專利名稱：具有寬廣pH活性纖維素酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到生物遺傳領(lǐng)域，具體涉及一種來源于深海真菌Phaeosphaeriasp. LH21的具有寬廣pH活性纖維素酶及其制備方法。
背景技術(shù)：
纖維素酶是一種由三種不同酶構(gòu)成的復(fù)雜體系，具體分為內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶及葡聚糖苷酶。微生物是纖維素酶的主要來源。真菌纖維素酶一般在酸性pH條件下具有生物活性，可應(yīng)用于飼料行業(yè)、生物乙醇的生產(chǎn)等，但也有例外，一些真菌纖維素酶也可以在中堿性PH條件下具有纖維素酶活性，例如來源于特異腐質(zhì)霉、熱白絲菌的纖維素酶，具有生物石洗功能，達(dá)到起花作用，立體感強(qiáng)。由于中堿性纖維素酶受到越來越多 的關(guān)注，一些研究者集中于細(xì)菌纖維素酶的研究，比如，芽孢桿菌、鏈霉菌的一些纖維素酶最適pH為中堿性，能耐受較高的pH，其中芽孢桿菌堿性纖維素酶已經(jīng)應(yīng)用于洗滌劑行業(yè)，可以除去織物表面的纖維絨毛，讓織物看起來艷麗，起到除舊返新的效果。有很多纖維素酶的基因被克隆了，由于細(xì)菌基因組中不含有內(nèi)含子，能夠快捷分離其纖維素酶基因，而相對(duì)于真菌纖維素酶的基因來說，要快速分離到其纖維素酶基因，難度相對(duì)來說更大，相關(guān)的專利也就較少，報(bào)道最多的是里氏木霉纖維素酶，它能協(xié)同水解纖維素，其效率較高，其中一些纖維素酶的表達(dá)已經(jīng)在里氏木霉得到加強(qiáng)，如內(nèi)切纖維素酶。在這里，我們通過現(xiàn)代生物信息學(xué)技術(shù)，得到一種新穎的具有寬廣PH活性纖維素酶的基因編碼區(qū)DNA及其多肽。雖然現(xiàn)有背景技術(shù)中存在涉及到上述的一些或者所有性質(zhì)的纖維素酶，但是還是要需要具有新的廣譜PH的纖維素酶，而此纖維素酶在生物石洗、織物拋光、紙槳處理以及生物質(zhì)的轉(zhuǎn)變是很有用的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種具有寬廣pH活性纖維素酶及其制備方法。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案一種具有寬廣PH活性纖維素酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。上述具有寬廣pH活性纖維素酶基因，其中，所述的纖維素酶基因編碼的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。上述纖維素酶基因的編碼多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。上述編碼多肽，其中，所述的編碼多肽在pH6-10條件下具有75%以上的纖維素酶相對(duì)活性，并且能在PH3-10保存下具有90%以上的殘余相對(duì)活性。一種具有寬廣pH活性纖維素酶的制備方法，包括以下步驟I)由深海真菌Phaeosphaeria sp. LH21培養(yǎng)分離出具有寬廣pH活性纖維素酶基因，該基因具有SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列；2)將基因克隆到表達(dá)載體PPIC9K中；
3)將構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到宿主細(xì)胞，生產(chǎn)具有寬廣pH活性纖維素酶的基因工程菌；4)培養(yǎng)基因工程菌，獲得具有寬廣pH活性纖維素酶。上述具有寬廣pH活性纖維素酶的制備方法，其中，所述宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，原核細(xì)胞包括大腸桿菌、枯草桿菌、鏈霉菌、或分支桿菌；真核細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、里氏木霉、黑曲霉、米曲霉或各種動(dòng)植物細(xì)胞。本發(fā)明以來源于深海真菌Phaeosphaeria sp. LH21的基因組為基礎(chǔ),利用同源性搜索得到保守性氨基酸片段，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并性引物得到中間序列，用基因組走讀擴(kuò)增兩端未知序列，反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增該基因，然后克隆到表達(dá)載體PPIC9K中，并在畢赤酵母GSl 15中獲得表達(dá)。通過Genbank同源搜索和蛋白質(zhì)功能鑒定研究表明，該基因的編碼區(qū)DNA是一個(gè)編碼纖維素酶的DNA序列。該基因能在任何宿主細(xì)胞中表達(dá)，表達(dá)的纖維素酶在PH6-10條件下具有75%以上的纖維素酶相對(duì)活性，此纖維素酶還能在pH3-10條件下能保持殘余相對(duì) 纖維酶活性90%以上。另外，本發(fā)明還提供了在寬廣pH條件下具有最佳纖維素酶活性的多肽的氨基酸序列及功能等同突變體。在本發(fā)明中，編碼的纖維素酶在pH6-10條件下可以表現(xiàn)出75%以上的相對(duì)活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO. I的核苷酸序列及其簡(jiǎn)并密碼子所產(chǎn)生的序列。由已知密碼子的簡(jiǎn)并性，與SEQ ID NO. I核苷酸序列同源性小于70%的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQID NO. 2所述的氨基酸序列，還包括核苷酸雜交的核苷酸序列。還可包括同源性至少70%的核苷酸序列。