專利名稱：一種周圍神經(jīng)切片染色的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及周圍神經(jīng)模型，尤其涉及一種周圍神經(jīng)切片染色的方法。
背景技術(shù)：
周圍神經(jīng)損傷是臨床常見的致殘性疾病，尤其是那些造成神經(jīng)缺損的損傷。臨床上采用的修復(fù)方法有直接縫合、自體神經(jīng)移植等。目前，可替代自體神經(jīng)用于修復(fù)神經(jīng)缺損的移植材料主要有人工合成材料、生物衍生材料和組織工程神經(jīng)三大類，雖然大部分仍處于實(shí)驗(yàn)研究階段，但也有部分材料已應(yīng)用于臨床。所有的修復(fù)方法都是為了恢復(fù)神經(jīng)的連續(xù)性和完整性，為近端再生的神經(jīng)軸突和相應(yīng)的末梢靶器官重建突觸聯(lián)系提供條件。但不論哪種方法修復(fù)的神經(jīng)，都有可能出現(xiàn)神經(jīng)纖維的錯(cuò)長(zhǎng)，使得靶器官得不到應(yīng)有的神經(jīng)支配，導(dǎo)致感覺和運(yùn)動(dòng)等功能恢復(fù)不良。要想解決這個(gè)問(wèn)題，需要充分了解周圍神經(jīng)內(nèi)部神經(jīng)纖維的構(gòu)造，特別是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維和感覺神經(jīng)纖維所構(gòu)成的功能束是如何分布和走行的。 研究表明不同部分周圍神經(jīng)的內(nèi)部構(gòu)型不是完全一樣的，但這些研究只是針對(duì)人體的部分神經(jīng)，提供信息有限，關(guān)于功能束的走行和分布，仍無(wú)較為全面充分的闡述。由此，建立周圍神經(jīng)三維可視化模型及相關(guān)產(chǎn)品對(duì)于醫(yī)學(xué)研究、臨床治療、組織工程神經(jīng)的制備有重大意義。請(qǐng)參閱圖1，目前建立周圍神經(jīng)三維可視化模型，都選用Karnovsky-Roots法染色后的周圍神經(jīng)切片來(lái)獲取圖像，這些圖像在確定周圍神經(jīng)束輪廓和內(nèi)部不同性質(zhì)神經(jīng)纖維分布時(shí)需要人工進(jìn)行輪廓確定和可視化；而且每個(gè)神經(jīng)切片只有幾微米厚，要想建立全身周圍神經(jīng)系統(tǒng)三維可視化模型需要將周圍神經(jīng)制成極大數(shù)量的切片。這對(duì)于建立全身周圍神經(jīng)可視化模型既準(zhǔn)確性欠佳又工作量巨大，使用該方法獲得二維圖像提供信息有限，不適合用于指導(dǎo)醫(yī)學(xué)研究、臨床治療、組織工程神經(jīng)的制備。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的是提供一種制作周圍神經(jīng)橫斷面切片的方法，使染色后的切片圖像中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能束和感覺神經(jīng)功能束分布特征更加明顯，能夠經(jīng)計(jì)算機(jī)平臺(tái)自動(dòng)進(jìn)行輪廓獲取和圖像分割，有利于構(gòu)建更加符合真實(shí)狀態(tài)下人的周圍神經(jīng)三維可視化模型。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為一種周圍神經(jīng)切片染色的方法，依次包括獲取周圍神經(jīng)標(biāo)本的步驟、所述標(biāo)本的切片步驟、所述標(biāo)本切片的染色步驟以及風(fēng)干步驟，所述切片的染色步驟包括第一次染色步驟、第二次染色步驟及第三次染色步驟。所述的第一次染色步驟包括利用常規(guī)的Karnovsky-Roots法染色，所述的第二次染色步驟包括利用甲苯胺藍(lán)進(jìn)行染色，所述的第三次染色步驟包括利用麗春紅2R染色液進(jìn)行染色。所述獲取周圍神經(jīng)標(biāo)本的步驟包括取出標(biāo)本中神經(jīng)周圍其他組織，將神經(jīng)用 10%,20%,30%蔗糖水依次過(guò)夜。
