專(zhuān)利名稱(chēng)：：眼內(nèi)壓調(diào)節(jié)早期基因及其用途的制作方法眼內(nèi)壓調(diào)節(jié)早期基因及其用途相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求2005年11月22日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.60/739,570的優(yōu)先權(quán)。上述申請(qǐng)的完整內(nèi)容在此引入作為參考。
背景技術(shù)：
：青光眼在世界上損害了上百萬(wàn)人的視力，是導(dǎo)致失明的主要原因之一。在訪(fǎng)問(wèn)北美眼科診所的大量患者中，美國(guó)每年診斷出數(shù)十萬(wàn)例新的青光眼病例，其中許多病例影響老年人群。實(shí)際上，僅美國(guó)每年用在青光眼上的費(fèi)用就達(dá)到數(shù)十億美元。在最常見(jiàn)的青光眼形式一開(kāi)角型青光眼中，視野損失是由視網(wǎng)膜神經(jīng)元死亡導(dǎo)致的進(jìn)行性視神經(jīng)纖維退化引起的。那些被稱(chēng)為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)的視網(wǎng)膜神經(jīng)元組成視神經(jīng)的視網(wǎng)膜細(xì)胞內(nèi)層。伴隨進(jìn)行性RGC死亡的是眼內(nèi)壓(IOP)的升高。在大多數(shù)青光眼患者中，在疾病的某些時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)到這種高眼壓。據(jù)認(rèn)為暴露于高IOP以恒定的每周速度誘導(dǎo)了RGC的慢性和進(jìn)行性凋亡。因此，青光眼是一種緩慢的、慢性的、進(jìn)行性的RGC的神經(jīng)變性疾病。青光眼患者的IOP平均比無(wú)青光眼者的IOP高1.4至1.7倍的水平。然而，青光眼難以治療，因?yàn)楦逫OP的準(zhǔn)確發(fā)生是不可預(yù)測(cè)的，并且通常是不明顯的，直到發(fā)生周邊視覺(jué)損失，此時(shí)通常進(jìn)展為不可逆的RGC損失。因此，青光眼主要是無(wú)痛的，周邊視覺(jué)損失通常僅在大多數(shù)視神經(jīng)軸突損失時(shí)才成為臨床上明顯的。青光眼的主流治療是用藥物將高IOP降回接近正常IOP水平。然而，盡管IOP正?；浅掷m(xù)的RGC死亡和向青光眼的臨床進(jìn)展通常繼續(xù)，這提示高IOP可能不是RGC凋亡的直接原因。因此，確切地高眼壓是如何觸發(fā)導(dǎo)致RGC凋亡的生物化學(xué)事件的還不清楚。當(dāng)前提出的青光眼中RGC凋亡的機(jī)理包括(i)興奮性毒性損傷(高活性NMDA受體、升高的谷氨酸鹽、€&++通量和一氧化氮水平)，(ii)缺血性或機(jī)械性視網(wǎng)膜損傷，導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞激活，引起相鄰視網(wǎng)膜細(xì)胞的旁觀者損害，和(iii)視神經(jīng)頭的機(jī)械壓縮，這阻止了RGC存活所需的軸突運(yùn)輸(也被稱(chēng)為"成套(cuffmg)"或"生理性軸突切開(kāi)(axotomy)")。然而，這些機(jī)理單獨(dú)不能解釋為什么只有RGC對(duì)凋亡敏感，而不是暴露于改變的谷氨酸鹽/一氧化氮化3++的潛在有害作用和機(jī)械應(yīng)力的視網(wǎng)膜內(nèi)層的所有細(xì)胞。這些假說(shuō)也不能解釋為什么IOP的正常化不導(dǎo)致當(dāng)軸突運(yùn)輸恢復(fù)時(shí)RGC死亡完全停止。因此，盡管高IOP顯然與青光眼中的RGC死亡有關(guān)，但是實(shí)際上高IOP和RGC凋亡之間在分子水平上沒(méi)有聯(lián)系。由于當(dāng)前的降低IOP的青光眼治療通常不能阻止RGC細(xì)胞的繼續(xù)損失和視神經(jīng)的退化，需要針對(duì)青光眼進(jìn)展的分子原因進(jìn)行治療的療法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及一種治療哺乳動(dòng)物的青光眼的方法。鑒定了幾種具有由高IOP誘導(dǎo)的顯著改變的表達(dá)并且在功能上與細(xì)胞信號(hào)發(fā)生和細(xì)胞死亡有關(guān)的基因。這些基因有些表達(dá)增強(qiáng)，有些表達(dá)降低，被稱(chēng)為眼內(nèi)壓調(diào)節(jié)早期基因或IPREG，包括a2巨球蛋白、PSD-95/SAP90相關(guān)蛋白-4、Reggiel-l、RBCK、Gzoc、蛋白質(zhì)磷酸酶1Y、核糖體蛋白L23-相關(guān)產(chǎn)物、膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白、環(huán)核苷酸門(mén)控陽(yáng)離子通道、SPARC、B-2芳基胺N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、淀粉狀蛋白前體樣蛋白2、雙載蛋白1、Crybb2、Ras-相關(guān)p23、解旋酶Rap30、蛋白體rPA28亞單位p、ATPasea-1亞單位、卩A3/A1晶體蛋白、(3A4晶體蛋白、S-腺苷甲硫氨酸合酶、天冬酰胺合酶和幾種cDNA克隆和表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種治療哺乳動(dòng)物的青光眼的方法，包括給哺乳動(dòng)物施用有效量的抑制一種或多種上調(diào)的IPREG的表達(dá)或活性的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述上調(diào)的IPREG選自a2巨球蛋白、PSD-95/SAP90相關(guān)蛋白-4、Reggie1-1、RBCK、Gzot、蛋白質(zhì)磷酸酶1Y、核糖體蛋白L23-相關(guān)產(chǎn)物、膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白、環(huán)核苷酸門(mén)控陽(yáng)離子通道、SPARC、和B-2芳基胺N-乙酰轉(zhuǎn)移酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抑制性組合物含有一種或多種選自下組的物質(zhì)小干擾RNA(siRNA)、反義寡核苷酸、中和抗體、小分子、重組基因表達(dá)載體、重組基因病毒載體、合成肽、重組多肽、擬肽和IPREG調(diào)節(jié)區(qū)抑制劑。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)眼內(nèi)注射、局部結(jié)膜應(yīng)用、局部角膜應(yīng)用或利用機(jī)械遞送裝置施用所述組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括施用眼內(nèi)壓正常化藥物，該藥物選自非選擇性腎上腺素受體阻斷劑、選擇性腎上腺素受體阻斷劑、前列腺素、碳酸酐酶抑制劑、腎上腺素能;敫動(dòng)劑和縮瞳藥。本發(fā)明還涉及一種治療哺乳動(dòng)物的青光眼的方法，包括給哺乳動(dòng)物施用有效量的提高一種或多種下調(diào)的IPREG的表達(dá)或活性的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，提高其表達(dá)的下調(diào)的IPREG是選自下組的一種或多種物質(zhì)淀粉狀蛋白前體樣蛋白2、雙載蛋白1、Crybb2、Ras-相關(guān)p23、解旋酶Rap30、蛋白體rPA28亞單位(3、ATPaseoc-l亞單位、(3A3/A1晶體蛋白、(3A4晶體蛋白、S-腺苷曱硫氨酸合酶和天冬酰胺合酶。該組合物包含一種或多種提高下調(diào)的IPREG的表達(dá)或活性的物質(zhì)，并且可以通過(guò)上述途徑給藥，并且可以進(jìn)一步與眼內(nèi)壓正?；幬锫?lián)合給藥。本發(fā)明還涉及通過(guò)施用有效量的既抑制至少一種上調(diào)的IPREG的表達(dá)或活性又提高至少一種下調(diào)的IPREG的表達(dá)或活性的組合物來(lái)治療哺乳動(dòng)物的青光眼。該組合物使用抑制IPREG的表達(dá)或活性(對(duì)于上調(diào)的IPREG)和/或提高IPREG的表達(dá)或活性(對(duì)于下調(diào)的IPREG)的物質(zhì)調(diào)節(jié)所鑒定的IPREG。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種預(yù)防由高IOP介導(dǎo)的RGC死亡的方法，包括給個(gè)體施用有效量的IPREG調(diào)節(jié)組合物，使得該組合物抑制一種或多種上調(diào)的IPREG的表達(dá)或活性和/或提高一種或多種下調(diào)的IPREG的表達(dá)或活性。另外，本發(fā)明還涉及一種預(yù)防哺乳動(dòng)物的慢性眼退^匕(chronicoculardegeneration)的方法，包4舌纟合哺乳動(dòng)物施用有效量的IPREG調(diào)節(jié)組合物，使得該組合物抑制一種或多種上調(diào)的IPREG的表達(dá)或活性和/或提高一種或多種下調(diào)的IPREG的表達(dá)或活性。本發(fā)明還涉及一種檢測(cè)患者的慢性眼退化的方法，包括測(cè)定患者房水中的一種或多種IPREG蛋白的表達(dá)水平，并且將測(cè)定的表達(dá)水平與具有正常眼功能的個(gè)體中相同的一種或多種IPREG蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行比較。與具有正常眼功能的個(gè)體中相同的IPREG蛋白的表達(dá)水平相比，一種或多種上調(diào)的IPREG蛋白的較高的表達(dá)水平和/或一種或多種下調(diào)的IPREG蛋白的較低的表達(dá)水平表示該患者具有慢性眼退化。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種^f企測(cè)患者中的RGC應(yīng)激的方法，包括在最初時(shí)間點(diǎn)測(cè)定患者房水中一種或多種IPREG蛋白的表達(dá)水平，在以后的時(shí)間點(diǎn)測(cè)定患者房水中相同的一種或多種IPREG蛋白的表達(dá)水平，并且將在最初時(shí)間點(diǎn)測(cè)定的一種或多種IPREG蛋白的表達(dá)水平與在以后時(shí)間點(diǎn)測(cè)定的表達(dá)水平進(jìn)行比較，因此患者中較高的一種或多種上調(diào)的IPREG蛋白的表達(dá)水平和/或較低的一種或多種下調(diào)的IPREG蛋白的表達(dá)水平表示患者中發(fā)生了RGC應(yīng)激。還提供了一種鑒定眼內(nèi)壓調(diào)節(jié)早期基因(IRPEG)的方法，該方法包括確定一種基因的表達(dá)是否被高眼壓所改變，其中該基因的表達(dá)不被視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)的損傷所改變。該方法進(jìn)一步包括確定該基因的表達(dá)是否在高眼壓發(fā)生后早期改變，確定改變的該基因的表達(dá)在高眼壓或青光眼發(fā)生后是否持續(xù)，以及確定在高眼壓降低后該基因的表達(dá)是否仍然改變。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，證實(shí)了所鑒定的基因在RGC死亡和/或青光眼中的作用。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用上述方法鑒定的IPREG。本發(fā)明還涉及用來(lái)治療青光眼、慢性眼退化或RGC死亡的藥物組合物。因此，本發(fā)明涉及一種含有有效量的至少一種抑制上調(diào)的IPREG的表達(dá)或活性的物質(zhì)和藥物可接受的載體的藥物組合物，其中施用該組合物以治療青光眼。在另一個(gè)實(shí)施方案中，施用該藥物組合物以治療慢性眼退化或RGC死亡。另外，本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，其含有有效量的至少一種提高下調(diào)的IPREG的表達(dá)或活性的物質(zhì)和藥物可接受的載體，其中施用該組合物以治療青光眼，或者，在另外的實(shí)施方案中，用于治療慢性眼退化或RGC死亡。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種藥物組合物，其含有有效量的至少一種抑制上調(diào)的IPREG的表達(dá)或活性的物質(zhì)和至少一種提高下調(diào)的IPREG的表達(dá)或活性的物質(zhì)和可接受的藥物載體，其中施用該組合物以治療青光眼、治療慢性眼退化或RGC死亡。專(zhuān)利或申請(qǐng)文件包括至少一張彩色附圖。具有彩色附圖的本專(zhuān)利或?qū)＠暾?qǐng)公開(kāi)文本將由專(zhuān)利局在收到請(qǐng)求和必要的費(fèi)用后提供?；谝韵聦?duì)本發(fā)明實(shí)施例實(shí)施方案的具體描述，以上所述將是顯而易見(jiàn)的。附圖不一定是衡量、強(qiáng)調(diào)，而是說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案。表1說(shuō)明已經(jīng)誘導(dǎo)高眼內(nèi)壓(IOP)然后用藥物降低IOP的大鼠視網(wǎng)膜的眼內(nèi)壓水平。表2列出了在基因陣列芯片分析中鑒定的基因，這些基因具有由于高IOP而引起的顯著改變的表達(dá)，其基因表達(dá)相比正常IOP視網(wǎng)膜具有相對(duì)改變。表3列出了滿(mǎn)足多種IPREG定義標(biāo)準(zhǔn)的基因的亞組，并且說(shuō)明了這些基因在誘導(dǎo)高IOP后的RNA表達(dá)水平的改變。圖1中的圖A說(shuō)明用倍他洛爾治療小鼠高眼壓模型的眼內(nèi)壓的改變。圖1中的圖B說(shuō)明進(jìn)行及不進(jìn)行倍他洛爾治療的小鼠高眼壓模型的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損失。