專利名稱：：區(qū)分疫苗免疫和野毒感染動(dòng)物的豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型雙基因缺失突變株的疫苗...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于動(dòng)物細(xì)菌基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具,及一種區(qū)分疫苗免疫和野毒感染動(dòng)物的豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型基因缺失突變株的構(gòu)建、疫苗制備及應(yīng)用，背錄技術(shù)豬傳染性胸膜肺炎(porcinecontagiouspleuropneum0niaPOP)是由胸膜肺炎放線桿菌Uc"'加6aw'2J"si^euro/加,fae,APP〉弓跑的一種豬傳染性呼吸離病，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，自我國(guó)發(fā)現(xiàn)PCP流行以來(lái)，廣大獸醫(yī)工作者對(duì)其病原學(xué)、流行病學(xué)、診斷及防制等方面都進(jìn)行了一系列研究，取得了一定的成就，但目前該病在我國(guó)發(fā)病率仍逐年增長(zhǎng)，有的豬場(chǎng)陽(yáng)性率已達(dá)到70%以上，已經(jīng)成為集約化豬場(chǎng)的主要傳染病之一，嚴(yán)重危及到我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè).APP是一種革蘭氏陰性菌，分為2個(gè)生物型,共15種血清型(1-15型)，毒力因子有溶血外毒素(Apx)、脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)、莢膜多糖(CapsularPolysaccharide,CP〉、外膜蛋fi(OuterMe邁braneProtein,(MP)、尿素酶(Urease)等，但大量研究證實(shí)，溶血外毒素(Apx)是其主要毒力因子，同時(shí)也是很好的免疫保護(hù)性抗原，APP共產(chǎn)生四種不同的溶血外毒素，即Apxl、ApxII、Apx邁和ApxlV。不同的血清型產(chǎn)生的外毒素不同，除ApxW外沒有任何一種血清型APP能同時(shí)產(chǎn)生ApxI、ApxH、Apx邁三種毒素。各種血清型APP所產(chǎn)生毒素種類見表1。_表1:A諷毒素在不同APP血清型中的分布_毒素類型APP血清型ApxI1591011ApxII123456789111215*ApxIII2346815'ApxIVA12345678910111215**注血清型15是JKfi提出的(Blackall，etal.2002):血清型13、14所含的Apx尚不十分清楚,但已證實(shí)其存在ApxWA(Bosse，eta1.2002)。目前在APP中已發(fā)現(xiàn)4種不同的Apx具有溶血活性或細(xì)胞毒性,即ApxI、ApxII、ApxI11和ApxIV(Frey等.Actinobacilluspleuropne咖oniaeOTX-toxins:uniformdesignationofha棚olysins,cytolysins,pleurotoxinandtheirgenes.JGenMicrobiol,1993,139(Pt8):1723-1728;SchallerA等.CharacterizationofapxIVA,anewRTXdeterminantofA;"加6aci7細(xì)/j/earo/meuffloniae.裕croAiWo肪1999,8(Pt8):2105-2116),如果要產(chǎn)生和分泌具有生物活性的Apx毒素，需要相鄰的按一定順序排列的四個(gè)基因CABD組成的操縱子調(diào)控，其中A基因編碼毒素結(jié)構(gòu)蛋白，C基因編碼毒素激活蛋白，負(fù)責(zé)對(duì)毒素進(jìn)行酰基化旨，B基因和D基因的翻譯后蛋白產(chǎn)物形成跨膜通道，負(fù)責(zé)毒素由細(xì)胞內(nèi)到細(xì)胞外的分泌。Apxl、ApxIIl操縱子有完整的CABD基因，而ApxII操縱子只有C基因和A基因，其產(chǎn)物由Apxl的抑基因產(chǎn)物負(fù)責(zé)分泌到細(xì)胞外，通過對(duì)APP其它毒力基因的缺失或插入失活，人ff;i對(duì)一些毒力因子的結(jié)構(gòu)、功能、免疫學(xué)意義有一定程度的了解，并獲得了一系列有應(yīng)用前禁的突變株，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明毒力基因缺失的突變株能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)不同血清型APP攻擊的交叉保護(hù)，展示了APP突變株制備的基因缺失疫苗良好的應(yīng)用前景，同時(shí)也提示通M^毒力因子的深入研究，是大有希望獲得廣譜、安全、髙效的APP基因工程疫苗的，Apxl、ApxII具有溶血活性,ApxI溶血活性強(qiáng)于ApxII,ApxIII沒有溶血活性但有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性。ApxI、ApxII、ApxIII三種毒素對(duì)于疾病臨床癥狀的出現(xiàn)以及典型的肺部病變是必需的，這三種毒素在體內(nèi)外都能表達(dá)，對(duì)肺巨噬細(xì)胞、多形核白細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞都有不同程度的細(xì)胞毒性，除ApxII只含有ApxIICA基因外，Apxl和Apxin均包括ApxCA抑4個(gè)基因。