專利名稱：一種木糖醇基因工程菌及其混合轉(zhuǎn)化生產(chǎn)木糖醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種木糖醇基因工程菌的構(gòu)建及其用于混合轉(zhuǎn)化D-阿拉伯糖醇生產(chǎn)木糖醇的方法。
背景技術(shù)：
木糖醇是一種五碳糖，其化學(xué)名稱為1，2，3，4，5—戊醇，分子式為C5H12O5,是一種白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，它的溶解度、溶液密度和折光系數(shù)等理化性質(zhì)與蔗糖基本相同，可以作為蔗糖的替代品。木糖醇是一種具有較高營養(yǎng)價(jià)值的天然甜味物質(zhì)，同時(shí)也是一種低能量甜味劑。木糖醇是人體糖類代謝的中間體，食用后不消耗胰島素，并且木糖醇具有特殊的防齲功能，可作糖尿病人的營養(yǎng)劑、治療劑及兒童防齲食品，同時(shí)木糖醇還具有降低血糖 濃度、促進(jìn)鈣吸收等多種功能。目前，木糖醇工業(yè)生產(chǎn)主要采用化學(xué)酸化催化加氫法和利用微生物直接發(fā)酵半纖維素水解液生產(chǎn)木糖醇，這兩種方法的原料多來源于富含多縮戊糖的玉米芯、甘蔗渣等農(nóng)副產(chǎn)品，這些原料首先經(jīng)過高溫水解后成為含大量木糖的水解液，因此存在酸堿消耗高、環(huán)境污染嚴(yán)重、工藝復(fù)雜等問題。全生物法制備木糖醇的研究已經(jīng)引起了全球的關(guān)注，但是在自然界中還沒有發(fā)現(xiàn)直接發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)木糖醇的微生物。1969年，Onishi和Suzuki首先報(bào)道了通過三步發(fā)酵將葡萄糖轉(zhuǎn)化為木糖醇，首先利用Ostnophilic將葡萄糖轉(zhuǎn)化為D-阿拉伯糖醇,再利用Acetic acid bacteria將生成的D-阿拉伯糖醇氧化成D-木酮糖，之后D-木酮糖被一種酵母還原為木糖醇，但是其轉(zhuǎn)化率非常低，后續(xù)發(fā)酵過程復(fù)雜。我們利用氧化葡糖桿菌{Gluconobacter oxydans)將D-阿拉伯糖醇氧化還原為木糖醇，氧化葡糖桿菌購自中國微生物菌種保藏中心，編號(hào)=CGMCCl. 110，該菌同時(shí)具有D-阿拉伯糖醇脫氫酶(AraDH)和木糖醇脫氫酶(XDH)活力，能夠?qū)-阿拉伯糖醇大部分氧化為木酮糖，而XDH的活力相對(duì)較低，木糖醇的生成量就遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于D-木酮糖的量，如果以木糖醇為目的產(chǎn)物，如何提高XDH的活力成為研究的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株具有高木糖醇脫氫酶活力的基因工程菌大腸桿菌BL_xdh06 Escherichia coli BL_xdh06,已于2012年6月7日保藏于中國武漢的武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號(hào)為CCTCC NO. M 2012207。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種具有高轉(zhuǎn)化率的混合靜止轉(zhuǎn)化D-阿拉伯糖醇生產(chǎn)木糖醇的方法。利用氧化葡糖桿菌混合靜止轉(zhuǎn)化D-阿拉伯糖醇生產(chǎn)木糖醇的方法，按照下述步驟進(jìn)行
(I)挑取氧化葡糖桿菌ifluconobacter斜面菌落于種子液培養(yǎng)基,28_37°C、
100-260 rpm 振蕩培養(yǎng) 8-20h。(2)將種子液以體積比1-10 %的接種量接種到擴(kuò)大培養(yǎng)基，28-37°C、100-260 rpm振蕩培養(yǎng)48-96h。
(3)將(2)中的發(fā)酵液 6000-12000 rpm，4°C離心 5-20 min，收集菌泥，用 O. I mol/L pH 6. 8的磷酸鉀緩沖液洗滌，離心后用適量的細(xì)胞轉(zhuǎn)化液重懸菌體；