圖2是說(shuō)明為差示基因陣列回收視網(wǎng)膜mRNA樣品的實(shí)驗(yàn)程序的流程圖。圖3是說(shuō)明青光眼大鼠視網(wǎng)膜中oc2巨球蛋白轉(zhuǎn)錄物上調(diào)的Northern印跡。圖4是說(shuō)明正常、青光眼和視神經(jīng)軸突切開(kāi)大鼠—見(jiàn)網(wǎng)膜中a2巨球蛋白、雙載蛋白1和Gza的蛋白質(zhì)表達(dá)水平的免疫印跡。圖5A-5B是一系列共聚焦顯微照片，說(shuō)明通過(guò)免疫組化研究所見(jiàn)的正常和高IOP大鼠一見(jiàn)網(wǎng)膜中a2巨球蛋白和LRP-1受體的表達(dá)。圖5C-5D是一系列共聚焦顯微照片，說(shuō)明通過(guò)免疫組化研究所見(jiàn)的正常和高IOP大鼠視網(wǎng)膜中a2巨球蛋白和LRP-1受體的定位。圖6是免疫印跡，說(shuō)明患有青光眼(G)和白內(nèi)障(C)的人眼的房水中a2巨球蛋白的表達(dá)。圖7是說(shuō)明青光眼中上調(diào)的IPREG如何共同作用導(dǎo)致RGC死亡的模型的示意圖。發(fā)明詳述本發(fā)明總的涉及通過(guò)調(diào)節(jié)可能與RGC凋亡有關(guān)的由高眼壓觸發(fā)的基因異常表達(dá)和/或功能/活性來(lái)治療和診斷哺乳動(dòng)物的青光眼的方法。本文使用的術(shù)語(yǔ)"目艮內(nèi)壓調(diào)節(jié)早期基因"或"IPREG"描述了滿(mǎn)足一個(gè)或多個(gè)將基因與眼退化相關(guān)聯(lián)的標(biāo)準(zhǔn)的基因。一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)是候選基因和/或基因產(chǎn)物的任何分子改變被高IOP誘導(dǎo)，而不是作為RGC損傷的結(jié)果產(chǎn)生。另一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)是這些分子改變?cè)诟逫OP發(fā)生后的相對(duì)早期觸發(fā)。另外，優(yōu)選地，由高IOP觸發(fā)的基因和/或基因產(chǎn)物的任何分子改變持續(xù)或長(zhǎng)期存在，甚至在IOP已經(jīng)正常化之后仍然存在。在一個(gè)特別優(yōu)選的方面，基因和/或基因產(chǎn)物的分子改變將致敏或引發(fā)RGC死亡，換句話(huà)說(shuō)，該基因?qū)⒃谒劳鲂盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如上調(diào)的基因產(chǎn)物)或神經(jīng)保護(hù)(例如下調(diào)的基因產(chǎn)物)中具有直接或間接的作用?；蜩b定在高IOP條件下差異表達(dá)的基因可以通過(guò)幾種本領(lǐng)域公知的方法鑒定，這些方法包括差異展示、基因陣列芯片、蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)方法，在一個(gè)具體實(shí)施方案中使用基因陣列芯片。使用基因陣列系統(tǒng)的方法在本領(lǐng)域中公知，簡(jiǎn)要地說(shuō)，mRNA可以從目標(biāo)組織(例如視網(wǎng)膜)中分離，以及從正常組織來(lái)源(即對(duì)照來(lái)源)和目標(biāo)組織來(lái)源(例如異常或病變組織)制備。由分離的mR_NA制備cDNA，并由純化的cDNA制備標(biāo)記的cRNA探針，然后將該探針與基因陣列DNA芯片在雜交條件下孵育。芯片上已經(jīng)與探針特異性結(jié)合的基因可以通過(guò);f全測(cè)何種標(biāo)記物與cRNA#罙針結(jié)合來(lái)鑒定，并且進(jìn)行分析來(lái)檢測(cè)與來(lái)自正常組織的cRNA探針雜交的基因陣列芯片和與來(lái)自目標(biāo)組織的cRNA雜交的基因陣列芯片之間基因表達(dá)變化的倍數(shù)。通常進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析來(lái)確定在芯片之間發(fā)現(xiàn)的基因表達(dá)的變化是否具有顯著性，然后在組織本身中驗(yàn)證被認(rèn)為具有顯著性的基因表達(dá)的變化(例如通過(guò)RT-PCR、northern印跡法、免疫印跡法或免疫熒光法)。對(duì)于本發(fā)明而言，視網(wǎng)膜mRNA的來(lái)源可以來(lái)自任何能夠經(jīng)歷和/或復(fù)制在青光眼中所見(jiàn)的改變(即高IOP、RGC死亡和高IOP正?；蟪掷m(xù)的RGC死亡)的系統(tǒng)；因此mRNA來(lái)源可以來(lái)自人組織、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型或細(xì)胞/組織培養(yǎng)系統(tǒng)。對(duì)于本發(fā)明而言，使用鞏膜外靜脈燒灼大鼠高眼壓模型，并且從正常大鼠、改變?yōu)楦逫OP的大鼠和改變?yōu)楦逫OP接著用藥物正?；拇笫笄邢碌囊暰W(wǎng)膜中分離mRNA。鑒定了33種在誘導(dǎo)高IOP后具有顯著改變的表達(dá)的基因和表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)。所有這些基因都是用于理解RGC損傷原因的有意義的候選物，在大鼠模型中用藥物使高IOP正常化后21天，鑒定的9種基因保持顯著改變的表達(dá)。眼內(nèi)壓調(diào)節(jié)早期基因鑒定了幾種在誘導(dǎo)高IOP后在視網(wǎng)膜中的表達(dá)改變的基因。在分析中發(fā)現(xiàn)具有上調(diào)的表達(dá)的基因是a2巨球蛋白、PSD-95/SAP90相關(guān)蛋白-4、Reggiel-l、RBCK、Gzoc、蛋白質(zhì)磷酸酶1Y、核糖體蛋白L23-相關(guān)產(chǎn)物、膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白、環(huán)核苷酸門(mén)控陽(yáng)離子通道、SPARC、和B-2芳基胺N-乙酰轉(zhuǎn)移酶，而顯示下調(diào)的表達(dá)的基因包括淀粉狀蛋白前體樣蛋白2、雙載蛋白1、Crybb2、Ras-相關(guān)p23、解旋酶Rap30、蛋白體rPA28亞單位p、ATPaseoc-l亞單位、(3A3/A1晶體蛋白、(3A4晶體蛋白、S-腺苷曱硫氨酸合酶、和天冬酰胺合酶。多種基因所見(jiàn)的改變的表達(dá)與推測(cè)的青光眼中RGC死亡的機(jī)制相符合，這些機(jī)制包括谷氨酸能應(yīng)激、旁觀者效應(yīng)、生長(zhǎng)因子剝奪和軸突生長(zhǎng)減少。例如，一種鑒定為具有上調(diào)的表達(dá)的IPREG,oc2巨球蛋白，與其受體LRP-1結(jié)合，通過(guò)NMDA受體的激活導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca"增多。有意思的是，已經(jīng)將NMDA受體活性與神經(jīng)凋亡相關(guān)聯(lián)。另外，oc2巨球蛋白結(jié)合并中和視網(wǎng)膜神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白，特別是神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF),NGF是一種重要的RGC的存活因子。因此a2巨球蛋白的過(guò)量表達(dá)可能通過(guò)將其對(duì)NMDA受體的興奮活性的作用加重到凋亡水平和/或降低存活因子NGF的生物利用度而引起RGC死亡(見(jiàn)圖7)。IPREGPSD95/SAP90也與NMDA受體結(jié)合，結(jié)合該受體的C-末端，并且通過(guò)src-家族激酶誘導(dǎo)該受體的磷酸化和激活。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)src-家族激酶Fyn、PSD95和NMDA受體之間復(fù)合體的形成增強(qiáng)了腦缺血中的細(xì)胞死亡，而PSD95的抑制減少了缺血后神經(jīng)元細(xì)胞死亡。此外，激活NMDA受體的src家族激酶本身^皮蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶和一種src家族磷酸酶特別是蛋白質(zhì)磷酸酶1y(PP1)激活，PP1也是在基因陣列分析中發(fā)現(xiàn)被上調(diào)的IPREG。PP1與RGC應(yīng)激相關(guān)聯(lián)，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)它抑制損傷的成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的軸突再生長(zhǎng)(見(jiàn)圖7)。另外，另一種上調(diào)的IPREG,Gza，是NMDA受體的直接作用物和通過(guò)第二信使的NMDA受體信號(hào)的介質(zhì)。實(shí)際上，已經(jīng)報(bào)道Gza在功能上以加劇神經(jīng)元細(xì)胞死亡的方式使a2巨球蛋白/LRP-l受體能夠與GTPases相互作用。因此，IPREGa2巨球蛋白、PSD95、PP1和Gza的上調(diào)說(shuō)明了通過(guò)增強(qiáng)NMDA受體激活引起RGC凋亡的信號(hào)協(xié)調(diào)。鑒定IPREG的方法以前的研究已經(jīng)鑒定了在高眼內(nèi)壓條件下表達(dá)改變的基因(AhmedF等人，W45:1247-1258，2004;EssonDW等人，/wve^Op/zM/wo/K、45:4450-4462，2004;PangIH等人,/m^/(9p/z/a/mo/46:1313-1321，2005)。但是，這些基因表達(dá)的改變無(wú)法解釋甚至在患者眼內(nèi)壓正?；笥^察到的持續(xù)的RGC死亡以及之后的視力損失。因此，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)來(lái)鑒定最可能與高眼壓和/或?qū)е虑喙庋蹱顩r繼續(xù)惡化的RGC死亡保持有關(guān)的基因。也就是說(shuō)，視網(wǎng)膜基因表達(dá)的改變由高眼壓觸發(fā)，并且在高IOP正常化后保持，引起RGC死亡。相應(yīng)地，提供了一種鑒定眼內(nèi)壓調(diào)節(jié)基因(IPREG)的方法，包括確定一種或多種候選基因是否滿(mǎn)足某些、優(yōu)選地所有特定的標(biāo)準(zhǔn)。將要用該方法評(píng)價(jià)的候選基因可以用多種方法發(fā)現(xiàn)/測(cè)定。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以簡(jiǎn)單地選擇一種或多種感興趣的基因。通常，這些候選基因的選擇將基于該基因在眼睛(例如視網(wǎng)膜細(xì)胞)中已知的表達(dá)，以及該基因與例如細(xì)胞活性/信號(hào)(例如生長(zhǎng)、分化、存活、粘附)的調(diào)節(jié)、高眼壓和/或細(xì)胞死亡的相關(guān)性。另外，也可以根據(jù)該方法所述的某些條件引起的基因表達(dá)的改變選擇候選基因，例如，通常在高眼內(nèi)壓、眼內(nèi)壓正常化、視力損失、視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡、視網(wǎng)膜細(xì)胞存活和/或青光眼條件下一種或多種基因的表達(dá)的改變。通過(guò)(例如)利用差異展示或基因微陣列將基因在所選條件下的表達(dá)與適當(dāng)?shù)膶?duì)照(例如正常和/或非病變條件)進(jìn)行比4交可以確定這些基因表達(dá)的改變。在該方法中確定高眼壓是否改變候選基因的表達(dá)。然而，優(yōu)選基因的表達(dá)對(duì)高眼壓和青光眼是特異性的，也就是說(shuō)，其表達(dá)不是可能由于IOP升高而發(fā)生的普通RGC損傷的結(jié)果。為了確定基因表達(dá)的改變是否只是由于RGC損傷而改變，可以在普通的、優(yōu)選急性的RGC損傷條件下利用其它合適的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?例如視神經(jīng)軸突切開(kāi)大鼠模型)來(lái)確定基因的表達(dá)。該方法中還確定在高眼壓發(fā)生后基因的表達(dá)是否早期改變。因此，進(jìn)一步確定一種或多種基因的改變的表達(dá)是否不同于以后的青光眼相關(guān)事件，是由高眼壓特異性地引起的。高眼壓發(fā)生后足夠早期的時(shí)間范圍取決于許多因素，對(duì)于人類(lèi)患者包括患者群體、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型(例如小鼠、大鼠、兔)或者其它模型系統(tǒng)(例如細(xì)胞培養(yǎng))，并且最好由熟練技術(shù)人員根據(jù)對(duì)特定組、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型和/或其他模型系統(tǒng)的了解來(lái)確定。例如，在此處使用的高眼壓/青光眼模型一大鼠鞏膜外靜脈燒灼模型(見(jiàn)實(shí)施例1)中，高眼壓發(fā)生后基因的早期表達(dá)在誘導(dǎo)高IOP后大約1天到7天或者大約3天到7天發(fā)生。該方法進(jìn)一步包括確定一種或多種候選基因的表達(dá)是否在高眼壓或青光眼發(fā)生后持續(xù)/長(zhǎng)期存在。也就是，確定基因的表達(dá)是否在發(fā)生高IOP后早期改變，基因表達(dá)是否長(zhǎng)期改變。這一標(biāo)準(zhǔn)使得鑒定的基因更可能與青光眼中所見(jiàn)的高眼壓保持和RGC死亡有關(guān)。測(cè)定滿(mǎn)足這一標(biāo)準(zhǔn)的基因表達(dá)的時(shí)間范圍也取決于患者群體或使用的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。通常，將發(fā)生高IOP后早期測(cè)定的基因表達(dá)與發(fā)生高IOP后足夠長(zhǎng)時(shí)間測(cè)定的相同基因在某一時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)進(jìn)行比較。