其中A基因編碼毒素的結(jié)構(gòu)蛋白，C基因編碼毒素激活蛋白，激活A(yù)蛋白與靶細(xì)胞結(jié)合并發(fā)揮毒素活性，B和D基因產(chǎn)物為毒素分泌時(shí)所必需,在不分泌毒素Apxl的APP中同樣有即xl抑基因存在,而抑xIICA的分泌是在Apxl邸的作用F完成的，在研究中人們還發(fā)現(xiàn)，編碼毒素激活因子的C基因缺失或失活可導(dǎo)3lCA蛋白喪失溶血活性，從而使其毒力顯著下降，但不具有溶組活性的A蛋白仍保持良好的免疫原性，此外，人們?cè)谂R床上還觀察到，曾經(jīng)感染APP存活的豬獲得了對(duì)所有血清型菌株再次感染的免疫力，其可能原因在于一方面細(xì)菌誘導(dǎo)的呼吸道局部粘膜免疫反應(yīng)發(fā)揮了交叉保護(hù)作用，這種局部免疫反應(yīng)是常規(guī)疫苗經(jīng)肌肉注射免疫時(shí)所不能達(dá)到的；另一方面，交叉保護(hù)力的產(chǎn)生還可能與定居在呼吸道局部的APP在繁殖過程中合成或分泌的其它物質(zhì)刺激機(jī)體產(chǎn)生了廣泛而完整的免疫應(yīng)答，受這種現(xiàn)象的啟發(fā)以及對(duì)A諷結(jié)構(gòu)與功能的不斷了解，國(guó)外學(xué)者構(gòu)建了ApxnC基因插入失活的基因工程突變株，經(jīng)鼻腔內(nèi)接種動(dòng)物，不僅表現(xiàn)出毒力降低，而且能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)不同血清型APP攻擊的交叉保護(hù),展示了APP基因缺失疫苗良好的應(yīng)用前景(PrideauxCT等，VaccinationandprotectionofpigsagainstpleuropneumoniawithavaccinestrainofActinobacilluspleurop朋咖oniaeproducedbysite-specificmutagenesisoftheApxIIoperon.InfectInmun,1999,67(4):l恥2-l恥6)。申諳人所在的華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病研究室也按同樣的方法構(gòu)建了以我國(guó)地方分離的APP血清7型菌株為親本菌株(HB04)的印xIIC基因描入失活的基因工程突變株，并進(jìn)一歩構(gòu)建了即rflC單基兩缺失的疫畝株冊(cè)04C(apxIIC),免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物證實(shí)具有很好的免疫效果(貝為成(Bei，)等.Constructionandcharacterizationofalive,attenuatedapxIICAinactivation咖tantofActinobacilluspleuropne咖oniaelackingadrugresistancemarker.F鵬MicrobiolLetter.2005,243:21-27)1997年Anderson和ltectones首先發(fā)現(xiàn)毒素A諷IV,它在結(jié)構(gòu)上與其他的三種Kn毒素有相似處，也有獨(dú)特處，特性上更有許多獨(dú)特的鮮為人知的地方。apxIVA基因是位于APPLacZ基因上游的一Slt似于RTX毒素家族成員腦膜炎奈瑟球菌鐵調(diào)控外分泌蛋白FrpA和ErpC基因的序判。疋如FrpA和FrpC,編碼ApxWA蛋白的操縱子在其上游包含有一段ORF(0EF1)基因，已經(jīng)證實(shí)ORF(0RF1)與ApxIVA的激活有關(guān)，對(duì)于可見的溶血性和協(xié)同溶血表型是必霈的，但具體作用機(jī)制并不清楚。它的大小與發(fā)現(xiàn)于FrpA和FrpC上游的不明功能的ORF相似，但卻與它沒有高的同源性。a諷IVA包含有兩個(gè)經(jīng)典的賴氨酸?；饔梦稽c(diǎn)(GK),它們相似于大腸桿菌的溶血素結(jié)構(gòu)基因HlyA上的由HlyC介導(dǎo)激活的對(duì)象。同時(shí)，位于0RF1上游的是nrp基因，在抑xIVA基因的下游是一個(gè)LacZ基因，該基兩單獨(dú)翻澤，已證實(shí)抑xWA基因在感染時(shí)才表達(dá)，在體外培養(yǎng)時(shí)無(wú)論在什么祥的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)都無(wú)法檢測(cè)到ApxW毒素。這一特性說(shuō)明對(duì)ApxW抗體的檢測(cè)可以鑒別PCP疫苗免疫豬和野毒感染豬，這對(duì)于我國(guó)出入境檢疫提供了一個(gè)快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，同時(shí)為養(yǎng)殖戶根除該傳染病提供了手段。ApxlV感染豬的免疫原性試驗(yàn)以及里鄰ApxlVA溶血活性試驗(yàn)表明ApxIV在PCP致病和免疫中起著一定的作用。與ApxI、Apxll和ApxlII這三種毒素相比，毒素ApxW的發(fā)現(xiàn)和研究起步較晚，目前對(duì)ApxIV的研究大多是基于診斷的目的進(jìn)行ApxW部分基因的克隆和表達(dá)研究,對(duì)它在APP致病與免疫中的作用及疫苗等方面的深入研究目前國(guó)內(nèi)外都沒有相關(guān)報(bào)道。鑒于上述背景，構(gòu)建在我國(guó)流行的APP血清7型菌毒素apxIIC和apxIVAN基因缺失突變株，研究其遺傳特性、生長(zhǎng)特性、毒力、對(duì)動(dòng)物鵬性和免疫原性等生物學(xué)特性，蹄選既保留良好免疫原性又失去對(duì)動(dòng)物致病性的不含抗性標(biāo)記的基因缺失疫苗菌株并研制成有效預(yù)防并在我國(guó)乃至全球根除豬傳染性胸膜肺炎基因缺失疫苗與應(yīng)用乃當(dāng)務(wù)之急，
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷,獲得一種適用于豬腳腹肺炎放線桿菌血淸7型的^性更強(qiáng)、免疫原性更好且能區(qū)分疫苗免疫和野毒感染動(dòng)物的豬胸腹肺炎放線桿菌血清7型雙基因缺失突變菌株s本發(fā)明的第二個(gè)目的是利用豬胸,炎自桿菌血清7型雙基因缺失突變菌株制備可區(qū)分疫苗免疫動(dòng)物和野毒感染動(dòng)物的豬傳染性腳膜肺炎雙基因缺失疫苗本發(fā)明的第三個(gè)目的是豬胸膜肺炎放線桿菌血淸7型雙基因缺失突變菌株制備豬傳染性胸膜肺炎基因缺失疫苗的應(yīng)用，其中包括所制備的基因缺失疫苗動(dòng)物(豬)臨床中的應(yīng)用。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種區(qū)分疫苗免疫和野毒感染動(dòng)物的豬腌膜肺炎放線桿菌血清7型雙基因缺失突變株(分類命名-yfc"加Asc/W做/^eoro/OTe咖ao/ae)APP-7iut01,于2007年1月19日保覼在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(地址:湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi))，保藏編號(hào)CCTCCNO:M207004,所述的一株區(qū)分疫苗兔疫動(dòng)物和野毒感染動(dòng)物的豬胸膜肺炎放線桿菌血清？