化率測定本發(fā)明化合物的IC50。IC50是被測化合物對底物轉(zhuǎn)化率產(chǎn)生50％抑制作用的濃度。同樣，由不同酶濃度時(shí)被測特異性酶引起的底物轉(zhuǎn)化率測定本發(fā)明化合物的Ki。Ki是被測化合物對底物轉(zhuǎn)化率產(chǎn)生50％抑制作用的濃度。實(shí)施例A和B給出了用于篩選本發(fā)明化合物的體外試驗(yàn)實(shí)例。
本發(fā)明某些優(yōu)選化合物在凝血酶試驗(yàn)中的Ki約為0.001至200nM。更好的化合物的Ki約為0.001至50nM。更好的優(yōu)選化合物的Ki約為0.001至10nM。
較好的本發(fā)明化合物對血纖維蛋白溶酶、t-PA、aPC、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的IC50至少是其對凝血酶IC50的10倍。尤其好的化合物其對血纖維蛋白溶酶、rt-PA、aPC、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的IC50是其對凝血酶IC50的約20至約100,000倍。更好的化合物其對血纖維蛋白溶酶、rt-PA、aPC、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的IC50是其對凝血酶IC50的約100至約1,000,000倍。如果本發(fā)明某化合物其對凝血酶、rt-PA、aPC、胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶的IC50高于被測化合物的最高濃度，就將化合物的最高濃度作為其IC50。4.藥物組合物另一方面，本發(fā)明包含了制備后用于保存和使用的藥物組合物，其中含有包含在藥學(xué)上認(rèn)可的載體中的治療有效量的本發(fā)明化合物。
本發(fā)明化合物的“治療有效量”取決于給藥途徑、受治哺乳動(dòng)物的種類和具體考慮的哺乳動(dòng)物的身體特征。決定此用量的這些因素及其相互關(guān)系是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域熟練開業(yè)醫(yī)師所熟知的。為了獲取最佳的藥效，可改變此用量和給藥方法，但這取決于體重、飲食、合并療法及其它醫(yī)學(xué)領(lǐng)域熟練醫(yī)師所知道的因素。
本發(fā)明化合物的“治療有效量”根據(jù)要求的效果和治療適應(yīng)癥而大不相同。通常，劑量為約0.01mg/kg體重至100mg/kg體重，較好的是約0.01mg/kg體重至10mg/kg體重。
用于治療的“藥學(xué)上認(rèn)可的載體”是醫(yī)藥領(lǐng)域所熟知的，并且在例如Rem-ington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro編，1985)中有所記述。例如，可以使用生理pH值的無菌鹽水和磷酸鹽緩沖的鹽水?？梢栽谒幬锝M合物中加入防腐劑、穩(wěn)定劑、著色劑、甚至賦味劑。例如，作為防腐劑，可加入苯甲酸鈉、山梨酸和對羥基苯甲酸酯。同上書1449。此外，可以使用抗氧化劑和懸浮劑。同上書。
本發(fā)明藥物組合物的配制和使用可以是口服的片劑、膠囊或酏劑；直腸用栓劑；注射用無菌溶液和懸浮液；等等。為了獲取最佳的藥效，可改變用量和給藥方法，但這取決于體重、飲食、合并療法及其它醫(yī)學(xué)領(lǐng)域熟練醫(yī)師所知道的因素。
非腸胃給藥時(shí)，例如每日的靜脈注射，可將注射用藥物組合物制備成常規(guī)形式，液體溶液或懸浮液，適于在使用前溶解或懸浮在液體中的固體形式，或是乳劑。合適的賦形劑是，例如水、鹽水、葡萄糖、甘露醇、乳糖、卵磷脂、白蛋白、谷氨酸鈉、鹽酸半胱氨酸等。此外，如有必要，注射用藥物組合物可以含有小量的無毒助劑，例如濕潤劑，pH緩沖劑等。如有必要，可以使用吸收加強(qiáng)劑(例如脂質(zhì)體)。5.用途和方法如本文所述制備和篩選后，本發(fā)明化合物是有效的體外和體內(nèi)凝血酶抑制劑。即，這些化合物可用作體外診斷藥以防止血液凝固，和體內(nèi)的藥物以預(yù)防可能有異常血栓形成的情況的哺乳動(dòng)物體內(nèi)血栓形成。
本發(fā)明的化合物可用于防止抽血試管中的血液凝結(jié)。使用內(nèi)為真空的加塞試管將靜脈穿刺抽取的血液抽入試管中，在醫(yī)學(xué)是眾所周知的。Kasten，B.L.，“Specimen Collection”，Laboratory Test Handbook，第2版，Lexi-CompInc.，Cleveland PP.16-17(編者Jacobs，D.S.等，1990)。這種真空管可能沒有抗凝添加劑，此時(shí)，它們被用于從哺乳動(dòng)物血液中分離血清?；蛘?，它們可能含有抗凝添加劑(如肝素鹽、EDTA鹽、檸檬酸鹽或酸鹽)，此時(shí)，它們被用于從哺乳動(dòng)物的血液中分離血漿。本發(fā)明化合物是因子Xa或凝血酶的有效抑制劑，即，可以加入血液收集管中防止抽入其中的哺乳動(dòng)物的血液凝固。
本發(fā)明化合物可單獨(dú)、與本發(fā)明的其它化合物組合，或與其它已知的抗凝劑組合用于血液收集試管中。加入試管的量應(yīng)足以在哺乳動(dòng)物的血液被抽入其中時(shí)抑制血凝塊的形成?？梢岳帽绢I(lǐng)域眾所周知的方法將化合物加入這類試管中，例如引入其液體組合物，以固體組合物加入，或凍干成固體的液體組合物。本發(fā)明化合物加入血液收集管中的量為，與2至10ml哺乳動(dòng)物血液混合時(shí)，化合物的濃度足以抑制血凝塊的形成。通常，要求濃度為約1至10,000nM，較好的是10至1000nM。
本發(fā)明化合物可以被用作預(yù)防可能有異常血栓形成的情況的哺乳動(dòng)物體內(nèi)血栓形成的藥劑。
異常血栓形成的情況在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域是眾所周知的，包括涉及哺乳動(dòng)物動(dòng)脈和靜脈脈管系統(tǒng)的那些。在冠狀動(dòng)脈脈管系統(tǒng)中，異常血栓形成(血栓形成)的特點(diǎn)是已形成的粥樣硬化斑塊破裂，這是引起急性心肌梗塞和不穩(wěn)定型心絞痛的主要原因，以及由血栓溶解療法或經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀血管成形術(shù)(PTCA)引起的閉塞性冠狀血栓形成。在靜脈脈管系統(tǒng)中，異常血栓形成的特點(diǎn)是可在一般因靜脈脈管系統(tǒng)內(nèi)血栓形成導(dǎo)致患肢血流量減少和肺栓塞傾向的、接受下肢或腹部大手術(shù)的病人中觀察到到的情況。異常血栓形成的另一特點(diǎn)是播散性血管內(nèi)凝血，通常在敗血性休克、某些病毒感染和癌癥時(shí)，在兩種血管系統(tǒng)中都會(huì)發(fā)生，其間發(fā)生凝血因子的迅速消耗和全身性凝血，引起遍及整個(gè)微血管系統(tǒng)的危及生命的血栓形成，引起廣泛的器官衰竭。
本發(fā)明涉及對可能有異常血栓形成的情況的哺乳動(dòng)物進(jìn)行預(yù)防的方法，即對所述哺乳動(dòng)物給以治療有效量的本發(fā)明化合物或藥物組合物。
本發(fā)明的化合物和藥物組合物是體內(nèi)給藥的，一般適用于哺乳動(dòng)物，更適用于人。體內(nèi)使用時(shí)，化合物或藥物組合物可以通過多種途徑對哺乳動(dòng)物給藥，其中包括口服、腸胃外給藥、靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、結(jié)腸、直腸、經(jīng)鼻或腹腔內(nèi)，同時(shí)可使用多種劑型。較好的是腸胃外給藥，如每日靜脈注射。或者，以口服為佳，如每日服用片劑、膠囊或酏劑。
在本發(fā)明方法的實(shí)施中，本發(fā)明的化合物或藥物組合物可以單獨(dú)給藥，或相互組合給藥，或與其它已知治療劑或體內(nèi)診斷用劑組合給藥。
對醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員來說顯而易見的是，本發(fā)明化合物或藥物組合的治療有效量取決于年齡、體重和受治哺乳動(dòng)物的種類、具體使用的化合物、具體的給藥方式和要求達(dá)到的效果和治療適應(yīng)癥。由于決定此用量的這些因素及其相互關(guān)系在醫(yī)學(xué)上是眾所周知的，所以本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將能夠決定治療有效劑量水平和獲取要求的防血栓形成效果所需的量。通常，建議以低劑量水平給以本發(fā)明的化合物或藥物組合物，同時(shí)不斷提高劑量水平，直至獲得要求的抑制體內(nèi)血栓形成效果，以此定義為治療有效量。對于本發(fā)明的化合物，單獨(dú)使用或作為藥物組合物的一部分使用時(shí)，此劑量約為0.0lmg/kg體重至100mg/kg體重，較好的是約0.01mg/kg體重至10mg/kg體重。
為了幫助理解，將通過以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。這些與本發(fā)明相關(guān)的實(shí)施例當(dāng)然不應(yīng)被視為是對本發(fā)明的具體限定，對本發(fā)明的改變，不論是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員現(xiàn)在已知或?qū)?huì)發(fā)現(xiàn)的，都被認(rèn)為屬于本發(fā)明的說明和后文權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。實(shí)施例實(shí)施例1制備(S)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-氧代-1-哌啶乙酸 本化合物通過改進(jìn)D.F.Veber和R.M.Freidinger的美國專利4,192,875(1980年3月11日)；和R.M.Freidinger等，J.Org.Chem.，47104-109(1982)所報(bào)導(dǎo)的方法用四步步驟制得。下面描述的新方法由更純凈的中間體著手，由此，可制得大量高純物質(zhì)。
將N-α-Boc-δ-芐氧基羰基-L-鳥氨酸(100.3g，0.27mol)溶解在甲醇(450ml)、水(320ml)和乙酸(46.5ml)形成的溶液中。加入10％鈀炭催化劑(10.0g)。在Parr設(shè)備上在35psi將混合物氫化2.5小時(shí)。薄層色譜(硅膠；20∶10∶3二氯甲烷/甲醇/乙酸；茚三酮)顯示全部轉(zhuǎn)化成N-α-Boc-L-鳥氨酸。
用氮?dú)獯迪春?，加入二羥乙酸(27.72g，0.30mol)，在環(huán)境溫度將混合物攪拌50小時(shí)，在35psi氫化17小時(shí)，隨后濾去催化劑。加入新鮮的10％鈀炭催化劑(5g)，在Parr振蕩器上在40psi將混合物再氫化20小時(shí)。濾去催化劑，在真空下將濾液濃縮至干。將殘余物溶于甲醇中并再次蒸發(fā)。重復(fù)該步驟，將殘余物的壓力抽至小于1mmHg并保持過夜，得到黃色泡沫狀物。
將粗中間體溶解在無水二甲基甲酰胺(625ml)中并在50-60℃加熱2.5小時(shí)。在真空于80℃除去溶劑。將生成的油溶解在500ml二氯甲烷中并用500ml1M氫氧化鈉溶液萃取。水溶液用500ml二氯甲烷反萃，冷卻下用550ml 1MHCl酸化，用5×500ml二氯甲烷和2×500ml 9∶1二氯甲烷/異丙醇再萃取。用無水硫酸鎂干燥合并的有機(jī)層，蒸發(fā)，得到50g(67％產(chǎn)量)固化的油狀標(biāo)題化合物，薄層色譜(TLC，硅膠；27∶3∶1二氯甲烷/甲醇/乙酸)確定其純度(具有Rf＝0.30的單個(gè)的色譜斑)。實(shí)施例2制備(S)-N-α-Boc-Ng-硝基精氨醇 在-78℃，向(S)-N-α-Boc-Ng-硝基精氨酸(370g，1.15mol)在6升無水四氫呋喃中的懸浮液中緩慢地加入四氫呋喃·甲硼烷配合物(1.0M，2.6升)，將反應(yīng)溫度控制在不超過-60℃。加料完成后，將反應(yīng)混合物在-20℃的冰箱內(nèi)放置過夜。
接著將綠黃色的反應(yīng)混合物冷凍至-78℃，緩慢地加入3升無水甲醇以中止反應(yīng)。中止反應(yīng)后2小時(shí)，將混合物溫?zé)嶂?5℃并再攪拌2小時(shí)。在真空中除去溶劑得到標(biāo)題化合物(360g)。薄層色譜(二氧化硅；90∶10二氯甲烷/甲醇)給出Rf＝0.28。實(shí)施例3制備(S)-Ng-硝基精氨醇鹽酸鹽 在0℃，向?qū)嵤├?的化合物(34g，0.1117mol)在500ml甲醇中的溶液中加入1.2升飽和HCl甲醇溶液。30分鐘后，移去冰浴并將反應(yīng)混合物攪拌2小時(shí)。此后，在真空中除去溶劑，可直接使用得到的固體而無須進(jìn)一步純化。實(shí)施例4制備Boc-正纈氨酸(環(huán))-甘氨酸-Ng-硝基-L-精氨醇 向?qū)嵤├?的化合物(7.49g，0.0275mol)和HOBt(4.43g，0.0289mol)在75ml無水乙腈中的溶液中加入4-甲基嗎啉(8.35g，0.0825mol，9.06ml)并將混合物冷卻至0℃。用4-甲基嗎啉(5.56g，0.055mol，6.05ml)處理實(shí)施例3的化合物(7.55g，0.0275mol)在25ml無水二甲基甲酰胺中的溶液，攪拌5分鐘，并將其加至上述溶液中。在0℃，于2分鐘內(nèi)，分批地向該混合物中加入EDC(5.26g，0.0275mol)。從0℃至環(huán)境溫度，將反應(yīng)混合物攪拌17小時(shí)，隨后在真空中除去溶劑，殘余物在短硅膠閃蒸柱上過濾進(jìn)行預(yù)純化，使用梯度范圍為5-20％甲醇-二氯甲烷洗脫，得到黃色泡沫狀物。將其在乙酸乙酯/甲醇中重結(jié)晶，得到7.70g(61％產(chǎn)量)無色固態(tài)標(biāo)題化合物，m.p.＝160-162℃；薄層色譜(硅膠；4∶1二氯甲烷/甲醇)給出Rf＝0.45。實(shí)施例5制備正纈氨酸(環(huán))-甘氨酸-Ng-硝基-L-精氨醇鹽酸鹽 在0℃于氮?dú)夥罩?，向?qū)嵤├?的化合物(3.86g，8.40mmol)在100ml乙酸乙酯中的懸浮液中加入1N HCl/乙酸乙酯溶液(42ml，5當(dāng)量)。在0℃將生成的糊狀懸浮液攪拌45分鐘，接著在環(huán)境溫度攪拌過夜。在氮?dú)夥罩谐闉V收集產(chǎn)物，將其溶解在無水甲醇中，接著在真空中蒸發(fā)至干。重復(fù)上述步驟，真空干燥后，得到3.38g(100％粗產(chǎn)量)無定形吸水的固態(tài)標(biāo)題化合物，NMR和薄層色譜測定表明其純度約95％，該產(chǎn)物立即在下面實(shí)施例中使用，薄層色譜(硅膠20∶10∶2二氯甲烷/甲醇/濃氫氧化銨)給出Rf＝0.5。實(shí)施例6制備N-芐基磺酰-正纈氨酸(環(huán))-甘氨酸-Ng-硝基-L-精氨醇 向?qū)嵤├?的化合物(395.8mg，1.0mmol)在10ml無水二甲基甲酰胺中的溶液中加入無水碳酸鈉粉末(276.4mg，2.0mmol)。