專利名稱：用于治療性克隆的人體細(xì)胞組織器官保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及凍存技術(shù)，尤其是人體細(xì)胞組織器官(如臍帶組織和臍帶相關(guān)細(xì)胞)的體外凍存技術(shù)，其中凍存的細(xì)胞被用于治療性克隆及其它用途。通過(guò)本發(fā)明的凍存技術(shù)，凍存的組織和細(xì)胞可以在復(fù)蘇使用前無(wú)限期保存。當(dāng)凍存的組織和細(xì)胞被復(fù)蘇后，可用于治療性克隆和移植、功能基因組學(xué)研究、疾病相關(guān)基因篩選以及篩選有生物活性的化合物的原料。
目前，生物材料的儲(chǔ)存時(shí)間是由生物材料降溫至冷凍保存溫度的過(guò)程所決定的。降溫過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)外的水分從液體狀態(tài)到固體狀態(tài)要經(jīng)歷結(jié)冰過(guò)程，包括水分子的有序排列——結(jié)晶化或非結(jié)晶化過(guò)程。對(duì)于冷凍學(xué)家而言，其技術(shù)關(guān)鍵在于使細(xì)胞進(jìn)入冷凍溫度后仍能使其回到生理狀態(tài)而沒(méi)有損傷。
細(xì)胞和組織凍存的兩個(gè)關(guān)鍵步驟是凍融和結(jié)晶。凍融技術(shù)要求細(xì)胞外液體結(jié)冰，但采用了很多步驟來(lái)減少細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰。有人建議采用全樣本凍存，但仍無(wú)法防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰，正是這些冰晶在凍融中對(duì)細(xì)胞造成致命的損傷。另一技術(shù)是結(jié)晶技術(shù)，其中試圖采用高濃度液體和/或多聚體來(lái)減少冰晶形成。然而長(zhǎng)久地暴露于高濃度甚至毒性水平的結(jié)晶添加劑中對(duì)細(xì)胞的損害亦很大。
在人體的各種細(xì)胞組織器官中，臍帶組織和臍帶相關(guān)細(xì)胞一直被認(rèn)為是生物學(xué)廢物，在胎兒出生后予以廢棄，盡管有些臍帶組織和臍帶相關(guān)細(xì)胞可作為人體細(xì)胞來(lái)源而用于體外研究，但通常為短期研究。并沒(méi)有將臍帶組織和臍帶相關(guān)細(xì)胞經(jīng)過(guò)凍存，解凍后再用于研究的報(bào)道。
近年來(lái)，隨著體細(xì)胞克隆技術(shù)、治療性器官克隆和同種或異種移植技術(shù)的發(fā)展和成功，要求一種能長(zhǎng)期保存臍帶組織和臍帶相關(guān)細(xì)胞的方法，確保臍帶組織和臍帶各種細(xì)胞在長(zhǎng)期乃至無(wú)限期的保存后能安全復(fù)蘇，并且保持其理化性質(zhì)不變，以便為臍帶提供者本人或他人提供器官克隆、移植、功能基因組學(xué)研究、疾病相關(guān)基因篩選以及篩選有生物活性的化合物的原料所用。
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種對(duì)用于治療性克隆的人體細(xì)胞組織器官進(jìn)行凍存的方法，用該方法進(jìn)行凍存的人體細(xì)胞、組織和器官，在解凍后能安全復(fù)蘇并且保持理化性質(zhì)不變，從而用于各種用途如制備治療性克隆。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種對(duì)用于治療性克隆的人體細(xì)胞、組織或器官進(jìn)行凍存的方法，該方法包括以下步驟(a)將獲取的人體細(xì)胞、組織或器官浸入冷凍保護(hù)液，充分混勻冷凍保護(hù)液，使冷凍保護(hù)液充分滲透入該細(xì)胞、組織、器官；(b)起始溫度設(shè)為20±5℃，以5-15℃/分鐘降溫至5-8℃，然后持續(xù)15-30分鐘，進(jìn)行點(diǎn)冰；(c)點(diǎn)冰以后，維持5±3分鐘以使冷凍溫度仍保持在5-8℃；(d)調(diào)整降溫速度至-0.5至-1.5℃/分鐘并將溫度降至-8±1℃，維持30±20分鐘；(e)以-0.1至-0.5℃/分鐘的速度下降至低于-70℃的保存溫度。
