一種桑樹中脫氧野尻霉素的提取純化方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種桑樹成分的提取方法，尤其涉及桑樹中脫氧野尻霉素的提取純化方法。它包括以下步驟：水提：取桑樹葉片曬干，然后加去離子水，恒溫沸騰提取，過濾收集濾液，濾渣加去離子水再提取，合并濾液，加入三氯乙酸離心，得第一上清液；上柱：將所述第一上清液用反向柱色譜進(jìn)行純化，得到含有脫氧野尻霉素的液體；醇沉取上清：在上柱后所得的含有脫氧野尻霉素的液體中先加入含醇質(zhì)量55-65%的乙醇攪拌3-8min，然后再加入含醇質(zhì)量70-80%乙醇攪拌3-5min，得第二上清液；濃縮：將所述第二上清液濃縮后得濃縮液；微波真空干燥：將所述濃縮液微波真空干燥得到含有脫氧野尻霉素的粉末產(chǎn)品。本發(fā)明提取純化提取率高、分離效果好。
【專利說明】一種桑樹中脫氧野尻霉素的提取純化方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種桑樹成分的提取方法，尤其涉及桑樹中脫氧野尻霉素的提取純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]桑葉作為藥食兩用植物含有多種有效成分，具有良好的降血糖、降血脂、減肥等作用。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)桑葉進(jìn)行了深入研究，證明桑葉中的多糖、黃酮及生物堿類均具有良好的降血糖作用。陳福君等報(bào)道了自桑葉中提取的桑葉總多糖(TPM)對(duì)四氧嗯陡糖尿病小鼠有顯著降血糖作用；桑葉中的生物堿可顯著降低血糖水平，其中DNJ降血糖作用尤其明顯。1-脫氧野夙霉素(DNJ)，化學(xué)名稱為3，4，5-三羥基-2羥甲基四氫吡啶，是桑葉中特有的天然活性成分，具有高效的藥理活性，可用于治療糖尿病、肥胖癥、病毒感染等疾病。
[0003]CN102276515B(2013-5-8)公開了一種脫氧野尻霉素的提取方法，將桑原料用酸水溶液浸泡提取1-3次；提取液上陽離了交換樹脂吸附，水洗后，用氨水洗脫；反滲透預(yù)濃縮洗脫液后，回收氨，中問體溶于親水性溶劑，催化轉(zhuǎn)化，溶液上凝膠層析柱，親水性溶劑洗脫；回收溶劑后，溶于混合溶劑，上層析柱，混合溶劑洗脫；回收混合溶劑，即得脫氧野屬霉素純品。然而該方法的提取率和分離效果仍然有待改進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供提取率高、分離效果好的桑樹中脫氧野尻霉素的提取純化方法。
[0005]本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的:
一種桑樹中脫氧野尻霉素的提取純化方法，它包括以下步驟:
(O水提:取桑樹葉片曬干，然后加去離子水，恒溫沸騰提取，過濾收集濾液，濾渣加去離子水再提取，合并濾液，加入三氯乙酸離心，得第一上清液；
(2)上柱:將所述第一上清液用反向柱色譜進(jìn)行純化，得到含有脫氧野尻霉素的液
體；
(3)醇沉取上清:在上柱后所得的含有脫氧野尻霉素的液體中先加入含醇質(zhì)量55-65%的乙醇攪拌3-8min，然后再加入含醇質(zhì)量70-80%乙醇攪拌3_5min，得第二上清液；
(4)濃縮:將所述第二上清液濃縮后得濃縮液；
(5)微波真空干燥:將所述濃縮液微波真空干燥得到含有脫氧野尻霉素的粉末產(chǎn)品。
[0006]作為優(yōu)選，所述步驟(1)水提具體是取桑樹葉片在陽光下暴曬曬干，然后加8-12倍曬干后桑樹葉片重量的去離子水，置于罐組式逆流提取設(shè)備中進(jìn)行包括至少第一循環(huán)、第二循環(huán)和第三循環(huán)的三次循環(huán)提取，所述灌組為每組三個(gè)提取罐串聯(lián)合用，逆流提取流速為25-35min/罐，提取溫度為80_110°C ；