在環(huán)境溫度下攪拌30分鐘后，加入苯甲磺酰氯(190.7mg，1.0mmol)。24小時(shí)后，用二氯甲烷稀釋混合物，濾去固體，在真空中除去溶劑得到殘余物。用硅膠閃蒸色譜純化殘余物，用梯度范圍為10-20％的甲醇/二氯甲烷洗脫，得到220mg(43％產(chǎn)量)無色泡沫狀標(biāo)題化合物。薄層色譜(硅膠；4∶1二氯甲烷/甲醇)給出Rf＝0.5。實(shí)施例7制備N-芐基磺酰-正纈氨酸(環(huán))-甘氨酸-L-精氨醇醋酸鹽 向?qū)嵤├?的化合物(965.3mg，1.88mol)在125ml甲醇中的溶液中加入乙酸(903.2mg，15.0mmol，0.86ml)，接著加入10％鈀炭催化劑(386mg)。在Parr振蕩器上在35psi將混合物氫化17小時(shí)，過濾，在真空中蒸去溶劑。將殘余物的壓力抽至小于1mmHg保持2天，其間偶爾溫?zé)嶂?，得?.02g(100％粗產(chǎn)量)泡沫狀標(biāo)題化合物。薄層色譜(硅膠；20∶10∶2二氯甲烷/甲醇/濃氫氧化銨)給出Rf＝0.32?？煸愚Z擊質(zhì)譜確認(rèn)其具有468的理論分子量。實(shí)施例8制備N-芐基磺酰-正纈氨酸(環(huán))-甘氨酸-L-精氨醛三氟醋酸鹽 在約5℃，向?qū)嵤├?的化合物(218.0mg，0.412mmol)在3ml無水二甲亞砜和3ml無水甲苯中的溶液中加入二氯乙酸(265.9mg，2.06mmol，170.1ml)，接著在1分鐘后加入EDC(790.6mg，4.12mmol)。在5℃將混合物攪拌5分鐘，然后在環(huán)境溫度下攪拌90分鐘。加入35ml水以中止反應(yīng)，用3×25ml二乙醚萃取，并用水稀釋至總體積為50ml。將水溶液放置在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上短時(shí)間，以除去揮發(fā)性物質(zhì)。在標(biāo)準(zhǔn)C18的50×300mm柱上，使用梯度范圍為10-30％的乙腈-水(含0.1％的三氟乙酸)的洗脫液在1小時(shí)內(nèi)對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行反相HPLC純化。將有用的餾份合并并凍干，得到151mg(63％產(chǎn)量)標(biāo)題化合物(無色、無定形固體)。HPLC(在C18反相柱上)分析顯示有三種產(chǎn)物形式?？煸愚Z擊質(zhì)譜確認(rèn)其具有466的理論分子量。實(shí)施例9制備正纈氨酸(環(huán))-甘氨酸-O-甲酯鹽酸鹽 將實(shí)施例1的化合物(43.5g，0.160mol)溶解在150ml無水甲醇中，冷卻至0℃，滴入飽和HCl甲醇溶液(400ml)。在0℃將該溶液攪拌1小時(shí)，隨后溫?zé)嶂镰h(huán)境溫度并攪拌14小時(shí)。在真空中濃縮該溶液得到透明油狀的標(biāo)題化合物，該化合物直接用于下面實(shí)施例中。薄層色譜(硅膠；27∶3∶1二氯甲烷/甲醇/濃氫氧化銨)給出Rf＝0.25。實(shí)施例10制備N-芐基磺酰-正纈氨酸(環(huán))-甘氨酸-O-甲酯 將實(shí)施例8的化合物(19.1g，85.8mmol)置于850ml無水乙腈中形成糊狀，用苯甲磺酰氯(32.7g，0.172mol)處理之。將得到的溶液冷卻至0℃并滴加三乙胺(60.0ml，0.428mol)。2小時(shí)后，加入另外一批苯甲磺酰氯(16.4g，85.8mmol)。將溶液緩慢地溫?zé)嶂镰h(huán)境溫度并攪拌16小時(shí)。濾去固體，在真空中濃縮濾液，得到油狀物。用閃蒸色譜(硅膠；用梯度范圍為10-50％的乙酸乙酯在二氯甲烷中的溶液洗脫)純化該油狀物，得到19.8g(68％產(chǎn)量)白色泡沫狀標(biāo)題化合物。薄層色譜(硅膠；27∶3∶1二氯甲烷/甲醇/乙酸)給出Rf＝0.55。實(shí)施例11制備N-芐基磺酰-正纈氨酸(環(huán))-甘氨酸 將實(shí)施例9的化合物(17.2g，52.7mmol)溶解在350ml甲醇中，冷卻至0℃，滴加1.0M氫氧化鋰水溶液(116ml)。1小時(shí)后，將反應(yīng)混合物溫?zé)嶂镰h(huán)境溫度并攪拌18小時(shí)。向糊狀物中加入Dowex 50X8-400離子交換樹脂(H＋型，49g)以將pH調(diào)節(jié)至3。攪拌30分鐘后，過濾糊狀物，使用幾批水/甲醇洗滌樹脂。在真空下濃縮濾液。將殘余物溶于乙腈中并在真空中濃縮之。重復(fù)該步驟，得到17.2g(100％產(chǎn)量)無色、無定形固態(tài)標(biāo)題化合物。薄層色譜(硅膠；27∶3∶1二氯甲烷/甲醇/乙酸)給出Rf＝0.30。實(shí)施例12制備N-α-叔丁氧基羰基-Ng-硝基-L-精氨酸內(nèi)酰胺 將溶液加熱至50℃使-α-N-叔丁氧基羰基-Ng-硝基-L-精氨酸(2.00g，6.3mmol)溶解在四氫呋喃(100ml)中。將該溶液冷卻至室溫。加入N-甲基哌啶(0.84ml，6.9mmol)。將該溶液在冰浴中冷卻。加入氯甲酸異丁酯(0.83ml，6.3mmol)，在0℃將反應(yīng)混合物攪拌6小時(shí)。將反應(yīng)混合物攪拌18小時(shí)(過夜)同時(shí)使杜瓦瓶中的冰熔化。在真空中除去溶劑。將粗產(chǎn)物溶解在20％乙酸乙酯/二氯甲烷(10ml)中，并通過3×5cm硅膠閃蒸色譜柱純化，使用20％乙酸乙酯/二氯甲烷作為洗脫劑。收集125ml洗脫液。在真空中除去溶劑，得到1.39g(74％粗產(chǎn)量)白色泡沫狀標(biāo)題化合物。Rf＝0.44(硅膠；5％異丙醇/二氯甲烷)?；衔镏泻挟惗〈茧s質(zhì)。該化合物可通過二氯甲烷/己烷或乙醇/水中的重結(jié)晶純化。實(shí)施例13制備N-α-叔丁氧基羰基-Ng-硝基-L-精氨醛 (a)步驟1向在冰浴中冷卻攪拌的LiAlH4在四氫呋喃(3.8ml 1M溶液，3.8mmol)中的溶液中滴加乙酸乙酯(0.43ml，3.8mmol)在四氫呋喃(5ml)中的溶液。將該溶液在0℃攪拌30分鐘生成LiAlH2(OEt)2。
向該LiAlH2(OEt)2溶液中滴加實(shí)施例12的化合物(0.92g，3.1mmol)在四氫呋喃(5ml)中的經(jīng)攪拌的溶液。30分鐘后，加入1.0N HCl/四氫呋喃(2ml1∶1混合物)以中止反應(yīng)。加入1.0NHCl(20ml)，該溶液用乙酸乙酯萃取3次(每次20ml)。合并的有機(jī)層用水(5ml)、飽和碳酸氫鈉(5ml)和鹽水(兩次，每次5ml)洗滌，用無水硫酸鎂干燥，過濾，在真空中除去溶劑，得到0.94g(100％產(chǎn)量)灰白色固態(tài)的標(biāo)題混合物。
(b)步驟2或者，標(biāo)題混合物可由下列步驟制得。
在強(qiáng)氮?dú)饬髦?，將頂上裝有攪拌設(shè)備的12升四頸圓底燒瓶用火焰干燥。該燒瓶冷卻后，在氮?dú)獾母采w下加入120.0g α-N-叔丁氧基羰基-Ng-硝基-L-精氨酸(376mmol，1當(dāng)量)，隨后通過套管加入6升無水四氫呋喃(Aldrich保證密封)。燒瓶裝上溫度計(jì)，邊攪拌邊用加熱槍將形成的懸浮液溫?zé)嶂?0℃。用冰浴將反應(yīng)混合物冷卻至5℃，并用冰/丙酮浴將其進(jìn)一步冷卻至-5℃。
在將溶液冷卻至-5℃期間，在一個(gè)500ml燒瓶中稱入36.66g N-甲基-O-甲基羥基胺鹽酸鹽(376mmol，1.0當(dāng)量)并使之懸浮在300ml二氯甲烷中。用氮?dú)鈱υ搼腋∫汗呐?分鐘，冷卻至0℃，并在氮?dú)夥罩型ㄟ^注射器加入46ml N-甲基哌啶(1.0當(dāng)量)。短時(shí)間用聲波處理該混合物使之完全溶解/形成游離堿，并仍然在氮?dú)夥罩杏帽±鋮s至0℃。生成的游離堿溶液備用。
當(dāng)上述精氨酸溶液冷卻至-5℃時(shí)，用注射器加入45ml N-甲基哌啶，5分鐘后，用注射器加入46ml氯甲酸異丁酯(0.95當(dāng)量)。形成的溶液在-5℃攪拌15分鐘。然后，通過套管在約15分鐘內(nèi)加入上面制得的N-甲基-O-甲基羥胺游離堿溶液。在-5℃再持續(xù)攪拌1.5小時(shí)，此時(shí)薄層色譜(硅膠；1∶10∶90乙酸/甲醇/二氯甲烷)顯示反應(yīng)完成。趁冷過濾反應(yīng)混合物，用400ml冷四氫呋喃洗滌該鹽，于真空下在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮濾液，得到黃色泡沫狀物。
將粗中間體溶于300ml二氯甲烷中，并加至硅膠柱(70-230目，7×50cm)上。該柱先用2升二氯甲烷、接著用2升2％甲醇在二氯甲烷中的溶液洗脫。隨后用5％甲醇在二氯甲烷中的溶液洗脫，直至所有產(chǎn)物洗出為止(檢查洗脫液的UV活性，一旦出現(xiàn)UV活性，就收集5份每份1升的洗脫液)。合并含純產(chǎn)物的洗脫液并在真空中濃縮，抽真空過夜，得到120.1g(88％產(chǎn)量)α-N-叔丁氧基羰基-Ng-硝基精氨酸-N-甲基-N-甲氧基羧酰胺(淡黃色泡沫狀物)。將該泡沫狀物置于300ml二氯甲烷、300ml甲苯中，在真空中再次除去揮發(fā)性物質(zhì)以除去任何殘余的水或甲醇。
將120.1g N-α-叔丁氧基羰基-Ng-硝基-L-精氨酸-N-甲基-N-甲氧基羧酰胺(331.4mmol)溶于2.8升無水(Aldrich保證密封)四氫呋喃中，將其轉(zhuǎn)移至裝有機(jī)械攪拌器和低溫溫度計(jì)的干燥的5升4頸圓底燒瓶中。使用干冰/丙酮浴將溶液冷卻至-70℃。用套管直接從Aldrich保證密封的幾個(gè)100ml瓶中加入300ml 1M LiAlH4在四氫呋喃中的溶液。用注射器另外加入50ml 1M LiAlH4在四氫呋喃中的溶液(總計(jì)331ml)。在加料期間，將反應(yīng)溫度保持在低于-60℃。在-70℃將反應(yīng)混合物攪拌0.5小時(shí)。移去冷凍浴，使反應(yīng)混合物緩慢地溫?zé)嶂?℃(約2.5小時(shí))。在-30℃至-20℃之間形成厚糊狀物。當(dāng)反應(yīng)混合物到達(dá)0℃時(shí)，取出少量試樣，使之在乙酸乙酯/2M硫酸氫鉀中分配。用薄層色譜(硅膠；乙酸乙酯)分析有機(jī)層。
當(dāng)確定反應(yīng)完成后，將其冷卻至-70℃，用滴液漏斗以足夠慢的速率加入503ml 2M硫酸氫鉀以使反應(yīng)溫度保持在低于-30℃。移去冷卻浴，使反應(yīng)混合物在2小時(shí)內(nèi)達(dá)到0℃，接著濾出白色沉淀。用500ml冷四氫呋喃洗滌該固體。在真空下以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將濾液濃縮至除去大部分四氫呋喃，剩余的白色淤泥幾乎是水性的。將粗產(chǎn)物置于1.5升乙酸乙酯中并用0.2M HCl(2×200ml)洗滌之。用400ml乙酸乙酯反萃HCl萃取液，合并有機(jī)層，用碳酸氫鈉飽和溶液(2×200ml)萃取。用400ml乙酸乙酯反萃碳酸氫鈉萃取液。合并有機(jī)層，用鹽水(200ml)洗滌，隨后用無水硫酸鈉干燥。過濾溶液，在真空下以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，并抽真空過夜，得到白色固態(tài)粗標(biāo)題化合物(89.0g)。該化合物在硅膠色譜上使用梯度范圍為0-10％的甲醇在二氯甲烷中的溶液作為洗脫液進(jìn)行純化。合并純餾份并蒸發(fā)，得到白色固態(tài)標(biāo)題化合物(75g，74％產(chǎn)量)。實(shí)施例14制備N-α-叔丁氧基羰基-Ng-硝基-L-精氨醛乙基環(huán)醇 將實(shí)施例13的化合物(41.60g，0.137mol)溶解在乙醇(200ml)中，加入濃鹽酸(1ml)。薄層色譜(硅膠；10％甲醇/二氯甲烷)確認(rèn)其反應(yīng)完成后，在真空中除去溶劑。通過硅膠柱(230-400目)以0-10％乙酸乙酯/二氯甲烷作為洗脫液使用閃蒸色譜純化粗產(chǎn)物。洗脫液合并，得到36.88g(81％)淺黃色泡沫狀標(biāo)題化合物。薄層色譜(硅膠；5％甲醇/二氯甲烷)給出Rf＝0.62。實(shí)施例15制備Ng-硝基-L-精氨醛乙基環(huán)醇鹽酸鹽 在0℃，向35g實(shí)施例14的化合物在500ml無水乙醇中的溶液中緩慢地加入500ml以HCl(g)飽和的無水乙醇溶液。將該混合物溫?zé)嶂?5℃并使用薄層色譜進(jìn)行檢查。出現(xiàn)強(qiáng)極性的產(chǎn)物就是要求的化合物。用干氮?dú)饬鞒ゴ蠖鄶?shù)的HCl并在真空中除去生成的(resulting)的有機(jī)溶劑。生成的33g標(biāo)題化合物為黃白色固體，不經(jīng)進(jìn)一步純化就可使用。實(shí)施例16制備N-芐基磺酰-正纈氨酸(環(huán))-甘氨酸-Ng-硝基-L-精氨醛乙基環(huán)醇 將實(shí)施例11的化合物(17.2g，52.7mmol)溶解于215ml乙腈中，并用實(shí)施例15的化合物(14.2g，53.0mmol)、EDC(15.2g，79.1mmol)、HOBt(7.12g，52.7mmol)對其進(jìn)行處理。在環(huán)境溫度將該溶液攪拌15分鐘，冷卻至0℃，然后用N，N-二異丙基乙胺(45.9ml，0.264mol)對其進(jìn)行處理。將反應(yīng)物溫?zé)嶂镰h(huán)境溫度并攪拌48小時(shí)。在真空中蒸發(fā)該溶液，接著將殘余物溶解在1.5升乙酸乙酯中，并用2×150ml的1N HCl、飽和碳酸氫鈉和鹽水依次洗滌之。有機(jī)層用無水硫酸鎂干燥、過濾并在真空中蒸發(fā)，得到黃色泡沫狀物。使用閃蒸柱色譜(硅膠；使用梯度范圍為3-5％的乙醇在二氯甲烷中的溶液進(jìn)行洗脫)純化該泡沫狀物，生成11.5g(40％產(chǎn)量)標(biāo)題化合物(白色固體)。薄層色譜給出的Rf＝0.40(硅膠；9∶1的二氯甲烷/甲醇)。實(shí)施例17制備N-芐基磺酰-正纈氨酸(環(huán))-甘氨酸-L-精氨醛乙基環(huán)醇醋酸鹽 將實(shí)施例16的化合物(9.50g，17.6mmol)溶解在乙醇(133ml)、水(33ml)和乙酸(33ml)中，加入10％鈀炭催化劑(4.0g)，在Parr裝置中在50psi H2下將溶液振搖19小時(shí)。濾去固體，在真空中蒸發(fā)濾液，得到淺棕色油狀的標(biāo)題化合物，該化合物直接用于下列反應(yīng)中。薄層色譜給出的Rf＝0.35(硅膠；20∶5∶2的二氯甲烷/甲醇/濃氫氧化銨)。實(shí)施例18制備N-芐基磺酰-正纈氨酸(環(huán))-甘氨酸-L-精氨醛三氟醋酸鹽 將實(shí)施例17的化合物(4.5g，8.1mmol)溶解在1N HCl(150ml)中，并在環(huán)境溫度下攪拌15小時(shí)。向該溶液中加入12N HCl(25.5ml)使反應(yīng)再持續(xù)3.5小時(shí)。在50×300mm的C18柱上，使用梯度范圍為10-30％的乙腈-水(含0.1％的三氟乙酸)的洗脫液在1小時(shí)內(nèi)對反應(yīng)物進(jìn)行反相HPLC純化。得到3.8g(81％產(chǎn)量)標(biāo)題化合物(白色固體)。