本發(fā)明涉及基因工程，具體涉及一種基于pcr-lfs的基因編輯元件crispr/cas9快速檢測技術(shù)。

背景技術(shù)：

1、轉(zhuǎn)基因食品是通過基因工程技術(shù)改變其遺傳物質(zhì)的食品，這一過程可能涉及將一個生物體的基因轉(zhuǎn)移到另一個生物體中，以賦予接受基因的生物體新的特性或改善原有特性。轉(zhuǎn)基因食品的開發(fā)通常旨在提高作物的產(chǎn)量、改善營養(yǎng)價值、增強對病蟲害的抵抗力或適應(yīng)不良土壤和氣候條件。例如，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以培育出抗蟲害的棉花、耐除草劑的大豆、富含維生素a的“黃金米”等。轉(zhuǎn)基因食品雖然有著無可替代的優(yōu)勢，但這些食品在上市前需要經(jīng)過嚴格的安全評估和測試，以確保它們對人體健康無害?；谌蜣D(zhuǎn)基因作物的迅速推廣，一些非法轉(zhuǎn)基因作物開始顯現(xiàn)出來。盡管許多國家已經(jīng)實施了嚴格的轉(zhuǎn)基因標簽規(guī)定，但未經(jīng)授權(quán)和不受控制的轉(zhuǎn)基因作物種植依然被報道。

2、基因編輯技術(shù)是一種全新的顛覆性基因操作技術(shù)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有廣泛的應(yīng)用，如何對基因編輯作物進行檢測，具有重大研究意義。crispr/cas9是一種革命性的基因編輯技術(shù)，它源自于細菌的天然免疫系統(tǒng)，具有高效率、低成本和操作簡便等眾多優(yōu)勢，與傳統(tǒng)基因編輯方法相比，其可以更快速地進行多重基因的編輯，并且可以在不同的生物體中應(yīng)用，包括植物、動物和人類細胞。目前該技術(shù)已在轉(zhuǎn)基因作物中得到了廣泛的應(yīng)用，包括基因敲除、基因敲入、基因調(diào)控已經(jīng)基因組層面的應(yīng)用等。

3、因此，亟需一種基于pcr-lfs的基因編輯元件crispr/cas9快速檢測技術(shù)，以有效解決現(xiàn)有技術(shù)在非法轉(zhuǎn)基因作物檢測中存在的問題，提高檢測的速度、靈敏度和特異性，降低成本，并適應(yīng)新技術(shù)的發(fā)展，增強監(jiān)管能力。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為此，本發(fā)明提供一種基于pcr-lfs的基因編輯元件crispr/cas9快速檢測技術(shù)，以解決現(xiàn)有技術(shù)中在檢測非法轉(zhuǎn)基因作物和基因編輯作物方面存在檢測速度慢、靈敏度不高、成本較高的問題。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

3、根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種基于pcr-lfs的基因編輯元件crispr/cas9快速檢測技術(shù)，包括以下步驟：

4、s1.選取植物樣品、準備質(zhì)粒標準品、設(shè)計和合成引物、制備探針以及制備膠體金；

5、s2.構(gòu)建含有crispr/cas9基因編輯元件的質(zhì)粒，然后將質(zhì)粒通過dh5α感受態(tài)細胞進行轉(zhuǎn)化，最后提取質(zhì)粒并測定濃度；

6、s3.pcr試紙條制備；

7、s4.從植物樣品中提取dna并進行pcr擴增及檢測；

8、s5.pcr-lfs檢測技術(shù)優(yōu)化與驗證。

9、進一步地，所述s3包括以下具體步驟：

10、s31.試劑配置：用超純水分別配制200ml?1mol/l?ph為8.0的tris-hcl緩沖液、10ml0.1mol/l碳酸鉀溶液、100ml?1％的檸檬酸三鈉溶液、10mm?pb和5g/l氯金酸溶液；用10mm?pbs將羊抗鼠二抗稀釋至1mg/ml；

11、s32.膠體金制作：用自來水和蒸餾水分別清洗錐形瓶和磁力攪拌子，然后將磁力攪拌子裝入錐形瓶，用王水浸泡過夜后再依次使用自來水、純水、超純水對清洗錐形瓶和磁力攪拌子清洗后烘干；

