專利名稱：可用于基因治療和治療性篩選的eNOS突變的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在依賴Akt的磷酸化位點(diǎn)處結(jié)構(gòu)改變的新的NOS變體和突變體。改變后的NOS蛋白質(zhì)或肽及其編碼核酸分子，可以作為基因治療劑用于治療疾病血管成形術(shù)后再狹窄、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、心力衰竭、糖尿病、和血管發(fā)生缺陷的疾病。
背景技術(shù)：
動(dòng)脈粥樣硬化和血管血栓癥是導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈疾病、心肌梗死、和中風(fēng)的發(fā)病和死亡的主要原因。動(dòng)脈粥樣硬化是從血管的內(nèi)皮的變化開始。內(nèi)皮的變化可能最終導(dǎo)致部分由攝取氧化態(tài)低密度脂蛋白(LDL)膽固醇引起的內(nèi)皮病灶的發(fā)展。這種病灶的破損可以導(dǎo)致血栓形成和血管阻塞。在冠狀動(dòng)脈的情況中，復(fù)合病灶的破損可能促成心肌梗死；而在頸動(dòng)脈的情況中，可能隨之發(fā)生中風(fēng)。
在動(dòng)脈粥樣硬化性冠心病中，內(nèi)皮功能障礙可以減少血管擴(kuò)張物質(zhì)(諸如一氧化氮)的產(chǎn)生。當(dāng)由于限流性冠狀動(dòng)脈狹窄或內(nèi)皮功能障礙導(dǎo)致自動(dòng)調(diào)控的血管舒張受到阻礙時(shí)，則發(fā)生心肌缺血。在這兩種情況中，動(dòng)脈血流不再能夠隨上升的氧需求而成比例增加。在其它情形中，當(dāng)氧需求保持不變，但存在冠狀動(dòng)脈痙攣導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈血流明顯減少，下面的動(dòng)脈粥樣硬化性斑塊快速發(fā)展導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈內(nèi)腔口徑減小，和/或血小板聚集引起微血管間歇性阻塞時(shí)，可能發(fā)生心肌缺血。
氣球血管成形術(shù)常用于因斑塊而變窄的血管的再開。雖然氣球血管成形術(shù)在打開血管的情況中成功率很高，但是它常常在手術(shù)過程中使內(nèi)皮裸露并損傷血管。這種損傷引起血管平滑肌細(xì)胞遷移至損傷部位并增殖，形成病灶，稱為肌內(nèi)膜增生或再狹窄。這一新病灶導(dǎo)致在血管成形術(shù)后3-6個(gè)月內(nèi)有顯著比例的患者癥狀復(fù)發(fā)。
在動(dòng)脈粥樣硬化、血栓癥、和再狹窄中，還存在正常血管功能的喪失，使得血管傾向于收縮而非擴(kuò)張。血管的過度收縮引起血管內(nèi)腔進(jìn)一步變窄，從而限制血流。這可以引起諸如心絞痛(如果涉及心動(dòng)脈)或暫時(shí)性腦缺血(即“小中風(fēng)”，如果涉及腦血管)。在其它疾病狀態(tài)中也發(fā)生這種血管功能異常(血管收縮過度或血管擴(kuò)張不足)。高血壓是由血管過度收縮以及血管壁變厚(特別是較小的血管)引起的。該過程可能影響肺血管并引起肺性高血壓。已知與血管收縮過度或血管擴(kuò)張不足有關(guān)的其它病癥包括移植性動(dòng)脈粥樣硬化、充血性心力衰竭、妊娠毒血癥、Raynaud現(xiàn)象、Prinzmetal心絞痛(冠狀動(dòng)脈血管痙攣)、腦血管痙攣、溶血性尿毒癥、和性無能。
由內(nèi)皮釋放的物質(zhì)，最初稱為“內(nèi)皮衍生的松弛因子”(EDRF)，在抑制這些病理性過程中具有重要作用。現(xiàn)在已知EDRF就是一氧化氮(NO)。NO在人的生理學(xué)中具有許多作用，包括松弛血管平滑肌、抑制血小板聚集、抑制有絲分裂、使血管平滑肌增殖、和粘附白細(xì)胞。因?yàn)镹O是最具潛力的內(nèi)源性血管擴(kuò)張劑，因?yàn)樗谶\(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的導(dǎo)管性動(dòng)脈血管舒張中起主要作用，所以增強(qiáng)NO合成也可以提高正常個(gè)體和血管病患者的運(yùn)動(dòng)能力。
內(nèi)皮一氧化氮合酶(eNOS)是對(duì)維持全身血壓、血管改造、和血管發(fā)生起作用的一氧化氮合酶(NOS)異構(gòu)體(Shesely等人，1996；Huang等人，1995；Rudic等人，1998；Murohara等人，1998)。因?yàn)閮?nèi)皮生成的NO不足是動(dòng)脈粥樣硬化和血管損傷的早期而持續(xù)的特征，所以經(jīng)證明，eNOS是血管基因治療中極有吸引力的靶。雖然eNOS激活的調(diào)控機(jī)制大部分還不清楚，但eNOS應(yīng)答多種形式的細(xì)胞刺激而發(fā)生磷酸化是已知的(Michel等人，1993；Garcia-Cardena等人，1996；Corson等人，1996)，但是磷酸化在一氧化氮(NO)生成中的作用和負(fù)責(zé)的激酶以前未有闡述。
發(fā)明概述本發(fā)明部分產(chǎn)生于新發(fā)現(xiàn)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Akt(蛋白激酶B)可以直接使eNOS中對(duì)應(yīng)于牛eNOS第1179位殘基或人eNOS第1177位殘基的絲氨酸殘基發(fā)生磷酸化并激活eNOS導(dǎo)致生成NO。突變型eNOS(S1179A或S1177A)對(duì)Akt磷酸化和激活有抗性，而突變型eNOS(S1179D或S1177D)或(S1179E或S1177E)是具有組成活性的。此外，使用腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，激活的Akt增強(qiáng)從內(nèi)皮細(xì)胞釋放基礎(chǔ)NO，而激活缺陷的Akt減少由VEGF刺激的NO生成。因此，eNOS是新描述的Akt底物，這一底物通過Akt將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與氣體第二信使NO的釋放相聯(lián)系。本發(fā)明部分還基于這兩發(fā)現(xiàn)突變型eNOS(S1179D)展示能增高NO生成速率和增強(qiáng)還原酶的活性。
本發(fā)明包括NOS多肽或蛋白質(zhì)及其分離的編碼核酸分子，其中NOS多肽或蛋白質(zhì)包含對(duì)應(yīng)于牛eNOS第1179位殘基、人eNOS第1177位殘基、大鼠nNOS第1412位殘基、或人nNOS第1415位殘基的替代氨基酸殘基。優(yōu)選的替代包括R基團(tuán)帶負(fù)電的氨基酸，包括天冬氨酸和谷氨酸。
本發(fā)明還包括NOS多肽或蛋白質(zhì)及其分離的編碼核酸分子，其中NOS多肽或蛋白質(zhì)包括對(duì)應(yīng)于牛eNOS第1179位殘基、人eNOS第1177位殘基、大鼠nNOS第1412位殘基、或人nNOS第1415位殘基的替代氨基酸殘基。優(yōu)選的替代包括R基團(tuán)不帶負(fù)電的氨基酸，諸如丙氨酸。
本發(fā)明提供了用于在內(nèi)源血管發(fā)生有缺陷的局部缺血性疾病(尤其是外周血管疾病和/或心肌缺血)患者中刺激側(cè)副血管發(fā)育的方法，包括遞送編碼本發(fā)明NOS多肽或Akt多肽的轉(zhuǎn)化基因。
本發(fā)明還包括表達(dá)本發(fā)明NOS多肽的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
最后，本發(fā)明包括用于鑒定調(diào)節(jié)受Akt調(diào)控的NOS活性的試劑的方法，一般包括步驟(a)將試劑與純化的NOS(優(yōu)選eNOS或nNOS)或者表達(dá)NOS(優(yōu)選eNOS或nNOS)的細(xì)胞，以及Akt接觸；并(b)測(cè)量受Akt調(diào)控的NOS(優(yōu)選eNOS或nNOS)活性。
圖的簡(jiǎn)述


圖1A-1B。是野生型的Akt，而非無激酶活性的Akt增加了由表達(dá)膜相關(guān)eNOS的細(xì)胞釋放的NO。在
圖1A中，在不存在或存在Akt或無激酶活性的Akt(K179M)的情況下用eNOS的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞，通過化學(xué)發(fā)光測(cè)定NO產(chǎn)量(以NO2-測(cè)定)。在
圖1B中，用如上的各種NOS質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞。在
圖1A和
圖1B中，從只用β-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)染的細(xì)胞獲得的水平減去NO2-產(chǎn)量。插圖顯示了總細(xì)胞裂解物中的蛋白質(zhì)表達(dá)。數(shù)據(jù)是平均值±SEM，n＝3-7次實(shí)驗(yàn)；*表示p＜0.05。
圖2A-2D。由有活性的Akt在體外和體內(nèi)進(jìn)行的eNOS磷酸化。在圖2A中，用HA-Akt或HA-Akt(K179M)轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞，免疫沉淀裂解物，并與作為底物的組蛋白2B(25mg)或重組eNOS(3mg)一起置于體外激酶反應(yīng)中。上面的圖描繪了底物中摻入的32P，下面的圖顯示了考馬斯染色的凝膠中底物的量。在圖2B中，從轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞親和純化32P標(biāo)記的野生型eNOS或雙絲氨酸突變eNOS(eNOS S635/1179)，并進(jìn)行自顯影(上面的圖)或Western印跡(下面的圖)。圖2B中的圖形數(shù)據(jù)反映了凝膠中經(jīng)標(biāo)記蛋白質(zhì)相對(duì)于免疫反應(yīng)性eNOS量的相對(duì)量。在圖2C中，用胰蛋白酶消化經(jīng)標(biāo)記eNOS，并通過RP-HPLC區(qū)分肽。上面的層析圖記錄了一個(gè)占優(yōu)勢(shì)的經(jīng)標(biāo)記胰蛋白酶消化肽，該肽隨未標(biāo)記合成磷肽標(biāo)準(zhǔn)共遷移(下面的層析圖)。插圖證明了經(jīng)標(biāo)記肽(上圖)和磷肽標(biāo)準(zhǔn)具有相同的質(zhì)量-離子的線性模式MS。在圖2D中，純化了重組野生型eNOS或eNOS S1179A，并如上述方法以等量(2.4mg)與重組Akt一起置于體外激酶反應(yīng)中。圖2D的上圖描繪了eNOS中摻入的32P，下圖顯示了考馬斯染色的凝膠中底物的量。圖形數(shù)據(jù)(n＝3)反映了標(biāo)記的eNOS相對(duì)于體外激酶反應(yīng)中eNOS量(考馬斯)的相對(duì)量。
圖3。證明第1179位絲氨酸對(duì)于Akt刺激NO釋放的功能是重要的。在不存在或存在Akt的情況中，用野生型eNOS或eNOS突變體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞，測(cè)定蛋白質(zhì)表達(dá)和NO產(chǎn)量(以NO2-測(cè)定)。有趣的是，S1179突變成S的構(gòu)建物不是由Akt激活的，而S1179突變成D導(dǎo)致獲得功能。在A中，數(shù)據(jù)是4-7次實(shí)驗(yàn)的平均值±SEM；*代表顯著差異(p＜0.05)。
圖4A-4C。Akt在內(nèi)皮細(xì)胞中調(diào)控NO的基礎(chǔ)和受激生成。在圖4A中，用腺病毒構(gòu)建物(作為對(duì)照的β-gal、myr-Akt、和AA-Akt)感染BLMVEC，并測(cè)定24小時(shí)的NO2-產(chǎn)量(n＝3)。插圖顯示了eNOS和Akt的表達(dá)。在圖4B中，檢驗(yàn)了腺病毒感染的BLMVEC的裂解物的NOS活性。將等量的蛋白質(zhì)(50mg)與各種濃度的游離鈣一起溫育，并測(cè)定NOS活性(n＝3次實(shí)驗(yàn))。在圖4C中，加上用腺病毒感染BLMVEC，隨后用VEGF(40ng/ml)刺激30分鐘，并通過化學(xué)發(fā)光對(duì)NO2-釋放進(jìn)行量化。數(shù)據(jù)表述為減去基礎(chǔ)水平后的VEGF刺激的NO2-釋放。數(shù)據(jù)是平均值±SEM，n＝4；*代表顯著差異(p＜0.05)。