較佳地，步驟(b)-(e)是在CO2緩沖環(huán)境中進(jìn)行；而且，用液氮冷卻的金屬探棒點(diǎn)冰而形成細(xì)胞外點(diǎn)冰。較佳地，在冰晶形成后，溫度以每分鐘0.5至1.5℃(如1度)的速度下降至約-8℃，并保持10-50分鐘以保證冷凍組織進(jìn)入冷凍狀態(tài)之前，在冷凍保護(hù)液中達(dá)到物理和生物學(xué)平衡狀態(tài)。
本發(fā)明還提供了將凍存的人體細(xì)胞、組織、器官解凍，用于制備治療性克隆供核的方法，它包括將上述凍存的人體細(xì)胞組織器官在1-3分鐘內(nèi)快速解凍，然后在體外培養(yǎng)用作供核。
在生物材料的凍存過(guò)程中，冷凍保護(hù)劑起的作用是保護(hù)結(jié)冰過(guò)程中細(xì)胞的活性。冷凍保護(hù)劑的主要通過(guò)以下方式起到保護(hù)作用，即當(dāng)水轉(zhuǎn)變成冰且鹽離子濃度升高時(shí)，起稀釋作用。結(jié)冰量取決于溫度和溶液組分。另外，冷凍保護(hù)劑還能降低細(xì)胞內(nèi)的結(jié)冰溫度、穩(wěn)定細(xì)胞膜和蛋白。
所有的溶液在形成冰晶核心之前都能在低于其冰點(diǎn)的溫度下過(guò)冷而不凍結(jié)。當(dāng)用凍融法凍存時(shí)，細(xì)胞外介質(zhì)的凍結(jié)出現(xiàn)在過(guò)冷低點(diǎn)時(shí)的點(diǎn)冰。非點(diǎn)冰引起的結(jié)冰是在溶液溫度大大地低于冰點(diǎn)時(shí)的自發(fā)結(jié)冰。因?yàn)樵撨^(guò)程是自發(fā)的，結(jié)冰隨機(jī)發(fā)生于無(wú)法預(yù)見(jiàn)的溫度下，因此在同樣的凍存程序下細(xì)胞的存活力差異很大。
另外，當(dāng)極度過(guò)冷時(shí)發(fā)生的快速結(jié)冰易造成細(xì)胞和組織損傷。另外，如果細(xì)胞外結(jié)冰發(fā)生極度過(guò)冷時(shí)，細(xì)胞內(nèi)冰形成的可能性大大增加。這一現(xiàn)象源于結(jié)冰導(dǎo)致的細(xì)胞脫水延遲發(fā)生，進(jìn)一步增加細(xì)胞內(nèi)水的潴留，從而使細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰的可能性又大大地增加了。
一旦細(xì)胞外點(diǎn)冰完成，樣品被冰包圍，樣品就能降溫至凍存狀態(tài)。
降溫步驟是凍融法中的關(guān)鍵點(diǎn)。部分結(jié)冰的細(xì)胞外溶液濃度高于細(xì)胞內(nèi)溶液，為達(dá)到熱力學(xué)平衡，細(xì)胞丟失水分而脫水。隨著細(xì)胞外冰的逐漸增多，脫水愈加嚴(yán)重。細(xì)胞的三個(gè)特性決定其脫水的速度(1)細(xì)胞膜的水滲透率(水滲透率愈差，細(xì)胞脫水的時(shí)間愈長(zhǎng))；(2)細(xì)胞膜水滲透率的溫度依賴性(所有細(xì)胞膜在溫度降低時(shí)其水滲透率下降)；(3)細(xì)胞的大小(大細(xì)胞比小細(xì)胞需要更長(zhǎng)的時(shí)間發(fā)生脫水)。由于各細(xì)胞的特性各不相同，其凍存的優(yōu)選條件就有一定的差異。
盡管，凍存時(shí)細(xì)胞損傷的確切機(jī)制尚未完全闡明，然而通過(guò)細(xì)胞活力測(cè)定發(fā)現(xiàn)，非常快和非常慢的冷卻速度都大大地降低細(xì)胞活力，中等冷卻速度產(chǎn)生最優(yōu)選的結(jié)果。盡管對(duì)于不同的細(xì)胞，其優(yōu)選冷卻速度和降溫曲線可以差別很大，但冷凍的總體程度是相近的。過(guò)快冷凍細(xì)胞沒(méi)有足夠的時(shí)間脫水而形成細(xì)胞內(nèi)冰，細(xì)胞損傷主要?dú)w因于細(xì)胞內(nèi)冰。過(guò)慢冷凍時(shí)，細(xì)胞損傷主要因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)時(shí)間暴露于高濃度的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的鹽分以及冷凍保護(hù)液，或細(xì)胞外冰和細(xì)胞之間的相互作用。
