專利名稱：用于生物傳感的基于螢光素-熒光素酶的微裝置的制作方法
用于生物傳感的基于螢光素-熒光素酶的微裝置
背景技術(shù)：
生物發(fā)光是天然發(fā)生的現(xiàn)象，其已經(jīng)用于多種應用，特別是在分子生物學中，在分 子生物學中與其相關(guān)的酶已經(jīng)用作遺傳報道分子。生物發(fā)光對于用作遺傳標記幾乎是理想 的。典型地，在哺乳動物細胞中沒有內(nèi)生性發(fā)光活性，而實驗引入的生物發(fā)光幾乎是瞬間 的、靈敏的且可定量的。盡管多種物種都顯示出生物發(fā)光，但僅有相對很少的已經(jīng)表征和克 隆。其中，僅螢火蟲(Photinus pyralis)熒光素酶、海腎(Renilla)熒光素酶和水母發(fā)光 蛋白已經(jīng)有了很多實用。在產(chǎn)生生物發(fā)光的螢火蟲熒光素酶的機制中對分子組分的研究 顯示該酶的基質(zhì)是螢火蟲熒光素，也即多雜環(huán)有機酸，D-(-)-2-(6’ -羥基-2’ -苯并噻唑 基)-δ 2-噻唑啉-4-羧酸(下文稱作“熒光素”)。螢火蟲熒光素酶是單體61 kD酶，其對兩步工藝中的熒光素的氧化起催化作用，其 在560nm發(fā)光。第一步包括通過用三磷酸腺苷(ATP)的α -磷酸鹽在鎂的存在下的?；?熒光素的羧酸酯基團活化以生成luciferyl adenylate并除去無機焦磷酸鹽。在第二步中， 用分子氧氧化該luciferyl adenylate以生成AMP、二氧化碳和氧化熒光素。該氧化熒光素 是以電子激發(fā)態(tài)生成的。一旦轉(zhuǎn)變?yōu)榛鶓B(tài)，該氧化熒光素發(fā)光。該下面稱作熒光素-熒光 素酶的反應的反應機理如下
熒光素+ATP+02+Mg2++熒光素酶一氧化熒光素+光子(1)。由于所有活細胞都包含三磷酸腺苷，因此在562納米處檢測到光表明存在活細 胞。記錄該發(fā)射的光并將其分析以測定該樣品中該微生物的濃度。該方法具有很多優(yōu)點， 包括例如約10_18微生物/克樣品流體的低檢測限、約1分鐘的短響應時間、以及低試劑和 儀器成本。

發(fā)明內(nèi)容
需要的是用于測定樣品中一種或多種微生物的濃度的簡單的基于熒光素-熒光 素酶的方法和設備。


通過參照以下描述和圖解該實施方案的附圖可以更好地理解本發(fā)明的實施方案， 在附圖中
圖1描繪了用于生物傳感的示例性基于熒光素-熒光素酶的微裝置的橫截面。
具體實施例方式本發(fā)明提供了用于測定樣品中一種或多種微生物的濃度的方法和設備。該方法包 括將樣品過濾通過樣品管內(nèi)部的過濾器以將該一種或多種微生物保留在該過濾器上?？梢?將所得到的包含或生成三磷酸腺苷的濾出液通過該樣品管并進入該報道分子區(qū)域。在該報 道分子區(qū)域中，該濾出液中的三磷酸腺苷與包括螢光素-熒光素酶絡合物的透明多孔基質(zhì) 接觸。三磷酸腺苷與該螢光素-熒光素酶絡合物相互作用以提供可以用檢測器測定的光響應。該檢測器典型地可以是電荷耦合設備(charge-coupled device)?？梢詫⒃摴忭憫c 校準曲線相比較以確定樣品中微生物的總濃度。如果需要微生物的特定濃度，可以通過用 緩沖或清洗試劑沖洗來清潔該樣品管。然后，可以將第二樣品引入該樣品管中?？梢詫⒃?樣品與對于評價所需微生物可以具有特異性的試劑相結(jié)合。該試劑可以是例如刺激物、抑 制劑、終止劑、抗生素、營養(yǎng)劑或其組合。例如，如果該試劑是特定微生物的抑制劑，該微生 物將停止或降低其生成三磷酸腺苷的能力。隨著該第二樣品通過該過濾器，濾出液將具有 降低的三磷酸腺苷的濃度。該降低的三磷酸腺苷的濃度將產(chǎn)生可能比原始響應低的第二光 響應。因此，如果從該第一光響應中減去該第二光響應，能夠測定該特定微生物的濃度。類 似地，使用對其他微生物而言特異性的其他試劑可以重復該工藝。因此，可以測定數(shù)種微生 物的濃度。此處所用的一些術(shù)語具有以下含義。在本說明書中所用的所有其他術(shù)語和短語 具有如本領域技術(shù)人員會理解的其普通含義。