12、在潔凈錐形瓶中加入196ml超純水和4ml?5g/l氯金酸，置于磁力攪拌器上攪拌后加熱，并向瓶中快速加入2.4ml1％的檸檬酸三鈉溶液，持續(xù)加熱攪拌至液體變色為酒紅色，繼續(xù)加熱攪拌5min后冷卻至室溫，用封口膜封口后于2-8℃保存；

13、s33.膠體金偶聯(lián)物制作：取1000μl膠體金注入1.5ml錐形離心管，加入0.1mol/l的碳酸鉀溶液7μl，振蕩混勻，隨后加入1mg/ml的anti-digoxin?5μl，振蕩混勻，并于3d旋轉(zhuǎn)混合儀上振蕩反應(yīng)60min后加入10％?bsa溶液85μl，振蕩混勻，隨后在3d旋轉(zhuǎn)混合儀振蕩封閉30min，低溫高速離心機上4℃下10500r/min離心15min，離心結(jié)束后，快速吸取25μl酒紅色沉淀物轉(zhuǎn)移到200μlpcr管中，加入10％的蔗糖溶液10μl、10％的bsa溶液50μl和25μl?pbs(1x)配制成重懸液，渦旋儀振蕩8s，混勻后于4℃保藏備用；

14、s34.金標墊制備：將vl98聚酯膜裁切成預(yù)處理條，置于金標處理液中浸泡2h，然后烘箱37℃干燥120min，再用切條機將其切割為4×6mm金標墊，移取配置好的重懸液滴加在金標墊上，7μl/片，37℃烘干60min；

15、s35.底板nc膜制備：揭除pvc底板中間預(yù)留的不干膠，將裁剪好的nc膜貼在pvc膠板中間對應(yīng)位置，將配置好的c、t線抗體從劃膜噴金儀的劃針倒吸進入劃線導(dǎo)管中，排出劃線導(dǎo)管倒吸中的空氣后擦除劃針溢出的抗體，c、t線劃線量設(shè)置為0.6μl/cm，將劃線完成的pvc底板烘干；

16、s36.樣品墊制備：將玻璃纖維板和紙板裁切成長條，將樣品墊處理液浸泡120min后烘干備用；

17、s37.組裝：將pvc底板19mm寬度一側(cè)不干膠揭除，樣品墊貼合位置與pvc底板齊平，然后將pvc底板17mm寬度一側(cè)不干膠揭除，吸水紙一側(cè)于pvc底板邊緣齊平，另一側(cè)壓覆于nc膜上貼合；

18、s38.切條：將組裝好的pvc板切為寬度4mm，裁切為長條的試紙條放入密封袋并加入干燥劑，封口；

19、s39.金標墊安裝：用鑷子將樣品墊掀起，再用另外一把鑷子將鋪金干燥好的金墊填放在樣品墊和nc膜中間，調(diào)整金標墊與nc膜壓覆尺寸2.0±0.2mm，試紙條制作完成后放置于干燥、陰涼處保存?zhèn)溆谩?/p>

20、進一步地，所述s1中探針引物及擴增內(nèi)標的制備具體步驟為：將新合成的引物探針在離心機上高速離心5s，將管壁上的粉末離心至管底，再向離心管中加入100μl的無核酸酶水，上下震蕩后，再在離心機上高速離心5s，得到10μm的上下游引物及探針，置于-20℃冰箱中保存，探針需要避光處理。

21、進一步地，所述s1中的引物對包括有第一引物對、第二引物對和探針：

22、所述第一引物對包括如seq?id?no.1所示的正向引物和如seq?id?no.2所示的反向引物；

23、所述第二引物對包括如seq?id?no.3所示的正向引物和如seq?id?no.4所示的反向引物；

24、所述探針包括核苷酸序列如seq?id?no.5所示。

25、進一步地，所述s2中將純化的質(zhì)粒經(jīng)dh5α感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化包括以下具體步驟：

26、從-80℃中取出dh5α感受態(tài)細胞，于超凈臺內(nèi)將質(zhì)粒dna溶液全部加入感受態(tài)細胞內(nèi)，并輕柔混勻，將感受態(tài)細胞于冰上冰浴30min，將感受態(tài)細胞離心管置于42℃水浴鍋內(nèi)熱激90s，然后迅速冰浴2min，最后向感受態(tài)細胞離心管加入200l無抗性液體lb，并將混合后的感受態(tài)細胞涂至含有氨芐抗性的lb平板上，涂板后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-16h直到長出單菌落，挑取單個菌落，接種至新的無抗性液體lb培養(yǎng)基中，于搖床上37℃，250rpm/min震蕩培養(yǎng)14-16h。