HPLC(在C18反相柱上)分析顯示產(chǎn)物具有三個(gè)峰?？煸愚Z擊質(zhì)譜確認(rèn)其具有466的理論分子量。實(shí)施例19制備N-叔丁氧羰基(Boc)-L-甲硫氨酰-甘氨酸甲酯 將N-α-叔丁氧羰基甲硫氨酸(24.9g，0.1mol)和甘氨酸甲酯鹽酸鹽(12.6g，0.1mol)在脫氣的二甲基甲酰胺(150ml)中進(jìn)行混合。在該混合物中溶入三乙胺(13.9ml，0.1mol)和HOBt(15.3g，0.1mol)，并加入DCC(20.6g，0.1mol)。將該混合物在室溫?cái)嚢柽^夜并過濾。在真空中蒸發(fā)濾液，接著將殘余物再溶解在二氯甲烷(150ml)中。用0.5M檸檬酸(3×50ml)和2N碳酸氫鈉水溶液(3×50ml)洗滌該溶液并用無水硫酸鈉干燥之。將該溶液過濾、在真空中蒸發(fā)并在乙酸乙酯/己烷中重結(jié)晶，得到24.1g(75％產(chǎn)量)標(biāo)題化合物。實(shí)施例20制備N-叔丁氧羰基-L-甲硫氨酰-甘氨酸甲酯甲基锍碘化物 在室溫邊攪拌邊將實(shí)施例19的化合物(960mg，3mmol)溶解在6ml碘甲烷中，將反應(yīng)混合物攪拌6.5小時(shí)，此時(shí)有粘稠的固體析出。潷去浮在上面的清液并在真空下干燥殘余物，得到1.41g(100％)吸濕性泡沫狀標(biāo)題混合物。實(shí)施例21制備(S)-3-叔丁氧羰基-氨基-2-氧代-1-吡咯烷乙酸 在氮?dú)夥罩袑?shí)施例20的化合物(7.3g，15.6mmol)溶解在312ml 1∶1二甲基甲酰胺/二氯甲烷中并冷卻至0℃。一次加入氫化鈉(1.5g 50％礦物油的懸浮液，31.5mmol)，在0℃將混合物攪拌2.5小時(shí)。接著依次加入乙酸乙酯(104ml)和水(24ml)，將形成的溶液在室溫下放置過夜。在真空下將該溶液蒸發(fā)至小的體積并使之在水(50ml)和二氯甲烷(50ml)中進(jìn)行分配。相分離后，用0.5M的檸檬酸將pH＝8的水相酸化成pH＝4。連續(xù)地用二氯甲烷萃取之，隨后在真空中蒸發(fā)，得到2.06g(51％)標(biāo)題化合物(晶狀固體)。實(shí)施例22制備(S)-3-叔丁氧羰基-氨基-2-氧代-1-吡咯烷乙酸-Ng-L-硝基精氨醇 將實(shí)施例21的化合物(5.16g，0.02mol)、實(shí)施例3的化合物(5.83g，0.022mol)、HBTU(8.34g，0.022mol)、HOBt(2.97g，0.02mol)溶解在500ml乙腈中。緩慢地向該溶液中加入N-甲基嗎啉(10ml，0.09mol)。將反應(yīng)混合物在25℃攪拌12小時(shí)并在真空中除去溶劑，得到殘余物。將該殘余物溶解在500ml乙酸乙酯中并用水(100ml)、10％HCl(3×100ml)、飽和碳酸氫鈉(3×100ml)和鹽水(100ml)洗滌。有機(jī)相用無水硫酸鎂干燥，過濾并在真空中蒸去溶劑，得到殘余物。將該殘余物在硅膠(300g)上進(jìn)行色譜分離，用梯度范圍為2-10％的甲醇在二氯甲烷中的溶液洗脫，得到3.3g(37％)標(biāo)題化合物。薄層色譜給出的Rf＝0.66(硅膠；95∶5二氯甲烷/甲醇)。實(shí)施例23制備(S)-3-氨基-2-氧代-1-吡咯烷乙酸-Ng-L-硝基精氨醇鹽酸鹽 將實(shí)施例22的化合物(3.3g，74mmol)溶解在200ml乙酸乙酯和50ml甲醇中。在0℃向該溶液中加入50ml以HCl氣飽和的乙酸乙酯溶液。將得到的混合物攪拌30分鐘。在真空中除去溶劑，得到3.1g(100％)標(biāo)題化合物(白色固體)。實(shí)施例24制備N-芐基磺酰-(S)-3-氨基-2-氧代-1-吡咯烷乙酸-Ng-L-硝基精氨醇 將苯甲磺酰氯(0.60g，3.1mmol)、實(shí)施例23的化合物(1g，2.6mmol)、25mlDMF和25ml乙腈在25℃下進(jìn)行攪拌。向該溶液中加入三乙胺(1.48ml，10.4mmol)。在25℃將該混合物攪拌12小時(shí)，在真空中除去溶劑后得到殘余物。將該殘余物溶解在100ml乙酸乙酯中并用水(100ml)、10％HCl(3×100ml)、碳酸氫鈉(3×100ml)和鹽水(100ml)進(jìn)行洗滌。有機(jī)相用無水硫酸鎂干燥，過濾并在真空中蒸發(fā)，生成殘余物。將該殘余物在硅膠(100g)上進(jìn)行色譜分離，用梯度范圍為5-15％的甲醇在二氯甲烷中的溶液洗脫，得到1.1g(85％)標(biāo)題化合物。薄層色譜給出Rf＝0.53(硅膠；95∶5二氯甲烷/甲醇)。實(shí)施例25制備N-芐基磺酰-(S)-3-氨基-2-氧代-1-吡咯烷乙酸-L-精氨醇 將實(shí)施例24的化合物(1.1g，2.2mmol)、100ml甲醇、3ml冰醋酸和200mg10％的鈀炭于45psi在Parr氫化器中氫化24小時(shí)。有機(jī)層經(jīng)硅藻土過濾并用100ml甲醇洗滌。在真空中蒸發(fā)有機(jī)層，得到1.2g(100％)標(biāo)題化合物。薄層色譜給出Rf＝0.82(硅膠；80∶20二氯甲烷/甲醇)。實(shí)施例26制備N-芐基磺酰-(S)-3-氨基-2-氧代-1-吡咯烷乙酸-L-精氨醛 在25℃攪拌實(shí)施例25的化合物(200mg，0.3mmol)、EDC(0.76g，3.0mmol)和4ml二甲亞砜。向該溶液中加入二氯乙酸(170(1，1.5mmol)。將反應(yīng)混合物攪拌30分鐘。接著將其倒入80ml水中，過濾并將其在20分鐘內(nèi)，在HPLC C18 50×300mm柱上進(jìn)行處理，使用梯度范圍為10-40％的乙腈-水(含0.1％三氟乙酸)作為洗脫液。合并純的餾份并凍干，得到130mg標(biāo)題化合物。快原子轟擊質(zhì)譜確認(rèn)其具有452的理論分子量。實(shí)施例27制備(S)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-六氫-1-氮雜-2-酮 在0℃，在2分鐘內(nèi)向L-(-)-α-氨基-ε-己內(nèi)酰胺(24.36g，0.19mol，由Sig-ma公司得到)在200ml四氫呋喃和200ml飽和碳酸氫鈉溶液中的溶液中快速地加入二碳酸二叔丁酯(di-t-butyl dicarbonate)(43.54g，0.20mol)?？焖俚?cái)嚢柙摶旌衔锊⒕徛販責(zé)嶂潦覝?。持續(xù)地?cái)嚢?天后，在真空中除去揮發(fā)物，加入固體氯化鈉使之在水相中達(dá)到飽和，接著用3×200ml乙酸乙酯萃取之。合并后的有機(jī)相用2×50ml水、1×50ml鹽水洗滌，并用無水硫酸鎂干燥，蒸干后得到37.92g淡黃色固態(tài)粗產(chǎn)物。合并后的水層用200ml乙酸乙酯、200ml 20％異丙醇在二氯甲烷中的溶液反萃，干燥后得到另外4.64g粗產(chǎn)物，合并后的粗產(chǎn)物產(chǎn)量為98％。由TLC(硅膠；乙酸乙酯，Rf＝0.4)確定由此得到的產(chǎn)物是純產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物合并，并在乙酸乙酯/己烷中重結(jié)晶，得到的產(chǎn)物為淺黃色晶狀固體，m.p.為148-150℃。實(shí)施例28制備(S)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-六氫-2-氧代-1-氮雜乙酸芐酯 在環(huán)境溫度下，在氮?dú)夥罩邢驅(qū)嵤├?7的化合物(12.28g，0.054mol)在215ml無水四氫呋喃中的溶液快速滴入雙(三甲基甲硅烷基)胺基鋰(70.0ml1M在四氫呋喃中的溶液，Aldrich，0.070mol)以便將溫度保持在約30℃。加料需要約20分鐘，將該溶液攪拌15分鐘，然后快速加入溴乙酸芐酯(24.65g，0.108mol，1 7.1ml)在35ml四氫呋喃中的溶液，以便將溫度保持在約32℃。經(jīng)過18小時(shí)反應(yīng)以后，加入100ml氯化銨飽和溶液以中止反應(yīng)，用600ml乙酸乙酯稀釋之，接著用2×50ml水、1×50ml鹽水萃??；用無水硫酸鎂干燥并蒸發(fā)。粗產(chǎn)物用硅膠閃蒸色譜純化，使用梯度范圍為4∶1-2∶1的己烷/乙酸乙酯洗脫，得到17.41g(86％產(chǎn)量)黃色粘稠油狀產(chǎn)物；TLC(硅膠；1∶1乙酸乙酯/己烷)Rf＝0.4。實(shí)施例29制備(S)-3-氨基-六氫-2-氧代-1-氮雜乙酸芐酯鹽酸鹽 在0℃，一次用5N HCl在乙酸乙酯(117ml，新鮮制得的，0.585mol)中的溶液處理實(shí)施例28化合物(17.04g，0.0453mol)在50ml乙酸乙酯中的溶液。將得到的溶液在0℃攪拌10分鐘，接著在環(huán)境溫度攪拌1.5小時(shí)。在真空中除去溶劑，加入無水乙腈(200ml)，再次蒸去溶劑。用真空泵將壓力抽至小于1mmHg并將該壓力保持幾個(gè)小時(shí)，得到14.06g(99.3％產(chǎn)量)淺黃色泡沫狀產(chǎn)物。TLC(硅膠；27∶3∶1二氯甲烷/甲醇/濃氫氧化銨)確定其為純產(chǎn)物，Rf＝0.4。實(shí)施例30制備(S)-3-芐基磺酰胺基-六氫-2-氧代-1-氮雜乙酸芐酯
向?qū)嵤├?9的化合物(9.38g，0.030mol)在300ml無水乙腈中的溶液中加入苯甲磺酰氯(6.29g，0.033mol)并在氮?dú)夥罩袑⑷芤豪鋮s至0℃。滴入三乙胺(6.68g，0.066mol，9.20ml)在25ml無水乙腈中的溶液，將溫度保持在小于5℃。形成的混合物在0℃攪拌1小時(shí)，隨后在環(huán)境溫度下攪拌9小時(shí)。加入另一份苯甲磺酰氯(572.0mg，3.0mmol)和三乙胺(0.92g，9.0mmol，1.27ml)，將混合物攪拌14小時(shí)，過濾并蒸發(fā)。殘余物用硅膠閃蒸色譜純化，使用梯度范圍為二氯甲烷至10％乙酸乙酯在二氯甲烷中的溶液進(jìn)行洗脫，得到11.10g(86％產(chǎn)量)粘性的黃色油狀產(chǎn)物，TLC(硅膠；9∶1二氯甲烷/乙酸乙酯)確定其為純產(chǎn)物Rf＝0.4。實(shí)施例31制備(S)-3-芐基磺酰胺基-六氫-2-氧代-1-氮雜乙酸(“芐基SO2-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸”) 向?qū)嵤├?0的化合物(11.06g，0.0257mol)在200ml乙醇中的溶液中加入10％鈀炭(1.11g)。在Parr振蕩器(Parr Shaker)上在40psi將混合物氫化5小時(shí)。濾去催化劑并除去溶劑，得到8.81g(接近定量)無色泡沫狀產(chǎn)物。TLC(硅膠；27∶3∶1二氯甲烷/甲醇/乙酸)確定其為純產(chǎn)物，Rf＝0.5。實(shí)施例32制備N-(芐基SO2-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸)Ng-硝基-L-精氨醛乙基環(huán)醇
將實(shí)施例31的化合物(6.81g，0.020mol)溶解在80ml乙腈中。向該混合物中加入實(shí)施例15的化合物(Ng-硝基-L-精氨醛乙基環(huán)醇鹽酸鹽，5.89g，0.022mol)、1-羥基苯并三唑一水合物(3.06g，0.020mol)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(5.75g，0.030mol)。在環(huán)境溫度下將得到的溶液攪拌20分鐘，接著加入N，N-二異丙基乙胺(12.83g，0.10mol，17.3ml)。將反應(yīng)混合物攪拌20小時(shí)，用700ml乙酸乙酯稀釋，并依次用2×50ml 1N HCl、碳酸氫鈉飽和溶液和鹽水洗滌。有機(jī)層用無水硫酸鎂干燥，過濾并在真空中蒸發(fā)，得到黃色泡沫狀物，在硅膠閃蒸色譜上使用95∶5二氯甲烷/乙醇作為洗脫液純化該泡沫狀物，得到7.54g(68％產(chǎn)量)無色泡沫狀產(chǎn)物。TLC(硅膠；9∶1二氯甲烷/乙醇)確定其為純產(chǎn)物，Rf＝0.40。實(shí)施例33制備N-(芐基SO2-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛乙基環(huán)醇 將實(shí)施例32的化合物(7.54g，0.0136mol)溶解在200ml 4∶1∶1乙醇/水/乙酸中，加入10％鈀炭催化劑(3.8g)。在Parr振蕩器上在50psi將混合物氫化19小時(shí)。濾去催化劑并蒸發(fā)濾液。將殘余物溶解在1∶1乙醇/乙腈的混合物中，再次蒸發(fā)。使用真空泵將壓力抽至小于1mmHg并保持3天，得到8.20g(粗品接近定量)無色、無定形固體產(chǎn)物。TLC(硅膠；20∶10∶2二氯甲烷/甲醇/濃氫氧化銨)確定其純度為約95％，Rf為0.48和0.43。實(shí)施例34制備N-(芐基SO2-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛 將實(shí)施例33的化合物(2.84g，5.0mmol)溶解在3N HCl(80ml)中并在環(huán)境溫度下攪拌2.5小時(shí)。在50×300mm C18柱上在1小時(shí)內(nèi)使用反相HPLC對反應(yīng)混合物進(jìn)行純化，使用梯度范圍為10-30％的乙腈/水(含0.1％三氟乙酸)作為洗脫液，得到2.18g(74％產(chǎn)量)無色無定形固體產(chǎn)物。RP/HPLC分析顯示產(chǎn)物具有三個(gè)峰。快原子轟擊質(zhì)譜確認(rèn)其具有480的理論分子量。實(shí)施例35(S)-3-氨基-2-氧代-六氫-1-氮雜乙酸芐酯鹽酸鹽與磺?；虬被酋Ｂ确磻?yīng)的通用步驟向?qū)嵤├?9的化合物(9.38g，0.030mol)在300ml無水乙腈中的溶液中加入下列合適的磺酰或氨磺酰氯(0.033mol)，并在氮?dú)夥罩袑⑷芤豪鋮s至0℃。接著滴入三乙胺(6.68g，0.066mol，9.20ml)在25ml無水乙腈中的溶液以便將溫度控制在低于5℃。在0℃將生成的混合物攪拌1小時(shí)隨后在環(huán)境溫度將混合物攪拌約2-20小時(shí)，過濾，在真空中蒸去溶劑。殘余物用硅膠閃蒸色譜純化，使用梯度范圍為二氯甲烷和10％-約15％乙酸乙酯在二氯甲烷中的溶液作為洗脫液，得到產(chǎn)物，TLC(硅膠)確定其純凈。
使用本方法和下列原料，可制得具有下列通式的中間體 R＝原料(所需量)苯基 苯磺酰氯(5.83g)1-萘基1-萘磺酰氯(7.48g)2-萘基2-萘磺酰氯(7.48g)2-甲氧基羰基苯基 2-甲氧基羰基苯磺酰氯(7.74g)2-甲氧基羰基芐基 2-甲氧基羰基苯甲磺酰氯(8.21g)2-三氟甲基苯基2-三氟甲基苯磺酰氯(8.07g)2-三氟甲基芐基2-三氟甲基苯甲磺酰氯(8.54g)2-苯基乙基2-苯基乙磺酰氯(6.75g)環(huán)己基甲基環(huán)己基甲磺酰氯(6.49g)環(huán)己基氨基環(huán)己基氨磺酰氯(6.52g)2-噻吩甲基2-噻吩甲磺酰氯(6.49g)。該中間體是通過2-氯甲基噻吩(K.B.Wiberg，Org.Synthe-ses，29，32，1949)與Na2SO3反應(yīng)得到相應(yīng)的磺酸鈉鹽(cf.S.Zuffanti，J.Am.Chem.
