一種海星優(yōu)質(zhì)卵子的促熟和人工受精方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種海星優(yōu)質(zhì)卵子的促熟和人工受精方法。
【背景技術(shù)】
[0002]海星是一類比較常見(jiàn)的無(wú)脊椎動(dòng)物，是棘皮動(dòng)物的代表鐘，具有成為模式動(dòng)物的有利條件:個(gè)體相對(duì)較小、生命力強(qiáng)、適應(yīng)性廣、在實(shí)驗(yàn)室控制條件下容易飼養(yǎng)；繁殖周期相對(duì)短，在實(shí)驗(yàn)室條件下可以控制；要求能分批產(chǎn)卵或連續(xù)產(chǎn)卵，有一定的產(chǎn)卵量；在無(wú)污染自然條件下無(wú)雌雄同體現(xiàn)象。早在1882年，埃黎耶.埃黎赫?梅契尼可夫就對(duì)海星幼蟲進(jìn)行研宄，首度發(fā)現(xiàn)了吞噬細(xì)胞而獲得1908年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。因此，海星是開(kāi)展生物學(xué)研宄的良好實(shí)驗(yàn)材料，不僅如此，海星具有較高的藥用保健和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，其生物資源的開(kāi)發(fā)利用也受到人們的重視。
[0003]海膽胚胎易于觀察和操作，是進(jìn)行顯微操作、開(kāi)展生殖發(fā)育生物學(xué)的良好素材，故而其優(yōu)質(zhì)卵子的獲取顯得尤為重要。關(guān)于海星優(yōu)質(zhì)卵子的獲取及人工受精方法國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供了一種海星優(yōu)質(zhì)卵子的促熟和人工受精方法。本發(fā)明建立了一種快速催熟海星卵子和簡(jiǎn)便的人工受精方法。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
一種海星優(yōu)質(zhì)卵子的促熟和人工受精方法，它包括以下步驟:
(1)海星親本的培育
將海星親本置于15?16°C恒溫的水族箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)期間投喂小型浮游動(dòng)物，2?3天投喂一次，4?6天換水100% ；
(2)海星性腺組織的采集
分別采集海星臂雌性性腺中的卵液和雄性性腺中的精液；
(3)海星卵子的人工促熟
向采集到的所述卵液中加入終濃度為2μΜ的1-甲基鳥嘌呤，置于16°C培養(yǎng)箱中，用搖床搖動(dòng)I?2h后卵子成熟；采用新鮮海水洗滌卵子備用；
(4)人工受精
將采集到的所述精液用海水稀釋50?100倍得精子稀釋液，吸取所述精子稀釋液加入到2 X 13?5 X 10 3個(gè)卵子中，再加入30?50mL海水，輕輕搖動(dòng)5?10分鐘，在解剖鏡下觀察受精效果，卵I吳舉起，表明受精完成。
[0006]對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟(I)中初始水溫為12°C，采用電熱棒加溫，每天升溫0.5?1°C，至16°C時(shí)維持此溫度。
[0007]對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟(I)中小型浮游動(dòng)物為鹵蟲和/或小型橈足類。
[0008]對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述小型浮游動(dòng)物的飼喂量為每只海星0.5?