所述第一循環(huán)是從第一提取罐開始逆流提取:具體是將曬干后桑樹葉片和8-12倍曬干后桑樹葉片重量的去離子水分別按等份加入第一提取罐、第二提取罐和第三提取罐中；第一提取罐第一次提取的藥液過濾后放入儲(chǔ)液罐備用，第一提取罐的第二次提取和第一提取罐的第三次提取分別加入4-5倍蒸餾水；然后將第一提取罐的第二提取液作為第二提取罐的第一次提取的溶劑，第二提取罐的第一提取液過濾備用；將第一提取罐的第三提取液作為第二提取罐的第二次提取的溶劑，第二提取罐的第二次提取中加入4-5倍蒸餾水；第二提取罐的第二提取液作為第三提取罐的第一次提取的溶劑；
所述第二循環(huán)是從第二提取罐開始逆流提取:具體是合并第一循環(huán)中的第一提取罐、第二提取罐和第三提取罐中的第一提取液至包含有第一循環(huán)第二次提取后的桑樹葉渣的第二提取罐中，然后加入4-5倍蒸餾水進(jìn)行第一次提??；將第二提取罐的第一提取液作為包含有第一循環(huán)第一次提取后的桑樹葉渣的第三提取罐中，然后加入4-5倍蒸餾水進(jìn)行第一次提??；然后將第三提取罐的第一提取液作為包含有第一循環(huán)第三次提取后的桑樹葉渣的第一提取罐中進(jìn)行第一次提??；
所述第三循環(huán)是從第三提取罐開始逆流提取:具體是合并第二循環(huán)中的第一提取罐、第二提取罐和第三提取罐中的第一提取液至包含有第二循環(huán)第一次提取后的桑樹葉渣的第三提取罐中，然后加入4-5倍水進(jìn)行第一次提??；將第三提取罐的第一提取液作為包含有第二循環(huán)第一次提取后的桑樹葉渣的第一提取罐中，然后加入4-5倍蒸餾水進(jìn)行第一次提?。蝗缓髮⒌谝惶崛」薜牡谝惶崛∫鹤鳛榘械诙h(huán)第一次提取后的桑樹渣的第二提取罐中進(jìn)行第一次提??；
合并第三循環(huán)中的第一提取罐、第二提取罐和第三提取罐中的第一提取液并過濾收集濾液，加入三氯乙 酸離心，得第一上清液。
[0007]更優(yōu)選地，所述三次循環(huán)提取中，每8小時(shí)斷開第一個(gè)提取罐卸料，重新投料后進(jìn)行依次串聯(lián)。
[0008]作為優(yōu)選，所述步驟(2)具體是將所述第一上清液過C18柱或MCI gel CHP 20P柱色譜，然后用不同濃度的流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，收集含脫氧野尻霉素的洗脫液。
[0009]更優(yōu)選地，當(dāng)選用的固定相為C18柱時(shí)，流動(dòng)相A為pH值3.5-4.5的磷酸鹽緩沖液，流動(dòng)相B為乙腈，在柱溫28-32°C、pH值5-6的條件下按0.4-0.5ml/min的流速梯度洗脫55-65min ;所述梯度洗脫條件為:在0_35min，所述流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為(90-95) / (5-10);在36-45min，所述流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為(80-85) / (15-20)；在46-55min，所述流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為(68-72) / (28-32);在56_65min，所述流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為(90-95) / (5-10)。
[0010]更優(yōu)選地，當(dāng)選用的固定相為MCI gel CHP 20P柱色譜時(shí)，選用甲醇-水為流動(dòng)相。
[0011]作為優(yōu)選，所述步驟(3)采用慢加快攪的方式加入乙醇:按照3-7ml/S滴加含醇質(zhì)量55-65%的乙醇，然后在200-300r/min下快速攪拌3_8min。
[0012]慢加快攪的方式可以使雜質(zhì)快速沉淀，有效成分又不至于被乙醇包裹，提高上清液中的有效成分含量。
[0013]作為優(yōu)選，所述提取純化方法還包括在步驟(3)醇沉取上清前，將上柱后所得的含有脫氧野尻霉素的液體抽真空至-0.09MPa以下并保持15-25min，然后加去離子水800kg，冷卻靜置8-15小時(shí)得前處理液。