Soc.，62，1044，1940)，接著PCl5進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的處理得到相應(yīng)的磺酰氯而制得的。全氟丁基 全氟-1-丁磺酰氯(9.97g)五氟芐基 五氟苯甲磺酰氯(9.26g)苯基氨基 苯基氨磺酰氯(6.32g)3-甲氧基羰基芐基 3-甲氧基羰基苯甲磺酰氯(8.21g)3-三氟甲基芐基 3-三氟甲基苯甲磺酰氯(8.54g)2-甲基芐基 2-甲基苯甲磺酰氯(6.75g)3-甲基芐基 3-甲基苯甲磺酰氯(6.75g)2-甲氧基芐基 2-甲氧基苯甲磺酰氯(7.28g)3-甲氧基芐基 3-甲氧基苯甲磺酰氯(7.28g)2-氯芐基 2-氯苯甲磺酰氯(7.43g)3-氯芐基 3-氯苯甲磺酰氯(7.43g)2-甲基-5-氟芐基 2-甲基-5-氟苯甲磺酰氯(7.35g)2-甲基-5-甲氧基芐基 2-甲基-5-甲氧基苯甲磺酰氯(7.75g)3-甲氧基羰基-5-甲氧 3-甲氧基羰基-5-甲氧基-6-三氟甲基苯甲磺基-6-三氟甲基芐基 酰氯(11.44g)實(shí)施例36制備本發(fā)明化合物的通用方法按照實(shí)施例31至34列出的四個(gè)步驟(氫化，偶合，氫化和水解)，使用實(shí)施例35的中間體合成本發(fā)明下列化合物(它們的三氟乙酸鹽) N-(苯基-SO2-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛36(a) N-(1-萘基-SO2-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛 36(b) N-(2-萘基-SO2-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛 36(c) N-(2-甲氧基羰基苯基-SO2-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛 36(d) N-(2-甲氧基羰基芐基-SO2-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛 36(e) N-(2-三氟甲基苯基-SO2-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛36(f) N-(2-三氟甲基芐基-SO2-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛 36(g) N-(苯基乙基-SO2-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛36(h) N-(環(huán)己基甲基-SO2-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛 36(i) N-(環(huán)己基氨基-SO2-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛 36(j) N-(2-噻吩甲基-SO2-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛 36(k) N-(全氟丁基-SO2-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛36(l) N-(五氟芐基-SO2-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛36(m) N-(苯基氨基-SO2-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛36(n) N-(3-甲氧基羰基芐基-SO2-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛 36(o) N-(3-三氟甲基芐基-SO2-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛36(p) N-(2-甲基芐基-SO2-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛36(q) N-(3-甲基芐基-SO2-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛36(r) N-(2-甲氧基芐基-SO2-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛 36(s) N-(3-甲氧基芐基-SO2-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛 36(t) N-(2-氯芐基-SO2-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛 36(u) N-(3-氯芐基-SO2-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛 36(v) N-(2-甲基-5-氟芐基-SO2-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛36(w) N-(2-甲基-5-甲氧基芐基-SO2-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛36(x)
N-(3-甲氧基羰基-5-甲氧基-6-三氟甲基芐基-SO2-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛36(y)。實(shí)施例37制備(S)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基-2-氧代-1-氮雜乙酸(叔丁氧羰基-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸)向?qū)嵤├?8的化合物(3.76g，0.010mol)在50ml乙醇中的溶液中加入10％鈀炭(0.76g)，在Parr振蕩器上在40psi將混合物氫化2小時(shí)。濾去催化劑并除去溶劑，得到2.77g(97％產(chǎn)量)無色泡沫狀產(chǎn)物。TLC(硅膠；CH2Cl2/MeOH/HOAc為27∶3∶1)Rf＝0.45。實(shí)施例38制備N-(叔丁氧羰基-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸)-Ng-硝基-L-精氨醛乙基環(huán)醇將實(shí)施例37的化合物(5.73g，0.020mol)溶解在80ml乙腈中，并用實(shí)施例15的化合物(Ng-硝基-L-精氨醛乙基環(huán)醇鹽酸鹽，5.89g，0.022mol)、1-羥基苯并三唑單水合物(3.06g，0.020mol)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(5.75g，0.030mol)處理之。在環(huán)境溫度下將得到的溶液攪拌20分鐘，接著用N，N-二異丙基乙胺(12.83g，0.10mol，17.3ml)處理之。將反應(yīng)混合物攪拌24小時(shí)，用700ml乙酸乙酯稀釋，并依次用2×50ml 1N HCl、碳酸氫鈉飽和溶液和鹽水洗滌。有機(jī)層用硫酸鎂干燥，過濾并在真空中蒸發(fā)，得到黃色泡沫狀物，以硅膠閃蒸色譜使用95∶5二氯甲烷/乙醇作為洗脫液純化該泡沫狀物，得到產(chǎn)物。TLC(硅膠；9∶1二氯甲烷/乙醇)確定其為純產(chǎn)物。實(shí)施例39制備N-(叔丁氧羰基-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛乙基環(huán)醇將實(shí)施例38的化合物(6.79g，0.0136mol)溶解在200ml 4∶1∶1乙醇/水/乙酸的混合物中，加入10％的鈀炭催化劑(3.4g)。在Parr振蕩器上在50psi將混合物氫化22小時(shí)。濾去催化劑并蒸發(fā)濾液。將殘余物溶解在1∶1乙醇/乙腈的混合物中，再次蒸發(fā)。使用真空泵將壓力抽至小于lmmHg并保持3天，得到接近定量的粗產(chǎn)物。TLC(硅膠；20∶10∶2的二氯甲烷/甲醇/氫氧化銨)確定其為純產(chǎn)物。實(shí)施例40(a)制備N-(正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛 將實(shí)施例39的化合物(2.57g，5.0mmol)溶解在3N HCl(80ml)中并在環(huán)境溫度下攪拌2.5小時(shí)。在50×300mm C18柱上在1小時(shí)內(nèi)使用反相HPLC對反應(yīng)混合物進(jìn)行純化，使用梯度范圍為0-20％的乙腈/水/0.1％TFA作為洗脫液，得到標(biāo)題化合物。RP/HPLC分析顯示產(chǎn)物具有三個(gè)峰。實(shí)施例40(b)制備N-(正纈氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛 使用實(shí)施例1的化合物作為原料，按照實(shí)施例38、39、40所描述的三個(gè)步驟(偶合、氫化、水解)制得無色、無定形的標(biāo)題化合物。RP/HPLC顯示產(chǎn)物具有三個(gè)峰。快原子轟擊質(zhì)譜確認(rèn)其具有312的理論分子量。實(shí)施例41制備(S)-3-[(叔丁氧基羰基)-N-甲基氨基]-2-氧代-1-氮雜乙酸芐酯在0℃、氮?dú)夥罩邢驓浠c(1.26g 60％油中分散液，用無水己烷洗滌過三次，0.0315mol)在60ml無水THF和6ml無水DNF中的懸浮液中快速滴入實(shí)施例28的化合物(11.29g，0.030mol)在30ml無水THF中的溶液，將溫度保持在5-10℃。10分鐘后，將混合物溫?zé)嶂镰h(huán)境溫度，攪拌1小時(shí)并再次冷卻至0℃。滴入碘甲烷(4.68g，0.033mol，2.05ml)在5ml無水THF中的溶液，并使溫度保持在小于約5℃，1小時(shí)以后，移去冰浴，將混合物在環(huán)境溫度攪拌24小時(shí)，用400ml Et2O稀釋該溶液，用2×50ml水和鹽水萃取之。有機(jī)層用硫酸鎂干燥，過濾并真空蒸發(fā)，得到的粗產(chǎn)物用硅膠閃蒸色譜純化，使用乙酸乙酯、己烷梯度洗脫，得到產(chǎn)物，TLC(硅膠；乙酸∶己烷為1∶1)確認(rèn)其為純產(chǎn)物。實(shí)施例42制備(S)-3-[(叔丁氧基羰基)-N-甲基氨基]-2-氧代-1-氮雜乙酸(“叔丁氧羰基-N-甲基正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸”)向?qū)嵤├?1的化合物(11.71g，0.030mol)在200ml乙醇中的溶液中加入10％鈀炭催化劑(1.17g)，在Parr振蕩器上在40psi將混合物氫化6小時(shí)。濾去催化劑并除去溶液，得到定量的無色泡沫狀產(chǎn)物。TLC(硅膠；CH2Cl2/MeOH/HOAc為27∶3∶1)確定其為純產(chǎn)物。實(shí)施例43制備N-(叔丁氧羰基-N-甲基-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸)-Ng-硝基-L-精氨醛乙基環(huán)醇將實(shí)施例42的化合物(6.01g，0.020mol)溶解在80ml乙腈中，并用實(shí)施例15的化合物(Ng-硝基-L-精氨醛乙基環(huán)醇鹽酸鹽，5.89g，0.022mol)、1-羥基苯并三唑單水合物(3.06g，0.020mol)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(5.75g，0.030mol)處理之。在環(huán)境溫度下將得到的溶液攪拌20分鐘，接著用N，N-二異丙基乙胺(12.83g，0.10mol，17.3ml)處理之。將反應(yīng)混合物攪拌22小時(shí)，用700ml乙酸乙酯稀釋，并用2×50ml 1N HCl、碳酸氫鈉飽和溶液和鹽水洗滌。有機(jī)層用硫酸鎂干燥，過濾并在真空中蒸發(fā)，得到黃色泡沫狀物，在硅膠閃蒸色譜上使用95∶5二氯甲烷/乙醇作為洗脫液純化該泡沫狀物，得到產(chǎn)物。TLC(硅膠；9∶1二氯甲烷/乙醇)確定其為純產(chǎn)物。實(shí)施例44制備N-(叔丁氧羰基-N-甲基-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛乙基環(huán)醇將實(shí)施例43的化合物(6.99g，0.0136mol)溶解在200ml 4∶1∶1乙醇/水/乙酸的混合物中，加入10％的鈀炭催化劑(3.5g)。在Parr振蕩器上在50psi將混合物氫化26小時(shí)。濾去催化劑并蒸發(fā)濾液。將殘余物溶解在1∶1乙醇/乙腈的混合物中，再次蒸發(fā)。使用真空泵將壓力抽至小于1mmHg并保持3天，得到接近定量的粗產(chǎn)物。TLC(硅膠；20∶10∶2的二氯甲烷/甲醇/氫氧化銨)確定其為純產(chǎn)物。實(shí)施例45制備N-(N-甲基-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛 將實(shí)施例44的化合物(2.64g，5.0mmol)溶解在3N HCl(80ml)中并在環(huán)境溫度下攪拌2.5小時(shí)。在50×300mm C18柱上在1小時(shí)內(nèi)使用反相HPLC對反應(yīng)混合物進(jìn)行純化，使用梯度范圍為0-20％的乙腈/水/0.1％TFA作為洗脫液，得到標(biāo)題化合物。RP/HPLC分析顯示產(chǎn)物具有三個(gè)峰。
實(shí)施例46至55將描述合成N-[D，L-3-氨基-3-芐基-2-氧代-1-哌啶乙酰]-L-精氨醛雙三氟醋酸鹽(30)或D，L-α-芐基-正纈氨酸(環(huán))-甘氨酸-L-精氨醛雙三氟醋酸鹽(30)。該合成的反應(yīng)流程圖見圖10。實(shí)施例46制備(S)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-氧代-1-哌啶乙酸(21) 按照實(shí)施例1的方法制得化合物21。實(shí)施例47制備(S)-3-氨基-2-氧代-1-哌啶乙酸乙酯(22)；或正纈氨酸(環(huán))甘氨酸-O-乙酯(22)在0℃，向化合物21(5.45g，0.020mol)在20ml無水乙醇中的溶液中加入12N HCl的乙醇溶液(50.0ml，0.60mol)。在0℃將該溶液攪拌1小時(shí)，接著在環(huán)境溫度下攪拌3小時(shí)。蒸去溶劑，將殘余物溶解在乙醇-乙腈為1∶1的混合物中并蒸發(fā)，共兩次。用真空泵將壓力抽至低于1mmHg，并保持24小時(shí)后，得到4.84g(接近定量)粘稠淺棕色泡沫狀產(chǎn)物22，TLC(二氧化硅；二氯甲烷/甲醇/濃氫氧化銨為27∶3∶1)Rf＝0.35。實(shí)施例48制備(S)-3-亞芐基氨基-2-氧代-1-哌啶乙酸乙酯(23)；或N-亞芐基正纈氨酸(環(huán))甘氨酸-O-乙酯(23)在0℃，在氮?dú)夥罩邢蚧衔?2(4.7586g，0.0200mol)和苯甲醛(2.1224g，0.0200mol，2.03ml)在50ml二氯甲烷中的溶液中加入無水硫酸鎂(5.0g)和Et3N(4.05g，0.040mol，5.58ml)。將該混合物從0℃至環(huán)境溫度攪拌21小時(shí)，在氮?dú)夥障逻^濾并蒸去溶劑。殘余物溶解在300ml二乙醚中。用50ml水(3次)、鹽水依次萃取，硫酸鎂干燥，在氮?dú)夥罩羞^濾并蒸發(fā)，得到5.13g(89％產(chǎn)量)淡黃色粘性油狀產(chǎn)物23。該物質(zhì)容易水解，在0℃氮?dú)夥罩袃?chǔ)存。實(shí)施例49制備D，L-3-亞芐基氨基-3-芐基2-氧代-1-哌啶乙酸乙酯(24)；或D，L-N-亞芐基-α-芐基正纈氨酸(環(huán))-甘氨酸-O-乙酯(24)在室溫，氮?dú)夥障孪騅Ot-Bu(5.25ml 1M的THF溶液，5.25mmol)溶液中快速滴入化合物23(1.4417g，5.00mmol)在5ml無水THF中的溶液，以使溫度保持在約30℃。在環(huán)境溫度下將生成的深紅棕色溶液攪拌1小時(shí)，隨后一次加入溴芐(855.2mg，5.00mmol，0.60ml)?？捎^察到平穩(wěn)的放熱使溫度升高至45℃，伴隨著快速的顏色變化，并形成沉淀。經(jīng)過22小時(shí)的反應(yīng)后，用二乙醚稀釋該混合物，用25ml水(2次)、鹽水依次萃取，用硫酸鎂干燥，過濾，蒸發(fā)得到1.6834g(89％產(chǎn)量)粘性的黃色油狀產(chǎn)物24。該物質(zhì)容易水解，在0℃氮?dú)夥罩袃?chǔ)存。實(shí)施例50制備D，L-3-氨基-3-芐基2-氧代-1-哌啶乙酸乙酯鹽酸鹽(25)；或D，L-α-芐基正纈氨酸(環(huán))-甘氨酸-O-乙酯鹽酸鹽(25)在室溫，將化合物24(1.5722g，4.15mmol)在5ml二乙醚和50ml 1N HCl中的混合物劇烈攪拌2小時(shí)。使用3×50ml二乙醚萃取該溶液，將水溶液短時(shí)間地放置在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(roto-vap)中除去痕量醚，隨后凍干3天得到黃色泡沫狀物，將該泡沫狀物溶解在25ml無水乙醇中，冷卻至0℃并用12N HCl乙醇溶液(3.46ml，41.5mmol)處理之。