在細(xì)胞內(nèi)冰核形成之前必須使細(xì)胞脫水。當(dāng)細(xì)胞在1M和2M濃度的冷凍保存液內(nèi)時(shí)，細(xì)胞脫水這一事件多發(fā)生在-50℃-40℃之間。值得一提的是，細(xì)胞內(nèi)的結(jié)冰量在降溫中可能不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成傷害，但如果解凍不夠快的話，細(xì)胞會(huì)因?yàn)槿芙鈺r(shí)發(fā)生腫脹而死亡。
利用本發(fā)明的組織和細(xì)胞冷凍方法，可以在低溫下避免細(xì)胞內(nèi)冰晶形成和細(xì)胞毒性化學(xué)試劑的使用，利用程序冷凍儀在適當(dāng)降溫速度下進(jìn)行冷凍保護(hù)組織。該組織和細(xì)胞的冷凍保存方法使組織和細(xì)胞能無(wú)限期保持其活力和生理特性，以供器官克隆、移植、體外檢測(cè)以及其他功用方面的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的對(duì)用于治療性克隆的人體細(xì)胞組織器官進(jìn)行凍存的方法，包括步驟(a)將獲取的人體細(xì)胞、組織或器官浸入冷凍保護(hù)液，充分混勻冷凍保護(hù)液，使冷凍保護(hù)液充分滲透入該細(xì)胞、組織、器官；(b)起始溫度設(shè)為20±5℃，以5-15℃/分鐘降溫至5-8℃，然后持續(xù)15-30分鐘，進(jìn)行點(diǎn)冰；(c)點(diǎn)冰以后，維持5±3分鐘以使冷凍溫度仍保持在5-8℃；(d)調(diào)整降溫速度至-0.5至-1.5℃/分鐘并將溫度降至-8±1℃，維持30±20分鐘；(e)以-0.1至-0.5℃/分鐘的速度下降至低于-70℃的保存溫度。
適用于本發(fā)明方法的人體細(xì)胞組織器官可以是任何的人體細(xì)胞、組織和器官，其中包括(但并不限于)臍帶相關(guān)細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、輸卵管細(xì)胞、耳細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、卵丘細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、成骨細(xì)胞；臍帶組織、皮膚、乳腺等。
在本申請(qǐng)中，“臍帶相關(guān)細(xì)胞”指來(lái)源于臍帶的各種細(xì)胞，包括消化后體外培養(yǎng)的臍帶組織的各種細(xì)胞，如血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等。“臍帶組織”指臍帶的全部組織，包括小段、切片等。
在本發(fā)明方法中，凍存溫度一般為低于-70℃，較佳地為不大于-120℃，更佳地為不大于-140℃，最佳地為不大于-196℃。如為短期保存(運(yùn)輸途中)可置于-76℃(干冰的溫度)。長(zhǎng)期保存時(shí)，溫度宜更低，例如采用液氮保存(-196℃)。
適用于本發(fā)明方法的冷凍保護(hù)液包括細(xì)胞滲透性晶體形成試劑或非細(xì)胞滲透性的晶體形成試劑合適的細(xì)胞滲透性晶體形成試劑的例子包括(但并不限于)丙二醇、乙二醇、二甲亞砜、甘油，較佳地是甘油。非細(xì)胞滲透性的晶體形成試劑的例子包括(但并不限于)高分子量復(fù)合糖比如硫酸軟骨素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇或羥乙基淀粉等。
通常，冷凍保護(hù)液被稀釋于稀釋劑中。合適的稀釋劑例子包括磷酸緩沖液和細(xì)胞培養(yǎng)液如DMEM、IDMEM、MEM、M199、RPMI1640、Ham′s F-10、NCTC109、NCTC135培養(yǎng)液、或以上稀釋劑的混合物。較佳地，該稀釋劑是DMEM培養(yǎng)液。為了在凍融過(guò)程中保持最佳的細(xì)胞活力，冷凍保護(hù)液和稀釋劑可根據(jù)各個(gè)不同的細(xì)胞加以調(diào)整。