27、進一步地，所述s2中質(zhì)粒提取步驟如下：

28、取1-5ml菌液，以10000rpm離心1min，收集菌體于1.5ml?ep管內(nèi)，并棄去上清lb培養(yǎng)基，向菌體沉淀中加入250l緩沖液p1，重懸菌體，隨后向離心管內(nèi)加入250l緩沖液p2，輕柔上下顛倒混勻，再加入350l緩沖液p3并立即輕柔上下顛倒直至白色絮狀沉淀后，12000rpm離心10min；

29、將離心后產(chǎn)物上清轉(zhuǎn)移至帶有廢液收集管的fastpure?dna?mini?columns吸附柱內(nèi)，12000rpm，離心30s，并棄掉收集管內(nèi)的廢液，隨后加入已用無水乙醇稀釋的pw2至吸附柱內(nèi)，清洗柱子內(nèi)的離子物質(zhì)，通過12000rpm離心30s棄掉pw2，并重復(fù)該步驟，通過空離心12000rpm，2min將吸附柱中殘留的洗液徹底去除；

30、將吸附柱置于干凈的1.5mlep管中，并加入50l?elution緩沖液至吸附柱的膜中央洗脫dna，室溫靜置1min12000?rpm離心1min，所得即為目的質(zhì)粒。

31、進一步地，所述s4中具體包括以下步驟：

32、s41.dna提?。褐参飿悠方?jīng)研磨儀處理后，通過dna試劑盒進行dna的提取，使用nanodrop測定dna濃度；

33、s42.使用veriti?96孔pcr儀進行擴增，程序如下：

34、95℃預(yù)變性5min；95℃變性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，重復(fù)30-40個循環(huán)；最終72℃延伸3min；

35、s43.pcr產(chǎn)物檢測：取6μl?dna擴增產(chǎn)物，加入44μl?10mm?tris-hcl混合均勻，并將將50μl混合物滴加于lfs的樣品墊上，10min后觀察lfs上的測試區(qū)和控制區(qū)的信號，并通過毛細管凝膠電泳確認pcr產(chǎn)物。

36、進一步地，所述s5中包括：pcr擴增體系優(yōu)化、顯示靈敏度比對分析、檢測特異性驗證、檢測靈敏度分析、實際樣品檢測和數(shù)據(jù)分析。

37、進一步地，所述s35中c線抗體為1mg/ml的羊抗鼠二抗，t線抗體為1mg/ml的鏈霉親和素。

38、進一步地，所述s36中璃纖維板裁切成17×300mm寬度長條，紙板裁切19×300mm寬度長條。

39、本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

40、1.本技術(shù)通過構(gòu)建基于pcr擴增和側(cè)向?qū)游隽髟嚰垪l(lateral?flow?strip，lfs)的檢測方法，為crispr/cas9基因編輯作物提供了快速、便捷的檢測手段。相較于傳統(tǒng)的實驗室檢測方法，如southern?blotting或?qū)崟r熒光定量pcr(qpcr)，本方法操作簡便，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，能夠在短時間內(nèi)完成從樣品處理到結(jié)果讀取的全過程。這對于田間檢測和現(xiàn)場快速篩查尤為重要，可以大大提高檢測效率，減少人為誤差，并且便于非專業(yè)人員操作。

41、2.本技術(shù)利用crispr/cas9基因編輯元件的特征序列設(shè)計特異性引物，并通過優(yōu)化pcr擴增體系，確保了檢測的高靈敏度和特異性。通過對不同稀釋度的標準品進行靈敏度比對分析，驗證了該方法能夠檢測到極低濃度的目標片段。此外，通過特異性驗證，確保了該方法不會出現(xiàn)非特異性擴增，從而避免假陽性的結(jié)果。這種高靈敏度和特異性確保了檢測結(jié)果的準確性，對于監(jiān)控非法轉(zhuǎn)基因作物的種植具有重要意義，有助于維護食品安全和市場秩序。