圖5A-5B。野生型和eNOS S1179D的純度和二聚體/單體比率。在A和B中，進(jìn)行了SDS-PAGE分析，使用7.5％聚丙烯酰胺凝膠，考馬斯藍(lán)染色。分子量標(biāo)準(zhǔn)(第1道)及其大小(以kDa表示)位于左邊。野生型eNOS(第2道)和eNOS S1179D(第3道)(每道1μg)由箭頭指示。在B中，蛋白質(zhì)(每道2μg)在SDS-PAGE上于4℃進(jìn)行電泳分離。分子量標(biāo)準(zhǔn)位于第1道。野生型和eNOS S1179D未煮過的樣品依次位于第2道和第3道。在第4道中，野生型eNOS在SDS加樣緩沖液中煮過。
圖6A-6B。eNOS S1179D比野生型eNOS具有更高速率的NO產(chǎn)量(A)和還原酶活性(B)。在A中，使用血紅蛋白捕獲實(shí)驗(yàn)，作為L(zhǎng)-精氨酸濃度的函數(shù)，測(cè)定了由野生型(●)和S1179D(○)eNOS生成NO的速率，數(shù)據(jù)以雙倒數(shù)曲線表述。在B中，在存在或不存在CaM的情況下，進(jìn)行了DCIP和細(xì)胞色素c實(shí)驗(yàn)。數(shù)值是平均值±S.E.，n＝4-6次測(cè)定。由至少3份酶制劑獲得相似結(jié)果。野生型與S1179D eNOS之間的顯著差異(p＜0.05)由星號(hào)指示。
圖7A-7B。與野生型相比，eNOS S1179D的NOS活性(A)和依賴NADPH的還原酶活性(B)增加對(duì)野生型和S1179D eNOS都進(jìn)行了血紅蛋白捕獲實(shí)驗(yàn)(A)和依賴NADPH的細(xì)胞色素c還原實(shí)驗(yàn)(B)。在A中，在存在所有NOS輔助因子的情況中，測(cè)定了野生型(實(shí)心符號(hào))和S1179D(空心符號(hào))eNOS生成NO的速率。在不存在精氨酸和BH4(A)、存在(實(shí)心符號(hào))或不存在(空心符號(hào))120nM鈣調(diào)蛋白的情況下，測(cè)定了野生型(圓圈)和S1179D(三角)還原細(xì)胞色素c的速率。數(shù)值是平均值±S.E.，n＝至少3份酶制劑的3-6次測(cè)定。
圖8A-8D。對(duì)于S1179D eNOS，依賴鈣調(diào)蛋白和鈣的NOS的激活和還原酶活性略微增強(qiáng)。對(duì)野生型(實(shí)心符號(hào))和S1179D eNOS(空心符號(hào))都進(jìn)行了依賴鈣調(diào)蛋白的血紅蛋白捕獲(A)和細(xì)胞色素c還原(B)實(shí)驗(yàn)。由血紅蛋白捕獲方法檢測(cè)的NO生成速率是在存在所有NOS輔助因子的情況下進(jìn)行的，而細(xì)胞色素c還原是在不存在精氨酸和BH4的情況下進(jìn)行的。在C和D中，在游離鈣濃度增加的情況下，進(jìn)行了相同實(shí)驗(yàn)。C和D中的插圖描繪了S1179D和野生型eNOS在NO生成和細(xì)胞色素c實(shí)驗(yàn)中的依賴鈣的轉(zhuǎn)換。野生型和S1179D eNOS的最大轉(zhuǎn)換率依次如下A，22和43min-1；B，620和1400min-1；C，58和100min-1；D，1930和3810min-1。數(shù)值是平均值±S.E.，n＝至少3份酶制劑的3-6次測(cè)定。
圖9A-9B。S1179D eNOS中，由EGTA啟動(dòng)的NOS失活降低。如上所述，和下列修改，進(jìn)行了血紅蛋白捕獲實(shí)驗(yàn)(A)和還原酶實(shí)驗(yàn)(B)。監(jiān)控反應(yīng)1分鐘以測(cè)定起始速率；然后向反應(yīng)混和物中加入EGTA，并再次監(jiān)控速率1分鐘。反應(yīng)中的游離鈣濃度為200μM，加入的EGTA的量使得螯合劑終濃度為0、200、400、和600μM。將野生型和S1179D eNOS的特異活性相對(duì)100％標(biāo)準(zhǔn)化。數(shù)值是平均值±S.E.，n＝至少3份酶制劑的3-6次測(cè)定。nd表示野生型eNOS無可檢測(cè)活性。
發(fā)明詳述A.一般描述本發(fā)明部分基于下列發(fā)現(xiàn)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Akt(蛋白激酶B)可以直接使eNOS的第1179位絲氨酸(人eNOS的第1177位絲氨酸)發(fā)生磷酸化并激活導(dǎo)致NO生成的酶而突變型eNOS(S1179A)對(duì)Akt磷酸化和激活有抗性。此外，使用腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，激活的Akt增加了由內(nèi)皮細(xì)胞釋放的基礎(chǔ)NO，而激活缺陷的Akt減少了VEGF刺激的NO生成。由此，eNOS是新近描述的Akt底物，它通過Akt將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與氣體第二信使NO的釋放相聯(lián)系。本發(fā)明部分還基于發(fā)現(xiàn)突變型eNOS(例如S1179D)展示NO生成速率增加和還原酶活性增加。
NO生成受依賴Akt的eNOS磷酸化調(diào)控的論證提供了新的具有組成活性的eNOS突變體，這一突變體可用于與NO合成或生物學(xué)活性的功能障礙有關(guān)的心血管疾病中，以改進(jìn)內(nèi)皮功能為目的的基因治療。這些疾病包括血管成形術(shù)后再狹窄、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、心力衰竭(包括心肌梗死)、糖尿病、和血管發(fā)生缺陷的疾病。此發(fā)現(xiàn)還提供了新的治療靶，可用于設(shè)計(jì)治療與NO合成或生物學(xué)活性的功能障礙有關(guān)的疾病的藥物。
本發(fā)明還提供了新的具有組成活性的nNOS突變體，這些突變體在大鼠nNOS第1412位或人nNOS第1415位殘基有替代氨基酸，可用于目的在于治療疾病的基因治療。
B.詳細(xì)描述NOS突變型蛋白質(zhì)或多肽的產(chǎn)生本發(fā)明提供了NOS蛋白質(zhì)或多肽、NOS蛋白質(zhì)的等位基因變體、和NOS蛋白質(zhì)的保守氨基酸替代，所有這些在Akt介導(dǎo)的磷酸化位點(diǎn)包含絲氨酸殘基的突變。例如，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽包括(但不限于)(1)包含第1177位絲氨酸向其它氨基酸(諸如丙氨酸)的突變、且對(duì)Akt介導(dǎo)的磷酸化有抗性的人eNOS蛋白質(zhì)(Janssens等人，生物化學(xué)雜生(J.Biol.Chem.) 26714519-14522，1992，本文中全文引用作為參考)；(2)包含第1179位絲氨酸向其它氨基酸(諸如丙氨酸)的突變、且對(duì)Akt介導(dǎo)的磷酸化有抗性的牛eNOS蛋白質(zhì)(美國(guó)專利5,498,539的SEQ ID NO2，在本文中全文引用作為參考)；(3)包含第1415位絲氨酸向其它氨基酸(諸如丙氨酸)的突變、且對(duì)Akt介導(dǎo)的磷酸化有抗性的人nNOS蛋白質(zhì)；(4)包含第1412位絲氨酸向其它氨基酸(諸如丙氨酸)的突變、且對(duì)Akt介導(dǎo)的磷酸化有抗性的大鼠nNOS蛋白質(zhì)；(5)包含第1177位絲氨酸向R基團(tuán)帶負(fù)電的氨基酸(諸如天冬氨酸或谷氨酸)的突變、且組成性有活性并展示NO生成增加和還原酶活性增加的人eNOS蛋白質(zhì)；(6)包含第1179位絲氨酸向R基團(tuán)帶負(fù)電的氨基酸(諸如天冬氨酸或谷氨酸)的突變、且組成性有活性并展示NO生成增加和還原酶活性增加的牛eNOS蛋白質(zhì)；(7)包含第1415位絲氨酸向R基團(tuán)帶負(fù)電的氨基酸(諸如天冬氨酸或谷氨酸)的突變、且組成性有活性并展示NO生成增加和還原酶活性增加的人nNOS蛋白質(zhì)；(8)包含第1412位絲氨酸向R基團(tuán)帶負(fù)電的氨基酸(諸如天冬氨酸或谷氨酸)的突變、且組成性有活性并展示NO生成增加和還原酶活性增加的大鼠nNOS蛋白質(zhì)；和(9)來自除了人、牛、或大鼠之外的物種，經(jīng)修飾在對(duì)應(yīng)于人eNOS第1177位、牛eNOS第1179位、大鼠nNOS第1412位、和人nNOS第1415位絲氨酸的位置包含除了絲氨酸之外的氨基酸，且或是對(duì)Akt介導(dǎo)的磷酸化有抗性；或是具有組成活性的，抑或展示NO生成增加和還原酶活性增加的eNOS蛋白質(zhì)。NOS突變體還可以通過突變磷酸化基序RXRKXS/T中的其它氨基酸來產(chǎn)生。
本發(fā)明提供了展示NO生成和還原酶活性增加、并在Akt介導(dǎo)的磷酸化位點(diǎn)的絲氨酸殘基處包含突變的具有組成活性的NOS多肽(優(yōu)選eNOS或nNOS)。獲得展示NO生成和還原酶活性增加的這些NOS多肽的保守性變體(諸如替代、刪除、和插入突變體)同樣屬于本領(lǐng)域技術(shù)范疇。如本文所用，保守性變體指對(duì)具有組成活性的NOS(優(yōu)選eNOS或nNOS)生成NO的能力或具有組成活性的NOS(優(yōu)選eNOS或nNOS)的還原酶活性無不良影響的氨基酸序列中的改變。當(dāng)改變后的序列影響組成性NOS的能力使得NO生成水平和還原酶活性不比野生型NOS高時(shí)，則說替代、插入、或刪除對(duì)具有組成活性的NOS多肽有不良影響。例如，可以改變組成性NOS的總電荷、結(jié)構(gòu)、或疏水/親水特性，而對(duì)組成性NOS的活性無不良影響。因此，可以改變NOS多肽的氨基酸序列，例如使得多肽更疏水或親水，而對(duì)NOS的活性無不良影響。
如在本文中所用，“具有組成活性的”NOS突變體或變體，無論是經(jīng)修飾的還是天然來源的，是指生成NO的速率高于在對(duì)應(yīng)于人NOS第1177位殘基或牛NOS第1179位殘基的氨基酸殘基處包含未磷酸化形式的絲氨酸的天然NOS的NOS蛋白質(zhì)(優(yōu)選eNOS或nNOS)。優(yōu)選的具有組成活性的變體在對(duì)應(yīng)于人NOS第1177位或牛NOS第1179位的氨基酸殘基處包含R基團(tuán)帶負(fù)電的氨基酸，諸如天冬氨酸或谷氨酸。
本發(fā)明提供了NOS蛋白質(zhì)或多肽、NOS蛋白質(zhì)的等位基因變體、和包含對(duì)應(yīng)于牛eNOS第1177位殘基、人eNOS第1179位殘基、大鼠nNOS第1412位殘基、或人nNOS第1415位殘基的替代氨基酸殘基的NOS蛋白質(zhì)的保守氨基酸替代，其中替代氨基酸殘基的R基團(tuán)不帶負(fù)電，諸如丙氨酸。
本發(fā)明的NOS蛋白質(zhì)(優(yōu)選eNOS或nNOS蛋白質(zhì))可以是分離的形式。如在本文中所用，當(dāng)采用物理的、機(jī)械的、或化學(xué)的方法從通常與蛋白質(zhì)結(jié)合的細(xì)胞成分中移取蛋白質(zhì)時(shí)，則說蛋白質(zhì)是分離的。熟練技術(shù)人員可以容易地采用標(biāo)準(zhǔn)純化方法來獲得分離的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還包括跨越對(duì)應(yīng)于牛eNOS第1179位殘基、人eNOS第1177位殘基、大鼠nNOS第1412位殘基、或人nNOS第1415位殘基的Akt磷酸化位點(diǎn)的NOS肽。肽可以在磷酸化位點(diǎn)包含絲氨酸，或者優(yōu)選地在對(duì)應(yīng)于牛eNOS第1179位殘基、人eNOS第1177位殘基、大鼠nNOS第1412位殘基、或人nNOS第1415位殘基的位置處包含絲氨酸的替代氨基酸。這些替代氨基酸包括(但不限于)R基團(tuán)模擬磷酸化狀態(tài)絲氨酸的氨基酸，諸如天冬氨酸或谷氨酸。這些替代還包括R基團(tuán)不帶負(fù)電的氨基酸，諸如丙氨酸?？缭酱宋稽c(diǎn)的肽的長(zhǎng)度可以是3、5、7、10、12、15、17、20、25、30、40、50、或更多氨基酸。