一種優(yōu)選的冷凍保護(hù)溶液是稀釋于DMEM培養(yǎng)液的1.5M到2.5M甘油，最好是2M的甘油。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，冷凍保護(hù)劑為1.5-2.5M甘油稀釋于DMEMF培養(yǎng)基中；冷凍組織，細(xì)胞浸入冷凍保護(hù)液時(shí)在20℃中完成，然后，降低溫度從20℃至6℃。降溫速度為-5至-15℃/分鐘。
在將細(xì)胞組織樣品與冷凍保護(hù)溶液混勻時(shí)，可使用任何機(jī)械攪動(dòng)方式進(jìn)行，從而增強(qiáng)冷凍保護(hù)液的滲透性。合適的混勻方法例子包括振蕩、水平搖動(dòng)、離心、真空泵抽吸等。通常，要有足夠的時(shí)間以保證冷凍保護(hù)液的充分滲透，因此混勻時(shí)間通常為1-4小時(shí)。較佳地為2-3小時(shí)。
當(dāng)稀釋冷凍保護(hù)液的培養(yǎng)基為碳酸氫鈉緩沖體系，較佳地可采用CO2緩沖環(huán)境，因?yàn)樵诶鋬霰Ｗo(hù)液滲透入組織和細(xì)胞的滲透過(guò)程中，需要CO2緩沖環(huán)境以確保溶液的酸堿度穩(wěn)定。CO2緩沖環(huán)境中的CO2的具體含量可根據(jù)不同的組織和細(xì)胞加以調(diào)整，以期保持最佳的細(xì)胞活力。通常，CO2濃度為含5％或10％或更高。
在本發(fā)明方法中，宜先將樣品溫度從室溫降至約-5℃至-10℃。這是可采用快凍或慢凍程序，較佳地是降溫速度為5-12℃/分鐘，更佳地降溫速度為8-10℃/分鐘。
在點(diǎn)冰以促發(fā)冰晶形成時(shí)，可用液氮冷卻的金屬探針接觸裝有組織或細(xì)胞的凍存管，也可直接接觸管內(nèi)的冷凍保護(hù)液或通過(guò)冷凍室內(nèi)的機(jī)械臂操作，也可在冷凍室內(nèi)注入氟立昂或干冰進(jìn)行點(diǎn)冰。
在點(diǎn)冰之后的降溫過(guò)程中，宜采用慢凍程序，即降溫速度低于0.1-0.5℃/分鐘，更佳地降溫速度為0.2-0.5℃/分鐘，更佳地降溫速度為0.2-0.4℃/分鐘，最佳地降溫速度約為0.2-0.3℃/分鐘。
在溶解凍存組織或細(xì)胞時(shí)，宜以較高速度升溫，在1-3分鐘內(nèi)將溫度升至37℃。一種解凍方法是將凍存管直接置入37℃水浴。也可采用其他直接而快速的加熱方法。
在解凍后，為避免冷凍保護(hù)液在常溫下對(duì)細(xì)胞的毒性作用，須在解凍后15分鐘內(nèi)，最好是在解凍后立即去除冷凍液。
解凍后的組織或細(xì)胞，可用于制備治療性克隆，以及作為功能基因組學(xué)研究，疾病相關(guān)基因篩選以及篩選有生物活性的化合物的原料。
下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明，應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于闡述目的而不用于限制本發(fā)明范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照本領(lǐng)域常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1人臍帶組織和臍帶相關(guān)細(xì)胞的凍存將臍帶組織浸入至少等量的冰上預(yù)冷的2.0M甘油的DMEM培養(yǎng)基凍存保護(hù)液中，持續(xù)1-2小時(shí)?；蛘?，將臍帶內(nèi)皮細(xì)胞的懸浮液與等量的冰上預(yù)冷的同上凍存保護(hù)液，持續(xù)0.5小時(shí)。期間充分混勻冷凍保護(hù)液，可置于CO2緩沖環(huán)境中，以50-70rpm搖床搖勻，或在管中輕輕震搖。
然后移入凍存管并真空封口。凍存管置入程序冷凍儀(Planer)，起始溫度設(shè)為20℃，以5-15℃/分鐘降溫至6℃，然后持續(xù)20分鐘，接著進(jìn)行點(diǎn)冰。持續(xù)20分鐘以確保整體組織溫度一致(至少要維持15分鐘)，為6℃。點(diǎn)冰的接觸點(diǎn)在冷凍管的液面以下。
點(diǎn)冰以后，維持5分鐘以使冷凍室內(nèi)溫度仍保持在6℃。調(diào)整降溫速度至-1℃/分鐘并將溫度降至-8℃，維持30分鐘。然后以-0.3℃或更慢速度下降至預(yù)定的保存溫度，可以是-70℃，也可以是更低溫度如為-120℃或-140℃下，則對(duì)細(xì)胞的損傷較小。
