一種胎盤間充質(zhì)前體干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種胎盤間充質(zhì)前體干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]干細(xì)胞的培養(yǎng)、擴(kuò)增與移植，已成為當(dāng)前再生醫(yī)學(xué)中的熱點(diǎn)。利用干細(xì)胞能夠分化成多種細(xì)胞的能力，促進(jìn)機(jī)體損傷和疾病康復(fù)過(guò)程中受損組織和器官的修復(fù)與再生，改善或恢復(fù)損傷組織和器官的功能，已經(jīng)成為生物學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)關(guān)注的焦點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，全世界每年約有上千萬(wàn)人遭受各種形式的創(chuàng)傷，有數(shù)百萬(wàn)人因在疾病康復(fù)過(guò)程中重要器官發(fā)生纖維化而導(dǎo)致功能喪失，有數(shù)十萬(wàn)人迫切希望進(jìn)行各種器官移植。隨著細(xì)胞生物學(xué)以及干細(xì)胞技術(shù)在組織工程和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用，使得干細(xì)胞在血液病、肌萎縮、腦萎縮、糖尿病等難治性性疾病的治療方面顯示出良好的發(fā)展前景。目前已被廣泛應(yīng)用于臨床試驗(yàn)研究,如移植物抗宿主病(GVHD)、充血性心衰、急性心梗、2型糖尿病、脊髓損傷、軟骨和骨損傷、克羅恩病等，而且在腎臟、肌肉和肺的損傷修復(fù)中也有初步進(jìn)展。而尋找合適的干細(xì)胞作為種子細(xì)胞來(lái)源，是再生醫(yī)學(xué)的關(guān)鍵。
[0003]胚胎干細(xì)胞是全能干細(xì)胞，具有分化成各個(gè)組織器官的能力，但是由于其存在的倫理問(wèn)題以及致瘤性的問(wèn)題，一直制約著其實(shí)際的應(yīng)用。限制了其作為細(xì)胞治療的種子細(xì)胞。影響了其在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。成體干細(xì)胞具有一定的分化能力，同時(shí)避免了胚胎干細(xì)胞的問(wèn)題，在臨床應(yīng)用中具有更實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。主要以造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞為代表。間充質(zhì)干細(xì)胞是一群來(lái)源于中胚層的，具有高度自我更新能力、多向分化潛能的成體干細(xì)胞。由于間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源廣泛，體外易于操作，造血支持和免疫調(diào)節(jié)作用明確，因此間充質(zhì)干細(xì)胞治療具有廣闊的前景。間充質(zhì)干細(xì)胞目前已經(jīng)在皮膚附件再生、心血管疾病治療等方面呈現(xiàn)出較好的應(yīng)用前景。但是隨著研究的進(jìn)展，人們逐漸認(rèn)識(shí)到，絕大部分體外培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)大部分是間充質(zhì)祖細(xì)胞和成熟間充質(zhì)細(xì)胞。更為重要的是，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞三系分化能力逐漸喪失，只具有兩系或單系分化能力的細(xì)胞比例逐漸增加，大大的限制了他們?cè)诮M織工程中的應(yīng)用。
[0004]Mendez-Ferrer等一些研究者在骨邊緣或骨實(shí)質(zhì)內(nèi)血管壁上發(fā)現(xiàn)了一種間充質(zhì)前體干細(xì)胞，它表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)志，同時(shí)還表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞，造血干細(xì)胞的標(biāo)志，而經(jīng)過(guò)傳統(tǒng)的貼壁培養(yǎng)后，它能夠迅速分化成間充質(zhì)干細(xì)胞，而漸漸失去其他干細(xì)胞的標(biāo)志。間充質(zhì)前體干細(xì)胞是一種比成熟間充質(zhì)干細(xì)胞更原始的，介乎于多能干細(xì)胞與成體干細(xì)胞之間的干細(xì)胞。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，這種間充質(zhì)前體干細(xì)胞更能支持移植動(dòng)物體內(nèi)的造血功能，具有比傳統(tǒng)間充質(zhì)干細(xì)胞更原始，具有更強(qiáng)分化功能的細(xì)胞。這種間充質(zhì)前體干細(xì)胞不僅具有間充質(zhì)干細(xì)胞的特性，表達(dá)常見(jiàn)的間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志，具有分化成骨、軟骨、脂肪的功能。還可分化成典型的所有三個(gè)胚層的細(xì)胞，如成熟的平滑肌細(xì)胞，心肌細(xì)胞，具有功能的肝細(xì)胞和表達(dá)神經(jīng)遞質(zhì)的神經(jīng)元細(xì)胞。這種間充質(zhì)前體干細(xì)胞或源于大血管的外膜和微血管的周細(xì)胞。