在本發(fā)明中，“寬廣pH活性纖維素酶”，指在pH6-10條件下可以表現(xiàn)出75%以上的纖維素酶活性的SEQ ID NO. 2序列的多肽，它在各種pH條件下的耐受性可以達(dá)到90%以上。該術(shù)語(yǔ)還包括SEQ ID NO. 2序列的突變體，這些突變體具有與天然中堿性纖維素酶相同的功能。這些突變體包括若干個(gè)氨基酸的缺失，插入和/或取代，以及在兩端添加一個(gè)、數(shù)個(gè)或一段氨基酸序列，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異。例如，用性能相近或相似的氨基酸取代，一般不會(huì)改變蛋白質(zhì)的生物功能。又比如，在兩端添加一個(gè)、若干個(gè)或一段氨基酸序列也不影響酶的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括寬廣PH活性纖維素酶的活性片段和活性衍生物。在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，可以是市場(chǎng)上銷售的質(zhì)粒。在生產(chǎn)本發(fā)明的具有寬廣PH活性纖維素酶時(shí)，可以將具有寬廣pH活性纖維素酶基因的編碼區(qū)DNA序列連接于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成具有寬廣PH活性的纖維素酶表達(dá)載體。表達(dá)載體含有復(fù)制起始點(diǎn)、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和必要的加工信息位點(diǎn)。表達(dá)載體還必須含有標(biāo)記基因，比如提供卡那霉素，氨芐表霉素，氨甲蝶呤等抗生素或其他毒性物質(zhì)的抗性蛋白質(zhì)；互補(bǔ)營(yíng)養(yǎng)缺陷型蛋白質(zhì)；提供復(fù)合培養(yǎng)基中沒有的必需營(yíng)養(yǎng)成分的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中，宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核細(xì)胞如大腸桿菌、枯草桿菌、鏈霉菌、分支桿菌等。常用的真核細(xì)胞如酵母細(xì)胞、里氏木霉、黑曲霉、米曲霉等，或各種動(dòng)植物細(xì)胞。本發(fā)明的具有寬廣pH活性纖維素酶基因或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列來設(shè)計(jì)引物，用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法制備，以Phaeosphaeria sp.全基因組DNA為模板，擴(kuò)增而得到相關(guān)基因。當(dāng)獲得相關(guān)基因時(shí)，就可將其克隆至相關(guān)載體，再轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從擴(kuò)繁后的宿主細(xì)胞中得到大批量的相關(guān)基因。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述I)具有寬廣pH活性纖維素酶基因的克隆首先培養(yǎng)Phaeosphaeria sp. LH21,培養(yǎng)方法按PDA的培養(yǎng)基，按Sambrook等的方法提取基因組DNA。根據(jù)P.nodorum SN15基因組測(cè)序信息，以其基因登錄號(hào)NW_001884567的序列進(jìn)行同源搜索，找出保守的同源片段，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并性引物5’ -TACTGGGAYTGCTGYAARGG-3’ 和 5’ -GCCTTSARCTTCKCGGGGAA-3’，擴(kuò)增中間序列，通過三輪 的基因走讀，擴(kuò)增兩側(cè)未知序列，拼接全長(zhǎng)序列，通過ORFfinder軟件預(yù)測(cè)開放閱讀框，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增到了預(yù)計(jì)的目的片段，驗(yàn)證是正確的。2)具有寬廣pH活性纖維素酶的制備上述獲得的具有寬廣pH活性纖維素酶基因通過SignalP3. O軟件預(yù)測(cè)信號(hào)肽，去除信號(hào)肽，在上游引物引入Not I位點(diǎn)，下游引物引入EcoR I，插入到pPIC9K中，再電轉(zhuǎn)到畢赤酵母GS115中，篩選能夠表達(dá)具有寬廣pH活性纖維素酶的基因工程菌。具體操作如下a、挑取具有寬廣pH活性纖維素酶基因的陽(yáng)性基因工程菌的單克隆，接種至25mlBMGY 中(250ml 搖瓶)，28°C，250rpm,大約 18h。b、室溫3000g離心5min，收集細(xì)胞，去除上清，用BMMY重懸細(xì)胞至100ml，進(jìn)行誘
導(dǎo)表達(dá)。C、在IL搖瓶中加入上述培養(yǎng)物，加蓋兩層滅菌紗布或干酪包布，放入搖床繼續(xù)生長(zhǎng)。d、每24小時(shí)，加甲醇至終濃度為O. 5%以繼續(xù)誘導(dǎo)。e、以CMC為底物，在50°C、各種pH條件下通過DNS法測(cè)定纖維素酶相對(duì)活性，以發(fā)現(xiàn)最適pH值。f、在50°C、各種pH條件孵育I小時(shí)后，以CMC為底物，在50°C、pH8條件下通過DNS法測(cè)定纖維素酶殘余相對(duì)活性，以發(fā)現(xiàn)PH值耐受性。序列表〈110〉華東理工大學(xué)<120>具有寬廣pH活性纖維素酶及其制備方法<160>2<170>Patent In version 3. 3〈210〉I<211>702<212>DNA〈213〉暗球腔菌 LH21 (Phaeosphaeria sp. LH21)〈400〉I