[0014]通過抽真空調(diào)節(jié)真空度，使后續(xù)的濃縮和純化更易進(jìn)行。[0015]作為優(yōu)選，所述步驟(4)濃縮具體是所述第二上清液減壓真空濃縮至原來體積的10-40%,得濃縮液。
[0016]更優(yōu)選地，所述步驟(4)濃縮具體是將所述第二上清液在真空度為-0.075~-0.06MPa下減壓真空濃縮至所述第二上清液體積的20_30%，得濃縮液。
[0017]作為優(yōu)選，所述提取純化方法還包括在步驟(4)濃縮前向所述第二上清液液中加入占第二上清液1.5-3倍質(zhì)量的石油醚和甲醇的混合液，混合浸泡0.5-0.8h，在40-50°C、50-70KHz下超聲提取2-4min。
[0018]采用該工藝可以使桑樹葉中的脫氧野尻霉素獲得更有效的提取，從而進(jìn)一步提高提取效率；并且有利于后續(xù)濃縮。
[0019]作為優(yōu)選，所述微波真空干燥具體是抽真空至真空度為-0.04~-0.01MPa，然后在微波頻率為100-260MHZ微波處理80-90s得到含有脫氧野尻霉素的粉末產(chǎn)品。
[0020]微波真空干燥可以使最終產(chǎn)品中純度提高，這可能是由于該條件下能使提取物中的一些雜質(zhì)揮發(fā)或分解。
【具體實(shí)施方式】
[0021]實(shí)施例一
水提:取IOOkg桑樹葉片在陽光下暴曬曬干，然后加800kg去離子水，置于罐組式逆流提取設(shè)備中進(jìn)行包括第一循環(huán)、第二循環(huán)和第三循環(huán)的三次循環(huán)提取，灌組為每組三個(gè)提取罐串聯(lián)合用，逆流提取流速為25min/罐，提取溫度為80°C ；
第一循環(huán)是從第一提取罐開始逆流提取:具體是將曬干后桑樹葉片和800kg去離子水分別按等份加入第一提取罐、第二提取罐和第三提取罐中；第一提取罐第一次提取的藥液過濾后放入儲(chǔ)液罐備用，第一提取罐的第二次提取和第一提取罐的第三次提取分別加入400kg蒸餾水；然后將第一提取罐的第二提取液作為第二提取罐的第一次提取的溶劑，第二提取罐的第一提取液過濾備用；將第一提取罐的第三提取液作為第二提取罐的第二次提取的溶劑，第二提取罐的第二次提取中加入400kg蒸餾水；第二提取罐的第二提取液作為第三提取罐的第一次提取的溶劑；
第二循環(huán)是從第二提取罐開始逆流提取:具體是合并第一循環(huán)中的第一提取罐、第二提取罐和第三提取罐中的第一提取液至包含有第一循環(huán)第二次提取后的桑樹葉渣的第二提取罐中，然后加入4-5倍蒸餾水進(jìn)行第一次提取；將第二提取罐的第一提取液作為包含有第一循環(huán)第一次提取后的桑樹葉渣的第三提取罐中，然后加入400kg蒸餾水進(jìn)行第一次提?。蝗缓髮⒌谌崛」薜牡谝惶崛∫鹤鳛榘械谝谎h(huán)第三次提取后的桑樹葉渣的第一提取罐中進(jìn)行第一次提??；
第三循環(huán)是從第三提取罐開始逆流提取:具體是合并第二循環(huán)中的第一提取罐、第二提取罐和第三提取罐中的第一提取液至包含有第二循環(huán)第一次提取后的桑樹葉渣的第三提取罐中，然后加入400kg水進(jìn)行第一次提取；將第三提取罐的第一提取液作為包含有第二循環(huán)第一次提取后的桑樹葉渣的第一提取罐中，然后加入4-5倍蒸餾水進(jìn)行第一次提??；然后將第一提取罐的第一提取液作為包含有第二循環(huán)第一次提取后的桑樹渣的第二提取罐中進(jìn)行第一次提取；
合并第三循環(huán)中的第一提取罐、第二提取罐和第三提取罐中的第一提取液并過濾收集濾液，加入三氯乙酸離心，得第一上清液取桑樹葉片曬干，然后加去離子水，恒溫沸騰提取，過濾收集濾液，濾渣加去離子水再提取，合并濾液，加入三氯乙酸離心，得第一上清液；