該普通含義可以通過參照技術(shù)詞典而得到， 例如 Hawley' s Condensed Chemical Dictionary, 11th Edition, Sax 禾口 Lewis, Van Nostrand ReinhoId, New York, N. Y. , 1987 禾口 The Merck Index, 11th Edition, Merck &Co·，Rahway N. J. , 1989。此處所用的術(shù)語“和/或”表示該術(shù)語相關(guān)的指代物中的任一種、指代物的任意組 合或所有指代物。除上下文有明確的另外表示之外，此處所用的單數(shù)形式“a”、“an”和“the (該，所 述)”可以包括復數(shù)指代。因此，例如，提及“配方”可以包括多個這種配方，使得化合物X的 配方可以包括化合物χ的多個配方。此處所用的術(shù)語“約”表示所指定數(shù)值的10%的變化，例如約50%意味著從45% 到55%的變化。對于整數(shù)范圍，該術(shù)語約能夠包括比所列整數(shù)大1或2個整數(shù)和小1或2 個整數(shù)。此處所用的術(shù)語“抗生素”表示抑制或消除微生物(例如細菌、真菌或原生動物)的 生長的化學治療劑。此處所用的術(shù)語“緩沖劑”表示抵制pH變化的溶液。此處所用的術(shù)語“電荷耦合設備”表示用于電子形成圖像的設備，其使用在被入射 光撞擊時釋放電子的硅層。此處所用的術(shù)語“抑制劑”表示抑制微生物生長的試劑。此處所用的短語“在一種實施方案中”表示特殊的特征、結(jié)構(gòu)或特點。然而，每個 實施方案可能不必需包括該特殊的特征、結(jié)構(gòu)或特點。此外，在與實施方案結(jié)合描述特殊的 特點、結(jié)構(gòu)或特征時，認為與其他實施方案相結(jié)合實施該特點、結(jié)構(gòu)或特征(無論是否公開 描述)是在本領域技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)的。此處所用的術(shù)語“熒光素”表示一旦用適當選擇的熒光素酶氧化就會產(chǎn)生生物發(fā) 光的任意底物。熒光素可以是天然或合成化合物。從不同生物物種中分離出來的熒光素在 結(jié)構(gòu)上可能變化非常大，盡管在很多情況中在廣泛多種種類中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了同樣的結(jié)構(gòu)。此處所用的術(shù)語“熒光素酶”表示酶，其對熒光素氧化為氧化熒光素起催化作用， 伴隨著在生物發(fā)光反應中產(chǎn)生光，以使得該氧化熒光素從該熒光素-熒光素酶絡合物中釋 放到該反應介質(zhì)中。這些熒光素發(fā)光的反應需要一種或多種輔助因素(例如三磷酸腺苷、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸/煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯或黃素單核苷酸)的存在。這種熒光 素酶的實例是螢火蟲、細菌和真菌的那些。此處所用的術(shù)語“熒光素-熒光素酶絡合物”表示除了此處所限定的引發(fā)化合物 之外，在引發(fā)生物發(fā)光反應所需的所有其他特定輔助因素的存在下熒光素酶與其適合的熒 光素的任意組合。有很多種熒光素-熒光素酶絡合物；每種熒光素酶使用特定的熒光素和 輔助因素。熒光素酶-熒光素酶絡合物能夠是任意這種組合，前提是一旦引入活性形式的 弓I發(fā)化合物，生物熒光反應就開始并發(fā)光。弓I發(fā)化合物是用于在添加到熒光素-熒光素酶 絡合物時引發(fā)熒光素酶介導的生物發(fā)光反應(不同于二價陽離子)所需要的輔助因素。這種 引發(fā)化合物的實例是三磷酸腺苷、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸/煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯 或黃素單核苷酸。