atggtaacct tctggcagat cgtgtttctcatagcggcca cagggattgcgacagttgac 60gcgcaaacca aaaccggaaa gaccaccagatactgggact gctgcaaaggctcctgcggc 120tggtcaggga aggcgccagt gaaccagcccatccagtcct gcgacaagtccgacaaccca 180ctctccaaca tggctgctaa gaatggctgcgagaacggtg ggcaggcgtacatgtgctca 240gaccagagcc catgggctgt cgatgacaacctggcatacg gtttctctgccgtgaagctg 300gctggtcaga ctgagaatgc ttggtgctgtgcctgctacg aattgacctttacctccggc 360ccagtcagtg gcaagaagat gatcgtgcaagccaccaaca ccggcggtgatctcggacag 420aaccacttcg acattgccat gccaggtggcggtgtcggcc tcttcaatgcctgcacaaac 480·caatggggcg caccaccgca aggctggggccagcaatacg gaggtattagctcgcgctca 540gagtgtgatg gcttccccgc gaagctcaaggctggttgtc agtggagattcgactggttc 600cgtggcgcgg acaacccaga tgttagcttcaaggaggtta cttgccccaaggccttgaca 660gccaggactc gctgtatccg gaatgggaagtctccaacat ag702<210>2<211>233〈212〉氨基酸〈213〉暗球腔菌 LH21 (Phaeosphaeriasp. LH21)<400>2MVTFWQIVFL I 從 TGIATVD AQTKTGKTTR YWDCCKGSCG WSGKAPVNQP IQSCDKSDNP 60LSNMAAKNGC ENGGQAYMCS DQSPWAVDDNLAYGFSAVKL AGQTENAWCCACYELTFTSG 120PVSGKKMIVQ ATNTGGDLGQ NHFDIAMPGGGVGLFNACTN QWGAPPQGWGQQYGGISSRS 180ECDGFPAKLK AGCQWRFDWF RGADNPDVSFKEVTCPKALT ARTRCIRNGKSPT23權(quán)利要求
1.一種具有寬廣pH活性纖維素酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述具有寬廣PH活性纖維素酶基因，其特征在于所述的纖維素酶基因編碼的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求I所述的纖維素酶基因的編碼多肽，其特征在于其氨基酸序列如 SEQ ID NO. 2 所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的編碼多肽，其特征在于所述的編碼多肽在PH6-10條件下具有75%以上的纖維素酶相對(duì)活性，并且能在pH3-10保存下具有90%以上的殘余相對(duì)活性。
5.一種具有寬廣pH活性纖維素酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 1)由深海真菌Phaeosphaeriasp. LH21培養(yǎng)分離出具有寬廣pH活性纖維素酶基因，該基因具有SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列； 2)將基因克隆到表達(dá)載體PPIC9K中； 3)將構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到宿主細(xì)胞，生產(chǎn)具有寬廣pH活性纖維素酶的基因工程菌； 4)培養(yǎng)基因工程菌，獲得具有寬廣pH活性纖維素酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述具有寬廣pH活性纖維素酶的制備方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，原核細(xì)胞包括大腸桿菌、枯草桿菌、鏈霉菌、或分支桿菌；真核細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、里氏木霉、黑曲霉、米曲霉或各種動(dòng)植物細(xì)胞。
全文摘要
一種具有寬廣pH活性纖維素酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。上述纖維素酶基因的編碼多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明以Phaeosphaeria sp.LH21基因組為基礎(chǔ)，通過基因組走讀和反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增到此纖維素酶基因。此基因及其突變體能與表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)入到任何宿主細(xì)胞中產(chǎn)生纖維素酶，以CMC為底物，在pH6-10、50℃條件下具有75％以上的相對(duì)活性，并且能在pH3-10保存下具有90％上以的殘余相對(duì)活性。本發(fā)明中的寬廣pH活性纖維素酶在洗衣滌劑行業(yè)、食品行業(yè)、紡織行業(yè)、石油化工、醫(yī)藥生產(chǎn)和飼料加工等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N9/42GK102911952SQ20121039600
公開日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月17日
發(fā)明者魏東芝, 王瑋, 趙喜華 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)