(4)轉(zhuǎn)化液轉(zhuǎn)化溫度為28-37 V，100-260rpm振蕩轉(zhuǎn)化24_60h，4h取樣，4h取樣，轉(zhuǎn)化液中得到木糖醇。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種具有高轉(zhuǎn)化率的混合靜止轉(zhuǎn)化D-阿拉伯糖醇生產(chǎn)木糖醇的方法。利用構(gòu)建的基因工程菌和氧化葡糖桿菌混合靜止轉(zhuǎn)化D-阿拉伯糖醇生產(chǎn)木糖醇，D-阿拉伯糖醇的轉(zhuǎn)化率由29 %提高到91. 6 %。利用上述構(gòu)建的基因工程菌和氧化葡糖桿菌混合靜止轉(zhuǎn)化D-阿拉伯糖醇生產(chǎn)木糖醇的方法，按照下述步驟進(jìn)行
(I)挑取氧化葡糖桿菌ifluconobacter斜面菌落于種子液培養(yǎng)基,28_37°C、
100-260 rpm 振蕩培養(yǎng) 8-20h。 (2)將種子液以體積比1-10 %的接種量接種到擴(kuò)大培養(yǎng)基，28-37°C、100-260 rpm振蕩培養(yǎng)48-96h。(3)將(2)中的發(fā)酵液 6000-12000 rpm，4°C離心 5-20 min，收集菌泥，用 O. I mol/L pH 6. 8的磷酸鉀緩沖液洗滌，離心后用適量的細(xì)胞轉(zhuǎn)化液重懸菌體；
(4)將上述基因工程菌疋coli WJl\-xdh06接種于LB-Amp (LB-氨芐青霉素)培養(yǎng)基中，37 1振蕩培養(yǎng)過夜，次日以1-10 %的接種量將種子液轉(zhuǎn)接至新鮮LB-Amp培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至菌體光密度值約為O. 6-0. 8時(shí)，加入IPTG (異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷)至終濃度O. 5-1. 2mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)5_15h左右。取一定體積工程菌液6000-12000 rpm,4°C離心5-20 min，收集菌泥，用O. I mol/L pH 6. 8的磷酸鉀緩沖液洗滌，菌體待用。(5)將(3)和(4)離心得到得菌體用適量的細(xì)胞轉(zhuǎn)化液重懸菌體。(6)轉(zhuǎn)化液轉(zhuǎn)化溫度為28-37 °C，100_260rpm振蕩轉(zhuǎn)化24_60h，4h取樣，轉(zhuǎn)化液中得到木糖醇。其中步驟(I)所述的種子液培養(yǎng)基組成如下葡萄糖20-40. O g/L，胰蛋白胨1-10.0 8/1，酵母膏2-20.0 g/L;氧化葡糖桿菌斜面培養(yǎng)基葡萄糖20-40. O g/L，胰蛋白胨1-10.0 8/1，酵母膏2-20.0 g/L，瓊脂 10-20 g/L，其余為水。其中步驟(2)所述的擴(kuò)大培養(yǎng)基組成如下葡萄糖20-40.0 g/L，酵母膏2-20.0g/L，胰蛋白胨1-10.0 g/L，D-阿拉伯糖醇5-20.0 g/L，碳酸鈣10-20.0 g/L，其余為水。其中步驟(3)所述的細(xì)胞轉(zhuǎn)化液組成如下D_阿拉伯糖醇20-40. O g/L，碳酸鈣10-30. O g/L，乙醇 3-8% (V/V)，其余為水。其中步驟(4)所述的LB-Amp培養(yǎng)基組成如下胰化蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L, Amp (氨芐青霉素)50 μ g/L (終濃度)，其余為水。其中步驟(5)所述的細(xì)胞轉(zhuǎn)化液包組成如下D_阿拉伯糖醇20-40. O g/L，碳酸鈣10-30. O g/L，乙醇 3-8% (V/V)，其余為水。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的氧化葡糖桿菌{Gluconobacter oxydans)購自中國微生物菌種保藏中心編號(hào)CGMCC1. 110。本發(fā)明所述木糖醇脫氫酶基因?yàn)镃hristina Prus報(bào)道的序列GVatereBiotechnology 23(2)，195 - 200，2005，NC_006677. I)。通過常規(guī)的基因工程技術(shù)將木糖醇脫氫酶基因?qū)氪竽c桿菌得到含有所述木糖醇脫氫酶基因Ui*)的大腸桿菌。本發(fā)明的基因工程菌具有較高的木糖醇脫氫酶酶活力，酶活力達(dá)21U/mg，其酶活性提高了 10倍。包括以下步驟