凍存組織(或細(xì)胞)從程序冷凍儀中移入-196℃冷凍庫(kù)或冷凍室內(nèi)保存，直至使用。
實(shí)施例2人臍帶組織和臍帶相關(guān)細(xì)胞的凍存樣品的解凍凍存組織溶解要求在1-3分鐘內(nèi)快速完成。在該實(shí)施例中，將含人臍帶組織和臍帶相關(guān)細(xì)胞的凍存樣品的凍存管直接置入37℃水浴，或其他直接而快速的加熱方法。
解凍后，立即用1000rpm離心10分鐘的方法，去除冷凍液。
實(shí)施例3人臍帶內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞克隆1、獲得供核的人臍帶內(nèi)皮細(xì)胞將實(shí)施例2或者直接培養(yǎng)獲得的人臍帶內(nèi)皮細(xì)胞，用M199或RM1640等培養(yǎng)液(加10％胎牛血清)培養(yǎng)，傳代，遺傳分析，冷凍保存或直接作供核。
2、奶山羊超排與寄母羊同步奶山羊超排每只動(dòng)物肌注PG,0.06-0.1mg/次，間隔10-14天后注射第二次，在第二次注射PG 10-14天后開始超排，即首先肌肉注射FSH，用量按7-12IU/Kg計(jì)(不同種動(dòng)物用量不盡相同)，分6次，2次/日，每次間隔8-12小時(shí)。間隔24小時(shí)發(fā)情時(shí)注射LRH,25ug/次，根據(jù)羊的體重作適當(dāng)調(diào)整。
寄母羊的同步為與提供卵母細(xì)胞胞質(zhì)的供質(zhì)母羊同步，受體母羊間隔10-14天分兩次肌肉注射PG，在供質(zhì)母羊超排注射PG前24小時(shí)，受體也同時(shí)注射PG，受體注射LRH的時(shí)間及劑量同供體。
3、卵母細(xì)胞的回收奶山羊注射LRH后28-30小時(shí)后手術(shù)回收卵母細(xì)胞。按手術(shù)常規(guī)剪毛、消毒、打開腹腔、拉出子宮與輸卵管，用10ml針筒7號(hào)針頭，沖卵液為含5％BSA的F10培養(yǎng)液，沖出輸卵管內(nèi)的卵子接于園杯內(nèi)。在體視解剖鏡下，將卵母細(xì)胞檢出置于CZB培養(yǎng)液中，37℃,5％二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
4、卵母細(xì)胞去核與注射人的體細(xì)胞將卵母細(xì)胞移于含7.5ug/ml細(xì)胞松弛素B的CZB培養(yǎng)液中20min，再移至CZB(含20mM HEPES)培養(yǎng)液中，同時(shí)將已消化成球形的臍帶內(nèi)皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞亦移至該液中。按常規(guī)將卵母細(xì)胞去核，去核后再將人的臍帶內(nèi)皮細(xì)胞直接注入卵母細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，形成的細(xì)胞被稱之為重構(gòu)卵。重構(gòu)卵置于CZB液中培養(yǎng)30分鐘，然后激活。
5、激活與包埋重構(gòu)卵于CZB+細(xì)胞松弛素B(7.5μg/ml)+離子霉素(10μm)中，37℃培養(yǎng)5分鐘。移至CZB+細(xì)胞松弛素B(7.5μg/ml)+6-DMAP(2μm)370C，液滴法培養(yǎng)2-6小時(shí)。激活后的重構(gòu)卵移至CZB中，待包埋。
包埋采用雙層包埋。所用的包埋液是0.8％與1.0％瓊脂糖(低熔點(diǎn)膠，約40℃)溶液。該包埋液是這樣制備的在10ml錐形玻璃離心管內(nèi)將適量的瓊脂糖與生理鹽水混合煮沸，至完全溶解后置于42℃，水浴待用。
包埋時(shí)，在一塑料平皿中加入含Ca2+、Mg2+的PBS液，在PBS液底部用吸管加入胎牛血清，將待包埋的卵母細(xì)胞移入血清層，使其自然下沉，待位于底壁，吸出。然后移入另一含剛倒出的0.8％瓊脂糖的小平皿中，將卵母細(xì)胞的位置移動(dòng)2-4次(起到洗滌作用)，再均勻吸卵(卵與卵之間有一定的距離，但相靠不是太遠(yuǎn))，移至PBS中。讓其自然凝固，再分割，換一口徑稍大的吸管，按相同方法進(jìn)行第二層包埋，不同點(diǎn)在于包埋液的瓊脂糖濃度為1.0％。