型雙基因缺失突變株缺失主要是A沖血清7型即xIIC基因和抑xIVAN基因，毒力基因缺失后一方面突變株對(duì)豬是安全的，同時(shí)可產(chǎn)生具有很好免疫原性的毒素ApxIIA蛋白和ApxIVAC蛋白，保證了疫苗的免疫效力；另一方面，用突變菌株制備成基因缺失疫苗后免疫動(dòng)物，動(dòng)物體內(nèi)不再產(chǎn)生針對(duì)A諷IVAN蛋白抗體，而野毒豬感染動(dòng)物后可以產(chǎn)生針對(duì)ApxIVAN蛋白抗體，一種區(qū)分疫苗免疫和野毒感染動(dòng)物的豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型單基因缺失突變株，所述的基因工程菌株它衍生于申請(qǐng)人申請(qǐng)?jiān)磺耙呀?jīng)公開報(bào)道的豬腳膜肺炎放線桿菌血清7型單基因工程菌株,菌株編號(hào)HB04C(貝為成(BeiW〉等.Constructionandcharacterizationofalive,attenuatedapxIICAinactivation鵬tantofActi加bacilluspleu卿ne咖oniaelackingadrugresistancemarker.FOBMicrobiolLetter.2005,243:21-27)。本發(fā)明制備的一種區(qū)分疫苗免疫和野毒感染動(dòng)物的豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型雙基因缺失突變株主要毒力基因apxIIC缺失了480bp，即xWAN缺失了602bp,導(dǎo)致毒力大大降低，細(xì)菌不再具有細(xì)胞毒性和溶血活性，因而具有很高的安全性。而且由于突變菌株仍然能表達(dá)無(wú)毒性的ap"IA和抑xIVAC蛋白，因此具有很好的免疫保護(hù)力，最為重要的是，突變株研制成疫苗免疫動(dòng)物后，動(dòng)物體內(nèi)不再產(chǎn)生針對(duì)A諷IVAN蛋白抗體，而野毒株感染動(dòng)物后可以產(chǎn)生針對(duì)ApxIVAN蛋白抗體，配套鑒別診斷方法就可以在我國(guó)對(duì)豬傳染性胸膜肺炎實(shí)行根除計(jì)劃。本發(fā)明的基本構(gòu)建方法是利用基因工程技術(shù)先將豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型(簡(jiǎn)稱APP-7，下同)—個(gè)主要的毒力因子apxll基因的激活因子apxIIC完全缺失后，因?yàn)橐a(chǎn)生和分泌具有生物活性的Apx毒素，需要相鄰的四個(gè)基因CABD組成的操縱子調(diào)控，其中A基因編碼毒素結(jié)構(gòu)蛋白，C基因編碼毒素激活蛋白，負(fù)責(zé)對(duì)毒素進(jìn)行?；せ?，B基因和D基因的黼譯后蛋白產(chǎn)物形成跨膜通道，負(fù)責(zé)毒素由細(xì)胞內(nèi)到細(xì)胞外的分泌。Apxl、有完整的C旭D基因，而毒素apxII基因操縱子只有C基因和A基因，其產(chǎn)物由A諷I的抑基因產(chǎn)物負(fù)責(zé)分泌到細(xì)胞外，因此，當(dāng)毒力基因的激活因子a諷IIC完全缺失后就不會(huì)產(chǎn)生具有毒性的毒素蛋白，由于A基因是結(jié)構(gòu)蛋白，與免疫保護(hù)性相關(guān)，表達(dá)的ApxIIA蛋白的生物學(xué)特性沒有改變，在apxIIC基因完全缺失的基礎(chǔ)上，進(jìn)一歩構(gòu)建毒素apxIV結(jié)構(gòu)基因A的N端缺失，因?yàn)橐呀?jīng)證實(shí)毒素apxIV基因的毒力主要與結(jié)構(gòu)基因A的N端相關(guān)(apxIVAN),而C端與其免疫原性相關(guān)。因此，當(dāng)缺失抑xIVAN基因后，突變株毒力大大降低同時(shí)又不影響免疫原性，最為重要的是，由于紐xl狄只在體內(nèi)感染才能表達(dá)，而在體外培養(yǎng)時(shí)檢測(cè)不到毒素ApxIVA基兩表達(dá)，apxIVAN基因缺失的突變株研制成疫苗免疫動(dòng)物，血清中檢測(cè)不到針對(duì)印xIVAN抗體，而野毒株感染是可以檢測(cè)apxIV細(xì)抗體，配套apxIVAN-ELISA診斷方法可以區(qū)分疫苗免疫豬和野毒感染豬。通過大量的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明，本發(fā)明制備的雙基因缺失突變菌株可用于制備豬傳染性胸腹肺炎放線桿菌血清7型雙基因缺失疫苗及應(yīng)用，本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)是1、本發(fā)明所用的材料為豬胸旗肺炎放線桿菌血清7型毒素apxIIC單基因缺失弱毒菌株，是本發(fā)明自行分離鑒定并構(gòu)建，APP血清7型菌株是目前我國(guó)流行并嚴(yán)重導(dǎo)致豬發(fā)病的優(yōu)勢(shì)血清型，因此，用該突變菌株進(jìn)一步構(gòu)建的apxIVAN基因缺失突變菌株研制成疫苗對(duì)豬免疫具有很強(qiáng)的針對(duì)性，有廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前鱟，2、本發(fā)明豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型雙基因缺失突變菌株不含抗性標(biāo)記的疫苗菌株，完全符合在我們國(guó)家疫苗生物安全性要求，3、豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型兩個(gè)主要毒力基因的apxIIC和抑xIVAN完全缺失后，獲得的雙基因缺失突變株毒力大大降低而其免疫原性未發(fā)生改變，可以保護(hù)多種血清型野毒菌株攻擊。4、用本發(fā)明構(gòu)建的雙基因缺失突變株研制成疫苗后免疫動(dòng)物，動(dòng)物血清中檢測(cè)不到針對(duì)apxIVAN抗體，而野毒株感染是可以檢測(cè)a諷IVAN抗體，配套已經(jīng)建立的抑xIVAN鑒別診斷方法，可區(qū)分疫苗免疫和野毒感染豬，達(dá)到對(duì)豬傳染性胸膜肺炎實(shí)行根除計(jì)劃。附圉說(shuō)明圖1:是本發(fā)明中用于構(gòu)建可區(qū)分疫苗免疫動(dòng)物和野毒感染動(dòng)物的豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型基因缺失突變株的物理圖譜.