上柱:將第一上清液過C18柱，然后用不同濃度的流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，收集含脫氧野尻霉素的洗脫液；其中的流動(dòng)相A為pH值3.5的磷酸鹽緩沖液，流動(dòng)相B為乙腈，在柱溫28?、ρΗ值5的條件下按0.4ml/min的流速梯度洗脫55min ;梯度洗脫條件為:在0_35min,流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為90/10 ;在36-45min，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為80/15 ;在46-55min，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為68/32。
[0022]醇沉取上清:在上柱后所得的含有脫氧野尻霉素的液體中先加入含醇質(zhì)量5%的乙醇攪拌3min，然后再加入含醇質(zhì)量70%乙醇攪拌3min，得第二上清液；
濃縮:將第二上清液減壓真空濃縮至原來體積的10%，得濃縮液；
微波真空干燥:將濃縮液抽真空至真空度為-0.04MPa，然后在微波頻率為IOOMHz微波處理80s得到含有脫氧野尻霉素的粉末產(chǎn)品，檢測結(jié)果見表1。
[0023]實(shí)施例二
水提:取IOOkg桑樹葉片在陽光下暴曬曬干，然后加1200kg曬干后桑樹葉片重量的去離子水，置于罐組式逆流提取設(shè)備中進(jìn)行包括至少第一循環(huán)、第二循環(huán)和第三循環(huán)的三次循環(huán)提取，灌組 為每組三個(gè)提取罐串聯(lián)合用，逆流提取流速為35min/罐，提取溫度為IlO0C ；
第一循環(huán)是從第一提取罐開始逆流提取:具體是將曬干后桑樹葉片和1200kg去離子水分別按等份加入第一提取罐、第二提取罐和第三提取罐中；第一提取罐第一次提取的藥液過濾后放入儲(chǔ)液罐備用，第一提取罐的第二次提取和第一提取罐的第三次提取分別加入500kg蒸餾水；然后將第一提取罐的第二提取液作為第二提取罐的第一次提取的溶劑，第二提取罐的第一提取液過濾備用；將第一提取罐的第三提取液作為第二提取罐的第二次提取的溶劑，第二提取罐的第二次提取中加入500kg蒸餾水；第二提取罐的第二提取液作為第三提取罐的第一次提取的溶劑；
第二循環(huán)是從第二提取罐開始逆流提取:具體是合并第一循環(huán)中的第一提取罐、第二提取罐和第三提取罐中的第一提取液至包含有第一循環(huán)第二次提取后的桑樹葉渣的第二提取罐中，然后加入4-5倍蒸餾水進(jìn)行第一次提??；將第二提取罐的第一提取液作為包含有第一循環(huán)第一次提取后的桑樹葉渣的第三提取罐中，然后加入500kg蒸餾水進(jìn)行第一次提??；然后將第三提取罐的第一提取液作為包含有第一循環(huán)第三次提取后的桑樹葉渣的第一提取罐中進(jìn)行第一次提?。?br> 第三循環(huán)是從第三提取罐開始逆流提取:具體是合并第二循環(huán)中的第一提取罐、第二提取罐和第三提取罐中的第一提取液至包含有第二循環(huán)第一次提取后的桑樹葉渣的第三提取罐中，然后加入500kg水進(jìn)行第一次提?。粚⒌谌崛」薜牡谝惶崛∫鹤鳛榘械诙h(huán)第一次提取后的桑樹葉渣的第一提取罐中，然后加入500kg蒸餾水進(jìn)行第一次提取；然后將第一提取罐的第一提取液作為包含有第二循環(huán)第一次提取后的桑樹渣的第二提取罐中進(jìn)行第一次提?。?br> 合并第三循環(huán)中的第一提取罐、第二提取罐和第三提取罐中的第一提取液并過濾收集濾液，加入三氯乙酸離心，得第一上清液取桑樹葉片曬干，然后加去離子水，恒溫沸騰提取，過濾收集濾液，濾渣加去離子水再提取，合并濾液，加入三氯乙酸離心，得第一上清液；上柱:將第一上清液過C18柱，然后用不同濃度的流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，收集含脫氧野尻霉素的洗脫液；其中的流動(dòng)相A為pH值4.5的磷酸鹽緩沖液，流動(dòng)相B為乙腈，在柱溫28-32°C、pH值5-6的條件下按0.5ml/min的流速梯度洗脫65min ;梯度洗脫條件為:在35min,流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為95/5 ;在45min，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為85/15 ;在46-55min，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為72/28 ;在56_65min，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為95/5。