6、移植與回收應(yīng)用手術(shù)的方法，將包埋后的重構(gòu)卵吸入移卵管，從輸卵管喇叭口處插入移卵管，將卵移進(jìn)輸卵管內(nèi)。隨后在輸卵管與子宮連接部用縫線結(jié)扎。在體內(nèi)培養(yǎng)6天后，剪下輸卵管，用培養(yǎng)液沖出胚胎，觀察胚胎發(fā)育情況。
7、發(fā)育胚胎檢驗(yàn)與保存采用PCR方法對(duì)發(fā)育的胚胎進(jìn)行驗(yàn)證，即該胚胎是否是來(lái)自人體細(xì)胞。方法如下從發(fā)育至桑椹或囊胚的胚胎取其部分細(xì)胞進(jìn)行PCR檢測(cè)，所用的隨機(jī)單引物(10bp)的序列為5′-ACCCCCGAAG-3′，PCR反應(yīng)程序是先94℃4分鐘，然后94℃10秒→36℃15秒→72℃30秒(共40個(gè)循環(huán))，最后是72℃4分鐘。
發(fā)育至囊胚的胚胎的保存可利用其內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，建立ES細(xì)胞；或者將發(fā)育的胚胎液氮冷凍保持備用。結(jié)果如下(一)超數(shù)排卵
1、超排奶山羊總數(shù)20只2、奶山羊超排效果卵巢發(fā)育率(以卵巢直徑＞1cm計(jì))85％(17/20)平均每只奶山羊排卵數(shù)11.2枚(225/20)平均每只奶山羊回收卵數(shù)11.7枚(235/20)回收卵效率104％(235/225)(在計(jì)排卵點(diǎn)數(shù)時(shí)有誤，有的幾個(gè)排卵點(diǎn)緊靠在一起)(二)受體同步發(fā)情通過(guò)PG處理后，羊的同步率為78％(20/26)。
(三)體細(xì)胞培養(yǎng)建立嬰兒臍帶內(nèi)皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞系。在傳代供過(guò)程中進(jìn)行了染色體數(shù)分析。觀察了100分裂相，2倍體(46條染色體)占75％。
本試驗(yàn)所用的人體細(xì)胞是臍帶內(nèi)皮細(xì)胞或臍帶成纖維細(xì)胞，未進(jìn)行冷凍與饑餓處理。
(四)卵母細(xì)胞去核與注射人的體細(xì)胞去核總卵數(shù)153枚，其中成活148枚，成活率96.7％體細(xì)胞注射后成活卵數(shù)133枚重構(gòu)卵存活率89.8％(五)重構(gòu)胚發(fā)育情況重構(gòu)胚早期發(fā)育情況表
結(jié)果表明，將人嬰兒臍帶內(nèi)皮細(xì)胞移植入去核卵母細(xì)胞的發(fā)育率達(dá)到75.5％，正常發(fā)育率達(dá)到60.2％。
(六)發(fā)育胚胎的驗(yàn)證用發(fā)育胚胎的細(xì)胞與山羊胚胎(囊胚)的DNA，分別進(jìn)行隨機(jī)引物PCR分析，其檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)


圖1，其中g(shù)oat1和2分別為莎能奶山羊細(xì)胞、和本地山羊細(xì)胞，human1和human2為來(lái)自2個(gè)治療性克隆植入前胚胎的細(xì)胞。
結(jié)果表明，發(fā)育胚胎的細(xì)胞的兩個(gè)樣品間是一致的，兩種山羊囊胚間亦是一致的；而山羊囊胚與發(fā)育胚胎(其基因組來(lái)自人體細(xì)胞)之間的差別是很明顯的。因此，這證實(shí)發(fā)育胚胎來(lái)自人，即胚胎細(xì)胞中含有的是人的染色體和基因組。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1．一種對(duì)用于治療性克隆的人體細(xì)胞、組織或器官進(jìn)行凍存的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(a)將獲取的人體細(xì)胞、組織或器官浸入冷凍保護(hù)液，充分混勻冷凍保護(hù)液，使冷凍保護(hù)液充分滲透入該細(xì)胞、組織、器官；(b)起始溫度設(shè)為20±5℃，以5-15℃/分鐘降溫至5-8℃，然后持續(xù)15-30分鐘，進(jìn)行點(diǎn)冰；(c)點(diǎn)冰以后，維持5±3分鐘以使冷凍溫度仍保持在5-8℃；(d)調(diào)整降溫速度為-0.5至-1.5℃/分鐘并將溫度降至-8±1℃，維持30±20分鐘；(e)以-0.1至-0.5℃/分鐘的速度下降至低于-70℃的保存溫度。