圖1A:即xIIC基因缺失的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒構(gòu)建示意圖圖1B:即xIVAN基因缺失轉(zhuǎn)移質(zhì)粒構(gòu)建流程示意圖圖2:是本發(fā)明制備的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pEMAlIC的鑒定結(jié)果，圖中M:DNAmarker(DL15000》1:pEMAIIC/XbalI+Snal2:pHi厶IIC/Xbal圖3:是本發(fā)明轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pE厶IVAN鑒定結(jié)果。圖中M:DNAmarker(DL15000)1:沐厶IVAN/Sa丑I+Afefl圖4:是本發(fā)明制備的沐厶IVAN轉(zhuǎn)移質(zhì)粒構(gòu)建的流程圖。圖5:是本發(fā)明的p腿厶IIC轉(zhuǎn)移質(zhì)粒構(gòu)建的流程圖，圖6:是本發(fā)明中可區(qū)分疫苗免疫動(dòng)物和野毒感染動(dòng)物的豬胸膜肺炎放線桿菌A清7型基因缺失突變株的PCR檢獮電泳圖譜。圖6A:即xIIC—雙交換PCR鑒定圖，M:DL2000鵬A分子量對(duì)照7號(hào)為篩選的apxIIC—單基因缺失株閨6B:雙基因缺失突變株P(guān)CR鑒定圍，M:DL2000DNA:1-6號(hào)雙基因缺失株7:單基因缺失株8:陰性對(duì)照?qǐng)D7:是本發(fā)明中的可區(qū)分疫苗免疫動(dòng)物和野毒感染動(dòng)物的豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型基因缺失突變菌株的Southern-blotting分析結(jié)果，圖為即xIVAN缺失的突變株Soiithern-blotting分析結(jié)果3是親本株4是突變株圖8:是本發(fā)明中的可區(qū)分疫苗免疫動(dòng)物和野毒感染動(dòng)物的豬胸TO炎放線桿菌血清7型基因缺失突變株的毒素ApxII的Western-blotting分析結(jié)果(注毒素ApxIVA不能在體外分泌表達(dá))，蹈中1:親本株2:突變菌株蹈9:是本發(fā)明中的區(qū)分疫苗兔疫和野毒感染動(dòng)物的豬胸liW炎放線桿菌血清7型雙基因缺失突變菌株的生長(zhǎng)特性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。閨10:是本發(fā)明中的區(qū)分疫苗兔疫和野毒感染動(dòng)物的豬腳膜肺炎放線桿菌血清7型雙基因缺失突變株株的遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。蹈lh是本發(fā)明的雙基因缺失突變菌株與親本菌株毒力比較微結(jié)果。圖12:是本發(fā)明的雙基因缺失疫苗對(duì)APP血清1型和7型攻擊Balb/C小白鼠的保護(hù)效果圖13:重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒PSK-nA構(gòu)建流程圖目處w'Mi.l1j具懷買履萬(wàn)a以下結(jié)合說(shuō)明書附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，實(shí)施例i1.毒素,irc引物設(shè)計(jì)和ra擴(kuò)增根據(jù)已報(bào)道的APP"7株序列(參照GenBank登錄號(hào)為AF315119的基W序列)設(shè)計(jì)兩對(duì)引物分別擴(kuò)增毒素印xii的激活基因a諷nc的上游糖和下游臂，擴(kuò)增片段大小分別為ieoobp和isoobp,上游镩兩端分別設(shè)計(jì)PstI和EcoRI酶切位點(diǎn)，下游臂兩端分別設(shè)計(jì)KpnI和XhoI酶切位點(diǎn)，上述引物均由上海生物工程公司合成，引物序判如下-pll-1:5'GCCTGCAGATT織CAfiCACCCTAC-3,(PstI)pII-2:5,-GTCAATTCGTAGCATCATCCCTCCC-S,(EcoRI〗上臂1600bppll-3:5,-TCCTCGAGGGCMTTAGMTCTATC-3,(EcoRI)pII-4:5'"GCGGTACCTTCACCTGGAGTTAGT—3,(Kpnl)下臂1800bp2.豬腳膜肺炎放線桿菌毒素抑rfl的激活基因a諷nC的上游蕾和下游臂的克隆將改良的TSA(即胰蛋白;fcS瓊脂培養(yǎng)基，購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司，以該培養(yǎng)基為基本成分，附加按體積比加1W的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(附coti朋BiideAdenineDiimcleotide,MD,乂稱VW子，購(gòu)自中國(guó)上?；瘜W(xué)試劑公司)和1諷的小牛血清)融化，冷卻至5(TC,倒于平板中，待冷卻凝固后，置37C溫箱2-3h至水汽烘干。將凍干的APP含有血清1型和血清7型的親本株冊(cè)04(該菌株參見貝為成(Beif〉等.Constructionandcharacterizationofalive,attenuatedapxIICAinactivationmut肌tofActinobacilluspleuro,咖oni肪lackingadrugresistancemarker.F鵬MicrobiolLetter.2005,243:21-27)接至烘干平板中過夜培養(yǎng)。第二天挑取單菌落接種于改良TSB(即胰蚩白大豆瓊脂i咅養(yǎng)基，購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司，以該培養(yǎng)基為基本成分，附加按體積比加W的煙WK腺嘌呤二核苷酸和1056的小牛血清)培養(yǎng)基中，37"200r/ndn培養(yǎng)7-lOh提取細(xì)菌的基兩組。取lidL改良TSB培養(yǎng)基于EP管中，室溫8000r/min離心5邁in,棄上清，沉淀懸浮fimLTE溶液中，加入650fflg/mL的溶菌酶，37t:作用2h后加2邁ol/LNaCl50nL,10%十二烷基磺酸鈉(SDS)110",20fflg/aiL的蛋白酵K3ia,5(TC作用3h或37TC過夜，均分到兩個(gè)EP管，加等體積的酚氯仿異戊酵(100:99:1)抽提兩次，用0.6V的異丙醇沉淀0.5h以上，離心后再用75%的乙醇洗滌，涼干后，溶于5加nLddaO中作PCR模板，擴(kuò)增反應(yīng)在50nL的體系中進(jìn)行，反應(yīng)體系如下模板DNA(1:咖質(zhì)粒鵬A》210XPCR緩沖液(購(gòu)自武漢晶美生物工程有限公司)5nL,25咖ol/LMgCh2.5iL,10u鵬l/LR0.5iL,10n邁ol/LP20.5iiL,l鵬ol/LdNTPs2uL,T叫ElnL,d孤033.4nL。