選擇引發(fā)化合物以能夠在適當選擇的其他組分(其可以包括多價陽離子) 的存在下與該熒光素-熒光素酶絡合物相互作用以引發(fā)生物發(fā)光反應。此處所用的術(shù)語“微生物”表示過小以不能被人的肉眼看到的生物體。此處所用 的術(shù)語“微生物”表示細菌、真菌、古細菌(archaea)或原生生物。此處所用的術(shù)語“報道分子區(qū)域”表示在該裝置上用該熒光素-熒光素酶絡合物 固定的區(qū)域。一旦ATP分子通過，其將被熒光素-熒光素酶消耗并將發(fā)光。此處所用的術(shù)語“樣品”表示懷疑包含分析物的材料。該樣品能夠作為從該來源 得到而直接使用或經(jīng)過預處理以改性該樣品的特征以后使用。該樣品能夠來自任意生物來 源，例如生理流體，包括血液、唾液、目鏡液、腦脊髓液、汗液、尿液、乳液、腹水液、raucous, 滑液、腹腔液、或羊膜液等。能夠在使用之前對該樣品進行預處理，例如由血液制備血漿、和 稀釋粘性液體等。處理方法能夠包括過濾、蒸餾、濃縮、干擾組分的失活和試劑的添加。除 了生理流體之外，也能夠使用其他液體樣品，例如水、和食品等，用于環(huán)境或食品制備化驗 的性能。此外，能夠使用懷疑包含分析物的固體材料作為樣品，例如土壤、和食品等。在一 些情況中，改性固體試驗樣品以形成液體介質(zhì)或釋放該分析物可能是有利的。此處所用的術(shù)語“刺激物”表示加速微生物生長的試劑。此處所用的術(shù)語“終止劑”表示停止、抑制或減速微生物的生長的試劑。此處所用的術(shù)語“透明多孔基質(zhì)”表示該多孔基質(zhì)傳送由該濾出液與該熒光 素-熒光素酶絡合物的相互作用提供的光響應產(chǎn)生的電磁輻射的一個或多個波長的能力。該新方法和設備能夠用于測定酶活性、微生物活性、微生物對特定試劑的敏感性、 微生物毒性、和疾病檢測等。此外，該新方法和設備可以在環(huán)境保護、食品安全、水質(zhì)量控制 和醫(yī)療和生物研究中找到應用。在一種實施方案中，提供了用于測定一種或多種微生物在樣品中的濃度的方法。 該方法提供(a)將包括一種或多種微生物的第一樣品通過樣品管內(nèi)的過濾器過濾以將該 一種或多種微生物保留在該過濾器上并提供第一濾出液；(b)將該第一濾出液通過該樣品 管內(nèi)的報道分子區(qū)域，其中該報道分子區(qū)域包括包括熒光素-熒光素酶絡合物的透明多孔 基質(zhì)；(c)檢測來自該報道分子區(qū)域的第一光響應，其中該光響應是由該濾出液與該熒光 素-熒光素酶絡合物的相互作用提供的；(d)將該第一光響應與校準曲線比較以測定該一 種或多種微生物在該樣品中的濃度；(e)任選地，將包括試劑和一種或多種微生物的第二 樣品過濾通過該樣品管內(nèi)的過濾器以將該一種或多種微生物保留在該過濾器上并提供第 二濾出液，其中該試劑對于第一微生物具有特異性且包括刺激物、抑制劑、終止劑、抗生素、營養(yǎng)劑或其組合；(f)任選地，將該第二濾出液通過該樣品管內(nèi)的該報道分子區(qū)域；(g)任 選地，檢測來自該報道分子區(qū)域的第二光響應，其中該第二光響應是由該第二濾出液與該 熒光素-熒光素酶絡合物的相互作用提供的；(h)任選地，將該第一光響應減去該第二光響 應以提供第一微生物特異性光響應；和(i)任選地，將該第一微生物特異性光響應與校準 曲線比較以測定該第一微生物在該樣品中的濃度，其中該一種或多種微生物包括一種或多 種細菌、一種或多種真菌、一種或多種古細菌、一種或多種原生生物或其組合。在一種實施方案中，用檢測器進行該第一和第二光響應的檢測。在一種實施方案 中，該檢測器包括照相機、視頻照相機、硅光電池或光電倍增管或其組合。在一種實施方案中，將該熒光素-熒光素酶絡合物固定在該透明多孔基質(zhì)上或封 裝在其內(nèi)。在一種實施方案中，包括該熒光素-熒光素酶絡合物的該透明多孔基質(zhì)包括透 明無機凝膠基質(zhì)、透明有機聚合物凝膠基質(zhì)、透明混雜無機-有機凝膠基質(zhì)或其組合。在一 種實施方案中，透明無機凝膠基質(zhì)包括硅膠、硼酸鹽、Tio2、Ai2o3、ao2或其組合。