將該溶液溫?zé)嶂镰h(huán)境溫度并在14小時(shí)后蒸去溶劑。一次加入乙醇-乙腈為1∶1的溶液，再次蒸發(fā)溶液，將殘余物的壓力抽至小于1mmHg的高真空，并保持12小時(shí)，得到1.3013g(96％產(chǎn)量)黃色玻璃狀產(chǎn)物25。TLC(二氧化硅；二氯甲烷∶甲醇∶濃氫氧化銨＝27∶3∶1)Rf＝0.55。實(shí)施例51制備D，L-3-(叔丁氧基羰基)氨基-3-芐基-2-氧代-1-哌啶乙酸乙酯(26)；或D，L-叔丁氧羰基-α-芐基正纈氨酸(環(huán))-甘氨酸-O-乙酯(26)向化合物25(653.6mg，2.00mmol)在6mlTHF中的溶液中加入2ml飽和碳酸氫鈉和二碳酸二叔丁酯(di-tert-butyl dicarbonate)(458.3mg，2.10mmol)。在室溫將混合物攪拌17小時(shí)，用100ml乙酸乙酯稀釋之，隨后用2×10ml鹽水萃取，用硫酸鎂干燥，過濾并蒸發(fā)。在硅膠閃蒸色譜上純化殘余物，用梯度范圍為9∶1-4∶1的己烷-乙酸乙酯作為洗脫液，得到597.5mg(77％產(chǎn)量)無色、無定形固體產(chǎn)物(化合物26)。TLC(二氧化硅；己烷∶乙酸乙酯為1∶1)Rf＝0.45。實(shí)施例52制備D，L-3-(叔丁氧基羰基)氨基-3-芐基2-氧代-1-哌啶乙酸(27)；或D，L-叔丁氧羰基-α-芐基正纈氨酸(環(huán))-甘氨酸-OH(27)在0℃，向化合物26(577.9mg，1.48mmol)在8ml乙醇中的溶液中加入1MLiOH溶液(3.7ml，3.7mmol)，在0℃將該溶液攪拌30分鐘隨后在室溫下攪拌2小時(shí)。加入Dowex 50X8-400(H＋型，3.0g)，攪拌15分鐘后濾出樹脂，用新鮮的乙醇∶水為1∶1的溶液洗滌，蒸發(fā)濾液。將殘余物的壓力抽至小于1mmHg的高真空并保持20個(gè)小時(shí)，其間偶爾溫和地加熱。得到524.4mg(98％產(chǎn)量)無色、無定形固體產(chǎn)物27。TLC(二氧化硅；二氯甲烷/甲醇/乙酸為27∶3∶1)Rf＝0.55。實(shí)施例53制備N-[D，L-3-(叔丁氧基羰基)氨基-3-芐基2-氧代-1-哌啶乙酰]-N\+g-硝基-L-精氨醛乙基環(huán)醇(28)；或D，L-叔丁氧羰基-α-芐基正纈氨酸(環(huán))-甘氨酸-Ng-硝基-L-精氨醛乙基環(huán)醇(28)在室溫，氮?dú)夥罩邢蚧衔?7(510.0mg，1.407mmol)在14ml無水乙腈中的溶液中加入Ng-硝基-L-精氨醛乙基環(huán)醇(452.4mg，1.69mmol)、1-羥基苯并三唑單水合物(215.9mg，1.41mmol)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(405.2mg，2.12mmol)。將混合物攪拌15分鐘后，加入N，N-二異丙基乙胺(727.4mg，5.65mmol，0.98ml)。將生成的澄清淡棕色溶液在室溫下攪拌3天，然后用100ml乙酸乙酯稀釋反應(yīng)混合物，并用25ml 0.1N HCl(2次)、碳酸氫鈉飽和溶液(2次)、水和鹽水依次萃取。隨后用硫酸鎂干燥，過濾并蒸發(fā)，粗產(chǎn)物在硅膠閃蒸色譜上使用梯度范圍為二氯甲烷/乙醇為98∶2-95∶5的混合溶液作為洗脫液純化，得到644.9mg淺黃色泡沫狀產(chǎn)物。用兩小份二乙醚研制(trituration)，得到540.5mg(67％產(chǎn)量)無色、無定形固體產(chǎn)物28；TLC(硅膠；乙酸乙酯)Rf＝0.27。實(shí)施例54制備N-[D，L-3-(叔丁氧基羰基)氨基-3-芐基2-氧代-1-哌啶乙酰]-L-精氨醛乙基環(huán)醇醋酸鹽(29)；或D，L-叔丁氧羰基-α-芐基正纈氨酸(環(huán))-甘氨酸-L-精氨醛乙基環(huán)醇醋酸鹽(29)向化合物28(508.5mg，0.8833mmol)在40ml 4∶1∶1乙醇/乙酸/水中的溶液中，加入10％的鈀炭催化劑(254mg)。在Parr振蕩器上在60psi將混合物氫化8小時(shí)。過濾并蒸去溶劑。將殘余物溶解在1∶1乙醇/乙腈的混合物中，再次蒸發(fā)。使用真空泵將壓力抽至小于1mmHg并保持24小時(shí)，得到562.5mg(接近定量)無色、無定形固體產(chǎn)物29。TLC(二氧化硅；20∶10∶2的二氯甲烷/甲醇/濃氫氧化銨)Rf＝0.45，0.30(兩種異構(gòu)體)。實(shí)施例55制備N-[D，L-3-氨基-3-芐基-2-氧代-1-哌啶乙酰]-L-精氨醛雙三氟醋酸鹽(30)；或D，L-α-芐基正纈氨酸(環(huán))甘氨酸-L-精氨醛雙三氟醋酸鹽(30)在環(huán)境溫度，將化合物29(514.4mg，0.871mmol)加至30ml 3N HCl中。將該溶液攪拌3小時(shí)，過濾，在50×300mm C18柱上使用反相HPLC對濾液進(jìn)行純化，在1小時(shí)內(nèi)使用梯度范圍為0-18％乙腈/水(含0.1％三氟乙酸)作為洗脫液，得到64mg(12％產(chǎn)量)無色、無定形固體產(chǎn)物30。RP/HPLC分析顯示兩種異構(gòu)產(chǎn)物具有五個(gè)峰。質(zhì)譜確認(rèn)其具有402的理論分子量。
實(shí)施例56至64將描述合成N-[D，L-3-氨基-3-芐基-六氫-2-氧代-氮雜-1-乙酰]-L-精氨醛雙三氟醋酸鹽(39)；或D，L-α-芐基正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸-L-精氨醛雙三氟醋酸鹽(39)。合成的反應(yīng)流程圖見圖11。實(shí)施例56制備N-亞芐基-α-氨基-ε-己內(nèi)酰胺(31)攪拌α-氨基-ε-己內(nèi)酰胺(31.42g，0.245mol)和苯甲醛(26.00g，0.245mol)在490ml苯中的溶液，并用迪安-斯達(dá)克榻分水器共沸回流4小時(shí)。蒸去溶劑，將殘余物的壓力抽至小于1mmHg的真空并保持24小時(shí)，得到52.98g(定量)很粘的金黃色油狀產(chǎn)物31。該物質(zhì)是水解不穩(wěn)定的，儲(chǔ)存在0℃的氮?dú)夥罩小?shí)施例57制備D，L-α-芐基-N-亞芐基-α-氨基-ε-己內(nèi)酰胺(32)在室溫氮?dú)夥罩?，?0分鐘內(nèi)向化合物31(21.63g，0.100mol)在400ml無水THF中的溶液中快速滴入雙(三甲基甲硅烷基)胺基鋰(105.0ml 1M THF溶液，0.105mol)以使溫度保持在約30℃。在環(huán)境溫度將生成的桔黃色溶液攪拌2小時(shí)，冷卻至0℃，在30分鐘內(nèi)快速滴入溴芐(17.10g，0.10mol，11.9ml)在75ml無水THF中的溶液以使溫度保持在小于5℃。在0℃將反應(yīng)混合物攪拌2小時(shí)，隨后溫?zé)嶂潦覝胤胖?0小時(shí)。用100ml飽和NH4Cl中止反應(yīng)，用1.5升乙酸乙酯稀釋，用100ml水(2次)和鹽水(2次)依次萃?。挥昧蛩徭V干燥，過濾并蒸發(fā)，得到27.73g黃色固體粗產(chǎn)物。在二乙醚中重結(jié)晶，得到第一批13.80g無色固體，m.p.140-142℃。用二乙醚/己烷研制殘余物，得到第二和第三批固體，使產(chǎn)物32的總重量達(dá)到14.66g(48％產(chǎn)量)。該物質(zhì)是水解不穩(wěn)定的，儲(chǔ)存在0℃氮?dú)夥罩小?shí)施例58制備D，L-α-氨基-α-芐基-ε-己內(nèi)酰胺鹽酸鹽(33)向化合物32(14.60g，0.0476mol)在50ml二乙醚中的溶液中加入200ml1N HCl。在室溫劇烈攪拌該溶液5小時(shí)，隨后用3×5ml二乙醚萃取。將水溶液蒸發(fā)至干，一次加入乙醇/乙腈為1∶1的混合物，再將溶液蒸發(fā)至干。將殘余物的壓力抽至小于1mmHg的真空并保持3天，其間偶爾溫?zé)嶂?，得?2.9g(接近定量)金黃色泡沫狀產(chǎn)物33。TLC(二氧化硅；二氯甲烷/甲醇/濃氫氧化銨27∶3∶1)Rf＝0.50。實(shí)施例59制備D，L-α-芐基-α-(芐氧羰基)氨基-ε-己內(nèi)酰胺(34)在2分鐘內(nèi)，向粗產(chǎn)物33(12.90g，約0.0476mol)在100mlTHF和100ml碳酸氫鈉飽和溶液中的溶液中快速加入N-(芐氧基羰基氧)-琥珀酰亞胺(12.46g，0.050mol)。攪拌該溶液，在14小時(shí)內(nèi)使溫度由0℃升高至環(huán)境溫度，蒸去THF。向剩余的水相中加入固體NaCl，用1×200ml和2×100ml乙酸乙酯萃取之。用50ml水(2次)和鹽水分批萃取合并后的有機(jī)層，隨后用硫酸鎂干燥，過濾，并蒸發(fā)。用硅膠閃蒸色譜純化粗產(chǎn)物，使用梯度范圍為己烷/乙酸乙酯4∶1-1∶1作為洗脫液，得到13.19g(79％產(chǎn)量)無色固體產(chǎn)物34，m.p.129-130℃，TLC(二氧化硅；乙酸乙酯/己烷2∶1)Rf＝0.35。實(shí)施例60制備D，L-3-芐基-3-(芐氧羰基)氨基-六氫-2-氧代-氮雜-1-乙酸叔丁酯(35)，或D，L-芐氧羰基-α-芐基-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸-O-叔丁酯(35)在室溫氮?dú)夥障掠?0分鐘內(nèi)，向化合物34(1.616g，4.59mmol)在19ml無水THF中的溶液中快速滴入雙(三甲基甲硅烷基)胺基鋰(5.51ml 1M THF溶液，5.51mmol)以使溫度保持在約27℃。在環(huán)境溫度將生成的暗黃色溶液攪拌30分鐘，在10分鐘內(nèi)加入溴乙酸叔丁酯(1.074g，5.51mmol，0.81ml)在7ml無水THF中的溶液。在環(huán)境溫度將溶液攪拌20小時(shí)，用10ml飽和NH4Cl溶液中止反應(yīng)，用100ml乙酸乙酯稀釋，有機(jī)相用25ml水(2次)和鹽水(2次)依次萃取；用硫酸鎂干燥，過濾并蒸發(fā)，殘余物用硅膠閃蒸色譜純化，使用己烷/乙酸乙酯9∶1為洗脫液，得到1.290g(60％產(chǎn)量)粘性黃色油狀產(chǎn)物35。TLC(二氧化硅；己烷/乙酸乙酯1∶1)Rf＝0.50。實(shí)施例61制備D，L-3-芐基-3-(芐氧羰基)氨基-六氫-2H-2-氧代-氮雜-1-乙酸(36)，或D，L-芐氧羰基-α-芐基-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸-OH(36)在0℃，向化合物35(1.2603g，2.70mmol)在15ml二氯甲烷中的溶液中加入6ml三氟乙酸。在0℃保持10分鐘后，移去冰浴并在環(huán)境溫度將溶液攪拌1小時(shí)。蒸去溶劑，在硅膠閃蒸色譜上純化殘余物，使用二氯甲烷/乙醇9∶1為洗脫液，得到887.8mg(80％產(chǎn)量)無色、無定形固體產(chǎn)物36。TLC(二氧化硅；二氯甲烷/甲醇/乙酸27∶3∶1)Rf＝0.57。實(shí)施例62制備N-[D，L-3-芐基-3-(芐氧羰基)氨基-六氫-2-氧代-氮雜-1-乙酰]-Ng-硝基-L-精氨醛乙基環(huán)醇(37)，或D，L-芐氧羰基-α-芐基-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸-Ng-硝基-L-精氨醛乙基環(huán)醇(37)在室溫，氮?dú)夥罩邢蚧衔?6(872.8mg，2.1 26mmol)在22ml無水乙腈中的溶液中加入Ng-硝基-L-精氨醛乙基環(huán)醇(683.0mg，2.55mmol)、1-羥基苯并三唑單水合物(325.6mg，2.126mmol)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(611.0mg，3.19mmol)。將混合物攪拌15分鐘后，加入N，N-二異丙基乙胺(1.099g，8.50mmol，1.48ml)。將生成的澄清淡棕色溶液在室溫下攪拌18小時(shí)，然后用200ml乙酸乙酯稀釋反應(yīng)混合物，并用25ml 0.1N HCl(2次)、碳酸氫鈉飽和溶液(2次)、水和鹽水依次萃取。隨后用硫酸鎂干燥，過濾并蒸發(fā)，粗產(chǎn)物在硅膠閃蒸色譜上使用梯度范圍為乙酸乙酯/己烷為2∶1至純乙酸乙酯作為洗脫液純化，得到967.2mg(73％產(chǎn)量)無色泡沫狀產(chǎn)物37。TLC(二氧化硅；乙酸乙酯)Rf＝0.25。實(shí)施例63制備N-[D，L-3-氨基-3-芐基-六氫-2-氧代-氮雜-1-乙酰]-L-精氨醛乙基環(huán)醇二醋酸鹽(38)，或D，L-α-芐基-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸-L-精氨醛乙基環(huán)醇二醋酸鹽(38)向化合物37(960.2mg，1.54mmol)在100ml 4∶1∶1乙醇/乙酸/水中的溶液中，加入10％的鈀炭(480mg)。在Parr振蕩器上在55psi將混合物氫化21小時(shí)。過濾并蒸去溶劑。將殘余物溶解在1∶1乙醇/乙腈的混合物中，再次蒸發(fā)。使用真空泵將壓力抽至小于1mmHg并保持24小時(shí)，得到856.7mg(99％粗產(chǎn)量)黃色泡沫狀產(chǎn)物38。TLC(二氧化硅；20∶10∶2的二氯甲烷/甲醇/濃氫氧化銨)Rf＝0.40，0.35(兩種異構(gòu)體)。實(shí)施例64制備N-[D，L-3-氨基-3-芐基-六氫-2-氧代-氮雜-1-乙酰]-L-精氨醛雙三氟醋酸鹽(39)，或D，L-α-芐基-正亮氨酸(環(huán))甘氨酸-L-精氨醛雙三氟醋酸鹽(39)在環(huán)境溫度，將化合物38(840.0mg，1.49mmol)加至50ml 3N HCl中。將該溶液攪拌3小時(shí)，過濾，在50×300mm C18柱上在1小時(shí)內(nèi)使用反相HPLC對濾液進(jìn)行純化，使用梯度范圍為0-75％乙腈/水(含0.1％三氟乙酸)作為洗脫液，得到348.2mg(36％產(chǎn)量)無色、無定形固體產(chǎn)物39。RP/HPLC分析顯示兩種異構(gòu)產(chǎn)物具有五個(gè)峰。質(zhì)譜確認(rèn)其具有416的理論分子量。
實(shí)施例65至72(a)將描述合成N-[((S)-3-N-苯基乙基氨基-2-氧代-1-哌啶乙酰]-L-精氨醛雙三氟醋酸鹽(47)；合成的反應(yīng)流程圖見圖12。實(shí)施例65制備(S)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-氧代-1-哌啶乙酸芐酯(40)向化合物21(20.0g，0.0735mol；見實(shí)施例46)在700ml無水乙腈和30ml無水N，N-二甲基甲酰胺中的懸浮液中加入無水K2CO3粉末(12.68g，0.0918mol)，隨后加入溴芐(13.81g，0.0808mol，9.61ml)。將混合物攪拌并劇烈地回流6小時(shí)，冷卻、過濾并蒸發(fā)。用硅膠閃蒸色譜純化殘余物，使用梯度范圍為40-50％的乙酸乙酯/己烷作為洗脫液，得到25.5g(96％產(chǎn)量)淺黃色油狀產(chǎn)物40。TLC(硅膠；乙酸乙酯/己烷1∶1)Rf＝0.35。實(shí)施例66制備(S)-3-氨基-2-氧代-1-哌啶乙酸芐酯鹽酸鹽(41)在室溫，向化合物40(4.00g，0.0110mol)在10ml乙酸乙酯中的溶液中一次加入5N HCl在乙酸乙酯中的溶液(50ml，新鮮制得的，0.25mol)。將該溶液攪拌3小時(shí)，蒸去溶劑，加入二氯甲烷，再次蒸去溶劑。用真空泵將殘余物的壓力抽至小于1mmHg并保持24小時(shí)，得到3.37g(接近定量)無色泡沫狀產(chǎn)物41。TLC(硅膠；二氯甲烷/甲醇/濃氫氧化銨27∶3∶1)Rf＝0.32。實(shí)施例67制備(S)-3-苯基乙基氨基-2-氧代-1-哌啶乙酸芐酯鹽酸鹽(42)向化合物41(1.50g，5.02mmol)和苯基乙醛(0.724g，6.03mmol)在35ml1，2-二氯乙烷中的混合物中加入三乙胺(2.03g，21.1mmol，2.80ml)。在環(huán)境溫度攪拌10分鐘后，在5分鐘內(nèi)快速地加入三乙酰氧基硼氫化鈉(1.49g，7.03mmol)。在室溫將反應(yīng)混合物攪拌15小時(shí)，加入30ml水中止反應(yīng)。用50ml二氯甲烷稀釋該混合物，分離有機(jī)層，用30ml碳酸氫鈉飽和溶液，水和鹽水依次洗滌之；用硫酸鎂干燥，過濾并蒸發(fā)。殘余物用硅膠閃蒸色譜純化，用二氯甲烷/乙醇95∶5洗脫，得到1.21g(66％產(chǎn)量)淺黃色油狀產(chǎn)物42；TLC(硅膠；二氯甲烷/乙醇9∶1)Rf＝0.4。實(shí)施例68制備(S)-3-[N-(叔丁氧基羰基)-N-苯基乙基氨基]-2-氧代-1-哌啶乙酸芐酯(43)向化合物42(1.19g，3.23mmol)在10ml四氫呋喃和10ml碳酸氫鈉飽和溶液中的混合物中加入二碳酸二叔丁酯(di-tert-butyl dicarbonate)(1.41g，6.47mmol)。在室溫將混合物攪拌1.5小時(shí)，用150ml乙酸乙酯稀釋之，隨后用30ml碳酸氫鈉飽和溶液、1NHCl和鹽水依次萃取，用硫酸鎂干燥，過濾并蒸發(fā)。