擴(kuò)增條件為恥"變性5nin后進(jìn)入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為94t:157"1721C40sec。35個(gè)循環(huán)后，721C延伸10Bin,擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分析，擴(kuò)增2個(gè)片段大小分別為1600bp和1800bp,與預(yù)期大小相當(dāng)，將得到的目的基因克隆到pfflM8載體(購(gòu)自大連寶生物工程有限公司)，送大連寶生物工程有限公司進(jìn)行外源基因序列的測(cè)定，結(jié)果參見圖IA所示，3.pMAnC轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建用Pstl和EcoRI酶切大小為1600bp的apxIIC上游臂PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用Kpil和Xhol酶切大小為1800bp的抑xIIC下游臂PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，同時(shí)用PstI和Xhol酶切載體pM)C2,fcl收上下游同源臂基因和載體pEM0C2，然后用TVDNAligase連接，161C水浴過夜，轉(zhuǎn)化Iffl5a感受態(tài)細(xì)菌，37"培養(yǎng)，挑菌，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Ms。大腸桿菌，小量制備質(zhì)粒、酶切鑒定，從而獲得轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pEM厶nC。其物理圖譜見圖iA,鑒定結(jié)果證實(shí)構(gòu)建的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒p腿厶nc是正確的(見圖2),轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pEMAnC構(gòu)建Sfi如圖5所示。4、毒素抑xIVA引物設(shè)計(jì)(用于基因克隆和分子檢覉)及PCR擴(kuò)增根據(jù)已報(bào)道的APP"7株序列(GenBank登錄號(hào)為AF315U9)設(shè)計(jì)一對(duì)弓l物擴(kuò)增毒素即xWA基因，擴(kuò)增片&fc小為1572bp,并且兩端分別設(shè)計(jì)SalI和lfotI酶切位點(diǎn)。上述引物均由上海生物工程公司合成。引物序列如下-Papx腿5,-GCGGATCCATGCTOGCAGTMCA-3,Papx腿5,-GCGMTTCTMAGCA鶴CATOGTCGC-3,擴(kuò)增條件為951C變性5min后進(jìn)入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為94"1加in,57€1adn,721C40sec。35個(gè)循環(huán)后，72TC延伸10鵬in,擴(kuò)增的1>0產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分析，擴(kuò)增片段大小為1572bp,與預(yù)期大小相當(dāng)，將得到的目的基因克隆到p旭-18載體(購(gòu)自大連寶生物工程有限公司)中，并同時(shí)送大連寶生物工程有限公司進(jìn)行外源基因序列的測(cè)定，參見圖1B所示，5.pE厶IVAN轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建用Sail和BamHI酶切大小為lOOObp的apxIVAN上游乾用BamHI和Xhol酶切大小為1600bp的即xIVAN下游臂，其物理圖譜見圖2，鑒定結(jié)果證實(shí)構(gòu)建的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，同時(shí)用SalI和NotI酶切載體p腿0C2?；厥誥pxIVAN上游臂基因、apxIVAN下游臂基因和載體p腿0C2，然后用1DNAligase連接，16"水浴過夜，轉(zhuǎn)化朋5t!感受態(tài)細(xì)菌，37"培養(yǎng)，挑菌，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化阪-大腸桿菌，小量制備質(zhì)粒、酶切鑒定，獲得轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pE厶IVAN是正確的(見圖3),轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pE厶apxIVM構(gòu)建流程如圖4所示。6.雙基因缺失突變菌株的構(gòu)建與鑒定將構(gòu)建的重組質(zhì)粒成厶IVM轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Ecolifl2155(德國(guó)漢若威大學(xué)Gerald-RGerlaehprofessor贈(zèng)送)，同時(shí)將以前構(gòu)建的毒素apxIIC單基因缺失突變菌株作為親本菌(Bei等，Constructionandcharacterizationofalive,attenuatedapxIICAinaetivationmutantofActi加bacilluspleurop朋咖oniaelackingadrugresistancemarker.raBMicrobiologyLetter.2005,243:21-270),將攜帶有重組質(zhì)粒pE厶IVAN大腸桿菌Ecolig2155與APP血清7型毒素apxIIC單基因缺失株朋04CHt行轉(zhuǎn)接，在氯每素抗性TSA(購(gòu)自美國(guó)GIBC0公司)平板(25ug/inL的氯導(dǎo)素加入到溫度為50-60°C滅菌的培養(yǎng)基中)上篩選陽(yáng)性菌落，將陽(yáng)性單菌落在不含氯導(dǎo)素抗性TSB(1%的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和10%的小牛血清)培養(yǎng)增殖抗性菌落后，在5祐蔗ITf板上篩選耐蔗糖菌落，挑取單菌落，命名HB04C即xIIC一/apxIVAN—為實(shí)驗(yàn)編號(hào)進(jìn)行PCR和Southern-blotting鑒定，PGR鑒定提取雙基因缺失突變菌株HB0CapxIIC—/apxn細(xì)一基因組鵬A,用PCR擴(kuò)增apxIV細(xì)基因，看是否能擴(kuò)增出大小為600bp缺失特異性DNA片段。