[0024]醇沉取上清:在上柱后所得的含有脫氧野尻霉素的液體中先加入含醇質(zhì)量65%的乙醇攪拌8min，然后再加入含醇質(zhì)量80%乙醇攪拌5min，得第二上清液；
濃縮:將第二上清液減壓真空濃縮至原來體積的40%，得濃縮液；
微波真空干燥:將濃縮液抽真空至真空度為-0.01MPa，然后在微波頻率為260MHz微波處理90s得到含有脫氧野尻霉素的粉末產(chǎn)品。
[0025]實(shí)施例三
水提:取IOOkg桑樹葉片在陽光下暴曬曬干，然后加1000kg曬干后桑樹葉片重量的去離子水，置于罐組式逆流提取設(shè)備中進(jìn)行包括至少第一循環(huán)、第二循環(huán)和第三循環(huán)的三次循環(huán)提取，灌組為每組三個(gè)提取罐串聯(lián)合用，逆流提取流速為30min/罐，提取溫度為IOO0C ；
第一循環(huán)是從第一提取罐開始逆流提取:具體是將曬干后桑樹葉片和1000kg去離子水分別按等份加入第一提取罐、第二提取罐和第三提取罐中；第一提取罐第一次提取的藥液過濾后放入儲(chǔ)液罐備用，第一提取罐的第二次提取和第一提取罐的第三次提取分別加入4-5倍蒸餾水；然后將第一提取罐的第二提取液作為第二提取罐的第一次提取的溶劑，第二提取罐的第一提取液過濾備用；將第一提取罐的第三提取液作為第二提取罐的第二次提取的溶劑，第二提取罐的第二次提取中加入450kg蒸餾水；第二提取罐的第二提取液作為第三提取罐的第一次提取的溶劑；
第二循環(huán)是從第二提取罐開始逆流提取:具體是合并第一循環(huán)中的第一提取罐、第二提取罐和第三提取罐中的第一提取液至包含有第一循環(huán)第二次提取后的桑樹葉渣的第二提取罐中，然后加入450kg蒸餾水進(jìn)行第一次提取；將第二提取罐的第一提取液作為包含有第一循環(huán)第一次提取后的桑樹葉渣的第三提取罐中，然后加入450kg蒸餾水進(jìn)行第一次提?。蝗缓髮⒌谌崛」薜牡谝惶崛∫鹤鳛榘械谝谎h(huán)第三次提取后的桑樹葉渣的第一提取罐中進(jìn)行第一次提??；
第三循環(huán)是從第三提取罐開始逆流提取:具體是合并第二循環(huán)中的第一提取罐、第二提取罐和第三提取罐中的第一提取液至包含有第二循環(huán)第一次提取后的桑樹葉渣的第三提取罐中，然后加入450kg水進(jìn)行第一次提??；將第三提取罐的第一提取液作為包含有第二循環(huán)第一次提取后的桑樹葉渣的第一提取罐中，然后加入450kg蒸餾水進(jìn)行第一次提取；然后將第一提取罐的第一提取液作為包含有第二循環(huán)第一次提取后的桑樹渣的第二提取罐中進(jìn)行第一次提??；
合并第三循環(huán)中的第一提取罐、第二提取罐和第三提取罐中的第一提取液并過濾收集濾液，加入三氯乙酸離心，得第一上清液取桑樹葉片曬干，然后加去離子水，恒溫沸騰提取，過濾收集濾液，濾渣加去離子水再提取，合并濾液，加入三氯乙酸離心，得第一上清液；
上 柱:將第一上清液過C18柱，然后用不同濃度的流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，收集含脫氧野尻霉素的洗脫液；其中的流動(dòng)相A為pH值4的磷酸鹽緩沖液，流動(dòng)相B為乙腈，在柱溫30°C、pH值5.5的條件下按0.45ml/min的流速梯度洗脫60min ;梯度洗脫條件為:在0-35min,流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為93/7 ;在36_45min，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為83/17 ;在46-55min，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為70/30 ;在56_60min，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為93/7。