在一種實 施方案中，該透明有機聚合物凝膠基質(zhì)包括聚乙烯醇、聚酯、聚酰亞胺、聚二甲基硅氧烷、聚 甲基丙烯酸甲酯、聚烯烴、聚碳酸酯或其組合。在一種實施方案中，該透明混雜無機-有機凝膠基質(zhì)包括硅膠、硼酸鹽、TiO2, A1203、、聚乙烯醇、聚酯、聚酰亞胺、聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚烯烴、聚碳 酸酯或其組合。在一種實施方案中，該樣品管包括有機聚合材料、無機材料或其組合。在一種實施 方案中，該聚合材料包括包括聚乙二醇、聚環(huán)氧乙烷的聚甲基丙烯酸甲酯；聚丙烯酰胺或其 組合。在一種實施方案中，該無機材料包括玻璃、陶瓷材料、金屬、金屬合金、金屬氧化 物、復合金屬氧化物或其組合。在一種實施方案中，提供了設備。該設備包括(a)樣品管，包括樣品入口、在該 樣品管內(nèi)的過濾器，其中該樣品管包括在該樣品入口和該過濾器之間的任選的試劑入口或 連接到在該過濾器和該報道分子區(qū)域之間的任選閥門的任選的清洗性緩沖液入口 ；和在該 過濾器和出口之間的報道分子區(qū)域，其中該報道分子區(qū)域包括包括熒光素-熒光素酶絡合 物的透明多孔基質(zhì)；(b)與該檢測器連接的檢測器以檢測來自該報道分子區(qū)域的一個或多 個光響應，其中該一個或多個光響應是由一種或多種濾出液與該熒光素-熒光素酶絡合物 的相互作用提供的；和(c)與該報道分子區(qū)域連接的分析儀以測定該一種或多種微生物在 該樣品中的濃度，其中該一種或多種微生物包括一種或多種細菌、一種或多種真菌、一種或 多種古細菌、一種或多種原生生物或其組合。在一種實施方案中，提供了設備。該設備包括(a)樣品管，包括樣品入口、在該 樣品管內(nèi)的過濾器和在該過濾器和出口之間的報道分子區(qū)域，其中該報道分子區(qū)域包括包 括熒光素-熒光素酶絡合物的透明多孔基質(zhì)；(b)與該報道分子區(qū)域連接的檢測器以檢測 來自該報道分子區(qū)域的一個或多個光響應，其中該一個或多個光響應是由一種或多種濾出 液與該熒光素-熒光素酶絡合物的相互作用提供的；和(c)與該檢測器連接的分析儀以測 定該一種或多種微生物在該樣品中的濃度。圖1是用于生物傳感的示例性基于熒光素-熒光素酶的微裝置(1)的橫截面視圖。在一種實施方案中，該微裝置(1)包括樣品管(10)、樣品儲存器(11)、試劑儲存器(12)、混合區(qū)域(13)、過濾器(14)、閥(15)、清潔性緩沖液入口儲存器(16)、報道分子區(qū)域 (17)、透明多孔基質(zhì)(18)、檢測器(19)、分析儀(20)和出口儲存器(21)。操作者打開該閥 (15)以將該樣品儲存器(11)與該出口儲存器(21)連接。將該樣品和試劑泵送到該混合區(qū) 域(13)中并結(jié)合，將該混合的樣品泵送通過該過濾器(14)。該過濾器(14)將保留該微生 物和其他大的碎片，并允許溶解在該樣品流體中的小分子(例如三磷酸腺苷)通過該過濾器 (14)。該流體將通過該閥(15)并進入該報道分子區(qū)域(17)。一旦在該報道分子區(qū)域(17) 中，該流體將進入包含該熒光素-熒光素酶絡合物的透明多孔基質(zhì)(18)中。該熒光素-熒 光素酶絡合物可以固定在該透明多孔基質(zhì)上，或者可以封裝在其內(nèi)。如上討論，在氧和鎂離子(Mg+2)存在下該三磷酸腺苷與熒光素-熒光素酶絡合物 依照方程(1)反應以產(chǎn)生波長為562納米的可見光。該562納米的可見光可以被檢測器 (19)接收，轉(zhuǎn)化為可以送往分析儀(20)的信號。該分析儀(20)將該信號與校準曲線比較 以測定該微生物在該樣品中的濃度。在完成數(shù)據(jù)分析時，操作者可以打開該閥(15)，將清潔 性緩沖液從該清潔性緩沖液儲存器(16)泵送通過該多孔基質(zhì)(18)并使固定在該透明多孔 基質(zhì)(18 )上或封裝在其內(nèi)的該熒光素-熒光素酶絡合物再生。然后，該操作者可以用廢物 儲存器(未示出)代替該樣品儲存器(11)和試劑儲存器(12)，打開該閥(15)，并將清潔性緩 沖液從該清潔性緩沖液儲存器(16)泵送到該廢物儲存器，由此從該過濾器中清洗掉任意殘 留的微生物和其他大碎片。