可以通過可獲得的任何方法來制備本發(fā)明的NOS蛋白質(zhì)、多肽、或肽，包括從經(jīng)修飾取代或改變了編碼對(duì)應(yīng)于人eNOS第1177位、牛eNOS第1179位、大鼠nNOS第1412位、或人nNOS第1415位絲氨酸的絲氨酸的核苷酸三聯(lián)體的NOS cDNA重組表達(dá)。任何可獲得的技術(shù)都可用于突變編碼絲氨酸殘基的核苷酸三聯(lián)體，諸如同源重組、定點(diǎn)誘變、或PCR誘變(參閱Sambrook等人，《分子克隆》(Molecular Cloning)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989)。起始的cDNA可以包括人和牛eNOS cDNA，以及編碼其它動(dòng)物物種的eNOS蛋白質(zhì)的cDNA，包括(但不限于)兔、大鼠、小鼠、豬、羊、馬、和非人靈長(zhǎng)類物種。
如在本文中所用，當(dāng)核酸分子基本上與核酸來源中編碼其它多肽的污染核酸分開時(shí)，則說編碼NOS蛋白質(zhì)或多肽(優(yōu)選eNOS或nNOS蛋白質(zhì)或多肽)的本發(fā)明核酸分子是“分離的”。
本發(fā)明還提供了編碼核酸分子的片段。如在本文中所用，編碼核酸分子的片段指完整蛋白質(zhì)編碼序列的一小部分。片段的大小將由意欲用途決定。例如，如果片段是選擇用來編碼蛋白質(zhì)的活性部分的，那么片段的長(zhǎng)度將需要足以編碼蛋白質(zhì)的功能區(qū)，包括Akt磷酸化位點(diǎn)。如果片段是用作核酸探針或PCR引物，那么在探查跨越NOS中Akt磷酸化位點(diǎn)的區(qū)域或引發(fā)NOS Akt磷酸化位點(diǎn)的側(cè)翼區(qū)域的過程中，選擇的片段長(zhǎng)度將獲得較小數(shù)目的假陽性。
可以容易地通過化學(xué)技術(shù)，例如Matteucci等人(美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)會(huì)刊(J.Am.Chem.Soc.) 1033185-3191，1981)的磷酸三酯法，或者使用自動(dòng)合成法，合成作為探針或特異引物(用于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，或用于合成編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的基因序列)使用的本發(fā)明的編碼核酸分子的片段(即合成寡核苷酸)。另外，通過眾所周知的方法可以容易地制備較大的DNA片段，諸如合成一組定義基因各個(gè)模塊片段的寡核苷酸，隨后連接這些寡核苷酸以構(gòu)建完整修飾的基因。
本發(fā)明的編碼核酸分子還可以進(jìn)一步修飾從而包含用于診斷和探測(cè)目的的可檢測(cè)標(biāo)記。本領(lǐng)域已知多種這樣的標(biāo)記，而且可以容易地與在本文中所述的編碼分子一起采用。合適的標(biāo)記包括(但不限于)生物素、放射性標(biāo)記核苷酸、等等。熟練技術(shù)人員可以采用任何本領(lǐng)域已知的標(biāo)記來獲得已標(biāo)記的編碼核酸分子。
本發(fā)明還提供了包含上述NOS編碼序列的重組DNA分子(rDNA)。如在本文中所用，rDNA分子是進(jìn)行了分子操作的DNA分子。產(chǎn)生rDNA分子的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，參閱Sambrook等人，《分子克隆》(Molecular Cloning)，1989。在優(yōu)選的rDNA分子中，編碼DNA序列是與表達(dá)控制序列和/或載體序列可操作連接的。
正如本領(lǐng)域眾所周知的，與本發(fā)明蛋白質(zhì)家族編碼序列之一可操作連接的載體和/或表達(dá)控制序列的選擇直接取決于期望的功能特性(如蛋白質(zhì)表達(dá))和轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。本發(fā)明所關(guān)注的載體至少能夠指導(dǎo)rDNA分子中包含的結(jié)構(gòu)基因的復(fù)制或插入宿主染色體中，優(yōu)選還能夠表達(dá)。
用于調(diào)控可操作連接的蛋白質(zhì)編碼序列的表達(dá)的表達(dá)控制元件在本領(lǐng)域是已知的，包括(但不限于)可誘導(dǎo)啟動(dòng)子、組成性啟動(dòng)子、分泌信號(hào)、和其它調(diào)控元件。優(yōu)選的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子是易于控制的，諸如應(yīng)答宿主細(xì)胞培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，含編碼核酸分子的載體將包括原核復(fù)制子，即在用重組DNA分子轉(zhuǎn)化的原核宿主細(xì)胞(諸如細(xì)菌宿主細(xì)胞)中具有指導(dǎo)其自主復(fù)制并維持在染色體外的能力的DNA序列。這些復(fù)制子在本領(lǐng)域是眾所周知的。另外，包含原核復(fù)制子的載體還可以包含其表達(dá)給出可檢測(cè)標(biāo)記(諸如藥物抗性)的基因。典型的細(xì)菌藥物抗性基因是給出氨芐青霉素或四環(huán)素抗性的基因。
包含原核復(fù)制子的載體還可以包含能夠在細(xì)菌宿主細(xì)胞(諸如大腸桿菌)中指導(dǎo)編碼基因序列表達(dá)(轉(zhuǎn)錄和翻譯)的原核或噬菌體啟動(dòng)子。啟動(dòng)子是由允許RNA聚合酶結(jié)合和啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的DNA序列形成的表達(dá)控制元件。與細(xì)菌宿主兼容的啟動(dòng)子序列通常供應(yīng)在含便于插入本發(fā)明DNA片段的限制性位點(diǎn)的質(zhì)粒載體中。這些載體質(zhì)粒的典型例子是可以從Biorad Laboratories(Richmond，CA)獲得的pUC8、pUC9、pBR322、和pBR329，和可以由Pharmacia(Piscataway，NJ)獲得的pPL和pKK223。
與真核細(xì)胞兼容的表達(dá)載體，優(yōu)選與脊椎動(dòng)物細(xì)胞兼容的表達(dá)載體，也可以用于形成含編碼序列的rDNA分子。真核細(xì)胞表達(dá)載體在本領(lǐng)域是眾所周知的，可以由多個(gè)商業(yè)性來源獲得。通常，提供的這些載體包含便于插入需要的DNA片段的限制性位點(diǎn)。這些載體的典型例子是pSVL和pKSV-10(Pharmacia)、pBPV-1/pML2d(International Biotechnologies公司)、pTDT1(ATCC編號(hào)31255)、等等真核表達(dá)載體。
用于構(gòu)建本發(fā)明rDNA分子的真核細(xì)胞表達(dá)載體還可以包含在真核細(xì)胞中有效的可選擇標(biāo)記，優(yōu)選藥物抗性選擇標(biāo)記。優(yōu)選的藥物抗性標(biāo)記是其表達(dá)導(dǎo)致新霉素抗性的基因，即新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neo)基因(Southern等人，分子和分析遺傳學(xué)雜志(J.Mol.Anal.Genet.) 1327-341，1982)?；蛘?，可選擇標(biāo)記可以存在于另一個(gè)質(zhì)粒上，且通過共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞導(dǎo)入兩種載體，并通過在對(duì)應(yīng)可選擇標(biāo)記的適當(dāng)藥物中培養(yǎng)來進(jìn)行選擇。
本發(fā)明還提供了用編碼本發(fā)明NOS蛋白質(zhì)(優(yōu)選eNOS或nNOS蛋白質(zhì))的核酸分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是原核的或真核的?？捎糜诒磉_(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)的原核細(xì)胞是不受限制的，只要細(xì)胞系與細(xì)胞培養(yǎng)方法兼容且與表達(dá)載體的增殖和基因產(chǎn)物的表達(dá)兼容。優(yōu)選的真核宿主細(xì)胞包括(但不限于)酵母、昆蟲、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選脊椎動(dòng)物細(xì)胞，諸如來自小鼠、大鼠、猴、或人細(xì)胞系的細(xì)胞。優(yōu)選的真核宿主細(xì)胞系包括可以從ATCC以CCL61號(hào)獲得的中國(guó)倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、可以從ATCC以CRL1658號(hào)獲得的NIH瑞士小鼠胚胎細(xì)胞NIH/3T3、倉鼠幼體腎細(xì)胞(BHK)、等等真核組織培養(yǎng)細(xì)胞系。任何原核宿主都可用于表達(dá)編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的rDNA分子。特定地，對(duì)于具有組成活性的NOS突變體，優(yōu)選的原核宿主是大腸桿菌。
可以使用眾所周知的方法實(shí)現(xiàn)用本發(fā)明rDNA分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染合適的細(xì)胞宿主，方法通常取決于所采用的載體類型和宿主系統(tǒng)。至于原核宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，通常采用電穿孔和鹽處理方法，參閱例如Cohen等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci. USA)692110，1972；和Maniatis等人，《分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular Cloning，ALaboratory Manual)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，NY，1982。至于用含rDNA的載體轉(zhuǎn)化脊椎動(dòng)物細(xì)胞，通常采用電穿孔、陽離子脂類、或鹽處理方法，參閱例如Graham等人，病毒學(xué)(Virol.) 52456，1983；和Wigler等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci. USA)761373-1376，1979?？梢允褂帽娝苤募夹g(shù)，包括選擇可選擇標(biāo)記，來鑒定經(jīng)成功轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，即包含本發(fā)明rDNA分子的細(xì)胞。例如，可以克隆導(dǎo)入了本發(fā)明rDNA的細(xì)胞以產(chǎn)生單個(gè)菌落。收獲并裂解那些菌落的細(xì)胞，使用諸如Southern(分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.) 98503，1975)或Berent等人(生物技術(shù)(Biotech.) 3208，1985)描述的方法，對(duì)它們的DNA內(nèi)容物，檢驗(yàn)rDNA的存在，或者使用免疫學(xué)方法，檢驗(yàn)細(xì)胞的蛋白質(zhì)生成。
本發(fā)明還提供了使用在本文中所述的核酸分子生產(chǎn)本發(fā)明NOS蛋白質(zhì)(優(yōu)選eNOS蛋白質(zhì)或nNOS蛋白質(zhì))的方法。一般而言，重組形式蛋白質(zhì)的生成通常涉及下列步驟。首先獲得編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核酸分子。如果編碼序列未被內(nèi)含子中斷，那么它直接適用于在任何宿主中表達(dá)。然后，如上所述，優(yōu)選將核酸分子與合適的控制序列可操作連接以形成含蛋白質(zhì)開放讀碼框的表達(dá)單位。將表達(dá)單位用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染合適的宿主，并在允許重組蛋白質(zhì)生成的條件下培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化或經(jīng)轉(zhuǎn)染的宿主。任選地，由培養(yǎng)基或細(xì)胞分離重組蛋白質(zhì)；在容忍一些雜質(zhì)的某些情況中，蛋白質(zhì)的回收和純化可能是不必要的。