[0026]醇沉取上清:在上柱后所得的含有脫氧野尻霉素的液體中先加入含醇質(zhì)量60%的乙醇攪拌5min，然后再加入含醇質(zhì)量78%乙醇攪拌4min，得第二上清液；
濃縮:將第二上清液減壓真空濃縮至原來體積的30%，得濃縮液；
微波真空干燥:將濃縮液抽真空至真空度為-0.03MPa，然后在微波頻率為160MHz微波處理88s得到含有脫氧野尻霉素的粉末產(chǎn)品。
[0027]實(shí)施例四
同實(shí)施例一，不同的是在水提的三次循環(huán)提取中，每8小時(shí)斷開第一個(gè)提取罐卸料，重新投料后進(jìn)行依次串聯(lián)。
[0028]上柱選用的固定相為MCI gel CHP 20P柱色譜時(shí)，選用甲醇-水為流動(dòng)相。采用慢加快攪的方式加入乙醇，按照5ml/s滴加含醇質(zhì)量60%的乙醇，然后在250r/min下快速攬拌5min。。
[0029]上柱后所得的含有脫氧野尻霉素的液體抽真空至-0.09MPa以下并保持20min，然后加去離子水800kg，冷卻靜置10小時(shí)得含有脫氧野尻霉素的前處理液。然后再醇沉取上清和濃縮。
[0030]濃縮具體是將第二上清液在真空度為-0.07MPa下減壓真空濃縮至第二上清液體積的25%，得濃縮液。
[0031]實(shí)施例五
同實(shí)施例二，不同的是在水提的三次循環(huán)提取中，每8小時(shí)斷開第一個(gè)提取罐卸料，重新投料后進(jìn)行依次串聯(lián)。
[0032]上柱選用的固定相為MCI gel CHP 20P柱色譜時(shí)，選用甲醇-水為流動(dòng)相。采用慢加快攪的方式加入乙醇，按照3ml/s滴加含醇質(zhì)量55%的乙醇，然后在200r/min下快速攪拌3min。。
[0033]上柱后所得的含有脫氧野尻霉素的液體抽真空至-0.09MPa以下并保持15min，然后加去離子水800kg，冷卻靜置8小時(shí)得含有脫氧野尻霉素的前處理液。然后再醇沉取上清和濃縮。
[0034]濃縮具體是將第二上清液在真空度為-0.075MPa下減壓真空濃縮至第二上清液體積的20%，得濃縮液。
[0035]實(shí)施例六
同實(shí)施例三，不同的是在水提的三次循環(huán)提取中，每8小時(shí)斷開第一個(gè)提取罐卸料，重新投料后進(jìn)行依次串聯(lián)。
[0036]上柱選用的固定相為MCI gel CHP 20P柱色譜時(shí)，選用甲醇-水為流動(dòng)相。采用慢加快攪的方式加入乙醇，按照7ml/s滴加含醇質(zhì)量65%的乙醇，然后在300r/min下快速攪拌8min。。
[0037]上柱后所得的含有脫氧野尻霉素的液體抽真空至-0.09MPa以下并保持25min，然后加去離子水800kg，冷卻靜置15小時(shí)得含有脫氧野尻霉素的前處理液。然后再醇沉取上清和濃縮。
[0038]濃縮具體是將第二上清液在真空度為-0.06MPa下減壓真空濃縮至第二上清液體積的30%，得濃縮液。
[0039]實(shí)施例七
醇沉取上清后向第二上清液液中加入占第二上清液1.5倍質(zhì)量的石油醚和甲醇的混合液，混合浸泡0.5h，在40°C、50KHz下超聲提取2min ;然后再進(jìn)行濃縮。
[0040]實(shí)施例八
醇沉取上清后向第二上清液液中加入占第二上清液3倍質(zhì)量的石油醚和甲醇的混合液，混合浸泡0.8h，在50°C、70KHz下超聲提取4min ;然后再進(jìn)行濃縮。
[0041]實(shí)施例九