Igo
[0009]對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟(2)中采用直徑2?3_的錐形鋼針在海星一臂上輕輕打開(kāi)一個(gè)直徑為2?3mm的小孔，用彎頭鑷子將發(fā)育良好的少量性腺取出，將取出的雌性性腺放于少許海水中，置于冰上，通過(guò)紗網(wǎng)過(guò)濾后獲得海星卵子；將取出的雄性性腺組織剪碎離心，取上清液體為精液，置于冰上。
[0010]對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述性腺呈橘紅色為雌性且表明性腺發(fā)育良好；性腺呈乳白色為雄性且表明性腺發(fā)育良好。
[0011]對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟(3)中卵液中卵子的濃度為I X 13?2 X 13個(gè) /mLo
[0012]對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟(4)中精子稀釋液的濃度為
IX 15?2 X 16個(gè) /mLo
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選到適用于海星卵子的最適促熟劑和最適促熟時(shí)間，采用該促熟劑可以迅速獲得優(yōu)質(zhì)的成熟卵子，且不會(huì)對(duì)后續(xù)受精等操作產(chǎn)生任何影響，從而建立了一種快速獲得海星優(yōu)質(zhì)卵子和人工受精的方法；而且，本發(fā)明不會(huì)對(duì)海星親體造成很大傷害而死亡，親體可以多次使用，卵子的獲得不受季節(jié)限制，可以做到按需供卵，為開(kāi)展生殖生物學(xué)和遺傳學(xué)研宄提供了良好的實(shí)驗(yàn)材料。
【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1為本發(fā)明實(shí)施例促熟前后的海星卵子形態(tài)，其中圖1A為促熟前的海星卵子圖，圖1B為促熟后的海星卵子圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015]以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0016]本發(fā)明所述海星優(yōu)質(zhì)卵子的促熟和人工受精方法包括以下步驟:
1、海星親本的培育
將隨機(jī)選取的20只成熟海星親本(根據(jù)性腺?zèng)Q定雌性親本和雄性親本的數(shù)量)置于100L水族箱內(nèi)養(yǎng)殖，初始水溫為12°C，采用電熱棒加溫，每天升溫0.5?1°C，至16°C時(shí)維持此溫度。培養(yǎng)期間投喂小型浮游動(dòng)物如鹵蟲和小型橈足類，每次投喂10?20g (每只海星0.5?lg)，2-3天投喂I次，每隔6天換水100%，親本培育在一周以上。
[0017]2、海星性腺組織的采集
采用直徑3mm的錐形鋼針在海星一臂上輕輕打開(kāi)一個(gè)小孔，用彎頭鑷子將少量性腺取出(因海星具有5條海星臂，每條海星臂都具有性腺組織，同時(shí)海星還具有很強(qiáng)的再生能力，僅從I?2條海星臂取少量性腺并不會(huì)對(duì)海星造成傷害，海星借助于其快速再生能力，可以迅速恢復(fù)為原來(lái)的狀態(tài)，所以采集少量性腺組織對(duì)其生物影響很小，不會(huì)對(duì)海星個(gè)體造成傷害)。性腺呈橘紅色為雌性且表明性腺發(fā)育良好；將取出的少量雌性性腺放于裝有少許海水的燒杯中，置于冰上，從雌性性腺中獲得含有海星卵子的海星卵液。性腺呈乳白色為雄性且表明性腺發(fā)育良好，將取出后的少量雄性性腺放于1.5mL離心管中，用剪刀剪碎，取上清液體即為海星精液，置于冰上。
[0018]3、海星卵子的人工促熟
取5mL海星卵液(卵液中卵子的濃度為IX 103~2X 13個(gè)/mL)置于裝有海水的50mL離心管中，加入1-甲基鳥嘌呤使其終濃度為2μΜ，置于16°C培養(yǎng)箱中，用搖床不斷搖動(dòng)，Ih后卵子成熟。用新鮮海水沖洗卵子，沖洗后將卵子置于50mL離心管中，采用新鮮海水洗滌卵子備用。本發(fā)明中的卵子也可以采用現(xiàn)有的未成熟的卵子進(jìn)行促熟。
[0019]本發(fā)明經(jīng)實(shí)驗(yàn)創(chuàng)造性的提供了 1-甲基鳥嘌呤可以具有促熟海星卵子的功能，而且1-甲基鳥嘌呤的使用量也具有至關(guān)重要的作用，只有合適的用量才可以起到有效促熟海星卵子的作用，用量太高或太低都起不到促熟作用。圖1為使用1-甲基鳥嘌呤促熟前后的海星卵子形態(tài)圖，從圖1A和圖1B的顯微鏡觀察照片中可以看到促熟前卵子略顯不規(guī)則，卵內(nèi)有生殖泡，促熟后的卵子呈圓形，生殖泡消失。
[0020]4、人工受精
取1PL海星精液放于ImL海水中稀釋得到精子稀釋液(稀釋后的精子稀釋液經(jīng)顯微鏡觀察大約濃度為5 X 15個(gè)/mL)，取300μ?所述精子稀釋液加入到5 X 103卵子中，輕輕搖動(dòng)，5?10分鐘后受精過(guò)程完成，解剖鏡下統(tǒng)計(jì)受精率為95.8%，受精完成后，采用新鮮海水沖洗受精卵，備用。