可以以多種方式進(jìn)行上述任一步驟。例如，需要的編碼序列可以從基因組片段獲得，并直接用于合適的宿主中。如上所述，使用合適的復(fù)制子和控制序列完成在各種宿主中可操作的表達(dá)載體的構(gòu)建。控制序列、表達(dá)載體、和轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染方法取決于表達(dá)基因的宿主細(xì)胞的類型，而且以前已經(jīng)詳細(xì)討論過。如果不能以通常方式獲得合適的限制性位點(diǎn)，那么可以添加在編碼序列的末端，從而提供將插入這些載體中的可切割基因。熟練技術(shù)人員可以容易地采用本領(lǐng)域已知的任何宿主/表達(dá)系統(tǒng)，與本發(fā)明核酸分子一起，用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)。
基因治療本發(fā)明涵蓋與使用最合適的遞送路徑的適宜的基因表達(dá)系統(tǒng)相結(jié)合的任何合適的基因遞送系統(tǒng)。例如，可以在體外或在體內(nèi)將本發(fā)明的NOS突變或變異基因(優(yōu)選eNOS或nNOS突變或變異基因)或Akt基因轉(zhuǎn)移至心臟(或骨骼肌)，包括心肌細(xì)胞(和骨骼肌細(xì)胞)以指導(dǎo)所編碼的蛋白質(zhì)的生成。特別有用的是人Akt基因和NOS突變體，優(yōu)選地，在對(duì)應(yīng)于人eNOS第1177位絲氨酸處包含R基團(tuán)帶負(fù)電的氨基酸(諸如天冬氨酸或谷氨酸)的人eNOS。施用NOS突變體或變異基因的路徑包括(但不限于)血管內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、真皮內(nèi)、和動(dòng)脈內(nèi)注射。
腺病毒基因遞送系統(tǒng)提供了幾種優(yōu)勢(shì)腺病毒可以(i)接納較大的DNA插入片段；(ii)生長(zhǎng)至高滴度；(iii)感染廣泛的哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型；和(iv)與大量可獲得的含不同啟動(dòng)子的載體一起使用。并且，因?yàn)橄俨《驹谘髦惺欠€(wěn)定的，所以它們可以通過靜脈內(nèi)注射來給藥。優(yōu)選的遞送載體是不依賴輔助噬菌體的復(fù)制缺陷型人腺病毒5，但是也可以獲得并使用其它遞送方法，包括直接向感興趣的細(xì)胞遞送核酸(參閱Sawa等人，基因治療(Gene Ther.)5(11)1472-1480，1998；Labhasetwar等人，藥物科學(xué)雜志(J.Pharm.Sci.) 87(11)1347-1350，1998；Lin等人，高血壓(Hypertension)30307-313，1997；Chen等人，循環(huán)研究(Circ.Res.)80(3)327-335，1997；Channon等人，心血管研究(Cardiovasc.Res.)32962-972，1996；Harv Heart Lett.9(8)5-6，1999；和Nabel等人，自然醫(yī)學(xué)(Nat. Med.)5(2)141-142，1999)。
已經(jīng)證明，使用腺病毒5系統(tǒng)，通過一次冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射，在體內(nèi)心肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染率超過60％(Giordano和Hammond，臨床研究(Clin.Res.) 42123A，1994)。非復(fù)制重組型腺病毒載體在轉(zhuǎn)染冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮和心肌細(xì)胞中特別有用，在冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射后產(chǎn)生高效率的轉(zhuǎn)染。非復(fù)制重組型腺病毒載體還可用于轉(zhuǎn)染外周血管系統(tǒng)的目的細(xì)胞(參閱美國(guó)專利5,792,453，在本文中全文引入作為參考)。
可以通過Graham等人(病毒學(xué)(Virology) 163614-617，1988)描述的挽救重組技術(shù)來構(gòu)建用于本發(fā)明的腺病毒載體。簡(jiǎn)而言之，將eNOS轉(zhuǎn)基因克隆到含啟動(dòng)子、多接頭、和刪除了E1A/E1B基因的部分側(cè)翼腺病毒序列的穿梭載體中。作為穿梭載體，可以以質(zhì)粒pAC1(或其類似物)和質(zhì)粒ACCMVPLPA作為例示質(zhì)粒pAC1(病毒學(xué)(Virology)163614-617，1988)(或其類似物)編碼人腺病毒5基因組(病毒學(xué)(Virology)163614-617，1988)左端部分，但是減去了編碼對(duì)病毒復(fù)制重要的早期蛋白質(zhì)的E1A和E1B序列；而質(zhì)粒ACCMVPLPA(生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.) 26725129-25134，1992)含多接頭、CMV啟動(dòng)子、和SV40多聚腺苷酸化信號(hào)的，以刪除了E1A/E1B基因的部分腺病毒序列為側(cè)翼。質(zhì)粒PAC1和ACCMVPLA的使用有助于克隆過程。然后將穿梭載體與含長(zhǎng)度大得不能裝囊的完整人腺病毒5基因組的質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中?？梢酝ㄟ^磷酸鈣沉淀或脂質(zhì)感染(生物技術(shù)(Biotechniques)15868-872，1993)進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。質(zhì)粒JM17編碼完整人腺病毒5基因組，加上載體pBR322的一部分，包括氨芐青霉素抗性基因(4.3kb)。雖然JM17編碼產(chǎn)生成熟病毒顆粒所需的所有腺病毒蛋白質(zhì)，但是它太大了，不能裝囊(40kb，野生型為36kb)。在一個(gè)小子集的共轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，含轉(zhuǎn)基因的穿梭載體(轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pAC1)與含完整腺病毒5基因組的質(zhì)粒(諸如pJM17)之間的挽救重組提供了E1A/E1B序列缺陷的重組基因組，它包含需要的轉(zhuǎn)基因，但是在重組過程中失去了其它序列，諸如pBR322序列，因此小得足以裝囊。使用X-gal處理，可以將編碼腺病毒HCMVSP1 lacZ(臨床研究(Clin.Res.) 42123A，1994)的CMV驅(qū)動(dòng)的β-半乳糖苷酶用于評(píng)價(jià)基因轉(zhuǎn)移的效率。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過減毒型或缺陷型DNA病毒，諸如(但不限于)單純皰疹病毒(HSV)、乳頭瘤病毒、Epstein-Barr病毒(EBV)、腺病毒、和腺伴隨病毒(AAV)，可以將編碼NOS(優(yōu)選eNOS或nNOS)的基因?qū)塍w內(nèi)。完全或幾乎完全缺失病毒基因的缺陷型病毒是優(yōu)選的。缺陷型病毒在導(dǎo)入細(xì)胞后沒有感染性。使用有缺陷的、有生命的載體能夠施用于特異的、定位的區(qū)域中的細(xì)胞，而不用擔(dān)心載體會(huì)感染其它細(xì)胞。因此，可以將載體特異靶向特定區(qū)域，如腦或脊髓中的特定區(qū)域。在特定的實(shí)施方案中，可以使用缺陷型皰疹病毒1(HSV1)(Kaplitt等人，分子和細(xì)胞神經(jīng)科學(xué)(Mol.Cell.Neurosci.) 2320-330，1991)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，病毒載體是減毒型腺病毒載體，諸如Straford-Perricaudet等人(臨床調(diào)查雜志(J.Clin.Invest.) 90626-630，1992)描述的載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，載體是缺陷型腺伴隨病毒載體(Samulski等人，病毒學(xué)雜志(J.Virol.) 613096-3101，1987；和Samulski等人，病毒學(xué)雜志(J.Virol.) 633822-3828，1989)。
本發(fā)明還關(guān)注不僅由遞送轉(zhuǎn)基因到例如冠狀動(dòng)脈或股動(dòng)脈中還有利用組織特異啟動(dòng)子進(jìn)行的細(xì)胞靶向的使用。例如通過將左心室肌球蛋白輕鏈-2(MLC[2V])或肌球蛋白重鏈(MHC)的組織特異的轉(zhuǎn)錄控制序列與諸如腺病毒構(gòu)建物中的本發(fā)明NOS基因的轉(zhuǎn)基因融合，轉(zhuǎn)基因的表達(dá)就限制于心室心肌細(xì)胞中。使用本發(fā)明的重組腺病毒系統(tǒng)，測(cè)定了與lacZ一起的MLC[2V]和MHC啟動(dòng)子提供的基因表達(dá)的功效和特異性程度。以前，Lee等人(生物化學(xué)雜志(J.Bool.Chem.) 26715875-15885，1992)已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了心臟特異表達(dá)。MLC[2V]啟動(dòng)子包含250bp，而且易于適應(yīng)腺病毒5包裝的限制。已知是旺盛的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的肌球蛋白重鏈啟動(dòng)子提供了合理的備選的心臟特異啟動(dòng)子，它包含少于300bp。平滑肌細(xì)胞啟動(dòng)子，諸如SM22α啟動(dòng)子(Kemp等人，生化雜志(Biochem.J.)310(Pt3)1037-1043，1995)和SMα肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(Shimizu等人，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.) 270(13)7631-7643，1995)也是可以獲得的。其它啟動(dòng)子，諸如肌鈣蛋白-C啟動(dòng)子，雖然高效且足夠小，但是欠缺適當(dāng)?shù)慕M織特異性。通過使用MLC[2V]或MHC啟動(dòng)子并體內(nèi)遞送轉(zhuǎn)基因，相信只有心肌細(xì)胞將提供NOS蛋白質(zhì)的適當(dāng)表達(dá)，而在心臟的內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、和成纖維細(xì)胞中沒有伴隨表達(dá)。
受限于心肌細(xì)胞的表達(dá)還具有將基因轉(zhuǎn)移用于心肌缺血臨床治療的優(yōu)勢(shì)。通過限制于心臟的表達(dá)，避免了對(duì)非心臟組織(諸如視網(wǎng)膜)中的血管發(fā)生的潛在有害影響。另外，在心臟的各種細(xì)胞中，肌細(xì)胞將有可能提供最長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，因?yàn)檫@種細(xì)胞不進(jìn)行快速轉(zhuǎn)換，由此表達(dá)將不會(huì)被與內(nèi)皮細(xì)胞一起發(fā)生的細(xì)胞分裂和死亡所降低?？捎糜诖四康牡膬?nèi)皮特異的啟動(dòng)子早已獲得。內(nèi)皮特異啟動(dòng)子的范例包括Tie-2啟動(dòng)子(Schlaeger等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Nat1.Acad.Sci.USA)94(7)3058-3063，1997)、內(nèi)皮素啟動(dòng)子(Lee等人，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)26510446-10450，1990)、和eNOS啟動(dòng)子(Zhang等人，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)270(25)15320-15326，1995)。