將該微裝置(1)準備好用于下一個樣品。盡管圖中未顯示，可 以為該微裝置(1)提供溫度調(diào)節(jié)機構(gòu)以將該流體保持在預設溫度并為其提供混合機構(gòu)以攪 拌該混合區(qū)域(13)中的混合物?？梢允褂萌我夂⑸锏囊后w作為該樣品。能夠使用通過例如在介質(zhì)中培養(yǎng)細菌 得到的培養(yǎng)溶液或臨床樣品(例如含細菌的尿液和血液)等作為該樣品。在一些實施方案中，該試劑儲存器(12)、混合區(qū)域(13)、閥(15)和清潔性緩沖液 儲存器(16)是任選的。適合的微生物可以包括例如一種或多種細菌、一種或多種真菌、一種或多種古細 菌、一種或多種原生生物或其組合。檢測裝置
在另一實施方案中，可以用電荷耦合裝置進行該第一和第二光響應的檢測。其他適合 的裝置可以包括例如照相機、視頻照相機、硅光電池、和光電倍增管(PMT)等或其組合。適合的電荷耦合裝置包括例如可獲自Photometries, Pleasanton, CA, USA的 CoolSNAP EZ。經(jīng)固定的熒光素-熒光素酶絡合物
在一種實施方案中，該熒光素-熒光素酶絡合物可以固定在該透明多孔基質(zhì)上?？梢?使用幾種方法，包括例如通過重氮化將熒光素酶固定在多孔基質(zhì)(具有經(jīng)胺處理的表面) 上；通過席夫堿反應將熒光素酶直接固定在多孔基質(zhì)(具有經(jīng)胺處理的表面)上；或通過席 夫堿反應將熒光素酶直接固定在多孔基質(zhì)(具有羧基、醛基)上。對于該熒光素而言，可以使 用兩種方法，包括例如將熒光素添加到溶液中并允許該溶液流過具有ATP的報道分子區(qū) 域；和使用例如熒光素酚基將熒光素固定到多孔基質(zhì)上。在另一實施方案中，可以將該熒光素-熒光素酶絡合物封裝在該透明多孔基質(zhì) 上。為了將該熒光素-熒光素酶絡合物封裝在該基質(zhì)內(nèi)，可以使用例如兩種方法。在第一種方法中，使用例如溶膠-凝膠或其他技術(shù)使表達熒光素-熒光素酶的細胞或微生物生長 并封裝在多孔基質(zhì)中。在第二種方法中，可以將熒光素酶加入到孔尺寸小于熒光素酶尺寸 的多孔基質(zhì)中。在上述各種方法中，可以通過例如以下添加熒光素(1)將熒光素添加到溶 液中并允許該包含熒光素的溶液流動通過具有ATP的報道分子區(qū)域；(2)使用熒光素的酚 基將該熒光素固定在多孔基質(zhì)上；和(3)用封裝在該基質(zhì)內(nèi)的細胞或微生物制備熒光素。在另一實施方案中，包括熒光素-熒光素酶絡合物的該透明多孔基質(zhì)包括透明無 機凝膠基質(zhì)、透明有機聚合物凝膠基質(zhì)、透明混雜無機-有機凝膠基質(zhì)或其組合。在一種實施方案中，該透明無機凝膠基質(zhì)包括硅膠、硼酸鹽、Ti02、Al2O3JrO2或其 組合。在一種實施方案中，該透明有機聚合物凝膠基質(zhì)包括聚乙烯醇、聚酯、聚酰亞胺、 聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚烯烴、聚碳酸酯或其組合。在一種實施方案中，該復合凝膠基質(zhì)包括上述其無機和有機聚合物凝膠基質(zhì)的組合。Schubert 等，Synthesis of Inorganic Materials, 2nd Edition, ffiley-VCH, Weinheim, Germany, 2005中公開了適合的透明無機凝膠基質(zhì)和透明混雜無機-有機凝膠基質(zhì)。適合的透明有機聚合物凝膠基質(zhì)可以包括例如水不溶性材料，例如乙酸纖維素、 丙酸纖維素、丁酸纖維素、乙酸丁酸纖維素、硝酸纖維素、聚丙烯酸酯、聚對苯二甲酸乙二醇 酯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯醇縮醛、聚酰亞胺、聚硅 氧烷、聚氨酯、聚糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、其共聚物或其組合。樣品管