所述標(biāo)本的切片步驟包括(1)將標(biāo)本固定在軟木片上，保持其伸直狀態(tài)，與之長(zhǎng)軸平行放置女性頭發(fā)作為標(biāo)志線，用組織包埋劑包埋標(biāo)本，_80°C速凍，將標(biāo)本切成1-1. 5cm 長(zhǎng)度標(biāo)本；(2)復(fù)溫至_20°C條件，將標(biāo)本切成5-10 μ m厚度切片。所述的第一次染色步驟進(jìn)一步包括孵育液配方孵育標(biāo)本12小時(shí)，蒸餾水洗去標(biāo)本上多余的孵育液。所述的第二次染色步驟進(jìn)一步包括1 %的甲苯胺藍(lán)在37 °C下復(fù)染標(biāo)本30分鐘，蒸餾水洗去標(biāo)本上多余的孵育液。所述的第三次染色步驟進(jìn)一步包括麗春紅2R染色液染色5分鐘，的磷鎢酸分色約1分鐘，的冰醋酸處理10秒鐘。所述標(biāo)本切片的風(fēng)干步驟進(jìn)一步包括風(fēng)干切片，依次浸泡90 %、95 %、無(wú)水酒精脫水，每次一分鐘，浸泡二甲苯兩次，每次5分鐘透明。與現(xiàn)有技術(shù)相比，經(jīng)Karnovsky-Roots法染色后的神經(jīng)切片再依次采用甲苯胺藍(lán)、麗春紅染色，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維軸突和髓鞘均可清晰顯示，以這兩個(gè)特征確定運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維的位置，使用計(jì)算機(jī)平臺(tái)自動(dòng)進(jìn)行神經(jīng)束輪廓獲取和不同性質(zhì)神經(jīng)纖維分布區(qū)域分割，實(shí)現(xiàn)人體周圍神經(jīng)三維可視化模型的建立。


下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。圖1是單純Karnovsky-Roots法染色后神經(jīng)切片圖像。圖2是復(fù)染甲苯胺藍(lán)后的切片圖像。圖3是麗春紅復(fù)染髓鞘后的切片圖像。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明周圍神經(jīng)切片染色的方法如下1、解剖新鮮自愿捐獻(xiàn)尸體，獲取新鮮周圍神經(jīng)標(biāo)本。2、取出神經(jīng)周圍其他組織，將神經(jīng)用10%、20%、30%蔗糖水依次過(guò)夜。3、將標(biāo)本固定在軟木片上，保持其伸直狀態(tài)，與之長(zhǎng)軸平行放置女性頭發(fā)作為標(biāo)志線，用組織包埋劑(opti-mum cutting temperature compound, OCT)包埋標(biāo)本，_80°C速凍，將標(biāo)本切成1-1. 5cm長(zhǎng)度標(biāo)本。4、復(fù)溫至_20°C條件，冰凍切片機(jī)將標(biāo)本切成5-10 μ m厚度切片，切6 μ m厚度最佳。5、Karnovsky-Roots法孵育液配方孵育12小時(shí)，蒸餾水洗去多余孵育液。 (Karnovsky-Roots法孵育液配方碘化乙酰硫代膽堿12. 5mg ；0. lmol/L磷酸緩沖液 16mL (0. lmol/L 磷酸氫二鈉 9mL, 0. lmol/L 磷酸二氫鉀 7mL) ；0. lmol/L 檸檬酸鈉 ImL ； 30mmol/L硫酸銅2. 5mL ；5mmol/L鐵氰化鉀2. 5mL ；蒸餾水^iiL。孵育液于用前20分鐘配好。)6、1%甲苯胺藍(lán)染色37°C復(fù)染30分鐘(甲苯胺藍(lán)lg、硼酸鈉(四硼酸鈉， Na2B407. 10H20) lg、加三蒸水100ml溶解)，蒸餾水洗去多余孵育液。7、麗春紅跗染色液(配方比例麗春紅跗lg，冰醋酸2. 5ml，蒸餾水97. 5ml)染5min，磷鎢酸分色約1分鐘，冰醋酸處理10秒。8、風(fēng)干切片，依次浸泡90^^95%,無(wú)水酒精脫水，每次一分鐘；浸泡二甲苯兩次， 每次5分鐘透明。請(qǐng)參閱圖2，Karnovsky-Roots法染色后周圍神經(jīng)切片，再經(jīng)過(guò)甲苯胺藍(lán)復(fù)染后， 圖像顯示原有的陽(yáng)性部位被加強(qiáng)，但陽(yáng)性部位的面積和位置不發(fā)生變化，復(fù)染后切片仍可采用Karnovsky-Roots法染色規(guī)律進(jìn)行定性定位運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維和感覺神經(jīng)纖維。請(qǐng)參閱圖3，采用麗春紅復(fù)染髓鞘后的切片圖像，圖像顯示紅色的麗春紅不影響甲苯胺藍(lán)復(fù)染后的切片，并且可以在圖像上形成藍(lán)色和紅色明顯的對(duì)比，不同性質(zhì)神經(jīng)纖維特征更加明顯，方便使用計(jì)算機(jī)平臺(tái)在圖像上自動(dòng)進(jìn)行不同性質(zhì)神經(jīng)纖維范圍的劃分。