如果不能擴(kuò)增出所述的DNA片段，表明結(jié)果與預(yù)期相符，可初歩鑒定篩選的基因突變菌株是正確的，如圖6B所示，Southern-blotting鑒定參照薩姆布魯I,弗里奇E和曼尼阿蒂斯T.著，第二版，金冬雁等譯校,《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，科學(xué)出版社，北京，1998)中的方法進(jìn)行Southern-Wotting鑒定，提,基兩突變菌株冊(cè)04C印xIIC—/即xIVM—的基因組DNA(參考文歉王柳等，人巨細(xì)胞病毒的分子克隆及其特異性DNA探針的制備，生物技術(shù)，1994,4:33-35),用Eco股酶切基因組DNA,在0.郛的瓊脂糖凝膠上30伏電泳6小時(shí)后，按常規(guī)方法(薩姆布魯I,弗里奇E和曼尼阿蒂斯T.著，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版，金冬雁等譯校，科學(xué)出版社，北京，1998)轉(zhuǎn)移到醋酸纖維素膜上，抑1C烤膜后備用。以SalI/tenHI酶切重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSK-IVA(參見圖13),國(guó)收，采用D魁回收試劑盒(購(gòu)自上海生工生物工程公司)回收U52bp的片段后，用地離辛標(biāo)記與檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自美國(guó)Boch公司產(chǎn)品)標(biāo)記(具體方法按Roch公司提供的試劑盒說(shuō)明書操作)，作為apxIM基因的MA探針，置于-20"保存?zhèn)溆谩Ｗ詈髮⒁謝IVA基因的MA探針與備用的醋酸纖維素膜雜交。雜交結(jié)果表明，親本菌和突變株均有兩條雜交帶，但是一條在親本菌中應(yīng)為2.4kb的雜交帶而在突變株中變成了1.8kb(如圖7),說(shuō)明突變菌株中即xIVA缺失了約600bp(BaaHI/S鵬I片段)。7.雙基因缺失突變菌株生物學(xué)特M鑒定(1)雙基因缺失突變菌株(實(shí)驗(yàn)編號(hào)為1ffl04CapxIIC—/即xIVAN—)免疫學(xué)活性分析以本發(fā)明的雙基因缺失突變菌株培養(yǎng)后的上清液和離心后的溶菌液為樣品進(jìn)行SDS-PAGE(聚丙稀Blft繊電泳)，按此方法進(jìn)行蛋白表達(dá)和聚兩烯酰氨凝膠電泳(S0S-PAGE)凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉30分鐘后加入一抗1小時(shí)，兔抗豬IgG-HRP,371Clh經(jīng)TBS洗后3,3'二氨基聯(lián)苯二胺鹽酸鹽(購(gòu)自Si柳a公司，整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行)顯色。結(jié)果如圖8所示豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清7型雙基因抑xIIC、apxIVAN失活后仍能分泌大小約U0KDa具有良好免疫原性的毒素蛋白ApxIIA。(2)基因缺失突變菌株生長(zhǎng)特性分析分別挑取親本菌(實(shí)驗(yàn)編號(hào)HB04)和雙基因缺失突變菌株(實(shí)驗(yàn)編號(hào)HB04/apXnC-/aiIVAN—》單菌落，接種入TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每間隔l小時(shí)取樣，以分光光度計(jì)0D6加讀取其值，通過每一個(gè)相同時(shí)間段OIW值大小來(lái)比較它們的生長(zhǎng)快慢，結(jié)果如圖9所示apxIIC和抑xIVAN基因的缺失對(duì)APP的生長(zhǎng)沒有影響，(3)基因缺失突變菌株的遺傳穩(wěn)定性分析將本發(fā)明制備的雙基因缺失突變菌株在改良的TSA培養(yǎng)基連續(xù),10次，用PCR鑒定，看每一代的突變菌株是否都能擴(kuò)增出約0.6kb的抑xWAN基因特異性片段，若不能，表明本發(fā)明的突變菌株是能夠穩(wěn)定遺傳的。PCR操作方法提取雙基因缺失突變株基因組DM,以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)在25liL的體系中迸行，反應(yīng)體系如下模板基因組DNA(l:lOO質(zhì)粒D腿)luL,10XPCR緩沖液2.5wL，25nmol/LJfeCl21.25liL,10n鵬l/Lft0.25ML,10u邁ol/LP20.25ML,l咖ol/LdNTPs1L,Ta成0.5nL,d細(xì)16nL。擴(kuò)增條件為951C變性5min后JftA循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為94TC1邁in,53^01ndn,721C30sec。32個(gè)循環(huán)后，721C延伸7min。結(jié)果如圖10所示本發(fā)明制備的雙基因缺失突變菌株能夠穩(wěn)定遺傳。經(jīng)以上實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明的豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型雙基因缺失突變菌株APP—7—mut01構(gòu)建是成功的，于2007年1月19日送交中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏'娜號(hào)為CCTCCNO:M207004。8、豬傳染性腳膜肺炎雙基因缺失疫苗的制備將獲得的豬胸膜肺炎放線桿菌基因缺失突變菌株(實(shí)驗(yàn)編號(hào)HB04/apxnC—/抑xIVAN—)進(jìn)行鑒定，每代接種于改良的TSA培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基以TSA培養(yǎng)基為基本成分，附加按體積比加1%的煙,腺嘌呤二核苷酸和10%的小牛血清，利用簾膜肺炎放線桿菌的apxIC、apxIIC基因進(jìn)行PCB檢測(cè)鑒定重組細(xì)菌的遺傳穩(wěn)定性，經(jīng)加次傳代后發(fā)現(xiàn)仍然不能擴(kuò)增出大小分別為602bp的apxIVAN和480bp的抑xIIC基因，說(shuō)明我們構(gòu)建的雙基因突變菌株具有遺傳性穩(wěn)定。