在一種實施方案中，該樣品管包括聚合材料或無機材料，或其他生物相容或生物惰性 材料。該樣品管可以是例如全部由一種材料制成或由不同部分制成，每一部分可以由不同 材料構(gòu)成。在一種實施方案中，該樣品管可以由一種材料制成。在另一實施方案中，該樣品管 可以在不同部分由兩種或更多種材料制成。在一種實施方案中，該樣品管可以全部由玻璃或聚合物制成。在另一實施方案 中，該樣品管可以由金屬制成，其具有由透明材料(例如玻璃或聚合物)制成的透明報道分 子區(qū)域。在其中該樣品管可能由多于一種材料(例如玻璃和金屬)制成的某些實施方案 中，可以使用密封劑以連接這些材料。在一種實施方案中，可以使用硅密封劑，例如Room Temperature Vulcanizing (RTV) 5 !齊[J。該樣品管可以經(jīng)選擇以提供適合的光透射特征。例如，該樣品管可以是官能化的 或非官能化的玻璃或多種聚合物中的任一種。一旦閱讀了本公開內(nèi)容，其他底物材料對于 本領域技術(shù)人員而言將是容易顯而易見的。適用于該樣品管的聚合材料可以包括例如是均聚物或共聚物的透明有機聚合物， 其是天然形成的或合成的，交聯(lián)的或未交聯(lián)的。感興趣的特定聚合物包括但不局限于聚烯 烴，例如聚丙烯；聚酰亞胺；聚碳酸酯；聚酯；聚酰胺；聚醚；聚氨酯；聚氟烴；聚苯乙烯 ’聚 (丙烯腈-丁二烯-苯乙烯)(ABS)；丙烯酸酯和丙烯酸聚合物，例如聚甲基丙烯酸甲酯；和 其他取代和未取代的聚烯烴；及其共聚物。
該樣品管也可以由“復合材料”(即由不同材料構(gòu)成的組合物)制成。該復合材料 可以是嵌段復合材料，例如A-B-A嵌段復合材料、或A-B-C嵌段復合材料等。該樣品管的內(nèi) 表面可以化學改性以提供所需的化學或物理性質(zhì)，例如降低分子部分到該樣品管的內(nèi)壁上 的吸附性和降低電滲流。例如，該樣品管的內(nèi)表面可以涂覆有或官能化以包含電中性分子 物種、兩性離子基團、親水或疏水低聚物或聚合物等。當用聚酰亞胺、聚酰胺和具有反應活 性位置或官能團(例如羧基、羥基、氨基和鹵代烷基)的聚烯烴(例如聚乙烯醇、聚羥基苯乙 烯、聚丙烯酸、聚丙烯腈等)，或者用能夠經(jīng)改性以包含這種反應活性位置或官能團的聚合 物時，可能可以將能夠提供各種所需表面性質(zhì)的基團化學鍵合到該表面上。也可以使用表 面活性劑(例如聚環(huán)氧乙烷三嵌段共聚物，例如可以商標“Pluronic”得到的那些、聚氧乙烯 山梨糖醇酐或“TWEEN”)、天然聚合物(例如牛血清清蛋白)或提供所需表面特征(特別是降 低生物分子(例如核酸或蛋白質(zhì))的吸附性)的其他部分，對該樣品管的內(nèi)表面進行有利地 改性。優(yōu)選地，該樣品管中的聚合材料可以包括例如包括聚乙二醇、聚環(huán)氧乙烷的聚甲 基丙烯酸甲基酯；聚丙烯酰胺等，或其組合。在一種實施方案中，可以對該包括聚乙二醇、聚 環(huán)氧乙烷的聚甲基丙烯酸甲基酯；聚丙烯酰胺等，或其組合進行例如表面改性。適用于該樣品管的無機材料可以包括例如玻璃、陶瓷材料、金屬、金屬合金、金屬 氧化物、復合金屬氧化物或其組合。適合的陶瓷材料可以包括例如Si02、ZrO2, Ti02、A1203、ZnO等或其組合。適合的金屬可以包括例如Al、Mg、Zn、Pd、Pt、Ni、Co、Rh、Ir、Fe、Ru、Au、Ag、Cu 等
或其組合。適合的合金可以包括例如不銹鋼、硬鋁、硅鋁合金、青銅、黃銅等或其組合。用于該樣品管的其他可能解決方案可以是使用上述材料的任意組合。操作條件
該用于測定樣品中一種或多種微生物的濃度的設備可以以例如可能適用于所需微生 物的任意所需溫度、壓力和流速操作。在示例性實施方案中，該設備可以以約0°C 約100°C的溫度，典型地為約室溫 約60°C，更典型地約35°C 約40°C的溫度操作。然而，在其中所需的微生物是適于高溫環(huán) 境的微生物的某些實施方案中，可以使用更高的溫度。在該樣品管內(nèi)的樣品的流速可以是任意所需的速率。在示例性實施方案中，該流 速可以為約0. 000005標準立方厘米/分鐘(sccm) 約lOsccm，優(yōu)選約0. 00005sccm 約 0. Isccm,更優(yōu)選約 0. 