在大鼠鞏膜外靜脈燒灼模型中，測(cè)定表達(dá)改變的基因持續(xù)表達(dá)的時(shí)間點(diǎn)為大鼠眼睛燒灼后28天(見(jiàn)實(shí)施例1，第2組)。IPREG的鑒定進(jìn)一步包括確定在例如使用眼內(nèi)壓調(diào)節(jié)藥物使高眼壓下降和/或正常化后基因的表達(dá)是否仍然改變。這一標(biāo)準(zhǔn)較好地再現(xiàn)了在人類(lèi)患者中常見(jiàn)的情況，即，盡管高眼壓正?；匀焕^續(xù)發(fā)生視野損失，因此這一標(biāo)準(zhǔn)有助于確保鑒定引起青光眼中眼退化的基因。為了評(píng)價(jià)在高眼壓下降后具有持續(xù)改變的表達(dá)的基因，可以在高IOP發(fā)生后較快速地使眼內(nèi)壓下降/正常化。例如，在大鼠鞏膜外靜脈燒灼模型中，在燒灼(例如誘導(dǎo)高IOP)后第3天用眼內(nèi)壓正?；幬镏委煷笫?，到燒灼后第7天觀察到眼內(nèi)壓正?；?，并且在燒灼后第28天，即高IOP正?；?1天，測(cè)定基因表達(dá)(參見(jiàn)實(shí)施例1,第3組)。為了確定基因表達(dá)是否長(zhǎng)期發(fā)生，可將IOP降低/正常化后稍后的時(shí)間點(diǎn)測(cè)定的基因表達(dá)與發(fā)生高IOP后早期測(cè)定的基因表達(dá)和/或正?；虮磉_(dá)(例如發(fā)生/誘導(dǎo)高眼壓之前的或在正常個(gè)體/動(dòng)物中所見(jiàn)的基因表達(dá))進(jìn)行比較。基因的表達(dá)可以通過(guò)其它測(cè)定基因表達(dá)的方法(例如，northern印跡法、逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(傳統(tǒng)的和實(shí)時(shí)的)、PCR)證實(shí)，通常是不用于在基因鑒定中說(shuō)明改變的表達(dá)的方法。另外，也可以測(cè)定伴隨的基因產(chǎn)物或蛋白質(zhì)表達(dá)的改變，來(lái)證實(shí)在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)現(xiàn)的表達(dá)改變也在蛋白質(zhì)水平上發(fā)現(xiàn)。對(duì)于特定蛋白質(zhì)/酶確定鑒定的基因和/或蛋白質(zhì)的表達(dá)改變是否導(dǎo)致蛋白質(zhì)活性(例如激酶活性、結(jié)合活性、酶切活性、蛋白質(zhì)激活或抑制活性)的改變也可能是有利的。對(duì)蛋白質(zhì)/酶活性的評(píng)價(jià)可以用許多本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行(例如，分光光度分析、熒光分析、量熱法、化學(xué)發(fā)光法、放射性測(cè)量、色傳分析)，并且依賴(lài)于具體的蛋白質(zhì)/酶。在利用上述方法將一種基因鑒定為IPREG后，該方法可以包括其他方面，以更好地理解該基因及其與RGC死亡的調(diào)節(jié)和/或原因和青光眼進(jìn)展的潛在相關(guān)性。對(duì)于利用基因微陣列鑒定的候選基因，例如，確定所鑒定的基因在視網(wǎng)膜和其它細(xì)胞/系統(tǒng)中的功能和/或作用可以提供關(guān)于說(shuō)明該基因在青光眼和RGC死亡中的推定作用的信息。該信息可被本領(lǐng)域技術(shù)人員從大量來(lái)源獲得，包括國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI)(例如PubMed(科學(xué)文章)、Entrez(基因組、基因、蛋白質(zhì))、GenBank)、其它聯(lián)機(jī)檢索、教科書(shū)、論文、圖書(shū)館、科學(xué)演示文稿等。特別有意義的是被認(rèn)為和/或已知在避免細(xì)胞凋亡或在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中具有作用的鑒定的基因。因此，該方法可以進(jìn)一步包括確定基因是否與細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活有關(guān)。通常這可以通過(guò)在上述一種或多種資源中檢索該基因來(lái)進(jìn)行。具體而言，筌定的與細(xì)胞死亡有關(guān)的基因的上調(diào)和鑒定的與細(xì)胞存活有關(guān)的基因的下調(diào)符合它們與RGC死亡的相關(guān)性。該方法還可以進(jìn)一步包括驗(yàn)證所鑒定的基因在青光眼中的體內(nèi)作用。確定所鑒定的基因是否在體內(nèi)影響青光眼、慢性眼退化和/或RGC死亡可以幫助確認(rèn)該基因?yàn)榍喙庋壑委煹挠行О袠?biāo)。相應(yīng)地，可以在體內(nèi)降低上調(diào)的基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)或活性，或者可以在體內(nèi)提高下調(diào)的基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)或活性，并且例如測(cè)定對(duì)RGC死亡的作用(例如預(yù)防)。確定基因或蛋白質(zhì)在青光眼中的作是在防止RGC死亡和/或青光眼進(jìn)展中證明完全有效的水平，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以測(cè)定該水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，將基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)或活性升高或降低至正常水平(例如在沒(méi)有高眼壓、RGC死亡和/或青光眼的動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的水平)。在體內(nèi)降低(例如抑制)或提高基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)或活性可以用如以下"治療方法"部分所述的多種方法(例如誘變、小干擾RNA(siRNA)、反義核苷酸、曱基化/脫曱基化、中和抗體、顯性陰性多肽、擬肽)來(lái)實(shí)現(xiàn)。操作所鑒定的基因或蛋白質(zhì)(例如回到正常水平)的效果可以用一種或多種動(dòng)物模型(例如小鼠、大鼠、兔、狗、猴)來(lái)確定，如果成功，則最終在人類(lèi)患者中進(jìn)行確定。本發(fā)明還涉及通過(guò)上述方法鑒定的IPREG。因此，鑒定的IPREG滿(mǎn)足該方法確定的標(biāo)準(zhǔn)。此外，也可以確定所鑒定的IPREG是否與細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活有關(guān)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，通常通過(guò)確定將鑒定的IPREG的表達(dá)或活性增強(qiáng)或減弱(降低)至一定水平(例如正常水平)是否防止RGC死亡和/或青光眼進(jìn)展，來(lái)驗(yàn)證IPREG在RGC死亡和/或青光眼中的作用。治療方法相應(yīng)地，本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)異常上調(diào)的和/或下調(diào)的與青光眼有關(guān)的基因的方法。該方法涉及使用上述實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?即鞏膜外靜脈燒灼大鼠高眼壓模型)鑒定的那些具有已知功能(例如0C2巨球蛋白或雙載蛋白1)和未知功能(例如克隆rx05013或EST196604)的基因。本發(fā)明的方法用來(lái)治療哺乳動(dòng)物，特別是人類(lèi)。上述動(dòng)物模型良好地顯示了在人類(lèi)中見(jiàn)到的青光眼的特征，并且是一種用于在人體內(nèi)評(píng)價(jià)青光眼治療效果的良好模型。因此，本發(fā)明涉及一種通過(guò)施用有效量的組合物治療患青光眼的哺乳動(dòng)物的方法，該組合物抑制一種或多種上調(diào)的IPREG的表達(dá)或活性。特別是，該方法包括抑制一種或多種在基因陣列分析中鑒定的上調(diào)的基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些基因包括a2巨球蛋白、PSD-95/SAP90相關(guān)蛋白-4、Reggiel-l、RBCK、Gza、蛋白質(zhì)磷酸酶1Y、核糖體蛋白L23-相關(guān)產(chǎn)物、膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白、環(huán)核苷酸門(mén)控陽(yáng)離子通道、SPARC、和B-2芳基胺N-乙酰轉(zhuǎn)移酶。本文使用的抑制上調(diào)的IPREG的表達(dá)或活性的組合物或物質(zhì)是指由減少上調(diào)的IPREG的基因或表達(dá)基因產(chǎn)物(例如DNA、RNA或蛋白質(zhì))和/或抑制上調(diào)的IPREG的功能活性的任何物質(zhì)組成的組合物。降低IPREG基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)水平可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的許多方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，包括，例如，IPREG的沉默化(例如通過(guò)抑制特異性脫曱基酶)；定向破壞IPREG的正轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)(例如通過(guò)同源重組或誘變)；抑制IPREG的正轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)物的基因或基因產(chǎn)物(例如使用反義寡核苷酸、小干擾RNA、中和抗體、顯性陰性基因/多肽、擬肽)；提高IPREG的負(fù)轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)物的活性或表達(dá)(例如使用重組基因表達(dá)載體、重組病毒載體、合成肽、重組多肽、超等位基因/多肽)；或者抑制IPREG本身(例如使用反義寡核苦酸、小干擾RNA、中和抗體、顯性陰性基因/多肽、擬肽)。上調(diào)的IPREG的功能活性可以用數(shù)種方法阻斷，包括直接抑制IPREG蛋白的活性(例如通過(guò)使用中和抗體、小分子或擬肽、顯性陰性多肽)；抑制激活I(lǐng)PREG的基因和/或蛋白質(zhì)(例如通過(guò)阻斷基因和/或蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性)；激活抑制IPREG的基因和/或蛋白質(zhì)(例如通過(guò)提高基因和/或蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性)；抑制作為IPREG功能下游介質(zhì)的基因和/或蛋白質(zhì)(例如通過(guò)阻斷介質(zhì)基因和/或蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或活性)；引入負(fù)調(diào)節(jié)IPREG的基因和/或蛋白質(zhì)(例如通過(guò)使用重組基因表達(dá)載體、重組病毒載體、或重組多肽)；或者基因置換，例如，置換為IPREG的亞效等位突變體(例如通過(guò)同源重組、利用重組基因表達(dá)或病毒載體的過(guò)量表達(dá)，或者誘變)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，抑制性組合物可以針對(duì)作為IPREG的細(xì)胞受體或結(jié)合配偶體的蛋白質(zhì)。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，所抑制的IPREG是a2巨球蛋白，例如使用針對(duì)該蛋白質(zhì)的中和抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)拮抗其受體(例如LRP-1)或拮抗a2巨球蛋白功能的下游介質(zhì)(例如IPREGGzoc和/或NMDA受體)抑制ot2巨球蛋白，例如使用抑制性肽或擬肽。或者，可以抑制oc2巨球蛋白的結(jié)合配偶體(例如NGF),由此阻斷a2巨球蛋白的功能。類(lèi)似地，抑制性組合物可以針對(duì)上調(diào)的IPREG，例如PSD-95，或者與PSD-95形成復(fù)合物以共激活受體(例如NMDA受體)從而介導(dǎo)細(xì)胞死亡的基因和/或蛋白質(zhì)(例如Fyn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抑制性組合物可以針對(duì)其它a2巨球蛋白、Gza和/或PSD-95功能的下游介質(zhì)，例如，該組合物可以抑制上調(diào)的IPREGPP1。在該方法的一個(gè)實(shí)施方案中，為抑制一種或多種上調(diào)的IPREG而施用的組合物可以含有小干擾RNA、反義寡核苷酸、中和抗體、小分子、重組基因表達(dá)載體、重組基因病毒載體、合成肽、重組多肽、擬肽或IPREG調(diào)節(jié)區(qū)抑制劑。如前所述，該組合物的物質(zhì)可以直接或間接抑制IPREG的表達(dá)、蛋白質(zhì)表達(dá)或功能活性。該組合物可以在適當(dāng)?shù)乃幬镙d體中通過(guò)數(shù)種途徑之一施用，包括眼內(nèi)注射、局部結(jié)膜應(yīng)用、局部角膜應(yīng)用(例如滴眼劑、眼用凝膠)或者使用機(jī)械遞送裝置或眼部插入物。本發(fā)明還涉及一種治療哺乳動(dòng)物的青光眼的方法，包括給哺乳動(dòng)物施用有效量的提高一種或多種下調(diào)的IPREG的表達(dá)或活性的組合物。該方法還包括提高在基因陣列分析中鑒定的那些具有已知和未知功能的基因的表達(dá)，在該方法的一個(gè)實(shí)施方案中，下調(diào)的基因選自淀粉狀蛋白前體樣蛋白2、雙載蛋白1、Crybb2、Ras-相關(guān)p23、解旋酶Rap30、蛋白體rPA28亞單位P、ATPaseoc-l亞單位、(3A3/A1晶體蛋白、PA4晶體蛋白、S-腺香曱硫氨酸合酶、和天冬酰胺合酶。