在硅膠閃蒸色譜上純化殘余物，用梯度范圍為己烷∶乙酸乙酯＝2∶1作為洗脫液，得到1.06g(70％產(chǎn)量)無色油狀產(chǎn)物43。TLC(二氧化硅；己烷∶乙酸乙酯為2∶1)Rf＝0.15。實(shí)施例69制備(S)-3-[N-(叔丁氧基羰基)-N-苯基乙基氨基]-2-氧代-1-哌啶乙酸(44)向化合物43(1.06g，2.27mmol)在35ml甲醇中的溶液中加入10％鈀炭催化劑(127mg)，在Parr振蕩器上在45psi將混合物氫化2小時(shí)。過濾并蒸去溶劑。使用真空泵將壓力抽至小于1mmHg并保持10小時(shí)使殘余物干燥，得到0.836g(98％產(chǎn)量)無色泡沫狀產(chǎn)物44。TLC(二氧化硅；27∶3∶1的二氯甲烷/甲醇/乙酸)Rf＝0.40。實(shí)施例70制備N-[(S)-3-[N-(叔丁氧基羰基)-N-苯基乙基氨基]-2-氧代-1-哌啶乙酰]-Ng-硝基-L-精氨醛乙基環(huán)醇(45)在室溫，氮?dú)夥罩邢蚧衔?4(836.0mg，2.22mmol)在20ml無水乙腈中的溶液中加入Ng-硝基-L-精氨醛乙基環(huán)醇(712.0mg，2.66mmo1)、1-羥基苯并三唑單水合物(340.0mg，2.22mmol)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(638.0mg，3.33mmol)。將混合物攪拌10分鐘后，加入N，N-二異丙基乙胺(1.15g，8.88mmol，1.55ml)。將生成的澄清淡棕色溶液在室溫下攪拌18小時(shí)，蒸去溶劑，殘余物溶解在150ml乙酸乙酯中，用25ml 1N HCl(2次)、碳酸氫鈉飽和溶液(2次)、水和鹽水依次萃取。隨后用硫酸鎂干燥，過濾并蒸發(fā)，粗產(chǎn)物在硅膠閃蒸色譜上使用二氯甲烷/異丙醇為95∶5的混合溶液作為洗脫液純化，得到1.305g(99％產(chǎn)量)無色泡沫狀產(chǎn)物45。TLC(二氧化硅；二氯甲烷/甲醇/濃氫氧化銨25∶5∶1)Rf＝0.65。實(shí)施例71制備N-[(S)-3-[N-(叔丁氧基羰基)-N-苯基乙基氨基]-2-氧代-1-哌啶乙酰]-L-精氨醛乙基環(huán)醇三氟醋酸鹽(46)向化合物45(933.0mg，1.58mmol)在20ml 4∶1∶1乙醇/乙酸/水中的溶液中，加入10％的鈀炭(280mg)。在Parr振蕩器上在45psi將混合物氫化20小時(shí)。過濾并蒸去溶劑。在1小時(shí)內(nèi)將殘余物在50×300mm C18柱上進(jìn)行反相HPLC純化，使用梯度范圍為5-75％的乙腈/水(含0，1％三氟乙酸)作為洗脫液，得到668mg(64％產(chǎn)量)無色、無定形固體產(chǎn)物46。TLC(二氧化硅；20∶10∶2的二氯甲烷/甲醇/濃氫氧化銨)Rf＝0.40。實(shí)施例72(a)制備N-[(S)-3-N-苯基乙基氨基-2-氧代-1-哌啶乙酰]-L-精氨醛三氟醋酸鹽(47)在環(huán)境溫度，將化合物46(543.0mg，0.824mmol)加至20ml 3N HCl中。將該溶液攪拌3小時(shí)，過濾，在50×300mm C18柱上在1小時(shí)內(nèi)使用反相HPLC對濾液進(jìn)行純化，使用梯度范圍為0-75％的乙腈/水(含0.1％三氟乙酸)作為洗脫液，得到334mg(63％產(chǎn)量)無色、無定形固體產(chǎn)物47。RP/HPLC分析顯示產(chǎn)物具有3個(gè)峰。質(zhì)譜確認(rèn)其具有416的理論分子量。實(shí)施例72(b)制備N-[(S)-3-N-苯基丙基氨基-2-氧代-1-哌啶乙酰]-L-精氨醛三氟醋酸鹽按照實(shí)施例67至72(a)中的步驟，但使用3-苯基丙醛代替苯基乙醛合成標(biāo)題化合物。RP/HPLC分析顯示產(chǎn)物具有3個(gè)峰。質(zhì)譜確認(rèn)其具有430的理論分子量。
實(shí)施例73-80描述了合成N-[(S)-3-N-苯基乙基氨基-六氫-2-氧代氮雜-1-乙酰]-L-精氨醛雙三氟乙酸鹽(56)。合成反應(yīng)流程圖見圖13。實(shí)施例73制備(S)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-六氫-2-氧代-1-氮雜乙酸乙酯(49)在環(huán)境溫度下，在氮?dú)夥罩邢蚧衔?8(4.57g，0.020mol，見實(shí)施例27)在100ml無水四氫呋喃中的溶液快速滴入雙(三甲基甲硅烷基)胺基鋰(26.0ml1M在四氫呋喃中的溶液，Aldrich，0.026mol)以便將溫度保持在約30℃。將該溶液攪拌15分鐘，然后快速加入溴乙酸乙酯(6.68g，0.040mol，4.44ml)在10ml無水四氫呋喃中的溶液，以便將溫度保持在約32℃。經(jīng)過1小時(shí)反應(yīng)以后，加入50ml氯化銨飽和溶液以中止反應(yīng)，用400ml乙酸乙酯稀釋之，接著用2×50ml水、1×50ml鹽水萃??；用硫酸鎂干燥，過濾并蒸發(fā)。粗產(chǎn)物用硅膠閃蒸色譜純化，使用2∶1的己烷/乙酸乙酯洗脫，得到5.23g(83％產(chǎn)量)黃色粘稠油狀產(chǎn)物49；TLC(硅膠；1∶1乙酸乙酯/己烷)Rf＝0.4。實(shí)施例74制備(S)-3-氨基-六氫-2-氧代-1-氮雜乙酸乙酯鹽酸鹽(50)在0℃，向化合物49(3.143g，0.0100mol)在20ml乙醇中的溶液中一次加入12N HCl的乙醇溶液(27.0ml，0.32mol)。將得到的溶液在0℃攪拌5分鐘，接著在環(huán)境溫度攪拌1小時(shí)。蒸去溶劑，加入無水乙腈(100ml)，再次蒸去溶劑。殘余物用真空泵將壓力抽至小于1mmHg并將該壓力保持20小時(shí)，得到2.410g(96％產(chǎn)量)淺黃色泡沫狀產(chǎn)物50。TLC(硅膠；25∶5∶1二氯甲烷/甲醇/濃氫氧化銨)Rf＝0.63。實(shí)施例75制備(S)-3-苯基乙基氨基-六氫-2-氧代-1-氮雜乙酸乙酯(51)向化合物50(6.00g，23.9mmol)和苯基乙醛(4.21g，35.0mmol，4.1ml)在170ml 1，2-二氯乙烷中的混合物中加入三乙胺(9.67g，95.6mmol，13.3ml)，在環(huán)境溫度攪拌10分鐘后，在15分鐘內(nèi)快速分批加入三乙酰氧基硼氫化鈉(7.09g，33.5mmol)。在環(huán)境溫度將反應(yīng)混合物攪拌21小時(shí)，加入140ml水中止反應(yīng)。用170ml二氯甲烷稀釋混合物，分離有機(jī)層，用150ml碳酸氫鈉飽和溶液、水、鹽水依次洗滌；以硫酸鎂干燥，過濾并蒸發(fā)。殘余物用硅膠閃蒸色譜純化，用二氯甲烷/乙醇97∶3的溶液洗脫，得到5.22g(69％產(chǎn)量)淺黃色油狀產(chǎn)物51，TLC(硅膠；二氯甲烷/甲醇/濃氫氧化銨27∶3∶1)Rf＝0.55。實(shí)施例76制備(S)-3-[N-(叔丁氧基羰基)-N-苯基乙基氨基]-六氫-2-氧代-氮雜乙酸乙酯(52)向化合物51(5.22g，16.4mmol)在50ml四氫呋喃和50ml碳酸氫鈉飽和溶液中的混合物加二碳酸二叔丁酯(di-tert-butyl dicarbonate)(7.16g，32.8mmol)。在室溫將混合物攪拌2小時(shí)，用350ml乙酸乙酯稀釋之，隨后用50ml飽和碳酸氫鈉溶液，1N HCl和鹽水依次萃取，用硫酸鎂干燥，過濾并蒸發(fā)。在硅膠閃蒸色譜上純化殘余物，用己烷/乙酸乙酯＝2∶1作為洗脫液，得到5.77mg(84％產(chǎn)量)淡黃色油狀產(chǎn)物52。TLC(二氧化硅；己烷/異丙醇為95∶5)Rf＝0.45。實(shí)施例77制備(S)-3-[N-(叔丁氧基羰基)-N-苯基乙基氨基]-六氫-2-氧代-氮雜乙酸(53)在室溫，向化合物52(5.77g，13.8mmol)在70ml乙醇中的溶液中加入1MLiOH溶液(31.0ml，31.0mmol)，在室溫將該溶液攪拌2小時(shí)。加入Dowex50X8-400(H＋型，15.0g)，攪拌15分鐘后濾去樹脂，用新鮮的乙醇/水為1∶1的溶液洗滌，蒸發(fā)濾液。將殘余物的壓力抽至小于1mmHg的高真空并保持20個(gè)小時(shí)，其間偶爾溫和地加熱。得到5.08g(94％產(chǎn)量)無色、無定形固體產(chǎn)物53。TLC(二氧化硅；二氯甲烷/甲醇/乙酸為27∶3∶1)Rf＝0.5。實(shí)施例78制備N-[(S)-3-[N-(叔丁氧基羰基)-N-苯基乙基氨基]-六氫-2-氧代-氮雜-1-乙酰]-Ng-硝基-L-精氨醛乙基環(huán)醇(54)在室溫，氮?dú)夥罩邢蚧衔?3(1.50mg，3.84mmol)在40ml無水乙腈中的溶液中加入Ng-硝基-L-精氨醛乙基環(huán)醇(1.34g，4.99mmol)、1-羥基苯并三唑單水合物(0.52g，3.84mmol)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(1.10g，5.76mmol)。將混合物攪拌15分鐘后，加入N，N-二異丙基乙胺(1.99g，15.4mmol，2.68ml)。將生成的澄清淡棕色溶液在室溫下攪拌22小時(shí)，蒸去溶劑，殘余物溶解在300ml乙酸乙酯中，用25ml 1N HCl(2次)、碳酸氫鈉飽和溶液(2次)和鹽水依次萃取。隨后用硫酸鎂干燥，過濾并蒸發(fā)，粗產(chǎn)物在硅膠閃蒸色譜上純化，使用梯度范圍為二氯甲烷/乙醇為98∶2-96∶4的混合溶液作為洗脫液，得到1.64g(71％產(chǎn)量)無色泡沫狀產(chǎn)物54。TLC(二氧化硅；二氯甲烷/甲醇/濃氨水25∶5∶1)Rf＝0.7。實(shí)施例79制備N-[(S)-3-[N-(叔丁氧基羰基)-N-苯基乙基氨基]-六氫-2-氧代-氮雜-1-乙酰]-L-精氨醛乙基環(huán)醇醋酸鹽(55)向化合物54(1.64g，2.72mmol)在30ml 4∶1∶1乙醇/乙酸/水中的溶液中，加入10％的鈀炭催化劑(250mg)。在Parr振蕩器上在45psi將混合物氫化19小時(shí)。另外再加入10％鈀炭(1.00g)并使氫化再持續(xù)21小時(shí)。過濾溶液并蒸去溶劑。將殘余物溶解在無水乙腈中，再次蒸發(fā)。將殘余物的壓力抽至小于1mmHg并保持24小時(shí)，得到1.75g(接近定量)無色、無定形固體產(chǎn)物55。TLC(二氧化硅；20∶10∶2的二氯甲烷/甲醇/濃氫氧化銨)Rf＝0.45。實(shí)施例80制備N-[(S)-3-N-苯基乙基氨基-六氫-2-氧代-氮雜-1-乙酰]-L-精氨醛雙三氟醋酸鹽(56)在環(huán)境溫度，將化合物55(1.46g，2.36mmol)加至50ml 3N HCl中。將該溶液攪拌3.5小時(shí)，過濾，在50×300mm C18柱上在1小時(shí)內(nèi)使用反相HPLC對濾液進(jìn)行純化，使用梯度范圍為0-15％的乙腈/水(含0.1％三氟乙酸)作為洗脫液，得到1.19g(77％產(chǎn)量)無色、無定形固體產(chǎn)物56。RP/HPLC分析顯示產(chǎn)物具有3個(gè)峰。質(zhì)譜確認(rèn)其具有430的理論分子量。實(shí)施例81(S)-3-氨基-2-氧代哌啶-1-乙酸芐酯鹽酸鹽與磺?；虬被酋Ｂ确磻?yīng)的通用步驟向?qū)嵤├?6的化合物(8.96g，0.030mol)在30ml無水乙腈中的溶液中加入適量的實(shí)施例35所列的磺?；虬被酋Ｂ?0.033mol)，在氮?dú)夥罩袑⑷芤豪鋮s至0℃。滴入三乙胺(6.68g，0.066mol，9.20ml)在25ml無水乙腈中的溶液使溫度保持在小于5℃。在0℃將生成的混合物攪拌1小時(shí)，隨后在環(huán)境溫度攪拌約2-20小時(shí)，過濾，在真空中蒸去溶劑。殘余物在硅膠閃蒸色譜上純化，使用梯度范圍為二氯甲烷和10％-約50％的乙酸乙酯在二氯甲烷中的溶液洗脫，得到產(chǎn)物。TLC(硅膠)確定其為純產(chǎn)物。
使用本方法和實(shí)施例35所列的原料，可制得具有下列通式(R如實(shí)施例35所定義)的中間體 實(shí)施例82制備本發(fā)明化合物的通用步驟按照實(shí)施例31至34所列的四步步驟(氫化，偶合，氫化和水解)，使用實(shí)施例81的中間體合成本發(fā)明下列化合物(作為它們的三氟乙酸鹽) N-(1-萘基-SO2-正纈氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛(化合物82(a)) N-(環(huán)己基氨基-SO2-正纈氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛(化合物82(b)) N-(2-萘基-SO2-正纈氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛(化合物82(c)) N-(苯基-SO2-正纈氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛(化合物82(d)) N-(對甲苯基-SO2-正纈氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛(化合物82(e)) N-(2-甲氧羰基苯基-SO2-正纈氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛(化合物82(f))實(shí)施例83(S)-3-氨基-2-氧代-六氫-1-氮雜乙酸芐酯鹽酸鹽與膦?；然锏难苌锓磻?yīng)的通用步驟下面所列的取代的膦?；然镉晌墨I(xiàn)所描述的方法制得，參見H.J.Musiol，F(xiàn).Grams，S.Rudolph-Bohner and L.Moroder，J.Org.Chem.，596144-6146(1994)及其所引用的參考文獻(xiàn)。向?qū)嵤├?9的化合物(9.38g，0.030mol)在300ml無水乙腈中的溶液中加入適當(dāng)?shù)南旅嫠械撵Ⅴ；然锏难苌?0.033mol)，在氮?dú)夥罩袑⑷芤豪鋮s至0℃。滴入三乙胺(6.68g，0.066mol，9.20ml)在25ml無水乙腈中的溶液使溫度保持在小于5℃。在0℃將生成的混合物攪拌1小時(shí)，隨后在環(huán)境溫度攪拌約2-20小時(shí)，過濾，在真空中蒸去溶劑。殘余物在硅膠閃蒸色譜上純化，使用梯度范圍為二氯甲烷和10％-約50％的乙酸乙酯在二氯甲烷中的溶液洗脫，得到產(chǎn)物。TLC(硅膠)確定其為純產(chǎn)物。
使用本方法和下面所列的原料，可制得具有下列通式的中間體 R1R″ 原料(所需的量)芐基 OEtBnPO(OEt)(Cl) (7.21g)芐基 Me BnPO(Me)(Cl) (6.22g)芐基 NHMe BnPO(NHMe)(Cl) (6.72g)芐基 S-iPr BnPO(S-iPr)(Cl)(8.21g)實(shí)施例84制備本發(fā)明化合物的通用步驟按照實(shí)施例31至34所列的四步步驟(氫化，偶合，氫化和水解)，使用實(shí)施例83的中間體合成本發(fā)明下列化合物(作為它們的三氟乙酸鹽) N-(芐基-PO-(OEt)-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛， N-(芐基-PO-(Me)-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛， N-(芐基-PO-(NHMe)-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛， N-(芐基-PO-(S-i-Pr)-正亮氨酸(環(huán))-甘氨酸)-L-精氨醛。實(shí)施例A化合物在體外凝血酶抑制試驗(yàn)中的動(dòng)力學(xué)分析通過測定抑制常數(shù)Ki評價(jià)實(shí)施例8的化合物，后文稱BzlSO2-正Val(環(huán))-Gly-Arg-al和實(shí)施例34的化合物，后文稱N-(BnSO2-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛作為凝血酶催化活性的抑制劑的能力。
使用購自Pentapharm Ltd.的生色底物Pefachrome t-PA(CH3SO2-六氫酪氨酸-甘氨酰-L-精氨醛-對硝基酰苯胺)測定酶活性。使用前，此底物在去離子水中再生。由Enzyme Research Laboratories，Inc.購得純化的人α-凝血酶(比活性3000U/mg)。全部試驗(yàn)中使用的緩沖液都是HBSA(10mM HEPES，pH7.5，150mM氯化鈉，0.1％牛血清白蛋白)。
在Corning微量滴定板的合適孔格中，混合50微升HBSA，50微升被測化合物在HBSA中的一定濃度的稀釋液(或是用于V。(未受抑制的速度)測定的純HBSA)和50微升生色底物(250mM，5×Km)。在0時(shí)間，孔中加入50微升稀釋于HBSA中的α凝血酶，使其在總體積200微升中的最終濃度為0.5nM。使用Thermo MaxKinetic Microplate Reader測定40分鐘內(nèi)在405nm波長的吸光度變化，由此測定40分鐘內(nèi)生色底物的水解速度。根據(jù)Williams和Morri-son在Methods in Enzymology，63437(1979)中提出的關(guān)系式，使用40分鐘內(nèi)測得的穩(wěn)態(tài)速度(Vs)測定被測化合物的Ki。在本試驗(yàn)過程中，底物的水解程度低于5％。