0005sccm 約 0. Olsccm0該樣品管內(nèi)的壓力可以是任意所需的壓力。此處參考或引用的所有專利和公開文件表示本發(fā)明所述領域技術(shù)人員的技術(shù)水 平，每一這些提及的專利或公開文件由此通過引用結(jié)合進來，就像其已經(jīng)整體單獨通過引 用結(jié)合進來或者整體在此處給出一樣。申請人保留將來自任意這種引用的專利或公開文件 的任何和所有材料和信息物理引入本說明書中的權(quán)力。此處公開的具體方法和組合物表示優(yōu)選的實施方案且是示例性的且并不意于限 制本發(fā)明的范圍。一旦考慮了本說明書，其他目的、方面和實施方案將是本領域技術(shù)人員容 易想到的，且包括在由權(quán)利要求的范圍限定的本發(fā)明的精神之內(nèi)。本領域技術(shù)人員將容易顯而易見得出可以在不脫離本發(fā)明的范圍和精神的情況下對此處公開的本發(fā)明進行各種 取代和改變。此處示例性描述的本發(fā)明適宜地可以在沒有如下的任何一種要素或多種要 素、或者一種限制或多種限制的情況下實施所述要素和限制沒有在本文中特別公開為必 需的。此處示例性描述的該方法和工藝適宜地可以以不同的步驟順序?qū)嵤?，且其并不必?制到此處或權(quán)利要求中指出的步驟順序。
權(quán)利要求
1.用于測定樣品中一種或多種微生物的濃度的方法，包括以下步驟(a)將包含一種或多種微生物的第一樣品過濾通過樣品管內(nèi)的過濾器以將該一種或多 種微生物保留在該過濾器上并提供第一濾出液；(b)將該第一濾出液過濾通過該樣品管內(nèi)的報道分子區(qū)域，其中該報道分子區(qū)域包括 包含熒光素-熒光素酶絡合物的透明多孔基質(zhì)；(c)檢測來自該報道分子區(qū)域的第一光響應，其中該光響應是由該濾出液與該熒光 素-熒光素酶絡合物的相互作用提供的；(d)將該第一光響應與校準曲線比較以測定該樣品中的該一種或多種微生物的濃度；(e)任選地將包含一種或多種微生物和試劑的第二樣品過濾通過該樣品管內(nèi)的該過濾 器以將該一種或多種微生物保留在該過濾器上并提供第二濾出液，其中該試劑對于第一微 生物而言是特異性的且包括刺激物、抑制劑、終止劑、抗生素、營養(yǎng)劑或其組合；(f)任選地將該第二濾出液通過該樣品管內(nèi)的該報道分子區(qū)域；(g)任選地檢測來自該報道分子區(qū)域的第二光響應，其中該第二光響應是由該第二濾 出液與該熒光素-熒光素酶絡合物的相互作用提供的；(h)任選地將該第一光響應減去該第二光響應以提供第一微生物特異性光響應；和(i )任選地將該第一微生物特異性光響應與校準曲線比較以測定該第一微生物在該樣 品中的濃度，其中該一種或多種微生物包括一種或多種細菌、一種或多種真菌、一種或多種古細菌、 一種或多種原生生物或其組合。
2.權(quán)利要求1的方法，其中該第一和第二光響應的檢測用檢測器進行。
3.權(quán)利要求2的方法，其中該檢測器包括照相機、視頻照相機、硅光電池、或光電倍增 管或其組合。
4.權(quán)利要求1的方法，其中將該熒光素-熒光素酶絡合物固定在該透明多孔基質(zhì)上或 封裝在其內(nèi)。
5.權(quán)利要求1的方法，其中包括熒光素-熒光素酶絡合物的該透明多孔基質(zhì)包括透明 無機凝膠基質(zhì)、透明有機聚合物凝膠基質(zhì)、透明混雜無機-有機凝膠基質(zhì)、或其組合。
6.權(quán)利要求5的方法，其中該透明無機凝膠基質(zhì)包括硅膠、硼酸鹽、1102、41203、21<)2或 其組合。
7.權(quán)利要求5的方法，其中該透明有機聚合物凝膠基質(zhì)包括聚乙烯醇、聚酯、聚酰亞 胺、聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚烯烴、聚碳酸酯或其組合。
8.權(quán)利要求5的方法，其中該透明混雜無機-有機凝膠基質(zhì)包括硅膠、硼酸鹽、TiO2, A1203、、聚乙烯醇、聚酯、聚酰亞胺、聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚烯烴、聚碳 酸酯或其組合。