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，提高其表達(dá)或活性的IPREG是雙載蛋白1。如本文使用的提高下調(diào)的IPREG的表達(dá)或活性的組合物或物質(zhì)是指由增加下調(diào)的IPREG的基因或表達(dá)基因產(chǎn)物或提高下調(diào)的IPREG的活性庫(kù)(activepool)和/或活性的任何物質(zhì)組成的組合物。因此，該組合物可以包含防止IPREG沉默化(例如通過(guò)激活特異性脫曱基化酶)、破壞IPREG的負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)(例如通過(guò)同源重組或誘變)、抑制IPREG的負(fù)轉(zhuǎn)錄或翻"^奪調(diào)節(jié)物或IPREG功能的負(fù)調(diào)節(jié)物(例如使用反義寡核苷酸、小干擾RNA或中和抗體)、或者提高IPREG的正轉(zhuǎn)錄和/或翻譯調(diào)節(jié)物、IPREG功能的正調(diào)節(jié)物、IPREG本身或其下游介質(zhì)的表達(dá)(例如使用重組基因表達(dá)載體、重組病毒載體、合成肽或重組多肽)的任何物質(zhì)。相應(yīng)地，提高下調(diào)的IPREG的表達(dá)或活性的組合物可以包含一種或多種選自小干擾RNA、反義寡核苷酸、中和抗體、小分子、重組基因表達(dá)載體、重組基因病毒載體、合成肽、重組多肽、顯性陰性基因或多肽、擬肽和IPREG調(diào)節(jié)區(qū)激活劑的物質(zhì)。因此，該組合物可以直接或間接提高下調(diào)的IPREG的表達(dá)或功能活性。下調(diào)的IPREG的組合物治療青光眼或青光眼相關(guān)問(wèn)題的方法。例如，本發(fā)明涉及一種治療哺乳動(dòng)物的青光眼的方法，包括給哺乳動(dòng)物施用有效量的既抑制至少一種上調(diào)的IPREG的表達(dá)或活性又提高至少一種下調(diào)的IPREG的表達(dá)或活性的組合物。本發(fā)明還涉及一種通過(guò)給個(gè)體施用有效量的調(diào)節(jié)一種或多種IPREG的組合物預(yù)防由高IOP介導(dǎo)的RGC死亡的方法，該組合物抑制上調(diào)的IPREG的表達(dá)或活性或者提高下調(diào)的IPREG的表達(dá)或活性。類(lèi)似地，本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種通過(guò)給哺乳動(dòng)物施用有效量的調(diào)節(jié)一種或多種IPREG的組合物預(yù)防哺乳動(dòng)物的眼退化的方法，該組合物抑制一種或多種在慢性眼退化中上調(diào)的IPREG的表達(dá)或活性或者提高一種或多種在眼退化中下調(diào)的IPREG的表達(dá)或活性。在該方法的一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該組合物抑制的上調(diào)的IPREG包括選自下組的物質(zhì)oc2巨球蛋白、PSD-95/SAP90相關(guān)蛋白-4、Reggiel-l、RBCK、Gza、蛋白質(zhì)磷酸酶1Y、核糖體蛋白L23-相關(guān)產(chǎn)物、膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白、環(huán)核苷酸門(mén)控陽(yáng)離子通道、SPARC、和B-2芳基胺N-乙酰轉(zhuǎn)移酶，該組合物提高其表達(dá)的下調(diào)的IPREG包括選自下組的物質(zhì)淀粉狀蛋白前體樣蛋白2、雙載蛋白1、Crybb2、Ras-相關(guān)p23、解旋酶Rap30、蛋白體rPA28亞單位P、ATPasea-l亞單位、卩A3/A1晶體蛋白、(3A4晶體蛋白、S-腺苷甲硫氨酸合酶、和天冬酰胺合酶。在該方法中調(diào)節(jié)一種或多種IPREG的組合物可以包含任何直接或間接提高下調(diào)的IPREG的表達(dá)或功能和/或抑制上調(diào)的IPREG的表達(dá)或功能的物質(zhì)。因此，在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該組合物包含小干擾RNA、反義寡核苷酸、中和抗體、小分子、重組基因表達(dá)載體、重組基因病毒載體和重組多肽、擬肽、IPREG調(diào)節(jié)區(qū)抑制劑和IPREG調(diào)節(jié)區(qū)激活劑。上述組合物優(yōu)選地也在適當(dāng)?shù)乃幬镙d體中通過(guò)數(shù)種途徑之一施用，包括眼內(nèi)注射、局部結(jié)膜應(yīng)用、局部角膜應(yīng)用和使用機(jī)械遞送裝置。為了治療青光眼而抑制a2巨球蛋白(上調(diào)的IPREG)的有效性的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)表明，同時(shí)使用降眼內(nèi)壓藥物增強(qiáng)了通過(guò)抑制a2巨球蛋白見(jiàn)到的RGC存活(見(jiàn)表1和表2)。因此，所有治療方法都可以進(jìn)一步包括與施用IPREG調(diào)節(jié)組合物(例如抑制上調(diào)的IPREG的表達(dá)或活性和/或提高下調(diào)的IPREG的表達(dá)或活性)聯(lián)合，或者除此之外，施用幾種眼內(nèi)壓正常化藥物之一。眼內(nèi)壓正常化藥物可以在IPREG調(diào)節(jié)組合物治療的任意時(shí)間給藥；因此，眼內(nèi)壓正?；幬锟梢栽诮M合物治療的整個(gè)過(guò)程中連續(xù)給藥，也可以在有效量的組合物之前、之后或者同時(shí)給藥。由于人類(lèi)患者更可能已經(jīng)接受降眼內(nèi)壓藥物治療，因此除任意降眼內(nèi)壓藥物以外，可以以本領(lǐng)域才支術(shù)人員認(rèn)為對(duì)于有效治療患者合適的間隔施用IPREG調(diào)節(jié)組合物。有多種藥物可以在這些方法中用來(lái)降低眼內(nèi)壓，包括非選擇性pi腎上腺素受體阻斷劑、選擇性pi腎上腺素受體阻斷劑、前列腺素、前列腺素類(lèi)似物、碳酸酐酶抑制劑、docosanoid、腎上腺素能激動(dòng)劑、膽堿能藥物和縮瞳藥。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，降眼內(nèi)壓藥物使用選擇性P1腎上腺素受體阻斷劑倍他洛爾。劑量和合適的載體根據(jù)本發(fā)明的方法，有效量的調(diào)節(jié)IPREG(即抑制其表達(dá)或活性和/或提高其表達(dá)或活性)的組合物可以在可接受的藥物載體中通過(guò)適當(dāng)?shù)耐緩?例如眼內(nèi)注射、局部結(jié)膜應(yīng)用、局部角膜應(yīng)用或4吏用機(jī)械遞送裝置)單獨(dú)地或與其他藥物聯(lián)合給哺乳動(dòng)物施用。藥物組合物的有效量是在給藥條件下足以達(dá)到所需治療或預(yù)防效果的量，例如，減輕和/或阻止RGC凋亡及青光眼進(jìn)展的組合物給藥量。組合物可以作為單劑量或多劑量給藥，以確?；颊咴谥委熎陂g保持組合物的治療顯著水平。劑量可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法確定，并且取決于為組合物選擇的具體藥物、對(duì)象年齡、體重、對(duì)藥物的敏感性和耐受性和總體健康狀況。組合物的制劑根據(jù)選擇的給藥途徑而不同(例如溶液或乳劑)。合適的藥物載體可以含有不與組合物中的調(diào)節(jié)性物質(zhì)相互作用的惰性成分?？梢?吏用標(biāo)準(zhǔn)藥物配制沖支術(shù)，如Remington'sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCompany,Easton，PA中所述的技術(shù)。用于腸胃外給藥的合適的藥物載體包括，例如，無(wú)菌水、生理鹽水、抑菌鹽水(含有大約0.9%mg/ml的苯曱醇的鹽水)、磷酸鹽緩沖液、漢克斯液、林格乳酸鹽等。診斷方法和試劑盒本發(fā)明還涉及允許醫(yī)生診斷青光眼或青光眼相關(guān)問(wèn)題的方法。高IOP的發(fā)生難以預(yù)測(cè)，通常，患者的結(jié)果是長(zhǎng)期暴露于高IOP,時(shí)間長(zhǎng)度足以發(fā)生顯著的眼退化，即在醫(yī)生發(fā)現(xiàn)和/或證明高水平的IOP之前。存在幾種鑒定的IPREG,其蛋白質(zhì)產(chǎn)物顯示伴隨的表達(dá)水平增加(上調(diào)的IPREG)或降低(下調(diào)的IPREG)(例如a2巨球蛋白、雙載蛋白l和Gzoc)。此外，許多IPREG蛋白是可溶性的，在眼睛的房水中可^f全測(cè)到(例如a2巨J求蛋白)。眼睛的房水可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)外科操作從患者采集。然后可以利用本領(lǐng)域公知的任何方法檢測(cè)房水中的可溶性蛋白質(zhì)，包括免疫沉淀法、免疫印跡法、免疫熒光法、色譜法(HPLC、離子交換或凝膠過(guò)濾)或比活性法(例如可檢測(cè)標(biāo)記的底物的酶切和/或結(jié)合)，并對(duì)檢測(cè)到的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平進(jìn)行定量。例如，圖5顯示了在青光眼病人眼睛的房水中，a2巨球蛋白的表達(dá)可被才企測(cè)到，并且顯著上調(diào)。因此，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)患者的慢性眼退化的方法，包括測(cè)定患者房水中的一種或多種IPREG蛋白的表達(dá)水平，并將測(cè)定的一種或多種IPREG蛋白的表達(dá)水平與具有正常眼功能的個(gè)體中相同的一種或多種IPREG蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行比較，在慢性眼退化個(gè)體中上調(diào)的IPREG蛋白的較高的表達(dá)水平或在慢性眼退化個(gè)體中下調(diào)的IPREG蛋白的較低的表達(dá)水平表示該患者具有慢性眼退化。一種或多種IPREG蛋白的表達(dá)水平可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇的上述任何方法來(lái)測(cè)定，并且可以與使用相同方法在具有正常眼功能的個(gè)體中(例如)或者在具有在特征上(例如在分子上)不同于青光眼的眼部病癥的個(gè)體中測(cè)定的相同的一種或多種IPREG蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行比較。一種或多種IPREG蛋白的對(duì)照和/或正常表達(dá)水平可以在測(cè)定患者的同時(shí)在來(lái)自正常個(gè)體的樣品中測(cè)定，或者用于比較的表達(dá)水平可以是以前為4吏用的具體方法建立的已知的、定量的標(biāo)準(zhǔn)。在該方法中可以測(cè)定通過(guò)基因陣列分析鑒定的一種或多種或者甚至全部IPREG的表達(dá)水平，在一個(gè)具體實(shí)施方案中，測(cè)定其表達(dá)水平的IPREG蛋白是oc2巨球蛋白和雙載蛋白1。對(duì)患者中RGC應(yīng)激狀態(tài)的了解對(duì)于醫(yī)生確定和/或說(shuō)明青光眼的嚴(yán)重程度和進(jìn)展是重要的。因此，本發(fā)明還涉及一種檢測(cè)患者中的RGC應(yīng)激發(fā)生的方法，包括在最初時(shí)間點(diǎn)測(cè)定患者房水中一種或多種IPREG蛋白的表達(dá)水平；在以后的時(shí)間點(diǎn)測(cè)定患者房水中相同的一種或多種IPREG蛋白的表達(dá)水平；并且將在最初時(shí)間點(diǎn)測(cè)定的一種或多種IPREG蛋白的表達(dá)水平與在以后時(shí)間點(diǎn)測(cè)定的表達(dá)水平進(jìn)行比較，一種或多種上調(diào)的IPREG蛋白的較高的表達(dá)水平和/或一種或多種下調(diào)的IPREG蛋白的較低的表達(dá)水平表示患者中發(fā)生了RGC應(yīng)激。一種或多種IPREG蛋白的表達(dá)水平可以如前所述在患者的房水中測(cè)定和定量(例如使用免疫化學(xué)法、色譜法或比活性法)。進(jìn)一步地，眾所周知由于許多環(huán)境和遺傳因素，個(gè)體對(duì)具體療法可能有不同的反應(yīng)。因此，本發(fā)明還涉及利用與療效相關(guān)聯(lián)的IPREG改變來(lái)預(yù)測(cè)具體青光眼治療為有效的可能性的方法，特別是，預(yù)測(cè)針對(duì)個(gè)體中的一種或多種具體IPREG對(duì)于青光眼治療將有用和/或成功的可能性。因此，在一方面，該方法涉及利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何核苷酸分析方法(例如SNP、焚光原位雜交(FISH)、測(cè)序、PCR或錯(cuò)配4企測(cè)分析)4全測(cè)生物樣品(例如血液、細(xì)胞或唾液)中已確定/已知是青光眼療效標(biāo)記物的IPREG的遺傳改變(例如基因復(fù)制、缺失、重組、轉(zhuǎn)座或序列突變)。另一方面，該方法涉及利用上述方法(例如免疫化學(xué)方法、色譜法或底物相互作用)或本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其他方法測(cè)定生物樣品(例如房水或細(xì)胞)中已確定其表達(dá)/活性與特定青光眼治療成功有關(guān)的IPREG蛋白的表達(dá)水平和/或活性。也可以制備用于檢測(cè)生物樣品(例如房水)中IPREG蛋白的表達(dá)水平的試劑盒。這樣的試劑盒可以包括可與一種或多種IPREG蛋白結(jié)合的抗體或功能片段，以及適合檢測(cè)抗體(或抗體片段)與一種或多種IPREG蛋白之間的復(fù)合體的存在的輔助試劑?？贵w組合物可以作為凍干形式提供，其單獨(dú)提供或者與對(duì)所檢測(cè)的一種或多種IPREG蛋白的其它表位具有特異性的其它抗體組合。試劑盒中可以包括抗體(可以標(biāo)記或者不標(biāo)記)以及輔助成分(例如緩沖液、穩(wěn)定劑、賦形劑、殺生物劑和/或惰性蛋白質(zhì)，例如牛血清白蛋白)。