2．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(b)-(e)是在CO2緩沖環(huán)境中進(jìn)行；而且，用液氮冷卻的金屬探棒點(diǎn)冰而形成細(xì)胞外點(diǎn)冰；
3．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，冰晶形成后，溫度以每分鐘1度的速度下降至-8℃，并保持10-50分鐘以保證冷凍組織進(jìn)入冷凍狀態(tài)之前，在冷凍保護(hù)液中達(dá)到物理和生物學(xué)平衡狀態(tài)。
4．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，人體細(xì)胞組織器官選自下組臍帶相關(guān)細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、輸卵管細(xì)胞、耳細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、卵丘細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、成骨細(xì)胞；臍帶、皮膚、乳腺。
5．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，凍存狀態(tài)的溫度為不高于-120℃。
6．如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，凍存狀態(tài)的溫度為不高于-140℃。
7．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，冷凍保護(hù)液含有細(xì)胞滲透試劑、晶體形成試劑或非晶體形成試劑，并且稀釋于選自下組的培養(yǎng)基或介質(zhì)中DMEM、IDMEM、MEM、M199、RPMI1640、Ham′s F12、Ham′s F10、NCTC109、NCTC135或磷酸緩沖鹽。
8．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，細(xì)胞滲透試劑、晶體形成試劑或非晶體形成試劑選自下組硫酸軟骨素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯乙二醇、羥乙基淀粉、甘油、丙二醇、乙烯乙二醇、二甲亞砜。
9．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，冷凍保護(hù)劑為1.5-2.5M甘油稀釋于DMEMF培養(yǎng)基中；冷凍組織，細(xì)胞浸入冷凍保護(hù)液時(shí)在20℃中完成，然后，降低溫度從20℃至6℃，降溫速度為-5至-15℃/分鐘。
10．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將凍存的人體細(xì)胞組織器官解凍，用于制備治療性克隆的供核，其步驟包括在1-3分鐘內(nèi)快速解凍，然后在體外培養(yǎng)用作供核。
全文摘要
本發(fā)明涉及對(duì)人活細(xì)胞、活組織和活器官以及原代細(xì)胞、繼代細(xì)胞和細(xì)胞株的體外保存技術(shù)。它包括將人各種組織細(xì)胞浸入冷凍保護(hù)液,與冷凍保護(hù)液充分混勻,冷凍保護(hù)液有效地滲透入組織,分階段地將溫度降至預(yù)定溫度。冷凍組織細(xì)胞在使用前可無(wú)限期保存?？捎糜谥委熜云鞴倏寺〉墓w細(xì)胞或細(xì)胞核。此外凍存的人體組織,細(xì)胞解凍復(fù)蘇后體外培養(yǎng)可作為功能基因組學(xué)研究,疾病相關(guān)基因篩選以及篩選有生物活性的化合物的原料。
文檔編號(hào)A01N1/02GK1302542SQ00111408
公開日2001年7月11日 申請(qǐng)日期2000年1月3日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月3日
發(fā)明者成國(guó)祥 申請(qǐng)人:上海中路生物工程有限公司