在心臟病治療方面，本發(fā)明包括用高滴度的載體通過冠狀動(dòng)脈內(nèi)或肌肉內(nèi)注射靶向心臟，目前優(yōu)選的是轉(zhuǎn)染所有細(xì)胞類型。如上所述，可以使用NOS轉(zhuǎn)基因(優(yōu)選eNOS或nNOS轉(zhuǎn)基因)治療諸如勃起障礙等疾病和心血管疾病(包括心肌梗死、心肌缺血、心力衰竭、再狹窄、支架狹窄、血管成形術(shù)后狹窄、和旁路移植失敗)。
可以按照標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)成功的重組載體進(jìn)行噬菌斑純化。將獲得的病毒載體在反向提供E1A和E1B功能的293細(xì)胞上繁殖至優(yōu)選滴度范圍為約1010-約1012病毒顆粒/ml。可以在80％匯合時(shí)感染細(xì)胞，并于48小時(shí)后收獲。3次凍融循環(huán)后，通過離心沉淀細(xì)胞碎片，并通過CsCl梯度超速離心(優(yōu)選雙CsCl梯度超速離心)純化病毒。在體內(nèi)注射之前，通過Sepharose層析柱(諸如G25 Sephadex)的凝膠過濾將病毒原液脫鹽。然后將產(chǎn)物濾過30μm濾器，由此降低未經(jīng)過濾的病毒在冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射時(shí)的有害影響(危及生命的心臟心率失常)并促進(jìn)有效的基因轉(zhuǎn)移。獲得的病毒原液的最終病毒滴度范圍是1010-1012病毒顆粒/ml。重組腺病毒必須是高度純化的，不含野生型(潛在能復(fù)制)病毒。不純的構(gòu)建物能夠在宿主動(dòng)物中引起強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答。關(guān)于這一點(diǎn)，可以通過例如引物合適的PCR鑒定成功的重組體、進(jìn)行兩輪噬菌斑純化、和雙CsCl梯度超速離心，進(jìn)行繁殖和純化以除去污染和野生型病毒。另外，通過在冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射之前將重組腺病毒濾過合適大小的濾器，可以避免與給患者注射腺病毒載體誘導(dǎo)的心臟心率失常有關(guān)的問題。這種策略似乎從本質(zhì)上改進(jìn)了基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)。
如果需要，病毒原種可以是含制藥學(xué)可接受載體(如鹽)的可注射制劑的形式。優(yōu)選地，載體在可注射制劑中的終滴度能夠有效轉(zhuǎn)移基因的范圍，大約107-大約1013病毒顆粒。下文描述了其它制藥學(xué)載體、配方、和劑量。使用基于經(jīng)皮導(dǎo)管的標(biāo)準(zhǔn)方法，在熒光鏡指導(dǎo)下，通過直接的冠狀動(dòng)脈內(nèi)(或移植血管)注射，以足以將轉(zhuǎn)化基因表達(dá)到允許高效治療的劑量向心肌膜遞送腺病毒轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物?？梢陨钊牍跔顒?dòng)脈(或移植血管)的內(nèi)腔(動(dòng)脈內(nèi)腔內(nèi)大約1cm)進(jìn)行注射，優(yōu)選在兩條冠狀動(dòng)脈中都進(jìn)行注射，因?yàn)閭?cè)血管的生長(zhǎng)在患者個(gè)體中是高度可變的。通過經(jīng)冠狀動(dòng)脈導(dǎo)管直接向冠狀動(dòng)脈注射物質(zhì)，相當(dāng)有效地靶擊基因并在注射過程中將主動(dòng)脈近端的重組載體的損失最小化是有可能的。已知，在冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射后的任何時(shí)候，以這種方式遞送的基因不會(huì)在肝細(xì)胞中表達(dá)，而且不會(huì)在尿中發(fā)現(xiàn)病毒RNA。本發(fā)明可以使用各種冠狀動(dòng)脈導(dǎo)管，或者例如Stack灌注導(dǎo)管。另外，可以使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的其它技術(shù)來向動(dòng)脈壁轉(zhuǎn)移NOS基因(優(yōu)選地eNOS或nNOS)。
對(duì)于外周血管疾病，特征為腿部供血不足的疾病的治療，可以通過在股動(dòng)脈或動(dòng)脈近端插入導(dǎo)管遞送表達(dá)本發(fā)明NOS(優(yōu)選地，eNOS或nNOS)蛋白質(zhì)或肽的重組腺病毒，由此使基因轉(zhuǎn)到由股動(dòng)脈供血的骨骼肌細(xì)胞中。
在首先將編碼本發(fā)明NOS(優(yōu)選eNOS或nNOS)或Akt蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因或核酸轉(zhuǎn)移到體外內(nèi)皮或血管平滑肌細(xì)胞(包括患者自身細(xì)胞)的情況中，可以將DNA直接轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中(參閱美國(guó)專利5,658,565)。一般而言，為了轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，可以在脂質(zhì)體介導(dǎo)的靶細(xì)胞轉(zhuǎn)染中利用含編碼本發(fā)明的Akt或NOS的DNA序列或其有生物學(xué)活性的片段的質(zhì)粒載體。與這些囊泡的不可滲透的本質(zhì)相關(guān)的脂質(zhì)體穩(wěn)定性使得它們可用于治療性DNA序列的遞送(綜述參閱Mannino和Gould-Forgerite，生物技術(shù)(BioTechniques)6(7)682-690，1988)。已知脂質(zhì)體被許多細(xì)胞類型通過融合而吸收。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以利用含陽離子膽固醇衍生物(諸如SF-chol或DC-chol)的陽離子脂質(zhì)體。如Gao和Huang(生化和生理學(xué)研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Comm.)179280-285，1991)所述，DC-chol分子包含叔氨基、中等長(zhǎng)度的間隔臂、和氨甲酰接頭鍵。
在關(guān)于使用脂質(zhì)體的技術(shù)的另一個(gè)實(shí)施方案中，用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑(Bethesda Research Laboratory)轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，向靶細(xì)胞遞送含編碼有生物學(xué)活性的NOS蛋白質(zhì)片段(優(yōu)選eNOS或nNOS蛋白質(zhì)片段)的DNA序列的基于病毒或非病毒的載體。脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺是多聚陽離子脂質(zhì)2，3-二油氧基-N-[2(精胺羧酰氨基)乙基]-N，N-二甲基-1-丙銨三氟乙酸鹽(DOPSA)與中性脂質(zhì)二油?；?磷脂酰乙醇胺的(DOPE)的3∶1脂質(zhì)體配方。
其它非病毒模式的基因遞送包括(但不限于)(a)直接注射裸露的DNA；(b)磷酸鈣[Ca3(PO4)2]介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染；(c)通過電穿孔轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞；(d)DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染；(e)聚凝胺介導(dǎo)的遞送；(f)原生質(zhì)體融合；(g)微注射；和(h)聚賴氨酸介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，將經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞轉(zhuǎn)移回哺乳動(dòng)物宿主。
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的產(chǎn)生本發(fā)明還包括含上述突變型NOS基因(優(yōu)選突變型eNOS或nNOS基因)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是已經(jīng)實(shí)驗(yàn)性地轉(zhuǎn)移了重組的、外源的、或克隆的遺傳材料的經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物。這些遺傳材料常常稱為“轉(zhuǎn)基因”。轉(zhuǎn)基因的核酸序列(在這個(gè)案例中是NOS形式)可以整合至在其它情況下通常沒有發(fā)現(xiàn)該特定核酸序列的基因組的一個(gè)基因座或者轉(zhuǎn)基因的通常基因座中。轉(zhuǎn)基因可以包含從靶動(dòng)物物種的相同物種或不同物種的基因組中得到的核酸序列。
術(shù)語“微生物細(xì)胞系轉(zhuǎn)基因動(dòng)物”指將基因的變化或遺傳信息導(dǎo)入微生物細(xì)胞系的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，由此賦予轉(zhuǎn)基因動(dòng)物將遺傳信息傳遞給后代的能力。如果這些后代真的具有一些或所有這樣的變化或基因信息，那么它們也是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
這樣的變化或遺傳信息可以是對(duì)于受體所屬的動(dòng)物物種是外來的，只對(duì)于特定的個(gè)別受體是外來的，或可以是受體早已具有的遺傳信息。在最后一種情況中，改變或誘導(dǎo)的基因可以與天然基因的表達(dá)不同。
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以由多種不同的方法產(chǎn)生，包括轉(zhuǎn)染、電穿孔、微注射、胚胎桿細(xì)胞中的基因靶向、和重組病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒感染(參閱例如美國(guó)專利號(hào)4,736,866；美國(guó)專利號(hào)5,602,307；Mullins等人，高血壓(Hypertension)22(4)630-633，1993；Brenin等人，外科學(xué)和腫瘤學(xué)(Surg.Oncol.) 6(2)99-110，1997；Tuan(編)，重組基因表達(dá)方案，《分子生物學(xué)方法》(Methods in Molecular Biology)，NO.62，Humana Press，1997)。
大量的重組或轉(zhuǎn)基因小鼠已經(jīng)產(chǎn)生，包括表達(dá)激活的癌基因序列(美國(guó)專利號(hào)4,736,866)；表達(dá)猴SV40 T抗原(美國(guó)專利號(hào)5,728,915)；干擾素調(diào)控因子1(IRF-1)的表達(dá)缺失(美國(guó)專利號(hào)5,731,490)；展示多巴胺異常(美國(guó)專利號(hào)5,723,719)；至少表達(dá)一種參與血壓控制的人基因(美國(guó)專利號(hào)5,731,489)；展示與天然發(fā)生的Alzheimer病中存在的狀態(tài)具有較高相似性(美國(guó)專利號(hào)5,720,936)；介導(dǎo)細(xì)胞粘附的能力降低(美國(guó)專利號(hào)5,602,307)；具有牛生長(zhǎng)激素基因(Clutter等人，遺傳學(xué)(Genetics)143(4)1753-1760，1996)；或能夠產(chǎn)生完全人抗體應(yīng)答(McCarthy，柳葉刀(The Lancet)349(9049)405，1997)的小鼠。