例如，抗體可以作為與輔助成分混合的凍干混合物提供，或者輔助成分可以單獨(dú)提供，由使用者組合使用。通常，基于活性抗體的含量，這些輔助物質(zhì)的含量低于大約5%重量，通?；诳贵w的濃度，總量至少為大約0.001%重量。當(dāng)使用一種或多種能夠與一種或多種IPREG蛋白反應(yīng)性抗體結(jié)合的第二抗體(例如二級(jí)抗體)時(shí)，這些抗體可以在試劑盒中提供，例如，在第二個(gè)小瓶或容器中提供。如果存在，則第二抗體一般被標(biāo)記，并且可以通過(guò)與上述抗體制劑類(lèi)似的方法進(jìn)4于配制。試劑盒的成分(例如抗a2巨J求蛋白抗體或抗體片段和輔助試劑)可以單獨(dú)包裝或者一起包裝在合適的容器(例如瓶、盒、封套或管)中。藥物組合物本發(fā)明還涉及在本發(fā)明方法中用于治療哺乳動(dòng)物或患者的藥物組合物。因此，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其含有有效量的至少一種抑制一種或多種上調(diào)的IPREG的表達(dá)或活性的物質(zhì)(例如分子、化合物、多肽)和藥物可接受的載體，其中施用該組合物以治療青光眼。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，藥物組合物還用來(lái)治療慢性眼退化或RGC死亡。該藥物組合物可以包含小千擾RNA、反義寡核苷酸、中和抗體、小分子、重組基因表達(dá)載體、重組基因病毒載體、合成肽、重組多肽、擬肽和IPREG調(diào)節(jié)區(qū)抑制劑。被藥物組合物抑制的上調(diào)的IPREG可以是在基因陣列分析中鑒定的具有已知或未知功能的那些IPREG之一(見(jiàn)表2)。本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，其含有有效量的至少一種提高一種或多種下調(diào)的IPREG的表達(dá)或活性的物質(zhì)和藥物可接受的載體，其中施用該組合物以治療青光眼。在一個(gè)實(shí)施方案中，該藥物組合物包含提高在基因陣列分析中發(fā)現(xiàn)下調(diào)的1PREG的表達(dá)或活性的物質(zhì)(例如分子、化合物、多肽)，該組合物可以包含小干擾RNA、反義寡核苷酸、中和抗體、小分子、重組基因表達(dá)載體、重組基因病毒載體、重組多肽、擬肽和IPREG調(diào)節(jié)區(qū)激活劑。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種藥物組合物，其含有有效量的至少一種抑制一種或多種上調(diào)的IPREG的表達(dá)或活性的物質(zhì)和至少一種提高一種或多種下調(diào)的IPREG的表達(dá)或活性的物質(zhì)和藥物可接受的載體，其中施用該組合物以治療青光眼，在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，治療慢性眼退化或RGC死亡。該藥物組合物針對(duì)的IPREG可以是在使用任何有效和適當(dāng)改變IPREG表達(dá)的物質(zhì)的基因陣列分析中確定具有顯著改變的表達(dá)的任何IPREG。如前所述，藥物組合物可以通過(guò)幾種途徑之一給藥，包括眼內(nèi)注射、局部結(jié)膜應(yīng)用、局部角膜應(yīng)用或使用機(jī)械遞送裝置。實(shí)施例實(shí)施例1.眼內(nèi)壓調(diào)節(jié)基因眼內(nèi)壓的誘導(dǎo)葛/(9尸.在麻醉下進(jìn)行大鼠眼睛鞏膜外層燒灼。結(jié)膜切開(kāi)后，分離眼外肌，根據(jù)定位、相對(duì)固定性、較大管徑和分支模式確定角膜緣主引流靜脈。用30"燒灼頭對(duì)右眼三根鞏膜外血管進(jìn)行燒灼。每只動(dòng)物的左眼在假手術(shù)(結(jié)膜切開(kāi)而不進(jìn)行燒灼)后用作正常IOP對(duì)照。豸亞IOP用TonopenXL眼壓計(jì)在光麻醉(肌內(nèi)注射4mgkg氯胺酮、0.32mg/kg賽拉嗪和0.4mg/kg乙酰丙嗪)下進(jìn)行測(cè)量。與其它儀器相比Tonopen讀數(shù)的精度(甚至在麻醉下)已經(jīng)得到確定。大鼠在麻醉下的平均正常IOP為12mmHg(范圍為10-14mmHg)，在燒灼的眼中升高至穩(wěn)定的平均值21mmHg(范圍為18-24mmHg)超過(guò)4個(gè)月。這些數(shù)值與以前發(fā)表的數(shù)據(jù)相符。無(wú)論燒灼左眼還是右眼，其IOP沒(méi)有差異(數(shù)據(jù)未顯示)；因此，為了便于記錄和管理而選擇右側(cè)。利用平面檢眼鏡檢查證實(shí)IOP升高的視網(wǎng)膜為正常灌注。燒灼使IOP升高大約1.7倍。證明這種升高與人開(kāi)角型青光眼的相關(guān)性高于其他模型，其他模型使壓力升高>2倍，并且通常導(dǎo)致局部缺血。葛的秀參/夢(mèng)瓶.每日作為滴眼劑應(yīng)用選擇性3-阻斷劑(0.5%倍他洛爾，Alcon)。如示(例如在燒灼3天后)開(kāi)始局部應(yīng)用倍他洛爾，在3天后導(dǎo)致IOP完全正?；Ｖ笤趹?yīng)用倍他洛爾的情況下IOP繼續(xù)保持正?；＠?，當(dāng)從燒灼后第3天開(kāi)始應(yīng)用倍他洛爾時(shí)，眼睛從第1天至第6天具有高IOP，從第7天開(kāi)始具有正?；腎OP。倍他洛爾對(duì)于正常眼睛的IOP沒(méi)有顯著性影響。通過(guò)燒灼一只眼的三根鞏膜外血管以減少房水流出，在大鼠眼睛中誘導(dǎo)高IOP,并且對(duì)側(cè)眼進(jìn)行假手術(shù)，用作對(duì)照(圖1A)。在靜脈燒灼后3、7、14、21和28天，燒灼眼的IOP顯著高于對(duì)照眼(pSO.Ol)。青光眼眼睛的平均IOP大約為21mmHg,相比而言，正常眼睛的平均IOP大約為12.6mmHg。每天用倍他洛爾局部治療減少了房水的產(chǎn)生，并且降低了燒灼誘導(dǎo)的高IOP,但是對(duì)于對(duì)側(cè)眼的正常IOP沒(méi)有顯著影響(見(jiàn)圖1A)。從燒灼后第3天開(kāi)始的倍他洛爾給藥使高IOP從第7天開(kāi)始完全正?；?。用倍他洛爾治療的燒灼的眼睛與應(yīng)用或不應(yīng)用倍他洛爾的對(duì)照眼睛的IOP沒(méi)有顯著性差異(圖1A)。高IOP誘導(dǎo)的RGC死亡靜脈燒灼導(dǎo)致的慢性高IOP以恒定速度引起積累性RGC損失(RudinskiM等人，JiVewro6/0/58:341-354，2004)。使用標(biāo)記視網(wǎng)膜內(nèi)RGC體的逆行示蹤劑(retrogradetracer),我們證實(shí)在燒灼后3、4、5周，平均RGC損失為大約15%、20%和27%。在燒灼后6周，平均RGC損失為大約35%(未顯示)。用倍他洛爾使IOP正?；档土薘GC損失的平均速度，但沒(méi)有阻止RGC損失(圖1B)。在所示的實(shí)驗(yàn)中，每日倍他洛爾給藥使IOP從第7天開(kāi)始正?；?。因此，短期(大約1周)暴露于高IOP觸發(fā)了較低的但是顯著的RGC損失速度，但是這種死亡不依賴(lài)于持續(xù)的高IOP。這些動(dòng)物數(shù)據(jù)復(fù)制了報(bào)道的用藥物降低IOP的患者的視野損失，所述視野損失在3年時(shí)影響了25%的患者，在10年時(shí)影響了超過(guò)70%的患者(KassMA等人，y^c/z0;似/7a/wo/107:1590-1598，1989;O'BrienC等人，爿m/(9盧/z"/歸/111:491-500，1991)。視神經(jīng)軸突切開(kāi)術(shù)誘導(dǎo)的RGC死亡為了與青光眼(為慢性眼內(nèi)損傷)進(jìn)行對(duì)比，研究了視神經(jīng)軸突切開(kāi)術(shù)，這是一種急性眼外損傷。對(duì)于視神經(jīng)軸突切開(kāi)術(shù)，在4天后見(jiàn)到最低的但是可檢測(cè)到的RGC死亡，在損傷后10天發(fā)現(xiàn)大約40%的RGC(BerkelaarM等人，《/A^wra"/14:4368-4374，1994;DiPoloA等人，/Voc脂/々W95:3978-3983,1998)。由于青光眼和軸突切開(kāi)體內(nèi)模型導(dǎo)致相當(dāng)?shù)腞GC損失，在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，將誘導(dǎo)高IOP后的第28天與視神經(jīng)軸突切開(kāi)術(shù)后的第4天進(jìn)行比較，將誘導(dǎo)高IOP后的第42天與視神經(jīng)軸突切開(kāi)術(shù)后的第10天進(jìn)行比較。眼內(nèi)壓調(diào)節(jié)早期基因(IPREG)7A^使用TRIZOL(LifeTechnologies)從視網(wǎng)膜組織分離總RNA。匯集屬于相同實(shí)驗(yàn)組的三個(gè)視網(wǎng)膜進(jìn)行基因微陣列實(shí)驗(yàn)。然后用RNAEASY(QIAGEN⑧)進(jìn)一步純化RNA。RNA樣品的完整性通過(guò)使用2100生物分析儀(Agilent)在RNA6000NanoLabChip(Agilent)上運(yùn)行試樣份進(jìn)行評(píng)價(jià)。凝^,染Jt.探針合成、雜交和掃描按照Affymetrix的方案在McGillUniversity和GenomeQuebecInnovationCentre進(jìn)行。對(duì)于所示的實(shí)驗(yàn)，使用大鼠U34基因組陣列(8,700種基因，Affymetrix)。簡(jiǎn)而言之，首先將RNA樣品轉(zhuǎn)化為雙鏈cDNA(T7-(dT)24引物(Genset))。然后純化cDNA，并用來(lái)產(chǎn)生生物素化的cRNA探針(BioarrayHighYieldRNA轉(zhuǎn)錄物標(biāo)記試劑盒(Enzodiagnostics))。將一份純化的cRNA在RNA6000NanoLabChip(Agilent)上分析，以證實(shí)完整性和大小分布。雜交后立即將芯片置于AffymetrixGeneChipFluidicsStation400(Affymetrix)上?？偣策M(jìn)行10次低嚴(yán)才各條件的洗滌(63SSPE,0.01%Tween-20，0.005%消泡劑)和4次高嚴(yán)格條件的洗滌(IOOmMMES,0.1MNaCl，0.01%Tween-20，50C)(所有試劑均來(lái)自Sigma)。然后將陣列與SAPE(鏈霉抗生物素/藻紅蛋白染料，MolecularProbes)—起孵育，然后進(jìn)行10次低嚴(yán)格條件的洗滌。將陣列與生物素化的抗鏈霉抗生物素抗體(VectorLaboratories)—起孵育，并再進(jìn)行15次低嚴(yán)格條件的洗滌。將陣列置于AgilentGeneArray掃描儀2500(Affymetrix)中檢測(cè)特異性結(jié)合的探針。用MicroarrayAnalysisSuite5.0版(Affymetrix)分析掃描的圖像。借助于KensingtonDiscoveryEdition1.8版(Inforsense)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。小心切下視網(wǎng)膜，以確保只制備視網(wǎng)膜mRNA進(jìn)行基因微陣列研究。從假手術(shù)的眼睛(正常IOP對(duì)照，第1組)、高IOP第28天的眼睛(檢測(cè)，第2組)和燒灼并從第3天起每日倍他洛爾治療的第28天的眼睛(第3組)獲得樣品。在第3組中，到第7天高IOP回歸正常水平。來(lái)自每一組(每組n-4)的樣品用基因微陣列進(jìn)行研究(見(jiàn)圖2的流程圖)。利用2.5倍的截?cái)嘀祦?lái)得到顯著性(p<0.05)。最初的分析集中于具有高IOP的視網(wǎng)膜(第2組)和正常IOP的視網(wǎng)膜(第1組)之間的差異表達(dá)。在第2組中，在高IOP的第28天時(shí)，32種基因的表達(dá)顯著改變，一些降低，而另外一些升高。這些基因是推斷的眼內(nèi)壓調(diào)節(jié)早期基因(IPREG)(表l)。表1.基因陣列結(jié)果。cDNA-陣列數(shù)據(jù)比較了高IOP第28天(A列)和燒灼28天但是只經(jīng)歷7天高IOP(從第4天至第28天施用倍他洛爾)的正常IOP(B歹'j)眼睛相對(duì)于正常IOP的改變。兩種情況都顯示相對(duì)于未燒灼的眼睛具有改變。相對(duì)于未燒灼的眼睛的相對(duì)改變名稱(chēng)Genebank推斷的功能燒灼的燒灼+_弓—高IOPA倍他洛爾B信號(hào)途徑1(x2巨球蛋白M23566多功能16.35.62cDNA克隆rx00382AI639155曱基轉(zhuǎn)移酶7.67.23PSD-95/SAP卯相關(guān)蛋白-4U67140受體銜接蛋白5.8-1.04Reggie1-1AF023302RGC再生3.91.85RBCKAB0U369PKCl-相關(guān)3.21.36GzaU77483信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)2.81.17蛋白質(zhì)磷酸酶1yS78217信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)2.62.58淀粉狀蛋白前體樣蛋白2X77934多功能-2.61.19雙載蛋白1Y13381胞吞作用-2.8-1.110Crybb2X83671轉(zhuǎn)錄因子-3.3-1.011Ras-相關(guān)p23X12535存活/凋亡-4.01.1結(jié)構(gòu)蛋白12cDNA克隆rx01295AI639375富含WD的蛋白質(zhì)6.94.813核糖體蛋白L23-相關(guān)產(chǎn)物U62635核糖體蛋白質(zhì)6.53.814克隆RKIAS43AA892520嚢泡蛋白質(zhì)5.12.915膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白AF028784膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記4.01.416環(huán)核苦酸門(mén)控陽(yáng)離子通道AJ000515感覺(jué)通道4.03.417SPARCU759282.61.918解旋酶RAP30L01267DNA修復(fù)-2.81.219蛋白體rPA28亞單位(3AA892801蛋白質(zhì)降解-2.920ATPasea-l亞單位M74494ATPase-3.31.521pA3/A1晶體蛋白X15143伴侶蛋白-3.6-1.122pA4晶體蛋白AFO13247伴侶蛋白-5.7代謝途徑23B-2芳基胺N-乙酰轉(zhuǎn)移酶U01347褪黑激素合成4.4丄524cDNA克隆rx05013AI639441起始因子3.82.825S-腺苦曱硫氨酸合酶J05571曱基供體-2.71.126天冬酰胺合酶U07201Asn合成-2.8-1.1EST27克隆rx05013AI6394413.828克隆rX03980AI6392072.629EST189275AA7997782.530克隆rx01612AI639465-2.631EST213677AI104388-2.632EST196604AA892801-3.033克隆rx01394AI639406-5.1對(duì)正常IOP(第1組)和7天具有高IOP、另外21天具有正常IOP的燒灼的眼睛(第3組)進(jìn)行了進(jìn)一步的比較，證明大多數(shù)候選IPREG具有完全正常的表達(dá)。