醇沉取上清后向第二上清液液中加入占第二上清液2倍質(zhì)量的石油醚和甲醇的混合液，混合浸泡0.7h，在45°C、60KHz下超聲提取3min ;然后再進(jìn)行濃縮。
[0042]對(duì)比實(shí)施例一
同實(shí)施例一，不同的是取桑樹葉片烘干，然后加水，恒溫沸騰提取，過濾收集濾液，濾渣加去離子水再提取，合并濾液，加入甲醇離心，得第一上清液；然后將第一上清液用離子交換樹脂純化，得到含有脫氧野尻霉素的液體；在上柱后所得的含有脫氧野尻霉素的液體加入含醇質(zhì)量70%的乙醇攪拌9min得第二上清液；將第二上清液濃縮后得濃縮液；將濃縮液烘干得到含有脫氧野尻霉素的粉末產(chǎn)品。
[0043]表1實(shí)施例和對(duì)比實(shí)施例脫氧野尻霉素產(chǎn)品比較
【權(quán)利要求】
1.一種桑樹中脫氧野尻霉素的提取純化方法，其特征在于:它包括以下步驟: (1)水提:取桑樹葉片曬干，然后加去離子水，恒溫沸騰提取，過濾收集濾液，濾渣加去離子水再提取，合并濾液，加入三氯乙酸離心，得第一上清液； (2)上柱:將所述第一上清液用反向柱色譜進(jìn)行純化，得到含有脫氧野尻霉素的液體； (3)醇沉取上清:在上柱后所得的含有脫氧野尻霉素的液體中先加入含醇質(zhì)量55-65%的乙醇攪拌3-8min，然后再加入含醇質(zhì)量70-80%乙醇攪拌3_5min，得第二上清液； (4)濃縮:將所述第二上清液濃縮后得濃縮液； (5)微波真空干燥:將所述濃縮液微波真空干燥得到含有脫氧野尻霉素的粉末產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種桑樹中脫氧野尻霉素的提取純化方法，其特征在于:所述步驟(1)水提具體是取桑樹葉片在陽光下暴曬曬干，然后加8-12倍曬干后桑樹葉片重量的去離子水，置于罐組式逆流提取設(shè)備中進(jìn)行包括至少第一循環(huán)、第二循環(huán)和第三循環(huán)的三次循環(huán)提取，所述灌組為每組三個(gè)提取罐串聯(lián)合用，逆流提取流速為25-35min/罐，提取溫度為80-1IO0C ； 所述第一循環(huán)是從第一提取罐開始逆流提取:具體是將曬干后桑樹葉片和8-12倍曬干后桑樹葉片重量的去離子水分別按等份加入第一提取罐、第二提取罐和第三提取罐中；第一提取罐第一次提取的藥液過濾后放入儲(chǔ)液罐備用，第一提取罐的第二次提取和第一提取罐的第三次提取分別加入4-5倍蒸餾水；然后將第一提取罐的第二提取液作為第二提取罐的第一次提取的溶劑，第二提取罐的第一提取液過濾備用；將第一提取罐的第三提取液作為第二提取罐的第二次提取的溶劑，第二提取罐的第二次提取中加入4-5倍蒸餾水；第二提取罐的第二提取液作為第三提取罐的第一次提取的溶劑； 所述第二循環(huán)是從第二提取罐開始逆流提取:具體是合并第一循環(huán)中的第一提取罐、第二提取罐和第三提取罐中的第一提取液至包含有第一循環(huán)第二次提取后的桑樹葉渣的第二提取罐中，然后加入4-5倍蒸餾水進(jìn)行第一次提??；將第二提取罐的第一提取液作為包含有第一循環(huán)第一次提取后的桑樹葉渣的第三提取罐中，然后加入4-5倍蒸餾水進(jìn)行第一次提??；然后將第三提取罐的第一提取液作為包含有第一循環(huán)第三次提取后的桑樹葉渣的第一提取罐中進(jìn)行第一次提?。? 所述第三循環(huán)是從第三提取罐開始逆流提取:具體是合并第二循環(huán)中的第一提取罐、第二提取罐和第三提取罐中的第一提取液至包含有第二循環(huán)第一次提取后的桑樹葉渣的第三提取罐中，然后加入4-5倍水進(jìn)行第一次提??；將第三提取罐的第一提取液作為包含有第二循環(huán)第一次提取后的桑樹葉渣的第一提取罐中，然后加入4-5倍蒸餾水進(jìn)行第一次提取；然后將第一提取罐的第一提取液作為包含有第二循環(huán)第一次提取后的桑樹渣的第二提取罐中進(jìn)行第一次提??