表1列出了BzlSO2-正Val(環(huán))-Gly-Arg-al和N-(BnSO2-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛的Ki。此數(shù)據(jù)顯示了這些化合物作為有效的人α凝血酶體外抑制劑的效果。
表1

*平均值±SD，n＝3實(shí)施例B用于測定特異性的體外酶試驗(yàn)測定被測化合物抑制此酶活性50％的濃度(IC50)，將該值與對以下某些或全部相關(guān)的絲氨酸蛋白酶測得的濃度相比較重組組織血纖維蛋白溶酶原活化劑(rt-PA)、血纖維蛋白溶酶、活性蛋白C(aPC)、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶，由此測定本發(fā)明化合物作為凝血酶催化活性的選擇性抑制劑的能力。
全部試驗(yàn)中使用的緩沖液都是HBSA(10mM HEPES，pH7.5，150mM氯化鈉，0.1％牛血清白蛋白)。在Corning微量滴定板的合適孔格中，在0時(shí)間，混合50微升HBSA，50微升被測化合物在HBSA中一定濃度(覆蓋了一很廣的濃度范圍)的稀釋液(或是用于V。(未受抑制的速度)測定的純HBSA)和50微升稀釋于HBSA中的酶進(jìn)行IC50的測定。在環(huán)境溫度保溫30分鐘后，加入50微升下文中規(guī)定濃度的底物，使其總體積為200微升。在最初5分鐘內(nèi)(此期間，少于5％所加入的底物被利用)使用一Thermo MaxKinetic Microplate Reader測定405nm處的吸光度變化，由此測定生色底物水解初速度。以使得水解初速度降低50％時(shí)所加入底物的濃度定義為IC50。1.凝血酶(fIIa)試驗(yàn)使用購自Pentapharm Ltd.的生色底物Pefachrome t-PA(CH3SO2-D-六氫酪氨酸-甘氨酰-L-精氨醛-對硝基苯胺)測定酶活性。使用前，此底物在去離子水中再生。由Enzyme Research Laboratories，Inc.購得純化的人α凝血酶。全部試驗(yàn)中使用的緩沖液都是HBSA(10mM HEPES，pH7.5，150mM氯化鈉，0.1％牛血清白蛋白)。
在合適的測試孔中混合HBSA(50微升)、α-凝血酶(50微升)和抑制劑(50微升)(覆蓋了較廣的濃度范圍)，并在室溫下保溫30分鐘，然后加入底物Pe-fachrome-t-PA(50微升)進(jìn)行IC50的測定。在前5分鐘(此期間，少于5％的加入底物被利用)使用一Thermo MaxKinetic Microplate Reader測定405nm波長的吸光度變化，由此測定Pefachrome-t-PA水解的初速度。將使水解初速度降低50％所加入的抑制劑濃度定義為IC50。2.重組組織血纖維蛋白溶酶原活化劑(rt-PA)使用底物Pefachrome t-PA(CH3SO2-六氫酪氨酸-甘氨酰-L-精氨醛-對硝基酰苯胺，購自Pentalharm)測定rt-PA的催化活性。試驗(yàn)前，底物在去離子水中再生，然后稀釋在HBSA中，試驗(yàn)中其最終濃度為500μM(約3倍于Km)。由Genentech Inc.購得人rt-PA(Activase)。酶在去離子水中再生，再稀釋在HB-SA中，然后用于試驗(yàn)，其最終濃度為1.0nM。3.血纖維蛋白溶酶試驗(yàn)使用生色底物，即Kabi Diagnostica的S-2251(D-纈氨酰-L-亮氨酰-L-賴氨酸-對硝基酰苯胺)，測定血纖維蛋白溶酶的催化活性。底物在去離子水中再生，再稀釋在HBSA中，然后用于試驗(yàn)，其最終濃度為300μM(約2.5倍于Km)。由Enzyme Research Laborataries，Inc.購得純化的人血纖維蛋白溶酶。將酶稀釋在HBSA中，然后用于試驗(yàn)，其最終濃度為1.0nM。4.活性蛋白C(aPC)使用生色底物，即Pentapharm Ltd.的Pefachrome PC(δ-芐氧基羰基-D-賴氨酸-L-脯氨酰-L-精氨醛-對硝基酰苯胺)，測定aPC的催化活性。底物在去離子水中再生，再稀釋在HBSA中，然后用于試驗(yàn)，其最終濃度為250μM(約3倍于Km)。由Hematologic Technologies，Inc.購得純化的人aPC。將酶稀釋在HBSA中，然后用于試驗(yàn)，其最終濃度為1.0nM。5.胰凝乳蛋白酶使用生色底物，即Kabi Diagnostica的S-2586(甲氧基-琥珀酰-L-精氨酸-L-脯氨酰-L-酪氨酰-對硝基酰苯胺)，測定胰凝乳蛋白酶的催化活性。底物在去離子水中再生，再稀釋在HBSA中，然后用于試驗(yàn)，其最終濃度為100μM(約9倍于Km)。由Worthington Biochemical Corp.購得純化的(3X-結(jié)晶的；CDI)牛胰a-凝乳蛋白酶。將酶以無離子水再生，稀釋在HBSA中，然后用于試驗(yàn)，其最終濃度為1.0nM。6.胰蛋白酶使用生色底物，即Kabi Diagnostica的S-2222(苯甲酰-L-異亮氨酸-L-谷氨酸-(γ-甲酯)-L-精氨醛-對硝基酰苯胺)，測定胰蛋白酶的催化活性。底物在去離子水中再生，再稀釋在HBSA中，然后用于試驗(yàn)，其最終濃度為250μM(約4倍于Km)。由Worthington Biochemical Corp.購得純化的(3X-結(jié)晶的；TRL3)牛胰胰蛋白酶。將酶以無離子水再生，稀釋在HBSA中，然后用于試驗(yàn)，其最終濃度為0.5nM。7.因子Xa使用生色底物，即Kabi Pharmacia Hepar Inc.(Franklin，OH)的S-2765(N-芐氧基羰基-D-精氨酸-L-甘氨酸-L-精氨醛-對硝基苯胺)，測定因子Xa的催化活性。使用前全部底物都在去離子水中再生。S-2765的最終濃度為250μM(約5倍于Km)。由Enzyme Research Laboratories，Inc.(South Bend，IN)購得純化的人的因子X，根據(jù)文獻(xiàn)記載活化和制備因子Xa(FXa)(Bock，P.E.，Craig，P.A.，Olson，S.T.，和Singh，P.Arch.Biochem.Biophys.273375-388(1989))。8.結(jié)果表2列出了測得的對上述酶的IC50，證明了與這些相關(guān)的絲氨酸蛋白酶相比，抑制α凝血酶作用的高度特異性。
表 2N-(BnSO2-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛(實(shí)施例34，A欄)，N-(環(huán)己基甲基磺酰-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛(實(shí)施例36(i)，B欄)和BzlSO2-正Val(環(huán))-Gly-Arg-al(實(shí)施例8和18，C欄)對人α凝血酶(與選定的絲氨酸蛋白酶相比)酰胺分解活性抑制作用的IC50

*-在抑制劑最大試驗(yàn)濃度(2500nM)沒有觀測到抑制作用。
下文表3顯示具有不同R1和X基團(tuán)以及環(huán)大小的本發(fā)明化合物對凝血酶、fXa和胰蛋白酶的特異性。以下數(shù)據(jù)證明了化合物對凝血酶的特異性。
表3

nd即未測定。實(shí)施例C化合物在人和大鼠血漿中的離體抗凝作用使用正常人和大鼠的混合血漿，在較大的抑制劑濃度范圍內(nèi)測定活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)的延長，由此測定BzlSO2-正Val(環(huán))-Gly-Arg-al(實(shí)施例8)和N-(BnSO2-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛(實(shí)施例34)的離體抗凝作用。
由George King Biomedical，Overland Park，KA購得新鮮冷凍的加檸檬酸鹽的正常人混合血漿。利用標(biāo)準(zhǔn)方法，從麻醉的大鼠收集加檸檬酸鹽的全血制備正常大鼠的混合血漿。將血漿快速冷凍，保存于-80℃。
根據(jù)制造者的說明書，使用Coag-A-Mate RA4自動(dòng)血凝度計(jì)(General Di-agnostics，Organon Technica，Oklahoma City，OK)，以自動(dòng)APTT試劑(Organon Technica，Durham，NC)為血凝引發(fā)劑，測定APTT。以快速解凍的血漿制備一系列被測化合物的稀釋液，然后取200微升加入試驗(yàn)板的孔中。如圖5和圖7所示，在鼠和人的血漿中，BzlSO2-正Val(環(huán))-Gly-Arg-a1和N-(Bn-SO2-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛都分別以劑量依賴性的方式延長了APTT，這表明了其在兩種哺乳動(dòng)物中的抗凝血作用。實(shí)施例D化合物在血栓形成的實(shí)驗(yàn)大鼠模型中抗血栓形成能力的評價(jià)使用如下建立的急性血管內(nèi)血栓形成實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜏y定BzlSO2-正Val(環(huán))-Gly-Arg-al(實(shí)施例8)和N-(BnSO2-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛(實(shí)施例34)的抗血栓形成作用(防止血栓形成)。1.FeCl3誘導(dǎo)的血小板依賴性動(dòng)脈血栓形成的大鼠模型這是血小板依賴性動(dòng)脈血栓形成的標(biāo)準(zhǔn)模型，已用于評價(jià)直接凝血酶抑制劑之類可能的抗血栓形成的化合物。Kurz，K.D.，Main，B.W.和Sandusky，G.E.，Thromb.Res.，60269-280(1990)。在此模型中，用一張吸收了FeCl3新鮮溶液的濾紙局部處理大鼠的頸動(dòng)脈片段，由此在其中形成富血小板的閉塞性血栓。FeCl3被認(rèn)為擴(kuò)散入被處理的動(dòng)脈片段，引起受作用的血管表面的去內(nèi)皮化作用。從而導(dǎo)致血液與內(nèi)皮下結(jié)構(gòu)接觸，并由此導(dǎo)致血小板的粘附，凝血酶的形成和血小板的凝聚，由此形成閉塞性血栓。利用超聲波流量計(jì)監(jiān)測被測化合物對使用FeCl3后發(fā)生的閉塞性血栓形成的作用，并以此為一級終點(diǎn)。使用流量計(jì)來測定頸動(dòng)脈血流量是對使用凝塊形成的熱測定的原始方法的改進(jìn)。Kurz，K.D.，Main，B.W.和Sandusky，G.E.，Thromb.Res.，60269-280(1990)。
雄性Harlan Sprague Dawley大鼠(420-450g)在使用前至少適應(yīng)72小時(shí)，接受手術(shù)前禁食12小時(shí)，但可自由飲水。準(zhǔn)備動(dòng)物，用Nembutal麻醉，然后插入導(dǎo)管以便測定血壓、給以藥物和麻醉劑。沿中線切開頸部，利用鈍器解剖術(shù)和攤開技術(shù)從頸動(dòng)脈鞘分離一段2cm的血管，由此分離得左頸動(dòng)脈。在分離的血管的近心端(基部)和遠(yuǎn)心端內(nèi)設(shè)絲縫合線留出空隙，以便在血管的近端附近設(shè)置超聲波流量探頭(Transonic)。然后用固定臂將探頭固定。
手術(shù)后，將動(dòng)物隨機(jī)分成對照組(鹽水)和用被測化合物(BzlSO2-正Val(環(huán))-Gly-Arg-al或N-(BnSO2-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛)處理組，每劑量每組至少6個(gè)動(dòng)物。在放置了流量探頭之后，在刺激血栓形成前5分鐘，根據(jù)表3中的劑量，將被測化合物以靜脈推注單劑量的形式給藥。在t＝0時(shí)，將一張直徑3mm的浸有10微升35％的FeCl3新鮮水溶液的濾紙(Whatman#3)貼于分離的頸動(dòng)脈片段上距流量探頭的遠(yuǎn)端。進(jìn)行60分鐘的血壓、血流、心率和呼吸監(jiān)測。
記錄閉塞的發(fā)生(即測得血流量為零)，作為一級終點(diǎn)。2.結(jié)果表4和表5中血栓形成性閉塞發(fā)生的減少證明了BzlSO2-正Val(環(huán))-Gly-Arg-a1和N-(BnS02-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛作為抗血栓形成劑在此體內(nèi)模型中防止血栓形成的效果。表4.BzlSO2-正Val(環(huán))-Gly-Arg-al在大鼠體內(nèi)血栓形成的FeCl3模型中的結(jié)果

*-用Fishers檢驗(yàn)，與鹽水對照組p≤0.05表5.N-(BnSO2-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛在大鼠體內(nèi)血栓形成的FeCl3模型中的結(jié)果

將閉塞的發(fā)生對給以的劑量作圖，可測得在此模型中防止50％血栓形成性閉塞的有效劑量(ED50)。這就可以直接將BzlSO2-正Val(環(huán))-Gly-Arg-al和N-(BnSO2-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛的抗凝血作用與前文所述曾在此模型中進(jìn)行評價(jià)的其它抗血栓形成劑進(jìn)行比較。表6列出了幾種已知抗凝血?jiǎng)┑腅D50，與本發(fā)明化合物進(jìn)行比較。表6.根據(jù)ED50，就動(dòng)脈血栓形成的FeCl3模型中的防止血栓作用，被測化合物效果與其它抗血栓形成劑的比較

ED50a即在50％的試驗(yàn)動(dòng)物中防止完全血栓形成性閉塞發(fā)生的劑量。
表6中的數(shù)據(jù)清楚地表明了本發(fā)明化合物在此試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭蟹乐归]塞性血栓形成的作用。此數(shù)據(jù)與防止人血栓形成的關(guān)聯(lián)可由其與此表中其它抗凝血?jiǎng)┑谋容^進(jìn)行推斷，如以下文獻(xiàn)所述，這些抗凝血?jiǎng)┰诖嗽囼?yàn)?zāi)Ｐ椭幸韵嗤绞竭M(jìn)行過評價(jià)，并已被臨床證明具有防止血栓形成的抗血栓形成作用Heparin-Hirsh，J.N.Engl.J.Med.，3241565-1574(1992)，Cairns，J.A.等，Chest，102456S-481S(1992)；Argtroban-Gold，H.K.等，J.Am.Coll.Car-diol.，211039-1047(1993)；和Hirulogtm-Sharma，G.V.R.K.等，Am.J.Cardiol.，721357-1360(1993)和Lidon，R.M等，Circulation，881495-1501(1993)。本發(fā)明化合物與臨床有效的抗血栓形成劑標(biāo)準(zhǔn)肝素、Arga-troban和Hirulogtm在相同的實(shí)驗(yàn)性血栓形成的嚙齒類模型中的體內(nèi)比較，結(jié)合前文實(shí)施例C所述的本發(fā)明化合物在大鼠和人血漿中都證明具有抗凝血作用，將使本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員推定此化合物將是人用的有效的抗血栓形成劑。實(shí)施例E化合物的口服活性給狗口服實(shí)施例34的化合物后，對其藥效學(xué)參數(shù)和藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行了評價(jià)。成年獵犬(9-12kg)被單獨(dú)飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)籠中，喂以標(biāo)準(zhǔn)的經(jīng)質(zhì)檢的商品狗食，任其隨意飲用自來水。通過胃管，將20mg/kg口服劑量的被測化合物溶于55ml的去離子水中，對狗給藥，然后用水沖洗。在另一方案中，將5mg/kg的被測化合物溶于5ml 0.9％的氯化鈉中，通過留置的隱靜脈導(dǎo)管快速靜脈推注給藥。兩種給藥途徑使用相同的狗，在將狗用于兩種不同的治療方案之間有一周的休息間期。
實(shí)驗(yàn)期內(nèi)，以檸檬酸鈉(最終濃度為0.38％)為抗凝血?jiǎng)?9體積的血液用1體積的檸檬酸鈉)，由頭靜脈采集血樣。與該抗凝血?jiǎng)┗旌虾?，將每一份血樣浸入冰水漿中快速冷卻。采集后10分鐘內(nèi)離心分離血漿(4℃，2400rpm，10分鐘)，然后轉(zhuǎn)移至冷凍試管中，在分析前保存于-70℃。
