單點(diǎn)去卷積顯微系統(tǒng)與成像方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明單點(diǎn)去卷積顯微系統(tǒng)與成像方法屬于光學(xué)顯微測(cè)量領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 在納米技術(shù)和生物技術(shù)的研究當(dāng)中，高分辨顯微成像技術(shù)起到了至關(guān)重要的作 用。特別是在生命科學(xué)領(lǐng)域，為了更好地理解人體生命的作用過(guò)程和疾病的產(chǎn)生機(jī)理，需要 觀察細(xì)胞（細(xì)胞內(nèi)器官）、病毒等在三維細(xì)胞內(nèi)的三維空間位置和分布，需要在細(xì)胞內(nèi)精確 定位特定的蛋白質(zhì)以研究其位置與功能的關(guān)系。而反映這些體系性質(zhì)的特征尺度都在納米 量級(jí)。光學(xué)顯微技術(shù)可以通過(guò)非接觸的方式實(shí)現(xiàn)快速成像、長(zhǎng)時(shí)間監(jiān)控成像，同時(shí)不會(huì)影響 生物體系的活性。近年來(lái)，隨著新的熒光探針和成像理論的出現(xiàn)，光學(xué)顯微鏡的分辨率得以 突破光學(xué)衍射極限，達(dá)到可以與電子顯微鏡相媲美的精度，并可以在活細(xì)胞上看到納米尺 度的蛋白質(zhì)。這些分辨率突破光學(xué)衍射極限的顯微技術(shù)被稱為超分辨顯微術(shù)。其中，最著 名的當(dāng)屬獲得2014年諾貝爾獎(jiǎng)的受激福射損耗（Stimulated Emission Depletion，STED) 顯微技術(shù)。
[0003] STED 技術(shù)由 Stefan W. Hell 提出（Hell, S. W. and Wichmann, J. (1994)，'Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission:Stimulated-emission-de pletion fluorescence microscopy'，Optics Letters，19 (11) :780 - 782)，其基本思想是 同時(shí)照射兩束具有不同波長(zhǎng)的皮秒脈沖激光光束，其中一束皮秒脈沖激光光束在樣品表面 會(huì)聚成面包圈狀的第一聚焦光斑，另外一束皮秒脈沖激光光束在樣品表面會(huì)聚成第二聚焦 光斑，將兩個(gè)光斑中心重合，其中位于光斑中心區(qū)域的熒光物質(zhì)激發(fā)出熒光，位于光斑內(nèi)但 不在光斑中心區(qū)域中的熒光物質(zhì)發(fā)生退激發(fā)，不發(fā)出熒光，從而實(shí)現(xiàn)超分辨成像。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明在傳統(tǒng)STED技術(shù)的基礎(chǔ)上，在不同時(shí)刻照射兩束具有相同波長(zhǎng)的激光束， 同時(shí)采用了去卷積算法，進(jìn)一步提高顯微系統(tǒng)的分辨率。
[0005] 本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：
[0006] 單點(diǎn)去卷積顯微系統(tǒng)，包括螺旋相位板、分光棱鏡、偏振分束器、四分之一波片、聚 焦物鏡、長(zhǎng)波通濾光片、收集物鏡和光電探測(cè)器；
[0007] 第一平行光經(jīng)過(guò)螺旋相位板調(diào)制后，依次經(jīng)過(guò)分光棱鏡、偏振分束器和四分之一 波片透射，由聚焦物鏡匯聚在熒光樣品上，形成環(huán)形光斑；所述的螺旋相位板使第一平行光 附加螺旋相位因子e Xp(il9);其中，i為虛數(shù)單位，1為螺旋相位板的拓?fù)浜蓴?shù)，Θ為旋轉(zhuǎn) 方位角；
[0008] 第二平行光經(jīng)過(guò)分光棱鏡反射后，依次經(jīng)過(guò)偏振分束器和四分之一波片透射，由 聚焦物鏡匯聚在熒光樣品上，形成圓形光斑；
[0009] 所述第一平行光與第二平行光波長(zhǎng)相同，在經(jīng)過(guò)分光棱鏡后同軸傳遞，將熒光樣 品表面激發(fā)出焚光，所述焚光依次經(jīng)過(guò)聚焦物鏡和四分之一波片透射，偏振分束器反射，長(zhǎng) 波通濾光片透射，由收集物鏡匯聚到光電探測(cè)器上進(jìn)行成像。
[0010] 上述單點(diǎn)去卷積顯微系統(tǒng)，所述的偏振分束器替換為二向色鏡。
[0011] 上述單點(diǎn)去卷積顯微系統(tǒng)，所述的長(zhǎng)波通濾光片（10)替換為帶通濾光片。
[0012] 上述單點(diǎn)去卷積顯微系統(tǒng)，所述長(zhǎng)波通濾光片的截止波長(zhǎng)λ選取應(yīng)滿足A1 < λ < λ2，其中，A1S激發(fā)光波長(zhǎng)，λ 2為焚光樣品表面激發(fā)出的焚光波長(zhǎng)。