它們的表達(dá)與正常IOP視網(wǎng)膜沒(méi)有不同。這些基因表達(dá)的正?；陌l(fā)生可能是由于i)RGC應(yīng)激/死亡被阻止，ii)改變的表達(dá)需要高眼壓持續(xù)28天，或者iii)改變的表達(dá)短期存在。然而重要的是，盡管IOP完全正?；窍鄬?duì)于正常IOP視網(wǎng)膜，8種候選IPREG仍保持顯著改變的表達(dá)(表2)。雙載蛋白、AMPLP-2、(3A4晶體蛋白和ras-相關(guān)p23的表達(dá)下調(diào)，oc2巨球蛋白、Gzoc、PTP-ly、reggiel-1和PSD95/SAP90相關(guān)蛋白4的表達(dá)上調(diào)。從第7天到第28天的IOP正?；瘺](méi)有逆轉(zhuǎn)3種基因(克隆rX00382、蛋白質(zhì)磷酸酶-1y和環(huán)核苷酸門(mén)控陽(yáng)離子通道)的表達(dá)的改變；只是部分逆轉(zhuǎn)了5種基因(oc2巨球蛋白、Reggie1.1、克隆rX01295和rX05(M3、核糖體蛋白L23相關(guān)產(chǎn)物和嚢泡蛋白克隆RKIAS43)的表達(dá)的改變；但是完全逆轉(zhuǎn)了Gza的上調(diào)(表2)。表2.滿(mǎn)足IPREG標(biāo)準(zhǔn)的選擇的基因從表1中列出了滿(mǎn)足所有IPREG標(biāo)準(zhǔn)的基因。也選擇了其他部分滿(mǎn)足標(biāo)準(zhǔn)的基因。*表示神經(jīng)元特異性蛋白質(zhì)，而其它蛋白質(zhì)在其它細(xì)胞型中表達(dá)。半定量RT-PCR所示的數(shù)據(jù)代表3個(gè)獨(dú)立的研究。確定具有等量的mRNA和相等的凝膠加樣量(數(shù)據(jù)未顯示)。通過(guò)定量RT-PCR證實(shí)名稱(chēng)完全標(biāo)準(zhǔn)a2巨3求蛋白cDNA克隆rx00382Reggiel-l蛋白質(zhì)磷酸酶1y*推斷的功能正常IOP10P第28天多功3匕曱基轉(zhuǎn)移酶蛋白R(shí)GC再生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)cDNA克隆rx01295*核糖體蛋白L23-相關(guān)產(chǎn)物克隆RKIAS43環(huán)核苷酸門(mén)控陽(yáng)離子通道cDNA克隆rx05013部分標(biāo)準(zhǔn)PSD-95/SAP90相關(guān)蛋白-4*受體活性的銜接蛋白富含WD的蛋白質(zhì)核糖體蛋白質(zhì)囊泡蛋白質(zhì)感覺(jué)通道起始因子Gza淀粉狀蛋白前體樣蛋白2*雙載蛋白1*信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)多功能胞吞作用解旋酶RAP30DNA修復(fù)重要的是注意到其表達(dá)在倍他洛爾治療后21天完全正?；幕?例如Gza)仍然可以是令人感興趣的候選者。這些基因也可能長(zhǎng)期存在，盡管時(shí)間短于在我們的實(shí)驗(yàn)例中研究的IOP正?；?1天(例子見(jiàn)表3)。表3.用中和抗體針對(duì)a2巨球蛋白的青光眼治療。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)表示至少6只眼睛的平均值(土sd)。通過(guò)染料從SC逆行進(jìn)行RGC標(biāo)記。"-"表示"未治療"。眼壓不被眼內(nèi)注射影響。<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>這些數(shù)據(jù)表明8種基因的視網(wǎng)膜表達(dá)的改變需要7天或者更短時(shí)間的視網(wǎng)膜對(duì)高IOP的暴露。此外，在沒(méi)有高眼壓的隨后的21天，表達(dá)持續(xù)改變，表明這種改變是長(zhǎng)期的。視網(wǎng)膜基因表達(dá)的改變被認(rèn)為先于RGC損失，因?yàn)樵谠摾蠷GC死亡最少。因此，這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)烈提示這些基因可能與RGC死亡有關(guān)，特別是與IOP正?；罄^續(xù)的RGC死亡有關(guān)?；蛭㈥嚵械拇_認(rèn)動(dòng)力學(xué)分析.所有研究(基因陣列、rt-pcr、Northern印跡法、Western印跡法、逆行標(biāo)記的RGC的計(jì)li)都是對(duì)在術(shù)后指定天數(shù)從對(duì)照(假手術(shù)的)或燒灼的眼睛中新鮮分離的視網(wǎng)膜進(jìn)行的。wr-尸c兄在指定的天數(shù)切下對(duì)照、高iop或軸突切開(kāi)的動(dòng)物的視網(wǎng)膜。提取總視網(wǎng)膜RNA(Trizol,GIBCO)，消化DNA(Dnase,擴(kuò)增級(jí)，GIBCO)，在第二次Trizol提取后再次純化樣品。對(duì)于RT-PCR分析，使用單視網(wǎng)膜0=3-5)。利用1pg總視網(wǎng)膜RNA和特異性引物(SIGMA)產(chǎn)生互補(bǔ)cDNA。cDNA的PCR擴(kuò)增用每種基因的特異性引物進(jìn)行。對(duì)于PCR,使用半定量PCR分析的嚴(yán)格條件。在總共30個(gè)循環(huán)后獲得候選基因的線(xiàn)性擴(kuò)增，而(3-肌動(dòng)蛋白(用作內(nèi)部控制)在18個(gè)循環(huán)后在線(xiàn)性范圍內(nèi)。在三個(gè)獨(dú)立的使用三種獨(dú)立制備的RNA樣品的RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，用STORM840成像系統(tǒng)掃描用來(lái)分析PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠，并且用imagequant分析軟件進(jìn)行定量分析。讀數(shù)為平均值士SEM，每組(正常的IOP和高IOP)中每一基因產(chǎn)物的數(shù)據(jù)對(duì)于作為內(nèi)部控制的(3-肌動(dòng)蛋白(100%)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。視網(wǎng)膜P-肌動(dòng)蛋白mRNA的表達(dá)水平不隨著高IOP的提高而改變(數(shù)據(jù)未顯示)。為了證實(shí)基因微陣列分析的結(jié)果，用某些候選IPREG的特異性引物對(duì)進(jìn)行定量RT-PCR。用獨(dú)立分離的^f見(jiàn)網(wǎng)膜mRNA樣品進(jìn)行的幾項(xiàng)RT-PCR實(shí)驗(yàn)定量地證實(shí)了雙載蛋白、AMPLP-2、PA4晶體蛋白和ras相關(guān)p23的下調(diào)，以及oc2巨球蛋白、Gzoc、PTP-ly、reggiel-l和PSD95/SAP90相關(guān)蛋白4的上調(diào)(見(jiàn)表3，有些數(shù)據(jù)未顯示)。選擇ot2巨球蛋白進(jìn)行進(jìn)一步的研究。對(duì)視網(wǎng)膜oc2巨球蛋白mRNA的Northern印跡分析顯示高IOP第28天比正常IOP高大約3倍(p0.001)。這種增加被倍他洛爾治療略微減弱，但是相對(duì)于正常IOP仍然顯著增加。相反，接受或未接受倍他洛爾治療的正常IOP的對(duì)照視網(wǎng)膜具有正常的和相當(dāng)?shù)腶2巨球蛋白mRNA(圖3)。高眼壓對(duì)IPREG的特異性調(diào)節(jié)^^^經(jīng)祐爻勿矛^.用賽拉嗪、乙酰丙。秦和乙酰丙嗪的混合物麻醉250-300克的雌性Wistar大鼠。通過(guò)切開(kāi)背側(cè)眼窩并部分去除淚腺和眼眶脂肪接近眼球。通過(guò)分離上直肌然后切開(kāi)眼牽縮肌顯現(xiàn)視神經(jīng)(ON)。在ON的眼球出口后5mm處形成縱向腦膜切口，避開(kāi)血管，以使視網(wǎng)膜循環(huán)不受影響。在眼球出口后5mm進(jìn)行ON切開(kāi)術(shù)，以使視神經(jīng)頭不受影響。所有動(dòng)物操作都由McGill動(dòng)物福利委員會(huì)(McGillAnimalWelfareCommittee)糸匕準(zhǔn)。^^s^7伊遊為、V《將一個(gè)視網(wǎng)膜勻漿化并且裂解(150mMNaCl,50mMTrispH8.0,2%NP-40,PMSF，亮抑酶肽和抑肽酶)45分鐘。離心除去核和碎片后，使用試劑盒(BIORAD)測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)的濃度。每泳道15g視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)在12%SDS-PAGE上分級(jí)分離，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用山羊抗大鼠a2巨球蛋白的多克隆抗體(Sigma和Calbiochem)檢測(cè)oc2巨球蛋白。使用純大鼠a2巨球蛋白(Sigma)作為對(duì)照。用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)-偶聯(lián)的抗體作為第二試劑。免疫反應(yīng)性帶用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光法(NEN)顯示。為了確定高眼壓，而不是RGC死亡，是基因表達(dá)的特異性調(diào)節(jié)物，將青光眼模型與視神經(jīng)軸突切開(kāi)模型進(jìn)行比較。視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)的定量western印跡分析用來(lái)自正常IOP、高IOP第28天和ON軸突切開(kāi)術(shù)第4天的樣品進(jìn)行。對(duì)于每種模型選擇這些時(shí)間點(diǎn)研究顯著RGC死亡之前的分子改變。在高IOP中，視網(wǎng)膜a2巨球蛋白表達(dá)顯著上調(diào)2.3倍，但是在視神經(jīng)軸突切開(kāi)中沒(méi)有改變(圖4)。相反，在青光眼和視神經(jīng)軸突切開(kāi)模型中，Gza蛋白(分別增加64%和43%)和雙載蛋白(在兩種模型中減少大約30%)的視網(wǎng)膜水平具有相當(dāng)?shù)母淖儭Ｒ虼?，Gza和雙載蛋白的改變不被高IOP特異性調(diào)節(jié)；實(shí)際上，它們可能是RGC損傷的標(biāo)記物，而a2巨球蛋白被高眼壓特異性誘導(dǎo)。實(shí)施例2.a2巨球蛋白在青光眼中的作用的驗(yàn)證a2巨球蛋白及其受體在視網(wǎng)膜中的定位逆/戶(hù)AGC標(biāo)記.用3%DII(1,1-雙十八烷基-3,3，3，3-四甲基吲味碳菁高氯酸鹽)或3%熒光金標(biāo)記RGC。簡(jiǎn)要地說(shuō)，麻醉Wistar大鼠，并將它們的頭固定在立體定向儀上。暴露兩個(gè)上丘(SC),將染料注入到每個(gè)半;求的SC處的兩個(gè)相鄰部位(前自后5.8mm，側(cè)向1.0mm,第一次染料溶液釋放深4.5mm，第二次釋放深3.5mm)。平鋪固定的視網(wǎng)膜和PGC計(jì)數(shù).染料注入后7天，灌注固定大鼠的脈管系統(tǒng)(經(jīng)心臟灌注磷酸鹽緩沖液(PB),然后是4%的PB中的PFA),并摘出眼睛。后固定1小時(shí)后穿過(guò)鞏膜形成切口，形成馬爾他十字圖案，并且從視神經(jīng)頭處的視神經(jīng)乳頭凹陷(eyecup)上剝離視網(wǎng)膜。將視網(wǎng)膜平鋪固定在載玻片上(玻璃體側(cè)向上)，風(fēng)干，并且覆蓋以固定基質(zhì)(MolecularProbes)。在熒光顯微鏡(Zeiss)下觀察視網(wǎng)膜。對(duì)于每個(gè)視網(wǎng)膜，每四分之一區(qū)域以20倍拍攝四張數(shù)碼圖片(上、下、鼻側(cè)和顳側(cè))。根據(jù)逆向運(yùn)輸?shù)娜玖系拇嬖诤托螒B(tài)學(xué)識(shí)別平鋪固定的視網(wǎng)膜中的RGC。將所有四個(gè)四分之一區(qū)域中的RGC(每個(gè)視網(wǎng)膜16張圖片)進(jìn)行平均，并表示為RGC/mn^計(jì)數(shù)面積。^瘦邀化和共炎^^凝裙y企查.如上所述心內(nèi)灌注大鼠，摘出它們的眼睛，除去前部和晶狀體。將剩余的視神經(jīng)乳頭凹陷浸沒(méi)在4%PFA中2小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到30%蔗糖中于4°C數(shù)小時(shí)，包埋在OCT(組織-Tek，MilesLaboratories,IN)中，并在液氮中在甲基丁烷中冷凍。將徑向冷凍切片(10-14m)置于明膠覆蓋的玻片上。用含1%Triton的PBS中的3%BSA在室溫下封閉切片30分鐘，并暴露于第一抗體一抗ot2巨球蛋白抗體(兔，1:200(Calbiochem)或山羊，1:100(Sigma))和/或抗LRP1受體(1:200SantaCruz)2小時(shí)。用抗月交質(zhì)標(biāo)記物膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(GFAP)的抗體(小鼠，1:400Chemicon)或抗神經(jīng)元標(biāo)記物微管蛋白III(TubulinIII)的抗體(小鼠，1:2000，Chemicon)進(jìn)行雙染色。