I、培養(yǎng)氧化葡糖桿菌，提取菌株的總DNA，通過PCR擴(kuò)增出目的片段。2、目的片段和表達(dá)載體通過酶切用T4連接酶連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主菌萬.BL21 ο3、提取大腸桿菌質(zhì)粒，通過PCR、雙酶切和SDS-PAGE進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證，證明重組菌構(gòu)建成功。4、測(cè)定基因工程菌的木糖醇脫氫酶酶活力。具體過程見實(shí)施例I。實(shí)施例I、具有木糖醇脫氧聞酶活力的基因工程菌的獲得
根據(jù)NCBI上發(fā)表氧化葡糖桿菌的木糖醇脫氫酶基因序列和表達(dá)載體PSE380上多克隆位點(diǎn)的特征，利用生物信息學(xué)軟件設(shè)計(jì)合成簡并引物P1: 5 ; TACCATGGTTCACCACCATCACCATCATATGTCGAAGAAGTTTAAG3 ;(含 Afco I 酶切位點(diǎn))；P2: 5 ; TGAAGCTTTCAACCGCCAGCAAT3丨(/含Hind III酶切位點(diǎn))。以氧化葡糖桿菌基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增目的基因。PCR反應(yīng)參數(shù)預(yù)變性95 V 2min;變性94 V 30sec;復(fù)性55 V30sec ;延伸72 V lmin ;循環(huán)35個(gè)；終止延伸72 V IOmin ;最后16°C保溫
PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖電泳檢測(cè)，UNIQ-10試劑盒純化回收片段大小約為O. 7-0. 9kb的PCR產(chǎn)物用于克隆表達(dá)。將PCR產(chǎn)物及載體PSE380分別用Afco I和Hind III雙酶切，用T4DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)E. coli BL21。重組質(zhì)粒通過PCR、酶切驗(yàn)證，通過PCR擴(kuò)增應(yīng)出現(xiàn)一條帶，PCR反應(yīng)參數(shù)
預(yù)變性95 V 2min ;變性94 V 30sec ;復(fù)性55 V 30sec ;延伸72 V
Imin ;循環(huán)30個(gè)；終止延伸-J2 V IOmin ;最后16°C保溫。將重組質(zhì)粒用III單酶切鑒定時(shí)應(yīng)出現(xiàn)一條帶，用Nco I和III雙酶切鑒定時(shí)應(yīng)出現(xiàn)兩條帶。結(jié)果表明重組菌構(gòu)建成功，命名為大腸桿菌BL-xdh06Escherichia coli BL_xdh06,已于2012年6月7日保藏于中國武漢的武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號(hào)為CCTCC NO. M 2012207。基因工程菌接種于3 ml LB-Amp培養(yǎng)基中，37 °C振蕩培養(yǎng)過夜，次日以2 %的接種量將種子液轉(zhuǎn)接至新鮮LB-Amp培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)至菌體光密度值(A_)約為O. 6時(shí)，加入IPTG至終濃度I mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)10 h左右。采用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳觀察目的蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明外源蛋白獲得高效表達(dá)。