[0013] -種在上述單點(diǎn)去卷積顯微系統(tǒng)上實(shí)現(xiàn)的成像方法，首先得到坐標(biāo)為（i，j)的物 點(diǎn)的灰度值Sum li ,，再通過(guò)移動(dòng)熒光樣品，遍歷i和j的所有取值，利用所有物點(diǎn)的灰度值信 息，構(gòu)造完整的二維圖像。
[0014] 上述成像方法，所述的坐標(biāo)為（i，j)的物點(diǎn)的灰度值信息，通過(guò)以下步驟得到：
[0015] 步驟a、在只照射第一平行光，不照射第二平行光的條件下，光電探測(cè)器（12)以坐 標(biāo)（i，j)為中心對(duì)熒光樣品進(jìn)行成像，得到分辨率為mXn的第一圖像Imagel n^
[0016] 步驟b、在只照射第二平行光，不照射第一平行光的條件下，光電探測(cè)器（12)以坐 標(biāo)（i，j)為中心對(duì)熒光樣品進(jìn)行成像，得到分辨率為mXn的第二圖像Imagd niin;
[0017] 步驟c、按照以下公式對(duì)第一圖像Imagelm,n和第二圖像Image2 m,n進(jìn)行運(yùn)算：
[0018] Templni n= deconv (Imagel m n)
[0019] Temp2m n= deconv (Image2 m n)
[0020] 式中，deconv表示去卷積運(yùn)算；
[0021] 步驟d、按照以下公式計(jì)算得到中心感興趣區(qū)域信息Temp111
[0023] 式中，η大于0;
[0024] 步驟e、按照以下公式對(duì)中心感興趣區(qū)域信息Tempn^n進(jìn)行求和運(yùn)算：
[0026] 式中，sumu表示坐標(biāo)為（i, j)的物點(diǎn)的灰度值。
[0027] 上述成像方法，構(gòu)造完整的二維圖像通過(guò)以下步驟得到：
[0028] 步驟a、構(gòu)造一個(gè)空白矩陣；
[0029] 步驟b、將SumiJ依次填到對(duì)應(yīng)元素位置。
[0030] 有益效果：
[0031] 第一、傳統(tǒng)STED技術(shù)要求兩個(gè)激光束波長(zhǎng)不相同，并且同時(shí)照射，而本發(fā)明要求 兩個(gè)激光束波長(zhǎng)相同，并且不同時(shí)照射，并利用兩幅圖像求差來(lái)縮小感興趣區(qū)域的范圍，這 些區(qū)別技術(shù)特征可以提高成像系統(tǒng)的分辨率。
[0032] 第二、本發(fā)明采用了去卷積運(yùn)算，進(jìn)而可以去除非焦平面上的模糊，減少探測(cè)器的 卷積效應(yīng)帶來(lái)的測(cè)量誤差，該技術(shù)特征可以進(jìn)一步提高成像系統(tǒng)的分辨率。
【附圖說(shuō)明】
[0033] 圖1是本發(fā)明單點(diǎn)去卷積顯微系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0034] 圖2是將Sumii 依次填到對(duì)應(yīng)元素位置后的示意圖。
[0035] 圖中：1螺旋相位板、2分光棱鏡、3偏振分束器、4四分之一波片、5聚焦物鏡、6長(zhǎng) 波通濾光片、7收集物鏡、8光電探測(cè)器。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0037] 具體實(shí)施例一
[0038] 本實(shí)施例為單點(diǎn)去卷積顯微系統(tǒng)實(shí)施例。
[0039] 本實(shí)施例的單點(diǎn)去卷積顯微系統(tǒng)，結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。該單點(diǎn)去卷積顯微系 統(tǒng)包括螺旋相位板1、分光棱鏡2、偏振分束器3、四分之一波片4、聚焦物鏡5、長(zhǎng)波通濾光片 6、收集物鏡7和光電探測(cè)器8 ;
[0040] 第一平行光經(jīng)過(guò)螺旋相位板1調(diào)制后，依次經(jīng)過(guò)分光棱鏡2、偏振分束器3和四分 之一波片4透射，由聚焦物鏡5匯聚在熒光樣品上，形成環(huán)形光斑；所述的螺旋相位板1使 第一平行光附加螺旋相位因子exp (il Θ );其中，i為虛數(shù)單位，1為螺旋相位板1的拓?fù)浜?數(shù)，Θ為旋轉(zhuǎn)方位角；螺旋相位板1的上述螺旋相位特性，使光束波前變?yōu)槁菪谓Y(jié)構(gòu)，光 束的中心出現(xiàn)相位奇點(diǎn)，光強(qiáng)變?yōu)榱?，這種光場(chǎng)即為渦旋光場(chǎng)，進(jìn)而形成環(huán)形光斑。
[0041] 第二平行光經(jīng)過(guò)分光棱鏡2反射后，依次經(jīng)過(guò)偏振分束器3和四分之一波片4透 射，由聚焦物鏡5匯聚在熒光樣品上，形成圓形光斑；