[0005]胎盤(placenta)是由胎兒的叢密絨毛膜與母體的基蛻膜共同組成的圓盤形結(jié)構(gòu)。胎盤細(xì)胞來(lái)源于滋養(yǎng)層細(xì)胞，與胚胎干細(xì)胞一樣都是來(lái)源于早期的胚胎。含有豐富的血管、毛細(xì)血管。因此胎盤有可能是豐富的前體干細(xì)來(lái)源。一些專利(201010178277.5 ;CN100344757C)申請(qǐng)公開的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞制備方法主要采用組織塊法或者酶消化后，在含胎牛血清或或其他血清培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)，利用細(xì)貼壁的屬性分離培養(yǎng)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞或者胎盤干細(xì)胞，這些方法獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞，表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)志，但大部分其實(shí)是相對(duì)成熟的間充質(zhì)祖細(xì)胞，具有間充質(zhì)干細(xì)胞的局限性例如低增殖性，有限的生命，在體外擴(kuò)增中逐漸喪失其干細(xì)胞的特性等特點(diǎn)，不表達(dá)巢蛋白，而且CD271陽(yáng)性率也下降，大大的影響了他們?cè)诮M織工程中的效果和應(yīng)用范圍。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供了一種胎盤間充質(zhì)前體干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其獲得的間充質(zhì)前體干細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)志，還表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志巢蛋白(Nestin)和CD271 ;自我更新能力、分化能力更強(qiáng)，具有更廣泛的應(yīng)用前景。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的:一種胎盤間充質(zhì)前體干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，包括胎盤的組織分離、組合酶消化、不連續(xù)梯度密度分離、免疫磁珠分選、間充質(zhì)前體干細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)；其特征在于具體步驟如下:
1)胎盤組織分離:無(wú)菌收集胎盤，常規(guī)方法，用有齒鑷和手術(shù)刀分離絨毛膜和羊膜，PBS沖洗絨毛膜及血管，并剪成2mmX2mm碎片；
2)組合酶消化:膠原酶I和組織分散酶II，37°C震蕩消化1飛小時(shí)，再用胰蛋白酶消化0.5?I小時(shí)；用2飛LPBS或a MEM稀釋，并用200目濾網(wǎng)過(guò)濾組織殘?jiān)?br> 3)不連續(xù)密度梯度分離:用10%?50%Percoll液，密度梯度2500rpm離心20min，吸取20%-30%Percoll之間的單個(gè)細(xì)胞，PBS離心洗滌2次；
4)加入神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體鼠抗人⑶271單克隆抗體，孵育30min，PBS洗滌2次，1500rpm離心5min ;加入磁珠標(biāo)記二抗抗鼠IgGl,2_8°C孵育15min,PBS洗漆2次，1500rpm離心5min ;通過(guò)磁場(chǎng)分選柱進(jìn)行分選,收集洗脫被標(biāo)記的細(xì)胞；
5)胎盤前體干細(xì)胞培養(yǎng):用神經(jīng)干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸分離的細(xì)胞，加入胎盤間充質(zhì)前體干細(xì)胞培養(yǎng)基即2%B27，bFGF 10ng/ml, EGF 10ng/ml，肝素20ng/ml，采用超低粘附細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)。37°C，5%C02，飽和濕度培養(yǎng)；每2-3天添加新鮮培養(yǎng)基；10-14天可見(jiàn)胎盤前體干細(xì)胞呈擬胚體樣球形生長(zhǎng)。