從血漿中萃取化合物，利用HPLC分離，利用一熒光基團(tuán)進(jìn)行柱后衍生，由此測定化合物的血濃度。利用APTT試驗(yàn)測定血液的凝固時(shí)間，此試驗(yàn)測定化合物使活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)的延長。由George King Biomedical，Overland Park，KS購得新鮮冷凍的加檸檬酸鹽的正常人混合血漿。根據(jù)制造者的說明書，使用Coag-A-Mate RA4自動(dòng)血凝度計(jì)(General Diagnostics，Organon Technica，Oklahoma City，OK)，以自動(dòng)APTT PlatelinL試劑(Organon Technica，Durham，NC)為血凝引發(fā)劑，測定APTT。以快速解凍的血漿制備每一血樣的一系列稀釋液，然后取200微升APTT試劑加入試驗(yàn)板的孔中，由此進(jìn)行試驗(yàn)。
比較靜脈注射和口服后的AUC值(曲線下面積，表示一段時(shí)間內(nèi)化合物在血液中的水平)，由此計(jì)算通過口服途徑給藥后供試化合物的全身生物利用度?？傮w上說，在就劑量差異進(jìn)行校正之后，給予的供試化合物表現(xiàn)出約66％的生物利用度(口服AUC與靜脈注射AUC之比)。此外，被測的實(shí)施例34化合物能被狗迅速吸收，因?yàn)樵诳诜?兩種劑量)20至30分鐘內(nèi)，APTT就顯著增加，并在較高水平維持長達(dá)2小時(shí)。給藥30至40分鐘后，化合物在血液中的水平達(dá)到最大值。APTT測定的數(shù)據(jù)證明了被測化合物的血漿中水平和抗凝血作用之間具有良好的相關(guān)性(r2＝0.64)。
權(quán)利要求
1.一種化合物，其特征在于，它具有以下結(jié)構(gòu)式 其中(a)X選自-S(O)2-、-N(R′)-S(O)2-、-C(＝O)-、-OC(＝O)-、-NH-C(＝O)-、-P(O)(R″)-和直接連接鍵，其中的R′氫原子、1至約4個(gè)碳原子的烷基、約6至14個(gè)碳原子的芳基或約6至16個(gè)碳原子的芳烷基，R″是NR′、OR′、R′、或SR′，條件是R″不是NH、OH、H或SH；(b)R1選自(1)1至約12個(gè)碳原子的烷基，(2)經(jīng)約5至8個(gè)碳原子的環(huán)烷基取代的1至約3個(gè)碳原子的烷基，其環(huán)碳原子可任意被羥基、氨基、胍基、脒基或1至約3個(gè)碳原子的烷氧基或烷基所取代，(3)3至約15個(gè)碳原子的環(huán)烷基，其環(huán)碳原子可任意被羥基、氨基、胍基、脒基或1至約3個(gè)碳原子的烷氧基或烷基所取代，(4)4至約10個(gè)環(huán)原子的雜環(huán)烷基，環(huán)原子選自碳原子和雜原子，其中的雜原子選自氧、氮和S(O)i，其中的i是0、1或2，環(huán)碳原子可任意被羥基、1至約3個(gè)碳原子的烷氧基或烷基、氨基、胍基或脒基取代，(5)4至約10個(gè)環(huán)原子的雜環(huán)基，環(huán)原子選自碳原子和雜原子，其中的雜原子選自氧、氮和S(O)i，其中的i是0、1或2，環(huán)碳原子可任意被羥基、1至約3個(gè)碳原子的烷氧基或烷基、氨基、胍基或脒基取代，(6)可以經(jīng)約5至8個(gè)碳原子的環(huán)烷基取代的約3至6個(gè)碳原子的鏈烯基，環(huán)碳原子可以被羥基、氨基、胍基、脒基或1至約3個(gè)碳原子的烷氧基或烷基取代，(7)約6至約14個(gè)碳原子的芳基，可以分別被Y1、Y2和/或Y3單取代、二取代或三取代，(8)5至14個(gè)原子的雜芳基，環(huán)原子選自碳原子和雜原子，其中的雜原子選自氧、氮和S(O)i，其中的i是0、1或2，可以分別被Y1、Y2和/或Y3單取代、二取代或三取代，(9)芳環(huán)上可以分別被Y1、Y2和/或Y3單取代、二取代或三取代的約7至15個(gè)碳原子的芳烷基，(10)6至11個(gè)原子的雜芳烷基，環(huán)原子為碳原子和雜原子，其中的雜原子選自氧、氮和S(O)i，其中的i是0、1或2，可以分別被Y1、Y2和/或Y3單取代、二取代或三取代，(11)芳環(huán)上可以分別被Y1、Y2和/或Y3單取代、二取代或三取代的約8至15個(gè)碳原子的芳鏈烯基，(12)7至12個(gè)原子的雜芳鏈烯基，環(huán)原子為碳原子和雜原子，其中的雜原子選自氧、氮和S(O)i，其中的i是0、1或2，可以分別被Y1、Y2和/或Y3單取代、二取代或三取代， (17)1至約12個(gè)碳原子的全氟烷基，(18)約6至約14個(gè)碳原子的全氟芳基，(19)約7至15個(gè)碳原子的全氟芳烷基，(20)氫原子，和(21) ，其中 是具有3至6個(gè)環(huán)碳原子的5至7元的雜環(huán)，其中的V是-CH2-、-O-、-S(＝O)-、-S(O)2-或S，其中的Y1、Y2和Y3是(i)各自選自氫原子、鹵原子、氰基、四唑基、氨基、胍基、脒基、甲基氨基和甲基胍基，-CF3、-CF2H、-CF2CF3、-CH(CF3)2，-C(OH)(CF3)2、-OCF3、-OCF2CF3、-OC(O)NH2、-OC(O)NHZ1、-OC(O)NZ1Z2、-NHC(O)Z1、-NHC(O)NH2、-NHC(O)NHZ1、-NHC(O)NZ1Z2、-C(O)OH、-C(O)NH2、-C(O)NHZ1、-C(O)OZ1、-P(O3)H、-P(O)3H2、-P(O)3(Z1)2、-S(O)3H、-S(O)mZ1、-Z1、-OZ1、-OH、-NH2、-NHZ1和-NZ1Z2，其中m是0、1或2，Z1和Z2各自選自1至約12個(gè)碳原子的烷基、約6至14個(gè)碳原子的芳基、其中有1至約9個(gè)碳原子的約5至14個(gè)原子的雜芳基、約7至15個(gè)碳原子的芳烷基和約6至11個(gè)原子的雜芳烷基(其中有約3至9個(gè)為碳原子)，或(ii)Y1和Y2一起為-OC(Z3)(Z4)O-，其中Z3和Z4各自選自氫原子、1至約12個(gè)碳原子的烷基、約6至14個(gè)碳原子的芳基、具有1至約9個(gè)碳原子的5至約14個(gè)原子的雜芳基、約7至15個(gè)碳原子的芳烷基、約6至11個(gè)原子的雜芳烷基(其中有約3至9個(gè)為碳原子)，(c)Q是-(CH2)n-(其中n是整數(shù)1至4)，或-(CH2)qR4-，其中q是1或2，R4是-S(O)p-、-O-、-N(R5)-，其中p是0、1或2，R5選自氫原子、1至4個(gè)碳原子的烷基和1至4個(gè)碳原子的?；?；(d)R2選自氫原子、1至4個(gè)碳原子的烷基或2至4個(gè)碳原子的鏈烯基；和(e)Y選自R1取代基，條件是Y不是 以及它們的藥學(xué)上可接受的鹽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，其中的X選自一直接連接鍵、-SO2-、-NH-S(O)2-、和-N(R′)-S(O)2-。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物，其特征在于，其中的X是一直接連接鍵或-SO2-。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，其中的R1選自烷基，芳烷基和芳基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的化合物，其特征在于，其中的R1選自取代或未取代的苯基或萘基。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物，其特征在于，其中的R1被選自-C(O)OH、-C(O)OZ1、-CH3、-OCH3和-CF3的取代基所取代。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的化合物，其特征在于，其中的R1是芳烷基。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的化合物，其特征在于，其中的R1是取代或未取代的芐基。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的化合物，其特征在于，其中的R1是環(huán)己基或環(huán)己基甲基。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，其中的Q是-(CH2)2-或-(CH2)3-。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，其中的R2是氫原子。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，其中的Y選自(a)氫原子(b)苯基-(CH2)i-，其中的i是整數(shù)0至3，苯基可以被Y1、Y2和/或Y3分別單取代、二取代或三取代，(c)雜芳基-(CH2)i-，其中的i是整數(shù)0至3，雜芳基可以被Y1、Y2和/或Y3分別單取代、二取代或三取代，(d)雜環(huán)烷基-(CH2)i-，其中的i是整數(shù)0至3，雜環(huán)烷基可以被羥基、有1至約3個(gè)碳原子的烷氧基或烷基取代，(e)C5至C8環(huán)烯基，可以被Z5、Z6和/或Z7取代，以及(f)C5至C8環(huán)烷基，可以被Z5、Z6和/或Z7分別單取代、二取代或三取代，其中的Z5、Z6和/或Z7分別選自-R6、-OR6和-CO2R6，其中R6選自氫原子、甲基和1至3個(gè)碳原子的烷基，以及(g)-(CH2)b-Z5，其中b是整數(shù)0至6。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的化合物，其特征在于，其中的Y是芳烷基或環(huán)烷基。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的化合物，其特征在于，其中的Y是取代或未取代的芐基或1-萘基甲基。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的化合物，其特征在于，其中的Y被選自-C(O)OH、-C(O)OZ1、-CH3、-OCH3和CF3的取代基所取代。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的化合物，其特征在于，其中的Y是具有約5至8個(gè)環(huán)碳原子的環(huán)烷基。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的化合物，其特征在于，其中的Y被選自-C(O)OH、-C(O)OZ1、-CH3和-OCH3的取代基所取代。
18.根據(jù)權(quán)利要求12所述的化合物，其特征在于，其中的Y是氫原子。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，其中的X是-S(O)2-、R1是取代或未取代的芳烷基，Q是-(CH2)2-，R2是氫原子。
20 根據(jù)權(quán)利要求19所述的化合物，其特征在于，其中的R1是取代或未取代的芐基。
21根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，其中的X是-S(O)2-，R1是取代或未取代的芳烷基，Q是-(CH2)3，R2是氫原子。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的化合物，其特征在于，其中的R1是取代或未取代的芐基。
23.一種化合物，其特征在于，它選自(a)N-芐基磺酰-正Val(環(huán))-Gly-L-精氨醛，(b)N-(正Val(環(huán))-Gly)-L-精氨醛，(c)D，L-a-芐基-正Val(環(huán))-Gly-L-精氨醛，(d)D，L-a-芐基-正Leu(環(huán))-Gly-L-精氨醛，(e)N-(1-萘基-SO2-正Val(環(huán))-Gly-L-精氨醛，(f)N-(BnSO2-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛，(g)N-(2-甲氧羰基芐基-SO2-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛，(h)N-(2-三氟甲基芐基-SO2-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛，(i)N-(環(huán)己基甲基-SO2-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛，(j)N-(2-噻吩甲基-SO2-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛，(k)N-(苯基氨基-SO2-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛，(l)N-(3-甲氧羰基芐基-SO2-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛，(m)N-(3-三氟甲基芐基-SO2-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛，(n)N-(2-甲基芐基-SO2-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛，(o)N-(3-甲基芐基-SO2-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛，(p)N-(3-甲氧基芐基-SO2-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛，(q)N-(2-氯芐基-SO2-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛，(r)N-(2-甲基-5-氟芐基-SO2-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛，(s)N-(2-甲基-5-甲氧基芐基-SO2-正Leu(環(huán))-Gly)-L-精氨醛，(t)N-〔(S)-3-N-苯基乙基氨基-2-氧代-1-哌啶乙?！?L-精氨醛，(u)N-〔(S)-3-N-苯基丙基氨基-2-氧代-1-哌啶乙?！?L-精氨醛，(v)N-〔(S)-3-N-苯基乙基氨基-六氫-2-氧代-氮雜-1-乙?！?L-精氨醛。
24.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，其中的X是-S(O)2-。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的化合物，其特征在于，其中的Q是-CH2-。
26.根據(jù)權(quán)利要求22所述的化合物，其特征在于，其中的Q是-CH2S(O)n-。
27.根據(jù)權(quán)利要求24所述的化合物，其特征在于，其中的Q是-(CH2)2-或-(CH2)3-。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的化合物，其特征在于，其中的R1是芳基或芳烷基。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的化合物，其特征在于，其中的R2是氫原子。
30根據(jù)權(quán)利要求29所述的化合物，其特征在于，其中的R1被Y1、Y2和/或Y3分別單取代、二取代或三取代，Y1、Y2和/或Y3分別選自-C(O)OH、-C(O)OZ1、-S(O)mZ1和-S(O)3H。
31.根據(jù)權(quán)利要求29所述的化合物，其特征在于，其中的R1是取代的萘基或取代的芐基。
32.根據(jù)權(quán)利要求29所述的化合物，其特征在于，其中的R1是未取代的萘基或未取代的芐基。
33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的化合物，其特征在于，其中的R1是取代的芐基。
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的化合物，其特征在于，其中的R1是芐基。
35.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，其中的X是-S(O)2-，R1是芳烷基，R2是氫原子。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的化合物，其特征在于，其中的R1是未取代的芐基或取代的芐基。
37.根據(jù)權(quán)利要求35所述的化合物，其特征在于，其中的R1被Y1、Y2和/或Y3分別單取代、二取代或三取代，Y1、Y2和/或Y3分別選自-C(O)OH、-C(O)OZ1、-S(O)mZ1和S(O)3H。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的化合物，其特征在于，其中的Q是-(CH2)2-或-(CH2)3-。
全文摘要
本發(fā)明公開了作為有效的凝血酶特異性抑制劑的肽醛，它們的藥學(xué)上認(rèn)可的鹽，它們的藥學(xué)上認(rèn)可的組合物，以及將其用作哺乳動(dòng)物體內(nèi)特點(diǎn)為異常血栓形成的疾病的治療藥劑的方法。
文檔編號C07K5/00GK1151166SQ9519366
公開日1997年6月4日 申請日期1995年6月19日 優(yōu)先權(quán)日1994年6月17日
發(fā)明者J·E·桑普爾, R·J·阿德基, R·F·納特, W·C·里普卡, D·C·羅利, M·S·L·林-威爾比, T·K·布蘭克 申請人:科爾凡斯國際股份有限公司