當(dāng)小鼠和大鼠仍然是大多數(shù)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的選擇動(dòng)物時(shí)，在某些情況中，優(yōu)選地或甚至必須使用其它動(dòng)物物種。轉(zhuǎn)基因方法已經(jīng)成功地用于多種非鼠動(dòng)物，包括綿羊、山羊、豬、狗、貓、猴、黑猩猩、倉鼠、兔、牛、和豚鼠(參閱如Kim等人，分子生殖和發(fā)育(Mol.Repord.Dev.)46(4)515-526，1997；Houdebine，生殖營(yíng)養(yǎng)學(xué)發(fā)展(Reprod.Nutr.Dev.)35(6)609-617，1995；Petters，生殖生育能力和發(fā)育(Reprod.Fertil.Dev.)6(5)643-645，1994；Schnieke等人，科學(xué)(Science)278(5346)2130-2133，1997；和Amoah，動(dòng)物科學(xué)(Animal Science)75(2)578-585，1997)。
將核酸片段導(dǎo)入能重組活性態(tài)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法可以是支持多種核酸分子共轉(zhuǎn)化的任何方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地獲得用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的詳細(xì)步驟，包括美國(guó)專利號(hào)5,489,743和美國(guó)專利號(hào)5,602,307。此外，NOS轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)發(fā)展得很好。例如，已經(jīng)產(chǎn)生了可誘導(dǎo)地表達(dá)或過度表達(dá)野生型eNOS的轉(zhuǎn)基因小鼠(參閱Ohashi等人，臨床調(diào)查雜志(J.Clin.Invest.) 102(12)2061-2071，1998；和Drummond等人，臨床調(diào)查雜志(J.Clin.Invest.) 102(12)2033-2034，1998)。這些方法可用于產(chǎn)生表達(dá)本發(fā)明NOS突變體的轉(zhuǎn)基因小鼠。
治療性篩選實(shí)驗(yàn)eNOS的磷酸化能夠調(diào)控其活性的發(fā)現(xiàn)使得能夠發(fā)展篩選實(shí)驗(yàn)來鑒定調(diào)節(jié)Akt調(diào)控的NOS(優(yōu)選eNOS或nNOS)活性或表達(dá)的試劑?？梢允褂萌魏慰色@得的形式，包括體內(nèi)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、體外基于蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)、和高生產(chǎn)率形式。
在測(cè)試化合物文庫的許多藥物篩選程序中，需要將高通量實(shí)驗(yàn)用于在給定的時(shí)間段里普查最多數(shù)目的化合物。在諸如由純化的或半純化的蛋白質(zhì)得到的無細(xì)胞系統(tǒng)中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，常常優(yōu)選地稱為“初級(jí)”篩選，因?yàn)閯?chuàng)造這些實(shí)驗(yàn)方法允許快速發(fā)展并較容易地檢測(cè)由待測(cè)化合物介導(dǎo)的分子靶中的變化。此外，在體外系統(tǒng)中通?？梢院雎源郎y(cè)化合物的細(xì)胞毒性和/或生物有效度的影響，實(shí)驗(yàn)改為集中研究可能在例如對(duì)分子間結(jié)合的抑制中顯現(xiàn)出來的藥物對(duì)分子靶的影響。
例如，可以通過將COS-7細(xì)胞(100mm培養(yǎng)皿)涂板并使用磷酸鈣用NOS(7.5-30mg)和Akt(1mg)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，由此進(jìn)行基于細(xì)胞或組織培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)。為了平衡所有的轉(zhuǎn)染，可以共轉(zhuǎn)染β-半乳糖苷酶cDNA的表達(dá)載體。轉(zhuǎn)染后24-48小時(shí)，可以通過Western印跡分析，使用eNOS mAb(9D10，Zymed)、HA mAb(12CA5，Boehringer Mannheim)、iNOS pAb(Zymed Laboratories)、或nNOS mAb(Zymed Laboratories)確認(rèn)合適蛋白質(zhì)的表達(dá)(40-80mg)。
轉(zhuǎn)染后24-48小時(shí)，如其所述(Sessa等人，1995)，處理培養(yǎng)基，通過特異于NO的化學(xué)發(fā)光來測(cè)量水溶液中NO的穩(wěn)定分解產(chǎn)物，亞硝酸鹽(NO2-)。將培養(yǎng)基除蛋白，并將含NO2-的樣品在含碘化鈉的冰醋酸中回流。在這些條件下，NO2-定量地還原成NO，在NO分析儀(Sievers，Boulders，CO)中與臭氧反應(yīng)后通過化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀定量NO。在所有實(shí)驗(yàn)中，可以通過使用NOS抑制劑抑制NO2-釋放來制備對(duì)照。另外，可以將用β-半乳糖苷酶cDNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的NO2-釋放減去對(duì)照作為血清或培養(yǎng)基的NO2-背景水平。如上所述，對(duì)于NO生成，在COS中積累cGMP也可以作為生物測(cè)定實(shí)驗(yàn)。如以前所述(Garcia-Cardena等人，1998)，在備選形式中，3H-L-精氨酸向3H-L-瓜氨酸的轉(zhuǎn)變可用于測(cè)定COS細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞裂解物中的NOS活性。
對(duì)于體內(nèi)磷酸化研究，可以用野生型或S635(對(duì)照)、牛1179A、D、E eNOS、人1177D或E eNOS、大鼠1412D或E nNOS、人1415D或E nNOS、和HA-Akt的cDNA轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞過夜。轉(zhuǎn)染后36小時(shí)，將細(xì)胞在含經(jīng)透析的血清、無磷酸鹽、添加了80μCi/ml32P正磷酸的Dulbecco極限必需培養(yǎng)基中放置3小時(shí)。在無磷酸鹽培養(yǎng)基中，一部分細(xì)胞可以用渥曼青霉素(500nM)預(yù)處理1小時(shí)，在標(biāo)記過程中也可以用該青霉素預(yù)處理(500nm)。然后收獲裂解物，如以前所述，將NOS溶解并通過ADP Sepharose親和層析法部分純化，SDS-PAGE(7.5％)后通過自顯影觀察NOS中摻入32P，并通過針對(duì)NOS的Western印跡檢驗(yàn)NOS蛋白質(zhì)的量。
對(duì)于體外磷酸化研究，將從大腸桿菌純化的重組NOS、從另一來源純化的eNOS、或跨越Akt磷酸化位點(diǎn)的NOS肽與從轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞免疫沉淀的野生型或無激酶活性的Akt一起溫育。簡(jiǎn)而言之，將NOS蛋白質(zhì)或肽與32P-ATP(2ml，特異活性3000Ci/mmol)、ATP(50mM)、DTT(1mM)一起，在含HEPES(20mM，pH＝7.4)、MnCl2(10mM)、MgCl2(10mM)、和免疫沉淀Akt的緩沖液中于室溫溫育20分鐘。
在檢驗(yàn)野生型和突變型NOS的體外磷酸化的實(shí)驗(yàn)中，使用與上述基本相同的條件，將從桿狀病毒感染的SF9細(xì)胞純化的重組Akt(1mg)與野生型、S1179A牛eNOS、S1177A人eNOS、S1179D或E牛eNOS、S1177D或E人eNOS、S1412D或E大鼠nNOS、或者S1415D或E人nNOS一起溫育?？梢酝ㄟ^SDS-PAGE分辨蛋白質(zhì)，并如上通過考馬斯染色測(cè)定蛋白質(zhì)的量。
測(cè)定依賴Akt的NOS磷酸化或激活的上述篩選實(shí)驗(yàn)可以用于篩選廣泛的各種試劑。例如，在對(duì)應(yīng)于牛eNOS第1179位、人eNOS第1177位、大鼠nNOS第1412位、或人nNOS第1415位絲氨酸的氨基酸處抑制NOS發(fā)生磷酸化的試劑(磷酸酶抑制劑)可能是有用的治療分子。相似地，激活A(yù)kt或模擬eNOS上Akt磷酸化位點(diǎn)的試劑也可能是有用的治療分子。
可以隨機(jī)選擇或者合理地選擇或設(shè)計(jì)在上述方法中分析的試劑。如在本文中所用，當(dāng)隨機(jī)選擇試劑而不考慮涉及本發(fā)明蛋白質(zhì)單獨(dú)或與其底物、結(jié)合配偶、等等一起結(jié)合的特異序列時(shí)，則說試劑是隨機(jī)選擇的。隨機(jī)選擇的試劑的范例是利用化學(xué)文庫或肽組合文庫，或者生物體的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
如在本文中所用，當(dāng)在非隨機(jī)的基礎(chǔ)之上考慮到靶位點(diǎn)的序列和/或其與試劑作用相關(guān)構(gòu)象來選擇試劑時(shí)，則說試劑是理性選擇或設(shè)計(jì)的。例如，理性選擇的肽試劑可以是其氨基酸序列與NOS中的Akt磷酸化位點(diǎn)相似的肽，特別是模擬NOS磷酸化位點(diǎn)的肽或小分子。
作為范例，本發(fā)明的試劑可以是肽、小分子、維生素衍生物、以及碳水化合物。熟練技術(shù)人員可以容易地認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明試劑的結(jié)構(gòu)特性是沒有限制的。
如本領(lǐng)域已知的，本發(fā)明的肽試劑可以使用標(biāo)準(zhǔn)固相(或液相)肽合成方法來制備。另外，可以使用商品化的寡核苷酸合成儀器來合成，并使用標(biāo)準(zhǔn)重組生產(chǎn)系統(tǒng)來重組生產(chǎn)編碼這些肽的DNA。如果待包含非基因編碼的氨基酸，那么必須使用固相肽合成法來生產(chǎn)。
本發(fā)明的另一類試劑是對(duì)本發(fā)明蛋白質(zhì)的決定性位點(diǎn)具有免疫反應(yīng)性的抗體?？贵w試劑是用含抗原區(qū)(意欲作為抗體的靶的那些蛋白質(zhì)部分)的肽免疫合適的哺乳動(dòng)物主體來獲得的。
經(jīng)鑒定調(diào)節(jié)eNOS活性的試劑的用途已鑒定的試劑在調(diào)節(jié)eNOS活性時(shí)的用途經(jīng)胃腸外、皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、穿真皮、或口腔途徑可以給藥本發(fā)明的試劑，諸如抑制NOS在對(duì)應(yīng)于牛eNOS第1179位殘基、人eNOS第1177位殘基、大鼠nNOS第1412位殘基、或人nNOS第1415位殘基絲氨酸的氨基酸處發(fā)生磷酸化的試劑(磷酸酶抑制劑)，以及激活A(yù)kt或模擬NOS上的Akt磷酸化位點(diǎn)的試劑?；蛘呋蛲瑫r(shí)，可以通過口服給藥。給藥的劑量將取決于受體的年齡、健康、和體重，并行治療的種類，如果有，治療的頻率，和期望效果的本質(zhì)。如下文所述，存在許多可以容易地用于給藥這些試劑的方法。
本發(fā)明還提供了含一種或多種本發(fā)明試劑的組合物。當(dāng)個(gè)體需要發(fā)生變化時(shí)，決定每種成分的有效量的最佳范圍屬于本領(lǐng)域技術(shù)范疇。典型的劑量范圍是0.1-100mg/kg體重。優(yōu)選的劑量范圍是0.1-10mg/kg體重。最優(yōu)選的劑量范圍是0.1-1mg/kg體重。