9.權(quán)利要求1的方法，其中該樣品管包括有機聚合材料、無機材料或其組合。
10.權(quán)利要求9的方法，其中該聚合材料包括包含聚乙二醇、聚環(huán)氧乙烷的聚甲基丙烯 酸甲酯；聚丙烯酰胺、或其組合。
11.權(quán)利要求9的方法，其中該無機材料包括玻璃、陶瓷材料、金屬、金屬合金、金屬氧 化物、復合金屬氧化物、或其組合。
12.設備，包括(a)樣品管，包括樣品入口 ；在該樣品管內(nèi)的過濾器，其中該樣品管包括在該樣品入口和該過濾器之間的任選的試 劑入口或連接到在該過濾器和報道分子區(qū)域之間的任選的閥的任選的清潔性緩沖液入口； 和在該過濾器和出口之間的報道分子區(qū)域，其中該報道分子區(qū)域包括包含熒光素-熒光 素酶絡合物的透明多孔基質(zhì)；(b)與該報道分子區(qū)域連接以檢測來自該報道分子區(qū)域的一個或多個光響應的檢測 器，其中該一個或多個光響應是由一種或多種濾出液與該熒光素-熒光素酶絡合物的相互 作用提供的；和(c)與該檢測器連接以測定該一種或多種微生物在該樣品中的濃度的分析儀，其中，該 一種或多種微生物包括一種或多種細菌、一種或多種真菌、一種或多種古細菌、一種或多種 原生生物、或其組合。
13.權(quán)利要求12的設備，其中該檢測器包括照相機、視頻照相機、硅光電池、或光電倍增管、或其組合。
14.權(quán)利要求12的設備，其中將該熒光素-熒光素酶絡合物固定在該透明多孔基質(zhì)上 或封裝在其內(nèi)。
15.權(quán)利要求12的設備，其中包含熒光素-熒光素酶絡合物的該透明多孔基質(zhì)包括透 明無機凝膠基質(zhì)、透明有機聚合物凝膠基質(zhì)、透明混雜無機-有機凝膠基質(zhì)或其組合。
16.權(quán)利要求15的設備，其中該透明無機凝膠基質(zhì)包括硅膠、硼酸鹽、Ti02、Al203、^O2 或其組合。
17.權(quán)利要求15的設備，其中該透明有機聚合物凝膠基質(zhì)包括聚乙烯醇、聚酯、聚酰亞 胺、聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚烯烴、聚碳酸酯或其組合。
18.權(quán)利要求15的設備，其中該透明混雜無機-有機凝膠基質(zhì)包括硅膠、硼酸鹽、Ti02、 A1203、、聚乙烯醇、聚酯、聚酰亞胺、聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚烯烴、聚碳 酸酯或其組合。
19.權(quán)利要求12的設備，其中該樣品管包括有機聚合材料、無機材料或其組合。
20.設備，包括(a)樣品管，包括樣品入口 ；在該樣品管內(nèi)的過濾器；和在該過濾器和出口之間的報道分子區(qū)域，其中該報道分子區(qū)域包括包含熒光素-熒光 素酶絡合物的透明多孔基質(zhì)；(b)與該報道分子區(qū)域連接以檢測來自該報道分子區(qū)域的一個或多個光響應的檢測 器，其中該一個或多個光響應是由一種或多種濾出液與該熒光素-熒光素酶絡合物的相互 作用提供的；和(c)與該檢測器連接以測定該一種或多種微生物在該樣品中的濃度的分析儀。
全文摘要
提供了用于測定樣品中的一種或多種微生物的濃度的方法和裝置。該方法包括將樣品過濾通過在樣品管內(nèi)部的過濾器以將該一種或多種微生物保留在該過濾器上。所得到的包含或生成三磷酸腺苷的濾出液通過該樣品管并進入該報道分子區(qū)域。在該報道分子區(qū)域中，該濾出液中的該三磷酸腺苷與包括螢光素-熒光素酶絡合物的透明多孔基質(zhì)接觸。該三磷酸腺苷與該螢光素-熒光素酶絡合物相互作用以提供用檢測器測定的光響應。將該光響應與校準曲線相比較以測定樣品中一種或多種微生物的總濃度。
文檔編號G01N21/76GK102066911SQ200880129899
公開日2011年5月18日 申請日期2008年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月21日
發(fā)明者潘 T., 王 W., 劉 X., 孫 Z. 申請人:霍尼韋爾國際公司