經(jīng)Western-blotting檢測(cè)A諷IIA毒素蛋白可以在突變菌株中能夠穩(wěn)定的表達(dá)，并具有良好的生物學(xué)活性。該豬腳膜肺炎放線桿菌雙基因缺失突變菌株在改良的TSA(按體積比計(jì)加W的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和10%的小牛血清)固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取單菌落于改良的TOS(以TBS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加按體積比為m的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和10%的小牛血清)固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直到活細(xì)菌濃度達(dá)到2X10SOTJ/mL,將細(xì)菌液與明膠保護(hù)劑按體積比為7:1(該明膠保護(hù)劑的配制方法是每10加l去離子水中加蔗糖40g,明膠8g,充分融化后，置12HC下滅菌3toin后保存?zhèn)溆?，于滅菌凍干瓶中按2.0^/瓶分裝，置-50"冷凍干燥機(jī)中凍干，凍干36-幼h后壓蓋，復(fù)蘇后確定沒有雜菌污染，置-2CTC保存?zhèn)溆?，作為研制雙基因缺失疫苗的疫苗菌株，9、豬傳染性鷹,炎雙基因缺失疫苗的安全性評(píng)價(jià)將過夜培養(yǎng)的親本菌株(冊(cè)04)和本發(fā)明的雙基因缺失突變菌株分別按體積比1:1000比例接種到20mlTSB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD600約0.8，連續(xù)2倍稀釋，每個(gè)稀釋度腹腔注射(i.p)8只Balb/C小鼠，每只2001,連續(xù)觀察5天，記錄小鼠死亡情況。結(jié)果見表1:從小鼠存活情況看，本發(fā)明的雙基因缺失突變菌株毒力有所降低，表明本發(fā)明的雙基因缺失突變菌株毒力明顯降低且對(duì)小鼠是安全的，表2本發(fā)明的雙基因缺失疫苗菌株與親本株毒力比較試驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>將本發(fā)明制備的雙基因缺失疫苗按每頭豬注射2fflL(含2Xl(fCFU活菌數(shù))接種6周齡的仔豬，部分接種仔豬出現(xiàn)輪度的一過性的發(fā)熱、^S升離反應(yīng)，兩天后恢復(fù)正常，在此期間注射本發(fā)明制備的基W缺失疫苗的仔豬的精神食欲正常，未見異常變化，可以檢測(cè)到胸膜肺炎放線桿菌間接血凝菌體抗體和毒素抗體'用親本菌株(HB04)接種的仔豬(即對(duì)照i),第二天全部呈iyg熱、體溫升高、呼吸困難等反應(yīng)，持續(xù)一周，并有一頭死亡，剖檢發(fā)現(xiàn)具有典型的豬傳染性腳膜肺炎病理變化而對(duì)照組2既沒有體溫升高，也沒有異常臨床表現(xiàn)。按每頭豬注射2邁L(含2X10"CFU活菌數(shù))接種本發(fā)明的雙基因缺失疫苗和未接種的妊娠母豬，窩產(chǎn)仔數(shù)基本相當(dāng)，均沒有出現(xiàn)死胎、木乃伊胎等，證實(shí)本發(fā)明制備的基因缺失疫苗對(duì)妊娠母豬也是安全的。10.豬傳染性胸膜肺炎雙基因缺失疫苗免疫Balb/C小白鼠的保護(hù)性試驗(yàn)將20克左右腳膜肺炎放線桿菌明性Bab/C小鼠48只，平均分為三個(gè)大組(或6個(gè)小組)，即本發(fā)明制備的雙基因缺失疫苗(冊(cè)04/apxIIC—/apxIVAN—)、單基因缺失疫苗(HB04/鄰xIIC—)組、TSB對(duì)照組。雙、單基因缺失疫苗組以0.2mL(活菌含量1X107CFU)培養(yǎng)液通過腹腔注射Bab/C小鼠；TSB對(duì)照組只腹腔注射0.2mLTSB培養(yǎng)基，免疫后第4周，TSB對(duì)照組、單基因缺失疫苗組和雙基因缺失疫苗組分別用APP血清7型菌(活菌含量6.0Xl(fCFU)和APP血清1型(活菌含量1.8Xl(fCFU)對(duì)免疫小鼠進(jìn)行攻毒。結(jié)果表明單基因缺失疫苗組和雙基因缺失疫苗組免疫的小鼠能對(duì)豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型提供100%保護(hù)。但是，沒有獲得保護(hù)的單基因缺失疫苗免疫小鼠比雙基因缺失疫苗免疫小鼠更快死亡，而TSB對(duì)照組不能提供任何保護(hù)(表2和圖1)。結(jié)果說(shuō)明我們研制的雙基因缺失疫苗對(duì)小鼠能提供有效保護(hù)。表3本發(fā)明制備的雙基因缺失疫苗對(duì)APP攻擊Balb/C小白鼠的保護(hù)性<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>11.豬傳染性鷹膜肺炎雙基面缺失疫苗在仔豬體內(nèi)的免疫效力檢獮1)豬的免疫程序:選擇豬傳染性胸膜肺炎陰性、40-50日齡的斷奶仔豬14頭，試驗(yàn)分3組，第一組為雙基芮缺失疫苗組，編號(hào)1S,.第二組為單基因缺失疫苗組，編號(hào)610,第三組為TSB對(duì)照組，編號(hào)1113,14號(hào)為空白對(duì)照TSB對(duì)照組每頭豬注射lmLTSB培養(yǎng)基，單基因缺失疫苗免疫組通過氣管注射培養(yǎng)液lmL(活菌含量1.3XltftFU),而本發(fā)明的雙基因缺失疫苗免疫組通過氣管注射培養(yǎng)液lmL(活菌含量L3X109CFU),免疫2次，間隔2周，在一免后2周和二免后2周各采血一次，分別用ELISA方法檢測(cè)毒素ApxII抗體水平(參照梁望旺等，豬腳膜肺炎放線桿菌毒素II蛋白的表達(dá)、純化及其間接ELISA檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用，中國(guó)魯醫(yī)學(xué)報(bào)，25(2):145-147,2005)和檢測(cè)毒素ApxIVA、ApxIVAM(缺失突變)抗體水平(參照黃紅量等，腳膜肺炎放線桿菌毒素砂淑基因的克隆與表達(dá)及間接ELISA方法的建立，生物工程學(xué)報(bào)，21(2):294-298,2005)。