除了有藥學(xué)活性的試劑，本發(fā)明的組合物還包含合適的藥學(xué)可接受的載體，這些載體包括有助于將活性化合物加工成可以以藥物形式遞送至作用位點(diǎn)的制劑的賦形劑和輔藥。用于胃腸外給藥的合適配方包括水溶形式的活性化合物的水溶液，例如水溶性鹽。另外，也可以給藥活性化合物的懸浮液，如適當(dāng)?shù)挠托宰⑸鋺腋∫?。合適的親脂性溶劑或載體包括脂肪油(例如芝麻油)或合成脂肪油酯(例如油酸乙酯或甘油三酯)。水性注射懸浮液可以包含，增加懸浮液粘性的物質(zhì)，例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇、和/或葡聚糖。任選地，懸浮液還可以包含穩(wěn)定劑。還可以利用將脂質(zhì)體裝囊試劑，以遞送到細(xì)胞中。
可以配制根據(jù)本發(fā)明的用于全身給藥的藥物制劑，用于腸、胃腸外、或局部給藥。事實(shí)上，可以同時(shí)使用所有三種類型的配方以實(shí)現(xiàn)活性成分的全身給藥。
用于口服給藥的合適配方包括硬的或軟的明膠膠囊、藥丸、藥片(糖衣片)、酏劑、懸浮液、糖漿、或吸入劑及其受控釋放形式。
在本發(fā)明方法的實(shí)踐中，本發(fā)明的化合物可以單獨(dú)或組合使用，或者與其它治療性或診斷性試劑組合使用。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物可以與通常接受的醫(yī)學(xué)實(shí)踐條件中開出的藥方中的其它化合物共給藥，諸如抗凝劑、溶栓劑、或其它抗栓劑，包括血小板聚集抑制劑、組織型纖溶酶原激活劑、尿激酶、尿激酶原、鏈激酶、肝素、阿司匹林、或華法林。通常本發(fā)明的化合物在哺乳動(dòng)物中，諸如人、綿羊、馬、牛、豬、狗、貓、大鼠、和小鼠中可以在體內(nèi)利用，或者在體外利用。
下列工作實(shí)施例明確指出了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，并且這些實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)理解為以任何方式對(duì)公開書其它部分的限制。其它的一般性形式對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯然的。
實(shí)施例下列步驟用于實(shí)施例1-2。
細(xì)胞轉(zhuǎn)染通過標(biāo)準(zhǔn)克隆方法，產(chǎn)生pcDNA3中的牛eNOS、人iNOS、大鼠nNOS cDNA和pCMV6中的HA標(biāo)記野生型Akt、Akt(K179M)、或myr-Akt。通過PCR產(chǎn)生pcDNA3中的myr-nNOS，摻入了含eNOS N-肉豆蔻酸化共有位點(diǎn)(MGNLKSVG，SEQ ID NO1)的新的氨基末端，這一保守位點(diǎn)以相同讀碼框融合在nNOS編碼序列的第二個(gè)氨基酸處。在COS細(xì)胞的預(yù)備實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)摻入的3H-肉豆蔻酸確認(rèn)了該構(gòu)建物發(fā)生N-肉豆蔻酸化，而天然nNOS不發(fā)生，并且導(dǎo)致大約60％的總蛋白質(zhì)靶向細(xì)胞的膜部分，而只有5-10％的nNOS在COS細(xì)胞中與膜結(jié)合。使用快速改變定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Quick Change site-directed mutagenesis kit)(Stratagene)，根據(jù)制造商的指示，在eNOS中推斷的Akt磷酸化位點(diǎn)處產(chǎn)生突變。通過DNA測(cè)序確認(rèn)所有突變體。將COS-7細(xì)胞涂板(100mm培養(yǎng)皿)，并使用磷酸鈣，用NOS(7.5-30mg)和Akt(1mg)轉(zhuǎn)染。為了平衡所有轉(zhuǎn)染，使用了β-半乳糖苷酶cDNA的表達(dá)載體。轉(zhuǎn)染后24-48小時(shí)，使用eNOS mAb(9D10，Zymed)、HA mAb(12CA5，BoehringerMannheim)、iNOS pAb(Zymed Laboratories)、或nNOS mAb(ZymedLaboratories)，通過Western印跡分析，確認(rèn)了合適蛋白質(zhì)的表達(dá)(40-80mg)。
轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞釋放的NO轉(zhuǎn)染后24-48小時(shí)，如其所述(Sessa等人，1995)，處理培養(yǎng)基，通過NO特異的化學(xué)發(fā)光來測(cè)量NO在水溶液中的穩(wěn)定分解產(chǎn)物亞硝酸鹽(NO2-)。將培養(yǎng)基除蛋白，并將含NO2-的樣品在含碘化鈉的冰醋酸中回流。在這些條件下，NO2-定量還原成NO，在NO分析儀(Sievers，Boulders，CO)中與臭氧反應(yīng)后通過化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀進(jìn)行量化。在所有實(shí)驗(yàn)中，NOS抑制劑可以抑制NO2-釋放。另外，將用β-半乳糖苷酶cDNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的NO2-釋放量減去對(duì)照作為血清或培養(yǎng)基的NO2-背景水平。如其所述，在一些實(shí)驗(yàn)中COS中積累cGMP也可以作為NO生成的生物試驗(yàn)。
NOS活性實(shí)驗(yàn)如Garcia-Cardena等人以前所述(1998)，3H-L-精氨酸向3H-L-瓜氨酸的轉(zhuǎn)變可用于測(cè)定COS細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞裂解物中的NOS活性。
體內(nèi)和體外磷酸化究對(duì)于體內(nèi)磷酸化研究，用野生型或S635、1179A eNOS、和HA-Akt的cDNA轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞過夜。轉(zhuǎn)染后36小時(shí)，將細(xì)胞在含透析血清、無磷酸鹽、添加了80μCi/ml32P正磷酸的Dulbecco極限必需培養(yǎng)基中放置3小時(shí)。一些細(xì)胞用無磷酸鹽培養(yǎng)基中的渥曼青霉素(500nM)預(yù)處理1小時(shí)。在標(biāo)記過程中用同樣的青霉素預(yù)處理。收獲裂解物，如以前所述，將NOS溶解并通過ADP Sepharose親和層析法部分純化，在SDS-PAGE(7.5％)后，通過自顯影觀察摻入NOS的32P，并通過對(duì)eNOS進(jìn)行Western印跡，檢驗(yàn)eNOS蛋白質(zhì)的量。對(duì)于體外磷酸化研究，將由大腸桿菌純化的重組eNOS與從轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞免疫沉淀的野生型或無激酶活性的Akt一起溫育。將eNOS與32P-ATP(2ml，特異活性3000Ci/mmol)、ATP(50mM)、DTT(1mM)一起，在含HEPES(20mM，pH＝7.4)、MnCl2(10mM)、MgCl2(10mM)、和免疫沉淀Akt的緩沖液中，于室溫下，溫育20分鐘。
在檢驗(yàn)野生型和突變型eNOS的體外磷酸化的實(shí)驗(yàn)中，使用與上述基本相同的條件，將從桿狀病毒感染的SF9細(xì)胞純化的重組Akt(1mg)與野生型或S1179A eNOS(2.4mg，從大腸桿菌純化)一起溫育。通過SDS-PAGE和32P摻入分辨蛋白質(zhì)，并通過上述考馬斯染色測(cè)定蛋白質(zhì)的量。
在鑒定經(jīng)標(biāo)記的eNOS肽的研究中，如上將免疫沉淀的Akt與重組eNOS一起溫育。將樣品進(jìn)行SDS-PAGE，并消化凝膠中的eNOS條帶，通過RP-HPLC純化產(chǎn)生的胰蛋白酶消化片段。監(jiān)控肽質(zhì)量和32P摻入，并通過質(zhì)譜進(jìn)一步分析突出的標(biāo)記峰。在其它實(shí)驗(yàn)中，合成了對(duì)應(yīng)于潛在Akt磷酸化位點(diǎn)的肽，通過HPLC純化，并通過質(zhì)譜確認(rèn)(耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院W.M.Keck生物技術(shù)資源中心)。野生型肽是1174 RIRTQSFSLQERHLRGAVPWA1194(SEQ ID NO2)，突變型肽除了S1179變成丙氨酸外與野生型相同。在體外，激酶反應(yīng)與上文所述基本相同地將肽(25mg)與重組Akt(1mg)一起溫育。然后將反應(yīng)物點(diǎn)到磷酸纖維素濾膜上，并通過Cerenkov計(jì)數(shù)測(cè)量摻入的磷酸鹽的量。
內(nèi)皮細(xì)胞中的腺病毒感染和NO釋放如以前所述(Garcia-Cardena等人，1996a)，在100mm培養(yǎng)皿(用于基礎(chǔ)NO釋放和NOS活性實(shí)驗(yàn))或C6細(xì)胞板(用于受激NO釋放)中培養(yǎng)牛肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(BLMVEC)。用200MOI含β-半乳糖苷酶29、HA標(biāo)記的無磷酸化活性的突變型Akt(AA-Akt；Alessi等人，1996)、或羧基末端HA標(biāo)記的具有組成活性的Akt(myr-Akt)的腺病毒感染BLMVEC 4小時(shí)。除去病毒，并將細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中復(fù)蘇18小時(shí)。在β-半乳糖苷酶病毒的預(yù)備實(shí)驗(yàn)中，優(yōu)化這些條件以能夠100％感染培養(yǎng)物。對(duì)于基礎(chǔ)NO生成的測(cè)量，在最初用病毒感染后24小時(shí)，收集培養(yǎng)基用于NO釋放的測(cè)量。對(duì)于受激NO釋放的測(cè)量，用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，隨后用VEGF(40ng/ml)刺激30分鐘。在一些實(shí)驗(yàn)中，在腺病毒感染后24小時(shí)，測(cè)定NOS的鈣依賴性。在含1％NP40的NOS實(shí)驗(yàn)緩沖液中裂解被感染的細(xì)胞，并將去污劑可溶性物質(zhì)用于活性測(cè)定。將裂解物與EGTA緩沖的鈣一起溫育從而在溫育中產(chǎn)生適當(dāng)量的游離鈣。
統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)以平均值±SEM表述。使用雙尾學(xué)生t-檢驗(yàn)法或ANOVA適當(dāng)?shù)嘏c因果推理檢驗(yàn)法一起進(jìn)行比較。當(dāng)p＜0.05時(shí)認(rèn)為差異是顯著的。
實(shí)施例1Akt調(diào)控從eNOS生成NO為了探索PI-3激酶的下游效應(yīng)物Akt直接影響NO生成的可能性，用eNOS和野生型Akt(HA-Akt)或無激酶活性的Akt(HA-Akt K179M)共轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞(不表達(dá)NOS)，并用NO特異的化學(xué)發(fā)光測(cè)量亞硝酸鹽(NO2-)的積累。轉(zhuǎn)染eNOS導(dǎo)致NO2-的積累增加，通過野生型Akt而非無激酶活性變體的共轉(zhuǎn)染，這種效果顯著增強(qiáng)(
圖1A)。使用cGMP作為有生物活性的NO的生物測(cè)定指標(biāo)獲得了相同結(jié)果。在這些實(shí)驗(yàn)條件下，使用磷酸-Akt特異Ab(識(shí)別第473位絲氨酸；未顯示)的Western印跡和Akt活性實(shí)驗(yàn)(參閱圖2A)，確認(rèn)了Akt有催化活性。轉(zhuǎn)染有組成活性的形式的Akt(myr-Akt)將cGMP積累(在COS細(xì)胞中測(cè)定)由5.5±0.8增加至11.6±0.9pmol cGMP/mg蛋白質(zhì)(分別是在eNOS單獨(dú)轉(zhuǎn)染或eNOS與myr-Akt一起轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中)，而無激酶活性的Akt不影響cGMP積累(5.8±0.8pmol cGMP，n＝4次實(shí)驗(yàn))。如插圖所示，COS細(xì)胞裂解物中表達(dá)了相同水平的eNOS和Akt，說明Akt調(diào)控eNOS，由此增加基礎(chǔ)條件下的NO生成。