； 合并第三循環(huán)中的第一提取罐、第二提取罐和第三提取罐中的第一提取液并過濾收集濾液，加入三氯乙酸離心，得第一上清液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種桑樹中脫氧野尻霉素的提取純化方法，其特征在于:所述三次循環(huán)提取中，每8小時(shí)斷開第一個(gè)提取罐卸料，重新投料后進(jìn)行依次串聯(lián)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種桑樹中脫氧野尻霉素的提取純化方法，其特征在于:所述步驟(2)具體是將所述第一上清液過C18柱或MCI gel CHP 20P柱色譜，然后用不同濃度的流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，收集含脫氧野尻霉素的洗脫液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種桑樹中脫氧野尻霉素的提取純化方法，其特征在于:當(dāng)選用的固定相為C18柱時(shí)，流動(dòng)相A為pH值3.5-4.5的磷酸鹽緩沖液，流動(dòng)相B為乙腈，在柱溫28-32°C、pH值5-6的條件下按0.4-0.5ml/min的流速梯度洗脫55_65min ;所述梯度洗脫條件為:在0-35min，所述流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為(90-95)/(5-10);在36_45min，所述流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為(80-85) / (15-20);在46_55min，所述流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為(68-72) / (28-32);在56_65min，所述流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為(90-95) / (5-10)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的一種桑樹中脫氧野尻霉素的提取純化方法，其特征在于:所述步驟(3)采用慢加快攪的方式加入乙醇:按照3-7ml/s滴加含醇質(zhì)量55-65%的乙醇，然后在200_300r/min下快速攪拌3_8min。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種桑樹中脫氧野尻霉素的提取純化方法，其特征在于:所述提取純化方法還包括在步驟(3)醇沉取上清前，將上柱后所得的含有脫氧野尻霉素的液體抽真空至-0.09MPa以下并保持15-25min，然后加去離子水800kg，冷卻靜置8_15小時(shí)得前處理液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種桑樹中脫氧野尻霉素的提取純化方法，其特征在于:所述步驟(4)濃縮具體是所述第二上清液減壓真空濃縮至原來體積的10-40%，得濃縮液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種桑樹中脫氧野尻霉素的提取純化方法，其特征在于:所述提取純化方法還包括在步驟(4)濃縮前向所述第二上清液液中加入占第二上清液1.5-3倍質(zhì)量的石油醚和甲醇的混合液，混合浸泡0.5-0.8h，在40-50°C、50-70KHz下超聲提取2-4min。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種桑樹中脫氧野尻霉素的提取純化方法，其特征在于:所述微波真空干燥具體是抽真空至真空度為-0.04~-0.01MPa,然后在微波頻率為100-260MHZ微波處理80-90s得到含有脫氧野尻霉素的粉末產(chǎn)品。
【文檔編號(hào)】C07D211/46GK103936664SQ201410164787
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月23日
【發(fā)明者】柳秦橋, 陸巍杰 申請人:湖州柳蔭生物科技有限公司