表4本發(fā)明的豬腳膜肺炎放線桿苗雙基因缺失疫苗免疫仔豬試驗(yàn)動(dòng)物分組設(shè)計(jì)組別免疫方案本發(fā)明的雙基因缺失疫苗免疫組(NO.l)單基因缺失疫苗疫苗組術(shù)2)TSB對(duì)照組(NO.3)以1idL(活菌含量1.3X10SCFU)本發(fā)明制備的基因缺失疫苗(朋04/即xIIC—/apxIVAN—)免疫豬，免疫后14天用同樣劑量加免一次以taL(活菌含量1.3X10tF0)單基因缺失疫苗(冊(cè)04/即xIIC—)免疫豬，免疫后14天用同樣劑量加兔一次每頭豬注射與基因缺失疫苗免疫組相同體積的TSB培養(yǎng)基，免疫后14天用同樣劑量注射一次。空白對(duì)照沒有注射任何物質(zhì)2)APP特異性毒素ApxIIA、ApxIVA、ApxIV艏的HJSA抗體水平檢測(cè)分別在第一次2周和第二次免疫豬后2周前腔靜脈采血，分離血清，采用間接ELISA檢測(cè)分別檢測(cè)毒素ApxII抗體水平(參照粱望旺等，豬腳膜肺炎放線桿菌毒素II蛋白的表達(dá)、純化及其間接ELISA檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用，中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，25(2):145-147,2005)和檢測(cè)毒素ApxIVA、ApxIV艦(缺失突變)抗體水平(參照黃紅量等，腳膜肺炎放線桿菌毒素^riV基因的克隆與表達(dá)及間接ELISA方法的建立，生物工程學(xué)報(bào)，21(2):294-298,2005)，結(jié)果見表4，TSB對(duì)照組小于h幼，表現(xiàn)為陰性單基因缺失疫畝組免疫斷奶仔豬攻毒前A諷nA-ELISA抗體水平在h1280"1:2560之簡(jiǎn)、ApxIVA-ELISA抗體水平在h320-1:1280之間，ApxWAM-ELISA抗體水平在b320-1:640之間。而本發(fā)明的雙基因缺失疫苗組免疫斷奶仔豬，攻毒前毒素紐xnA-ELISA抗體水平小于l:640-1:l幼O之間，ApxIVA-ELISA抗體水平在1:320-1:640之間，而ApxIMM-ELISA抗體水平小于1:20,為明性，ApxIIA、ApxIVA和ApxIVAM的ELISA抗體水平總體情況見表4所示。結(jié)*,毒素ApxIVAN缺失后的雙基因缺失疫苗免疫的斷奶仔豬能產(chǎn)生針對(duì)ApxIIA、ApxIVA的ELISA抗體，但不能產(chǎn)生針對(duì)ApxIVAE的抗體，因此該疫苗配套ApxIVAM-ELISA鑒別診斷方法可以區(qū)分豬胸膜肺炎放線桿菌7型疫苗免疫動(dòng)物和野毒感染動(dòng)物。3)免疫仔豬攻毒保護(hù)率試驗(yàn)二免后2周以TSB對(duì)瓶組ai13號(hào))、單基因缺失疫苗組(610號(hào))、本發(fā)明的雙基因缺失疫苗組(1~5號(hào))、豬通過氣管用2.OmL(活菌含量1.0X107CFU)APP血清1型菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(菌株號(hào)S4074,由澳大利亞動(dòng)物保健研究所Dr.PatBlackall贈(zèng)送)培養(yǎng)液攻毒，連續(xù)觀察1周，觀察臨床癥狀并最后計(jì)算攻毒保護(hù)率情況。結(jié)果說(shuō)明以hbo4血清7型制備的ma因缺失疫苗免疫斷奶仔豬可以完全保護(hù)同源血清l型攻擊，優(yōu)于傳統(tǒng)的滅活疫苗'攻毒后保護(hù)率情況見表5。表s本發(fā)明制備的雙基因缺失疫苗免疫仔豬后抗體水平和攻毒ifey結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>a食欲情況(36h內(nèi))0,吃食；1,食欲降低2,有點(diǎn)厭食；3不吃食b呼吸困難-0，正常1,輕微2,中等程度3'嚴(yán)重c嗜睡程度0,正常1,輕微！2,中等mK:3,嚴(yán)重d肺病變指數(shù)〈IO,基本正常>10發(fā)病e胸膜炎百分比<25*,正常25-5雌微腳膜炎50-7596,中等程度胸膜炎i>75*,嚴(yán)重胸膜炎。權(quán)利要求1.一種區(qū)分疫苗免疫和野毒感染動(dòng)物的豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型雙基因缺失突變株，其特征在于，該菌株是豬胸膜肺炎放線桿菌ActinobacilluspleuropneumoniaeAPP-7-mut01，其保藏號(hào)為CCTCCNOM207004。2、包含權(quán)利要求1所述的一種區(qū)分疫苗免疫和野毒感染動(dòng)物的豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型雙基因缺失突變株的疫苗。3、權(quán)利要求1所述的一種區(qū)分疫苗免疫和野毒感染動(dòng)物的豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型雙基因缺失突變株在制備豬傳染性胸膜肺炎基因缺失疫苗中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于動(dòng)物細(xì)菌基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種區(qū)分疫苗免疫和野毒感染動(dòng)物的豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型雙基因缺失突變株的構(gòu)建、疫苗及應(yīng)用。本發(fā)明得到一株區(qū)分疫苗免疫動(dòng)物和野毒感染動(dòng)物的豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型基因缺失突變株APP-7-mut01(保藏號(hào)為CCTCCNOM207004)。該株缺失APP血清7型兩個(gè)主要的毒力因子apxIIC和apxIVAN基因。突變株對(duì)豬安全，且具良好免疫原性的毒素ApxIIA和ApxIVAC蛋白，保證了疫苗的免疫效力。用突變株的疫苗免疫動(dòng)物，動(dòng)物體內(nèi)不再產(chǎn)生針對(duì)ApxIVAN蛋白抗體，而野毒豬感染的產(chǎn)生針對(duì)ApxIVAN蛋白抗體。本發(fā)明還公開了利用該雙基因缺失突變株構(gòu)建，疫苗制備及應(yīng)用。文檔編號(hào)C12N1/20GK101265457SQ20071005279公開日2008年9月17日申請(qǐng)日期2007年7月20日優(yōu)先權(quán)日2007年7月20日發(fā)明者何啟蓋,劉金林,斌吳,銳周,方六榮,曹勝波,肖少波,貝為成,金梅林,陳煥春申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)