[0008]所述的組合酶包括膠原酶0.1_1%、組織分散酶0.1-1%和0.05-0.25%胰蛋白酶。
[0009]所述的不連續(xù)密度梯度包括10%，20%, 30%, 50%的Percoll分離液。
[0010]所述的胎盤間充質(zhì)前體干細(xì)胞培養(yǎng)基為神經(jīng)干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加B272-10% (v/v), bFGF 10-100ng/ml, EGF 10-100 ng/ml,肝素 20_100ng/ml，不含胎牛血清和其他血清。
[0011]所述的胎盤間充質(zhì)前體干細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)志⑶105，⑶73，⑶90，⑶44，同時(shí)表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志⑶271和巢蛋白NESTIN。
[0012]本發(fā)明的積極效果是其獲得的干細(xì)胞是間充質(zhì)前體干細(xì)胞，比傳統(tǒng)方法獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞更原始，增殖和分化能力更強(qiáng)；為解決傳統(tǒng)間充質(zhì)干細(xì)胞有限增殖能力和分化能力提供了解決方法；獲得的間充質(zhì)前體干細(xì)胞不僅能表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志，還表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志，為干細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用提供了良好的種子細(xì)胞來(lái)源；并且所用的培養(yǎng)基不含胎牛血清，更適用于臨床應(yīng)用。
【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1間充質(zhì)前體干細(xì)胞球。間充質(zhì)前體干細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，與胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)表型相似，呈擬胚體樣生長(zhǎng)。
[0014]圖2免疫熒光顯示間充質(zhì)前體干細(xì)胞球表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志(巢蛋白)陽(yáng)性(綠色熒光)。
[0015]圖3流式檢查顯示間充質(zhì)前體干細(xì)胞表達(dá)所有間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物，CD73，CD90, CD105, CD29, CD44 陽(yáng)性。
[0016]圖4流式結(jié)果顯示間充質(zhì)前體干細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體⑶271陽(yáng)性。而傳統(tǒng)培養(yǎng)方法獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞不表達(dá)CD271。
[0017]圖5間充質(zhì)前體干細(xì)胞經(jīng)貼壁培養(yǎng)后，分化成間充質(zhì)干細(xì)胞，形態(tài)為長(zhǎng)梭形、魚群狀生長(zhǎng)。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明并不受限于下述實(shí)施例。
[0019]實(shí)施例1:胎盤間充質(zhì)前體干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法
1.無(wú)菌收集足月產(chǎn)嬰兒胎盤，用含慶大霉素(100U/ml)、肝素(50U/ml)的磷酸鹽緩沖液2L進(jìn)行沖洗血塊；
2.分離絨毛膜和羊膜，用組織鑷機(jī)械去除蛻膜組織，PBS沖洗絨毛膜及血管，并剪成碎片(2mmX 2mm)；
3.0.1%膠原酶I和組織分散酶II經(jīng)37°C震蕩消化I小時(shí)；
4.再用0.05%胰蛋白酶消化0.5小時(shí)；
5.用大量磷酸鹽緩沖液稀釋，并用200目濾網(wǎng)過(guò)濾組織殘洛。2000rpm離心1min,磷酸鹽緩沖液重懸；
6.不連續(xù)密度梯度離心:依次加50%，30%,20%, 10%的Percoll液，不連續(xù)密度梯度離心2500rpm離心20min，吸取20%_30%Percoll之間的單個(gè)細(xì)胞。PBS離心洗滌2次；
7.免疫磁珠分選:加入鼠抗人⑶271單克隆抗體，孵育30min，PBS洗滌2次，1500rpm離心5min ；
8.加入磁