LB-Amp培養(yǎng)基胰化蛋白胨IOg/L,酵母提取物 5g/L，NaCl 10g/L, Amp 50 μ g/L (終濃度)?；蚬こ叹臃N于3 ml LB-Amp培養(yǎng)基中，37 °C振蕩培養(yǎng)過夜，次日以2 %的接種量將種子液轉(zhuǎn)接至新鮮LB-Amp培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)至菌體光密度值(A6tltl)約為O. 6時(shí)，加入IPTG至終濃度I mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)10 h左右。取適量菌液8000 r/min，4°C離心10 min,收集菌泥,用O. I mol/L pH 6. 8的磷酸鉀緩沖液洗漆兩次,離心后用適量的磷酸鉀緩沖液重懸菌體，冰浴中超聲破碎(超3 s停3 S，全程時(shí)間10 min, 200 W)。之后于10000 rpm, 4 °C離心10 min,上清即為粗酶液。
利用粗酶液測(cè)定木糖醇脫氫酶的酶活力，結(jié)果表明重組菌具有基因克隆供體菌氧化葡糖桿菌的木糖醇脫氫酶活力，酶活力為21 U/ml，而且重組菌的木糖醇脫氫酶活力約為氧化葡糖桿菌的10倍。獲得具有木糖醇脫氫酶高酶活力的基因工程菌。測(cè)定方法
木糖醇脫氫酶是一種氧化還原酶，它的催化活性是可逆的，木酮糖轉(zhuǎn)化為木糖醇為其還原反應(yīng)，需要輔酶NADH，木糖醇轉(zhuǎn)化為木酮糖為其氧化反應(yīng)，需要輔酶NAD+。反應(yīng)如下
權(quán)利要求
1.一種木糖醇基因工程菌大腸桿菌BL_xdh06 Escherichia coli BL_xdh06,保藏編號(hào)為 CCTCC NO. M 2012207。
2.利用權(quán)利要求I所述的木糖醇基因工程菌和氧化葡糖桿菌混合靜止轉(zhuǎn)化D-阿拉伯糖醇生產(chǎn)木糖醇的方法，其特征在于按照下述步驟進(jìn)行 (1)挑取氧化葡糖桿菌{Gluconobacter斜面菌落于種子液培養(yǎng)基,28-37°C、100-260 rpm 振蕩培養(yǎng) 8_20h ； (2)將種子液以體積比1-10%的接種量接種到擴(kuò)大培養(yǎng)基，28-37°C、100-260 rpm振蕩培養(yǎng)48-96h ； (3)將(2)中的發(fā)酵液6000-12000 rpm，4°C離心 5-20 min，收集菌泥，用 O. I mol/L pH6. 8的磷酸鉀緩沖液洗滌，離心后用適量的細(xì)胞轉(zhuǎn)化液重懸菌體； (4)將基因工程菌萬.co7iBL21-xdh06接種于LB-氨芐青霉素培養(yǎng)基中，37 °C振蕩培養(yǎng)過夜，次日以1-10 %的接種量將種子液轉(zhuǎn)接至新鮮LB-Amp培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)至菌體光密度值約為O. 6-0. 8時(shí)，加入異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷至終濃度O. 5-1. 2mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)5-15h ； 取一定體積工程菌液6000-12000 rpm，4°C離心5-20 min，收集菌泥，用O. I mol/L pH6. 8的磷酸鉀緩沖液洗滌，菌體待用； (5)將(3)和(4)離心得到得菌體用適量的細(xì)胞轉(zhuǎn)化液重懸菌體； (6)轉(zhuǎn)化液轉(zhuǎn)化溫度為28-37V，100-260rpm振蕩轉(zhuǎn)化24_60h，4h取樣，轉(zhuǎn)化液中得到木糖醇。