權(quán)利要求
1.一種周圍神經(jīng)切片染色的方法，依次包括獲取周圍神經(jīng)標(biāo)本的步驟、所述標(biāo)本的切片步驟、所述標(biāo)本切片的染色步驟以及風(fēng)干步驟，其特征在于，所述切片的染色步驟包括第一次染色步驟、第二次染色步驟及第三次染色步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的周圍神經(jīng)切片染色的方法，其特征在于，所述的第一次染色步驟包括利用常規(guī)的Karnovsky-Roots法染色，所述的第二次染色步驟包括利用甲苯胺藍(lán)進(jìn)行染色，所述的第三次染色步驟包括利用麗春紅2R染色液進(jìn)行染色。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的周圍神經(jīng)切片染色的方法，其特征在于，所述獲取周圍神經(jīng)標(biāo)本的步驟包括取出標(biāo)本中神經(jīng)周圍其他組織，將神經(jīng)用10^^20^^30%蔗糖水依次過(guò)夜。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的周圍神經(jīng)切片染色的方法，其特征在于，所述標(biāo)本的切片步驟包括(1)將標(biāo)本固定在軟木片上，保持其伸直狀態(tài)，與之長(zhǎng)軸平行放置女性頭發(fā)作為標(biāo)志線，用組織包埋劑包埋標(biāo)本，_80°C速凍，將標(biāo)本切成1-1. 5cm長(zhǎng)度標(biāo)本；(2)復(fù)溫至_20°C 條件，將標(biāo)本切成5-10 μ m厚度切片。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的周圍神經(jīng)切片染色的方法，其特征在于，所述的第一次染色步驟進(jìn)一步包括孵育液配方孵育標(biāo)本12小時(shí)，蒸餾水洗去標(biāo)本上多余的孵育液。
6.據(jù)權(quán)利要求2所述的周圍神經(jīng)切片染色的方法，其特征在于，所述的第二次染色步驟進(jìn)一步包括的甲苯胺藍(lán)在37°C下復(fù)染標(biāo)本30分鐘，蒸餾水洗去標(biāo)本上多余的孵育液。
7.權(quán)利要求2所述的周圍神經(jīng)切片染色的方法，其特征在于，所述的第三次染色步驟進(jìn)一步包括麗春紅2R染色液染色5分鐘，1 %的磷鎢酸分色約1分鐘，1 %的冰醋酸處理10秒鐘。
8.權(quán)利要求2所述的周圍神經(jīng)切片染色的方法，其特征在于，所述標(biāo)本切片的風(fēng)干步驟進(jìn)一步包括風(fēng)干切片，依次浸泡90^^95%,無(wú)水酒精脫水，每次一分鐘，浸泡二甲苯兩次，每次5分鐘透明。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種周圍神經(jīng)切片染色的方法，依次包括獲取周圍神經(jīng)標(biāo)本的步驟、所述標(biāo)本的切片步驟、所述標(biāo)本切片的染色步驟以及風(fēng)干步驟，所述切片的染色步驟包括第一次染色步驟、第二次染色步驟及第三次染色步驟。本方法使得染色后的切片圖像中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能束和感覺神經(jīng)功能束分布特征更加明顯，能夠經(jīng)計(jì)算機(jī)平臺(tái)自動(dòng)進(jìn)行輪廓獲取和圖像分割，有利于構(gòu)建更加符合真實(shí)狀態(tài)下人的周圍神經(jīng)三維可視化模型。
文檔編號(hào)G01N1/30GK102243154SQ201110084099
公開日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2011年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月2日
發(fā)明者劉小林, 張毅, 戚劍, 朱慶棠, 羅鵬, 顧立強(qiáng) 申請(qǐng)人:中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院