第二抗體是FITC偶聯(lián)的抗小鼠、Cy3-偶聯(lián)的抗兔或AlexaFluor488抗山羊抗體(以1:250、1:1000或1:500稀釋度使用)，在室溫下孵育1小時(shí)。用Zeiss共聚焦顯微鏡(LSM510)記錄共聚焦圖像。因?yàn)閍2巨球蛋白是一種可溶性蛋白質(zhì)，因此研究了它的定位及其細(xì)胞受體(LRP-1)的定位(見(jiàn)圖5A-5D)。在正常視網(wǎng)膜中，在大多數(shù)RGC中發(fā)現(xiàn)了ot2巨球蛋白，其中它與逆行示蹤劑熒光金標(biāo)記和微管蛋白(3HI(—種RGC-特異性標(biāo)記物)共定位(數(shù)據(jù)未顯示)，但是也定位于米勒細(xì)胞和視網(wǎng)膜星形膠質(zhì)細(xì)胞中。LRP-1受體的陽(yáng)性免疫染色也與焚光金陽(yáng)性神經(jīng)元共定位。在正常視網(wǎng)膜中，幾乎僅在RGC中檢測(cè)到LRP-1免疫染色，而在青光眼(燒灼第28天，具有高IOP)中，RGC中的LRP-1表達(dá)仍然較高，但是也在fiver層中檢測(cè)到，在推測(cè)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和米勒細(xì)胞過(guò)程中，LRP-1與GFAP在該層中共定位。在使用由高滲鹽水青光眼模型誘導(dǎo)的高眼壓大鼠制備的視網(wǎng)膜切片進(jìn)行的研究中獲得類(lèi)似的oc2巨球蛋白上調(diào)和LRP共定位的數(shù)據(jù)(數(shù)據(jù)未顯示)，提示該結(jié)果對(duì)于一種青光眼動(dòng)物模型不是特異的。對(duì)大鼠房水的半定量western印跡分析證明在高IOP眼中比正常對(duì)側(cè)眼中激活的oc2巨球蛋白顯著增多(數(shù)據(jù)未顯示)。與這些發(fā)現(xiàn)相符，使用在手術(shù)期間收集的人房水進(jìn)行的半定量研究證明激活的oc2巨球蛋白在青光眼房水中平均顯著增多，而在白內(nèi)障患者中沒(méi)有顯著增多(圖6)。總之，數(shù)據(jù)表明在2個(gè)大鼠動(dòng)物模型和人類(lèi)中，oc2巨球蛋白在高眼壓中上調(diào)，oc2巨球蛋白與其受體LRP-1在RGC和其它視網(wǎng)膜層中共定位，并且也存在于房水中。在體內(nèi)確認(rèn)oc2巨球蛋白為青光眼治療靶標(biāo)在眼睛顳上側(cè)四分之一進(jìn)行結(jié)膜切開(kāi)。用30G針在眼壁上形成穿孔，以允許套管進(jìn)入眼眶中。用直立孩i電極^^申器(Narishige)制備的玻璃套管(10厚)通過(guò)塑料管與Hamilton注射器連接，以分配抗a2巨球蛋白兔抗體(Calbiochem)、對(duì)照PBS或?qū)φ胀每贵w(Sigma)的溶液。在術(shù)后第14天和第21天進(jìn)行注射(在具有正常IOP的假手術(shù)的對(duì)照眼中，以及具有高IOP的燒灼的眼中)。眼內(nèi)注射2iid的體積，其中含有總共大約2ng抗體。選擇該量是因?yàn)樵谕暾笫笠暰W(wǎng)膜的定量western印跡分析中估計(jì)在青光眼眼睛中總共有大約1ngoc2巨球蛋白(數(shù)據(jù)未顯示)。眼壓不受眼內(nèi)注射的影響，高IOP眼保持高IOP，正常IOP眼保持正常IOP(數(shù)據(jù)未顯示)。已經(jīng)證實(shí)oc2巨球蛋白與LRP-1的相互作用對(duì)神經(jīng)元有害(LopesMB等人，丄e"338:301-305,1994;YepesM等人，JC//"/肌e"112:1533-1540，2003)，包括對(duì)RGC有害(BirkenmeierG等人，7Vewro"poW8:149-151，1996;BirkenmeierG等人，F(xiàn)￡^S丄e"416:193-196，1997;HerzJ,/C7/"/歸W12:1483-1485,2003)。為了評(píng)價(jià)oc2巨球蛋白在RGC死亡中的可能的作用，向正常眼睛中顯孩t注射a2巨球蛋白，以確定是否接著發(fā)生青光眼樣RGC死亡。在這一例子中，通過(guò)單一眼內(nèi)注射向正常眼睛中遞送總共1-2Hg的ot2巨球蛋白，在注射后第14天或第28天通過(guò)逆行標(biāo)記對(duì)存活的RGC進(jìn)行計(jì)數(shù)。選擇1-2pg的量以最好地模擬從大鼠高眼壓模型的青光眼眼睛的房水中定量的oc2巨球蛋白的總量(數(shù)據(jù)未顯示)。與注射PBS載體的對(duì)側(cè)眼組相比，快速眼內(nèi)ot2巨球蛋白注射導(dǎo)致RGC進(jìn)行性損失。在三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中(每組n=3、2、6只眼)，在a2巨球蛋白注射后2周和4周與載體PBS相比分別有11±3%(p^0.01)和28±11%(p《0.001)的RGC損失。這些數(shù)據(jù)提示a2巨球蛋白誘導(dǎo)進(jìn)行性RGC死亡，其動(dòng)力學(xué)與高眼壓誘導(dǎo)的動(dòng)力學(xué)相當(dāng)。與以前的顯示a2巨球蛋白mRNA和蛋白質(zhì)不依賴(lài)于高IOP持續(xù)過(guò)量表達(dá)的結(jié)果結(jié)合起來(lái)，這些結(jié)果有助于解釋高IOP正?；蟮倪M(jìn)行性RGC死亡。利用第二個(gè)實(shí)驗(yàn)例證實(shí)a2巨球蛋白在RGC死亡中的作用。向具有高IOP的青光眼眼內(nèi)注射抗a2巨3求蛋白的中和抗體，以確定是否可以阻止RGC死亡。該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪窃陂_(kāi)始a2巨球蛋白中和治療之前誘導(dǎo)高IOP14天，以觸發(fā)a2巨球蛋白的過(guò)量表達(dá)和RGC損傷。應(yīng)用中和作為單一治療，或者與每日倍他洛爾治療聯(lián)合，以更好地反映用降壓藥同時(shí)治療青光眼患者的臨床情況。中和抗體在燒灼后第14天和21天給藥，在術(shù)后第42天計(jì)數(shù)通過(guò)逆行標(biāo)記鑒定的活的RGC。在這個(gè)方案中，在第21天和第42天之間不給予抗體。對(duì)照大鼠用對(duì)照抗體、鹽水處理，或者不注射(見(jiàn)表3)。高IOP42天后，與正常IOP相比有33±6%RGC的損失(表4,第3行對(duì)比第1行)。高IOP中的RGC損失是依賴(lài)于時(shí)間的。在高IOP第28天有19±5%RGC的損失，高IOP第14天有8±5%RGC的損失(表4,第4行和第5行)。每日應(yīng)用倍他洛爾(從第14天到第42天)將IOP正?；筊GC損失顯著減少到19±1%(表4，第8行對(duì)比第3行)。在青光眼第14天和第21天兩次單獨(dú)眼內(nèi)注射抗a2巨球蛋白抗體使RGC損失減少到21±3%(表4，第7行對(duì)比第6行和第3行)。用抗oc2巨球蛋白抗體聯(lián)合倍他洛爾治療具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用，使RGC損失顯著降低至11±4%(表4,第10行對(duì)比第9行)。這種聯(lián)合治療明顯優(yōu)于單獨(dú)的任一種治療(表4，第10行對(duì)比第7行和第8行)。聯(lián)合治療中的RGC計(jì)數(shù)與眼內(nèi)注射對(duì)照抗體的正常IOP眼中的RGC計(jì)數(shù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有不同(表4，第10行對(duì)比第2行)，并且與經(jīng)受14天高IOP的眼睛在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有不同(表4，第10行對(duì)比第5行)。對(duì)照抗體或鹽水的對(duì)照眼內(nèi)注射不改變正常^L網(wǎng)膜中的RGC計(jì)數(shù)(數(shù)據(jù)未顯示)或者青光眼第42天的RGC計(jì)數(shù)(表4，第6行對(duì)比第3行)，并且不改變應(yīng)用倍他洛爾使IOP正?；谋Ｗo(hù)作用(表4,第8行對(duì)比第9行)。#論a2巨球蛋白基因上調(diào)a2巨球蛋白基因和蛋白質(zhì)僅在高IOP大約7天后就上調(diào)，不依賴(lài)于高眼壓，其表達(dá)持續(xù)超過(guò)20天。a2巨球蛋白mRNA的誘導(dǎo)對(duì)于高IOP是特異性的，并且在視神經(jīng)軸突切開(kāi)術(shù)后不提高。因此，短期高眼壓足以引起視網(wǎng)膜中高眼壓特異性的、長(zhǎng)期的提高。這些數(shù)據(jù)確定a2巨球蛋白在燒灼大鼠青光眼模型以及高滲鹽水大鼠青光眼模型中作為一種IPREG(數(shù)據(jù)未顯示)，也證明了在青光眼人眼中的表達(dá)高于白內(nèi)障眼睛。a2巨球蛋白損傷的機(jī)理在青光眼中，a2巨球蛋白及其LRP-1受體富含于RGC中，LRP-l-a2巨球蛋白相互作用對(duì)于各種類(lèi)型的神經(jīng)元有害(LopesMB等人，丄"/338:301-305,1994;YepesM等人，/C/,'"/m^W112:1533-1540,2003)，包括對(duì)RGC有害(BirkenmeierG等人,8:149-151，1996;BirkenmeierG等人,416:193-196，1997;HerzJ，《/C7/w/騰"112:1483-1485,2003)。與a2巨球蛋白的神經(jīng)毒性作用相符，這種蛋白質(zhì)在正常眼睛中的眼內(nèi)運(yùn)輸導(dǎo)致青光眼樣RGC損失；而該蛋白質(zhì)的中和顯著減少或延遲了青光眼中的RGC死亡，特別是在與眼壓正常化藥物聯(lián)用時(shí)。神經(jīng)毒性機(jī)理包括通過(guò)激活NMDA受體(NMDAR)提高iCa++,以及調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元中的谷氨酸鹽神經(jīng)傳遞(BacskaiBJ等人，尸rociVa〃Jcad97:11551-11556，2000;QuiZ等人，J5/o/C7^w277:14458-14466，2002;QuiZ等人，臉w賜cz眞e122:291-303，2003;QuiZ等人，J所o/C7zem279:34948-34956，2004)。因此，目艮中a2巨球蛋白的上調(diào)可以4吏NMDAR具有正常的興奮性活性，導(dǎo)致RGC死亡。oc2巨球蛋白也結(jié)合并且中和視網(wǎng)膜神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白，特別是神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)(ChiabrandoGA等人，/7Vewmsc/70:57-64,2002;SkornickaEL等人，/iVewmyc/i^67:346-353,2002)，NGF是重要的RGC的存活或保持因子。因此，oc2巨球蛋白的過(guò)量表達(dá)將導(dǎo)致生長(zhǎng)因子的生物利用度降低(參見(jiàn)圖7中的模型)，并且可能是關(guān)于為什么外來(lái)NGF的運(yùn)輸不能保護(hù)青光眼中的RGC的一種解釋。其它上調(diào)的基因和RGC損傷的關(guān)系在高眼壓中上調(diào)的其它IPREG可能與RGC死亡有關(guān)。特別感興趣的是一些這樣的IPREG可以與a2巨球蛋白協(xié)同作用。上調(diào)的PSD95/SAP90-相關(guān)蛋白-4(PSD95/SAP90)和GTPaseGzoc與NMDAR活性有關(guān)。PSD95/SAP90在不同于血影蛋白(spectrin)的部位結(jié)合NMDAR的C-末端(WechslerA和TeichbergVI，五MSO/17:3931-3939,1998)，并且通過(guò)src-家族激酶誘導(dǎo)NMDAR磷酸化和激活(HouXY等人，5ra/"955:123-132，2002)。Fyn-PSD95-NR復(fù)合物制劑增強(qiáng)了腦缺血中的細(xì)胞死亡，而沉默化的PSD95減少了缺血后神經(jīng)元細(xì)胞死亡(HouXY等人，A^wra"/丄e"385:230-233，2005)。激活NMDAR的src-家族激酶(HouXY等人，5ra/"尺w955:123-132，2002)本身被蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(LeiG等人，￡M50/21:2977-2989，2002;vanZundertB等人，r削AiV麼歸.27:428-437,2004)(PTP)激活，因此上調(diào)的PTP-y(PP1)可能與青光眼和RGC應(yīng)激相關(guān)。而且，蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶活性改變了NMDAR復(fù)合物中的亞單位裝配(Ferrani陽(yáng)KileK和LeslieSW,尸/zarwaco/Ex/777w314:86-93，2005),并且在PTP-y(PPl)和NMDAR之間存在正反饋回路(SzatmariE等人，/腸/C/zem280(45):37526-35,2005)。上調(diào)的Gzoc是NMDAR信號(hào)的直接相互作用物和介質(zhì)。實(shí)際上已經(jīng)報(bào)道了ot2巨球蛋白/LRP-l受體和GTPase之間的功能增強(qiáng)加劇了神經(jīng)元死亡(HashimotoY等人，J7Vewmyc/20:8401-8409,2000)。視網(wǎng)膜Gza也可與幾種Gi-偶聯(lián)的受體的活性有關(guān)，所述受體包括5-羥色胺(serotonin)和阿片樣受體(Connor和Christie,1999)。Gzoc在神經(jīng)元中高度表達(dá)(KelleherKL等人，5raz>/^sDev5ra/"107:247-253:1998)，并且纟皮逆向轉(zhuǎn)運(yùn)到末端，在這里它可以通過(guò)減弱RAP-1活性(JohansonSO等人，A^wrac/^w21:779-785,1996)抑制神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白信號(hào)發(fā)生和分化(MengJ和CaseyPJ，/Ao/C/zem277,W4/7-4342《2002)(參見(jiàn)圖7)?