3.利用氧化葡糖桿菌靜止轉(zhuǎn)化D-阿拉伯糖醇生產(chǎn)木糖醇的方法，其特征在于按照下述步驟進(jìn)行 (1)挑取氧化葡糖桿菌{Gluconobacter斜面菌落于種子液培養(yǎng)基,28-37°C、100-260 rpm 振蕩培養(yǎng) 8_20h ； (2)將種子液以體積比1-10%的接種量接種到擴(kuò)大培養(yǎng)基，28-37°C、100-260 rpm振蕩培養(yǎng)48-96h ； (3)將(2)中的發(fā)酵液6000-12000 rpm，4°C離心 5-20 min，收集菌泥，用 0. I mol/L pH6.8的磷酸鉀緩沖液洗滌，離心后用適量的細(xì)胞轉(zhuǎn)化液重懸菌體； (4)轉(zhuǎn)化液轉(zhuǎn)化溫度為28-37°C，100-260rpm振蕩轉(zhuǎn)化24-60h，間隔4h取樣，4h取樣，轉(zhuǎn)化液中得到木糖醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的木糖醇基因工程菌和氧化葡糖桿菌混合靜止轉(zhuǎn)化D-阿拉伯糖醇生產(chǎn)木糖醇的方法，其特征在于其中步驟(I)所述的種子液培養(yǎng)基組成如下葡萄糖20-40. O g/L，胰蛋白胨1-10.0 g/L，酵母膏2-20.0 g/L ;氧化葡糖桿菌斜面培養(yǎng)基葡萄糖20-40. O g/L，胰蛋白胨1-10.0 8/1，酵母膏2-20.0 g/L，瓊脂10-20 g/L，其余為水; 其中步驟(2)所述的擴(kuò)大培養(yǎng)基組成如下葡萄糖20-40.0 g/L，酵母膏2-20.0 g/L,胰蛋白胨1-10.0 g/L，D-阿拉伯糖醇5-20.0 g/L，碳酸鈣10-20.0 g/L，其余為水； 其中步驟(3)所述的細(xì)胞轉(zhuǎn)化液組成如下D-阿拉伯糖醇20-40. O g/L，碳酸鈣10-30. O g/L,乙醇 3-8% (V/V)，其余為水； 其中步驟(4)所述的LB-Amp培養(yǎng)基組成如下胰化蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L,氨芐青霉素終濃度50 μ g/L,其余為水；其中步驟(5)所述的細(xì)胞轉(zhuǎn)化液包組成如下D-阿拉伯糖醇20-40. O g/L，碳酸鈣10-30. O g/L，乙醇 3-8% (V/V)，其余為水。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用氧化葡糖桿菌混合靜止轉(zhuǎn)化D-阿拉伯糖醇生產(chǎn)木糖醇的方法，其特征在于其中步驟(I)所述的種子液培養(yǎng)基組成如下葡萄糖20-40. O g/L，胰蛋白胨1-10.0 8/1，酵母膏2-20.0 g/L ;氧化葡糖桿菌斜面培養(yǎng)基葡萄糖20-40. O g/L,胰蛋白胨1-10.0 8/1，酵母膏2-20.0 g/L，瓊脂10-20 g/L，其余為水; 其中步驟(2)所述的擴(kuò)大培養(yǎng)基組成如下葡萄糖20-40.0 g/L，酵母膏2-20.0 g/L,胰蛋白胨1-10.0 g/L，D-阿拉伯糖醇5-20.0 g/L，碳酸鈣10-20.0 g/L，其余為水； 其中步驟(3)所述的細(xì)胞轉(zhuǎn)化液組成如下D-阿拉伯糖醇20-40. O g/L，碳酸鈣10-30. O g/L，乙醇 3-8% (V/V)，其余為水。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種木糖醇基因工程菌及其混合轉(zhuǎn)化生產(chǎn)木糖醇的方法，涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提出構(gòu)建一種木糖醇基因工程菌E.coliBL21-xdh06，該工程菌是通過PCR方法，從氧化葡糖桿菌(Gluconobacteroxydans)獲得木糖醇脫氫酶(xylitoldehydrogenase，XDH)基因xdh，將其克隆并在宿主菌E.coliBL21進(jìn)行穩(wěn)定高效表達(dá)。該基因工程菌表達(dá)的木糖醇脫氫酶，其酶活性提高了10倍，利用該基因工程菌和氧化葡糖桿菌混合靜止轉(zhuǎn)化D-阿拉伯糖醇生產(chǎn)木糖醇，D-阿拉伯糖醇的轉(zhuǎn)化率由29%提高到91.6%。
文檔編號(hào)C12P19/02GK102936576SQ201210209060
公開日2013年2月20日 申請(qǐng)日期2012年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月25日
發(fā)明者齊向輝, 郭齊, 王飛, 鄧文穎, 王亮, 孫文敬, 陳華友, 蒙健宗, 張?jiān)乒?申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)