[0021]以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其進(jìn)行限制；盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，依然可以對(duì)前述實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明所要求保護(hù)的技術(shù)方案的精神和范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種海星優(yōu)質(zhì)卵子的促熟和人工受精方法，其特征在于它包括以下步驟: (1)海星親本的培育 將海星親本置于15?16°C恒溫的水族箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)期間投喂小型浮游動(dòng)物，2?3天投喂一次，4?6天換水100% ； (2)海星性腺組織的采集 分別采集海星臂雌性性腺中的卵液和雄性性腺中的精液； (3)海星卵子的人工促熟 向采集到的所述卵液中加入終濃度為2μΜ的1-甲基鳥嘌呤，置于16°C培養(yǎng)箱中，用搖床搖動(dòng)I?2h后卵子成熟；采用新鮮海水洗滌卵子備用； (4)人工受精 將采集到的所述精液用海水稀釋50?100倍得精子稀釋液，吸取所述精子稀釋液加入到2 X 13?5 X 10 3個(gè)卵子中，再加入30?50mL海水，輕輕搖動(dòng)5?10分鐘，在解剖鏡下觀察受精效果，卵I吳舉起，表明受精完成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海星卵子的促熟和人工受精方法，其特征在于:所述步驟(I)中初始水溫為12°C，采用電熱棒加溫，每天升溫0.5?1°C，至16°C時(shí)維持此溫度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海星卵子的促熟和人工受精方法，其特征在于:所述步驟(I)中小型浮游動(dòng)物為鹵蟲和/或小型橈足類。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的海星卵子的促熟和人工受精方法，其特征在于:所述小型浮游動(dòng)物的飼喂量為每只海星0.5?lg。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海星卵子的促熟和人工受精方法，其特征在于:所述步驟(2)中采用直徑2?3_的錐形鋼針在海星一臂上輕輕打開(kāi)一個(gè)直徑為2?3_的小孔，用彎頭鑷子將發(fā)育良好的少量性腺取出，將取出的雌性性腺放于少許海水中，置于冰上，通過(guò)紗網(wǎng)過(guò)濾后獲得海星卵子；將取出的雄性性腺組織剪碎離心，取上清液體為精液，置于冰上。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的海星卵子的促熟和人工受精方法，其特征在于:所述性腺呈橘紅色為雌性且表明性腺發(fā)育良好；性腺呈乳白色為雄性且表明性腺發(fā)育良好。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海星卵子的促熟和人工受精方法，其特征在于:所述步驟(3)中卵液中卵子的濃度為I X 103~2X 13個(gè)/mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海星卵子的促熟和人工受精方法，其特征在于:所述步驟(4)中精子稀釋液的濃度為I X 105~2 X 16個(gè)/mL。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種海星優(yōu)質(zhì)卵子的促熟和人工受精方法，包括：（1）海星親本的培育；（2）海星雌雄性腺組織的采集；（3）采用終濃度為2μM的1-甲基鳥嘌呤促熟海星卵子；（4）海星的人工受精。本發(fā)明首次建立了海星優(yōu)質(zhì)卵子的獲得和人工受精方法，通過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選到海星卵子最適促熟劑和促熟時(shí)間。本發(fā)明具有操作方便，高效、實(shí)用的特點(diǎn)，不會(huì)傷害親體，卵子的獲取不受季節(jié)限制；在棘皮動(dòng)物生殖生物學(xué)和實(shí)驗(yàn)胚胎學(xué)研究方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值和推廣應(yīng)用前景。
【IPC分類】A01K61-00
【公開(kāi)號(hào)】CN104798708
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510178843
【發(fā)明人】徐冬冬, 張玉榮, 樓寶, 丁躍平
【申請(qǐng)人】浙江省海洋水產(chǎn)研究所
【公開(kāi)日】2015年7月29日
【申請(qǐng)日】2015年4月16日