；蛳抡{(diào)和RGC損傷視網(wǎng)膜雙載蛋白(一種在胞吞作用和嚢泡內(nèi)化和轉(zhuǎn)運(yùn)中起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì))的下調(diào)(DiPaoloG等人，A^wo"33:789-804,2002;TomizawaK等人，JCW/163:813-824,2003)可以解釋青光眼中受損的軸突運(yùn)輸。雙載蛋白由RGC表達(dá)(HosoyaO和TsutsuiK，7Vewra"/19:2179-2187，2004)。同樣，下調(diào)的RKIAS43是一種與突觸小泡膜蛋白VAT-1(—種膽堿能突觸小泡膜蛋白)具有98.9%同源性、與嚢泡胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1具有80%同源性的EST;提示在胞吞作用和嚢泡功能中起作用。減少的軸突運(yùn)輸在傳統(tǒng)上被解釋為由高壓引起的壓縮導(dǎo)致的視神經(jīng)頭的機(jī)械"生理軸突切開(kāi)術(shù)"。上述數(shù)據(jù)證明高眼壓通過(guò)引起嚢泡運(yùn)輸?shù)鞍妆磉_(dá)的長(zhǎng)期降低，引起逆向缺乏并且可以導(dǎo)致RGC死亡，可以在功能上模擬生理軸突切開(kāi)術(shù)。下調(diào)的解旋酶與DNA修復(fù)有關(guān)，并且4交低的DNA修復(fù)可以加劇細(xì)胞死亡。與RGC死亡特別有關(guān)，解旋酶在功能上與拓樸異構(gòu)酶相關(guān)(HowardMT等人，/VocA^/zlcadSd91:12031-12035,1994),拓樸異構(gòu)酶活性是雙載蛋白的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)絕對(duì)需要的(TsutsuiK等人，《/C/zew276,57<59-5"%,2001)。因此，圖7模型中所示的雙載蛋白的下調(diào)與解旋酶的下調(diào)相一致。最后，下調(diào)的淀粉狀蛋白前體樣蛋白2與銅的內(nèi)穩(wěn)態(tài)有關(guān)，并且可能參與神經(jīng)保護(hù)(WhiteAR等人，/A^wc^c/22:365-376，2002)。它們的缺乏可以Y吏RGC對(duì)應(yīng)激壽丈感。結(jié)論體內(nèi)證據(jù)表明在大鼠青光眼模型中，高眼壓調(diào)節(jié)一組關(guān)鍵的視網(wǎng)膜基因產(chǎn)物。一組基因的表達(dá)由短期高眼壓選擇性調(diào)節(jié)，并且長(zhǎng)期持續(xù)改變，甚至在用藥物使高眼壓正?；蟆ＥcRGC死亡有關(guān)的基因產(chǎn)物上調(diào)，而與RGC保持或存活有關(guān)的基因產(chǎn)物下調(diào)?？扇苄缘鞍踪|(zhì)a2巨球蛋白，一種明顯上調(diào)的視網(wǎng)膜基因產(chǎn)物，被確認(rèn)為防止青光眼中RGC死亡的治療靶標(biāo)。本發(fā)明已經(jīng)參照其優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行了具體說(shuō)明和描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在不背離權(quán)利要求書(shū)包括的本發(fā)明范圍的條件下，可以在形式和細(xì)節(jié)上對(duì)其進(jìn)行各種變化。權(quán)利要求1.一種治療哺乳動(dòng)物的青光眼的方法，包括給該哺乳動(dòng)物施用有效量的抑制一種或多種上調(diào)的眼內(nèi)壓調(diào)節(jié)早期基因(IPREG)的表達(dá)或活性的組合物。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種上調(diào)的IPREG選自a2巨球蛋白、PSD-95/SAP90相關(guān)蛋白畫(huà)4、Reggiel畫(huà)l、RBCK、Gza、蛋白質(zhì)磷酸酶1Y、核糖體蛋白L23-相關(guān)產(chǎn)物、膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白、環(huán)核苷酸門(mén)控陽(yáng)離子通道、SPARC和B-2芳基胺N-乙酰轉(zhuǎn)移酶。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述組合物含有一種或多種選自下組的物質(zhì)小干擾RNA、反義寡核苷酸、中和抗體、小分子、重組基因表達(dá)載體、重組基因病毒載體、合成肽、重組多肽、擬肽和IPREG調(diào)節(jié)區(qū)抑制劑。4.權(quán)利要求3的方法，其中所述組合物通過(guò)至少一種選自眼內(nèi)注射、局部結(jié)膜應(yīng)用、局部角膜應(yīng)用和機(jī)械遞送裝置的方法施用。5.權(quán)利要求4的方法，其中所抑制的IPREG是a2巨球蛋白。6.權(quán)利要求5的方法，其中通過(guò)拮抗a2巨球蛋白受體抑制a2巨球蛋白的活性。7.權(quán)利要求6的方法，進(jìn)一步包括施用一種或多種眼內(nèi)壓正常4匕藥物。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述一種或多種眼內(nèi)壓正常化藥物選自非選擇性腎上腺素受體阻斷劑、選擇性腎上腺素受體阻斷劑、前列腺素、碳酸酐酶抑制劑、腎上腺素能激動(dòng)劑和縮瞳藥。9.權(quán)利要求8的方法，其中所施用的眼內(nèi)壓正?；幬锸潜端鍫枴?0.—種治療哺乳動(dòng)物的青光眼的方法，包括給該哺乳動(dòng)物施用有效量的提高一種或多種下調(diào)的眼內(nèi)壓調(diào)節(jié)早期基因(IPREG)的表達(dá)或活性的組合物。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述一種或多種下調(diào)的IPREG選自淀粉狀蛋白前體樣蛋白2、雙載蛋白1、Crybb2、Ras-相關(guān)p23、解旋酶Rap30、蛋白體rPA28亞單位(3、ATPasea-l亞單位、(3A3/A1晶體蛋白、(3A4晶體蛋白、S-腺苷曱硫氨酸合酶、和天冬酰胺合酶。12.權(quán)利要求11的方法，其中所述組合物含有一種或多種選自下組的物質(zhì)小干擾RNA、反義寡核苷酸、中和抗體、小分子、重組基因表達(dá)載體、重組基因病毒載體、合成肽、重組多肽、擬肽和IPREG調(diào)節(jié)區(qū)激活劑。13.權(quán)利要求12的方法，其中提高其表達(dá)或活性的IPREG是雙載蛋白1。14.權(quán)利要求13的方法，進(jìn)一步包括施用一種或多種眼內(nèi)壓正?；幬?。15.—種治療哺乳動(dòng)物的青光眼的方法，包括給該哺乳動(dòng)物施用有效量的組合物，該組合物抑制至少一種上調(diào)的IPREG的表達(dá)或活性并且提高至少一種下調(diào)的IPREG的表達(dá)或活性。16.權(quán)利要求15的方法，進(jìn)一步包括施用一種或多種眼內(nèi)壓正?；幬?。17.—種預(yù)防由高眼內(nèi)壓(IOP)介導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)死亡的方法，包括給個(gè)體施用有效量的眼內(nèi)壓調(diào)節(jié)早期基因(IPREG)調(diào)節(jié)組合物，其中該組合物抑制一種或多種上調(diào)的IPREG的表達(dá)或活性和/或提高一種或多種下調(diào)的IPREG的表達(dá)或活性。18.權(quán)利要求17的方法，進(jìn)一步包括施用一種或多種眼內(nèi)壓正?；幬铩?9.一種預(yù)防哺乳動(dòng)物的慢性眼退化的方法，包括給哺乳動(dòng)物施用有效量的眼內(nèi)壓調(diào)節(jié)早期基因(IPREG)調(diào)節(jié)組合物，其中該組合物抑制一種或多種上調(diào)的IPREG的表達(dá)或活性和/或提高一種或多種下調(diào)的IPREG的表達(dá)或活性。20.權(quán)利要求19的方法，進(jìn)一步包括施用一種或多種眼內(nèi)壓正?；幬?。21.—種檢測(cè)患者的慢性眼退化的方法，包括a)測(cè)定患者房水中的一種或多種眼內(nèi)壓調(diào)節(jié)早期基因(IPREG)蛋白的表達(dá)水平；和b)將所述表達(dá)水平與具有正常眼功能的個(gè)體中相同的一種或多種IPREG蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行比較，其中與具有正常眼功能的個(gè)體中相同的IPREG蛋白的表達(dá)相比，一種或多種上調(diào)的IPREG蛋白的較高的表達(dá)水平和/或一種或多種下調(diào)的IPREG蛋白的較低的表達(dá)水平表示該患者具有慢性眼退化。22.—種檢測(cè)患者中的RGC應(yīng)激的方法，包括a)在最初時(shí)間點(diǎn)測(cè)定患者房水中一種或多種眼內(nèi)壓調(diào)節(jié)早期基因(IPREG)蛋白的表達(dá)水平；b)在以后的時(shí)間點(diǎn)測(cè)定患者房水中相同的一種或多種IPREG蛋白的表達(dá)水平；和c)將在最初時(shí)間點(diǎn)測(cè)定的一種或多種IPREG蛋白的表達(dá)水平與在以后時(shí)間點(diǎn)測(cè)定的表達(dá)水平進(jìn)行比較，其中患者中較高的一種或多種上調(diào)的IPREG蛋白的表達(dá)水平和/或較低的一種或多種下調(diào)的IPREG蛋白的表達(dá)水平表示該患者中RGC應(yīng)激的發(fā)生。23.—種鑒定眼內(nèi)壓調(diào)節(jié)早期基因(IRPEG)的方法，包括a)確定一種基因的表達(dá)是否被高眼壓所改變，其中該基因的表達(dá)不被視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)損傷所改變；b)確定該基因的表達(dá)是否在高眼壓發(fā)生后早期改變；c)確定改變的該基因的表達(dá)在高眼壓或青光眼發(fā)生后是否持續(xù)；和d)確定在高眼壓降低后該基因的表達(dá)是否仍然改變。24.權(quán)利要求23的方法，進(jìn)一步包括確定鑒定的基因在體內(nèi)對(duì)RGC死亡和/或青光眼的作用。25.用權(quán)利要求23的方法鑒定的IPREG。26.—種藥物組合物，其含有有效量的至少一種抑制一種或多藥物載體，其中施用該組合物以治療青光眼。27.權(quán)利要求26的藥物組合物，其中施用該組合物治療選自慢性眼退化和RGC死亡的至少一種。28.權(quán)利要求27的藥物組合物，其中所述一種或多種上調(diào)的IPREG選自ot2巨球蛋白、PSD-95/SAP90相關(guān)蛋白-4、Reggiel-l、RBCK、Gza、蛋白質(zhì)磷酸酶1y、核糖體蛋白L23-相關(guān)產(chǎn)物、膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白、環(huán)核苷酸門(mén)控陽(yáng)離子通道、SPARC、和B-2芳基胺N-乙酰轉(zhuǎn)移酶。29.權(quán)利要求28的藥物組合物，其中所述至少一種物質(zhì)是一種或多種選自下組的物質(zhì)小干擾RNA、反義寡核苷酸、中和抗體、小分子、重組基因表達(dá)載體、重組基因病毒載體、合成肽、重組多肽、擬肽和IPREG調(diào)節(jié)區(qū)抑制劑。30.—種藥物組合物，其含有有效量的至少一種提高一種或多種下調(diào)的眼內(nèi)壓調(diào)節(jié)早期基因IPREG的表達(dá)或活性的物質(zhì)和適當(dāng)?shù)乃幬镙d體，其中施用該組合物以治療青光眼。31.權(quán)利要求30的藥物組合物，其中施用該組合物治療選自慢性眼退化和RGC死亡的至少一種。32.權(quán)利要求31的藥物組合物，其中下調(diào)的IPREG選自淀粉狀蛋白前體樣蛋白2、雙載蛋白1、Crybb2、Ras-相關(guān)p23、解旋酶Rap30、蛋白體rPA28亞單位p、ATPaseot-l亞單位、PA3/A1晶體蛋白、pA4晶體蛋白、S-腺苷曱硫氨酸合酶、和天冬酰胺合酶。33.權(quán)利要求32的藥物組合物，其中至少一種物質(zhì)是一種或多種選自下組的物質(zhì)小干擾RNA、反義寡核苷酸、中和抗體、小分子、重組基因表達(dá)載體、重組基因病毒載體、合成肽、重組多肽、擬肽和IPREG調(diào)節(jié)區(qū)激活劑。34.—種藥物組合物，其含有有效量的至少一種抑制一種或多種上調(diào)的IPREG的表達(dá)或活性的物質(zhì)和至少一種提高一種或多種下調(diào)的IPREG的表達(dá)或活性的物質(zhì)和藥物可接受的載體，其中施用該組合物以治療青光眼。35.權(quán)利要求34的藥物組合物，其中施用該組合物治療選自慢性眼退化和RGC死亡的至少一種。全文摘要本發(fā)明涉及通過(guò)調(diào)節(jié)由高眼內(nèi)壓介導(dǎo)的基因表達(dá)的改變來(lái)治療青光眼和青光眼相關(guān)疾病的方法。用藥物組合物治療青光眼、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)死亡和慢性高眼壓，該藥物組合物含有抑制被高眼內(nèi)壓上調(diào)的眼內(nèi)壓調(diào)節(jié)早期基因(IPREG)或其基因產(chǎn)物的表達(dá)或活性和/或提高被高眼內(nèi)壓下調(diào)的IPREG或其基因產(chǎn)物的表達(dá)或活性的物質(zhì)。本發(fā)明還涉及鑒定IPREG的方法和通過(guò)測(cè)定IPREG蛋白質(zhì)的表達(dá)水平檢測(cè)個(gè)體中的慢性眼退化和RGC應(yīng)激發(fā)生的方法。文檔編號(hào)G01N33/574GK101360999SQ200680051597公開(kāi)日2009年2月4日申請(qǐng)日期2006年11月22日優(yōu)先權(quán)日2005年11月22日發(fā)明者H·U·薩拉戈維申請(qǐng)人:麥吉爾大學(xué)