eNOS是雙重?；耐庵苣さ鞍?，靶擊進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞的高爾基體區(qū)和原生質(zhì)膜(Liu等人，1997；Garia-Cardena等人，1996a；Shaal等人，1996)，而且在應(yīng)答拮抗劑的攻擊中的NO的有效生成要求區(qū)域化(Sessa等人，1995；Liu等人，1996；Kantor等人，1996)。為了檢驗(yàn)Akt激活eNOS是否要求膜區(qū)域化，用Akt和eNOS的肉豆蔻酸化、棕櫚酸化缺陷突變體G2A eNOS)的cDNA共轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，并將NO釋放量化。如
圖1B所示，Akt不激活未?；问降膃NOS，說明功能性相互作用要求兩種蛋白質(zhì)的膜區(qū)域化(Downward等人，1998)。其次，確定了Akt能否激活結(jié)構(gòu)類似但是可溶性不一樣的NOS異構(gòu)體神經(jīng)元的和可誘導(dǎo)的NOS(分別是nNOS和iNOS)。Akt與nNOS和iNOS的共轉(zhuǎn)染沒有導(dǎo)致NO釋放的進(jìn)一步增加，證明Akt對(duì)eNOS的特異性。然而，為了增強(qiáng)nNOS與生物膜的相互作用，在nNOS上添加N-肉豆蔻酸化位點(diǎn)，導(dǎo)致Akt以類似eNOS的方式刺激nNOS，說明當(dāng)錨定在膜上時(shí)，兩種異構(gòu)體可能對(duì)Akt激酶是敏感的。
實(shí)施例2eNOS突變的產(chǎn)生上述實(shí)驗(yàn)暗示Akt可能經(jīng)eNOS的磷酸化調(diào)控從完整細(xì)胞釋放NO。事實(shí)上，eNOS中存在兩個(gè)推斷的Akt磷酸化基序(RXRXXS/T)(牛eNOS第635位和第1179位絲氨酸或者人eNOS第633位和第1177位絲氨酸)，nNOS中存在一個(gè)基序(大鼠nNOS第1412位絲氨酸和人nNOS第1415位絲氨酸)，iNOS中沒有發(fā)現(xiàn)明顯的基序。為了檢驗(yàn)eNOS是否是Akt體外磷酸化的潛在底物，用HA-Akt或HA-Akt(K179M)轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞，并使用重組eNOS作為底物評(píng)估激酶活性。如圖2A所示，有活性的激酶使組蛋白2B和eNOS(分別為69.32.9和115.4±3.8pmol ATP/nmol底物，n＝3)發(fā)生磷酸化，而無活性的Akt沒有顯著增加組蛋白或eNOS的磷酸化。為了闡明推斷的eNOS中的Akt磷酸化位點(diǎn)是否負(fù)責(zé)32P的摻入，將兩個(gè)絲氨酸突變成丙氨酸，并在完整COS細(xì)胞中檢驗(yàn)Akt刺激野生型和突變型eNOS發(fā)生磷酸化的能力。用32P-正磷酸標(biāo)記已轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過ADP-Sepharose親和層析法部分純化eNOS，并將磷酸化狀態(tài)和蛋白質(zhì)水平量化。如圖2B所示，與未刺激細(xì)胞相比Akt的共表達(dá)導(dǎo)致eNOS的磷酸化增強(qiáng)2倍。用渥曼青霉素預(yù)處理eNOS/Akt轉(zhuǎn)染細(xì)胞消除了磷酸化中Akt誘導(dǎo)的增加。此外，第635位和第1179位絲氨酸向丙氨酸的突變消除了依賴Akt的eNOS磷酸化，說明這些殘基能夠在完整細(xì)胞中作為潛在的磷酸化位點(diǎn)。
為了直接鑒定Akt磷酸化的殘基，將野生型eNOS與免疫純化的Akt一起溫育，并通過HPLC及隨后的MALDi質(zhì)譜(MALDi-MS)確定磷酸化位點(diǎn)。如圖2C所示，主要的32P標(biāo)記胰蛋白酶消化磷肽隨合成磷肽(第1177-1185位氨基酸中第1179位是磷酸絲氨酸)共洗脫，而且通過線性模式MS測(cè)定具有相同的質(zhì)量-離子。使用反射模式MALDi-MS，經(jīng)標(biāo)記胰蛋白酶消化肽和標(biāo)準(zhǔn)磷肽都顯示HP3O4損失，說明胰蛋白酶消化肽發(fā)生磷酸化。另外，S1179A突變體與野生型蛋白質(zhì)相比，依賴Akt的eNOS磷酸化顯著降低(圖2D)。使用由野生型或eNOS S1179A得到的肽(第1174-1194位氨基酸)作為重組Akt的底物獲得了相同結(jié)果(野生型肽摻入24.6±3.7nmol磷酸/mg，丙氨酸突變肽摻入0.22±0.02nmol磷酸/mg；n＝5)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)證明eNOS是Akt的底物，而且磷酸化的主要位點(diǎn)是第1179位絲氨酸(人eNOS第1177位絲氨酸)。
其次，我們檢驗(yàn)了第635位絲氨酸處的推斷的Akt磷酸化位點(diǎn)和第1179位絲氨酸的已鑒定位點(diǎn)的功能重要性。用雙重突變eNOS S635/1179A轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞消除了依賴Akt的NO釋放。第635位絲氨酸向丙氨酸的突變不削弱NO釋放，而eNOS S1179A消除了依賴Akt的激活eNOS(圖3)。這些結(jié)果說明第1179位絲氨酸對(duì)于NO釋放功能是重要的。為了替代由添加的磷酸提供的負(fù)電荷，第1179位絲氨酸向天冬氨酸的突變(eNOSS1179D)部分模擬了由Akt誘導(dǎo)的激活(人eNOS S1177D)。所有定點(diǎn)突變體在細(xì)胞裂解物中都充分表達(dá)了，并保持了NOS催化活性(參閱插圖Western印跡)在只用eNOS轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞，NOS活性依次是85.3±27.0、71.9±2.9、80.8±23.2、和131.8±36.7pmol生成的L-瓜氨酸/mg，它們分別來自表達(dá)野生型、S1179A、S635、和eNOS S1179D的COS細(xì)胞裂解物的蛋白質(zhì)，n＝3次實(shí)驗(yàn))。
為了檢驗(yàn)Akt是否介導(dǎo)從內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO，用表達(dá)激活的Akt(myr-Akt)、激活缺陷的Akt(AA-Akt)、或作為對(duì)照的β-半乳糖苷酶的腺病毒感染牛肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(BLMVEC)，并測(cè)量NO積累。如圖4A所示，myr-Akt刺激BLMVEC的NO基礎(chǔ)生成，而用β-半乳糖苷酶或激活缺陷的Akt感染的細(xì)胞釋放低水平的NO，接近檢測(cè)極限。這些數(shù)據(jù)連同COS細(xì)胞的類似結(jié)果說明eNOS的Akt磷酸化足以在鈣的靜止水平調(diào)控NO生成。事實(shí)上，相對(duì)于用β-半乳糖苷酶病毒感染的BLMVEC中的NOS活性，在myr-Akt感染的BLMVEC裂解物中測(cè)量的NOS活性證明酶對(duì)鈣激活作用的敏感性(在固定的鈣濃度下測(cè)定)增強(qiáng)(圖4B)。有趣的是，相對(duì)于myr-Akt和β-半乳糖苷酶病毒感染細(xì)胞激活缺陷的Akt感染的細(xì)胞中的NOS活性的鈣敏感性受到大大的抑制。
已知用VEGF處理細(xì)胞激活A(yù)kt23和PI-3激酶抑制劑部分阻斷的機(jī)制釋放NO(Papapetropoulos等人，1997)。為了檢驗(yàn)VEGF作為NO釋放和Akt激活的拮抗劑之間的功能聯(lián)系，用mry-Akt、AA-Akt、或β-半乳糖苷酶的腺病毒感染BLMVEC，并將VEGF刺激的NO釋放量化。如圖4C所示，用myr-Akt感染內(nèi)皮細(xì)胞增強(qiáng)了VEGF驅(qū)動(dòng)的NO生成，而AA-Akt削弱了NO釋放。這些結(jié)果暗示，Akt參與內(nèi)皮細(xì)胞中基礎(chǔ)和受激NO生成所需的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。
綜上所述，這些資料證明了，Akt能夠磷酸化eNOS的第1179位絲氨酸(人eNOS第1177位絲氨酸)，而且磷酸化作用增強(qiáng)了酶生成NO的能力。
實(shí)施例3材料和方法eNOS構(gòu)建物和蛋白質(zhì)純化如以前所述，用大腸桿菌BL21細(xì)胞中的groELS表達(dá)質(zhì)粒pCW中的野生型牛eNOS(Martasek等人，1996)。如下產(chǎn)生用于在大腸桿菌中表達(dá)的S1179D突變型eNOS。用XhoI/XbaI消化pcDNA3(Fulton等人，1999)中的eNOS S1179D，亞克隆到pCW中的eNOS的相同位點(diǎn)，并與groELS共表達(dá)。如以前所報(bào)導(dǎo)的(Roman等人，1995；Martasek等人，1999)，以下列修改進(jìn)行重組eNOS的分離。用10mMNADPH或10mM 2’AMP從2’5’-ADP Sepharose洗脫eNOS。使用409-412nm處的峰吸光率對(duì)eNOS定量，血紅素的消光系數(shù)是0.1μM-1cm-1。通過7.5％SDS-PAGE及隨后的考馬斯染色測(cè)定eNOS的純度。同樣進(jìn)行低溫SDS-PAGE，除了樣品不用煮沸且電泳是于4℃在冰/水混和物中進(jìn)行的(Klatt等人，1995)。在滴定NOS輔助因子(L-精氨酸、鈣調(diào)蛋白、和NADPH)的實(shí)驗(yàn)中，它們?cè)诿傅募兓蛢?chǔ)存中是忽略的，并如下文所述溫育。
NOS活性實(shí)驗(yàn)如其所述(Kelm等人，1988)，通過血紅蛋白捕獲實(shí)驗(yàn)測(cè)量NO生成。簡(jiǎn)而言之，反應(yīng)混和物在HEPES緩沖液(50mM)中含有eNOS(0.5-2.5μg)、氧合血紅蛋白(8μm)、L-精氨酸(100μM)、BH4(5μM)、CaCl2(120μM)、鈣調(diào)蛋白(120-200nM)、和NADPH(100μM)，pH7.4。在eNOS的鈣EC50值的測(cè)定中，上述反應(yīng)混和物修改如下用MOPS緩沖液(10mM，pH7.6)、KCl(100mM)、和CaM(250nM)替代。在這些條件下，使用WinMAXC程序1.8版(斯坦福大學(xué))計(jì)算游離鈣，Kd＝2.2×10-8M。通過混和比例適當(dāng)?shù)?0mM K2EGTA和10mM CaEGTA原液(Molecular Probes)來調(diào)準(zhǔn)游離鈣濃度。于401nm監(jiān)控NOS活性的線性化超過2分鐘，并根據(jù)吸光率的變化，使用消光系數(shù)60mM-1cm-1計(jì)算NO生成。所有反應(yīng)于23℃進(jìn)行，每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表3-8次觀察。用于276nm處的消光系數(shù)0.0033μM-1cm-1確定鈣調(diào)蛋白濃度。使用這種方法生成NO被加入的硝基-L-精氨酸(1mM)完全阻斷。當(dāng)通過向反應(yīng)混和物添加EGTA(200-800μM)來測(cè)定eNOS的失活時(shí)，螯合劑是在NADPH起始反應(yīng)后1分鐘加入的。當(dāng)檢驗(yàn)NADPH-細(xì)胞色素c還原酶活性時(shí)，使用的條件相同。這些反應(yīng)在0.5ml體積中含有CaM(120nM)和CaCl2(200μM)，以及eNOS(0.5μg)。
如Bredt等人(1990)以前所述，測(cè)定L-精氨酸向L-瓜氨酸的轉(zhuǎn)變。簡(jiǎn)而言之，將eNOS(0.25-2μg)于23℃在下列反應(yīng)混和物中溫育3-10分鐘50-100μL的反應(yīng)終體積中含有3pmol L-[3H]-精氨酸(55Ci/mmol)、10-300μM精氨酸、1mM NADPH、120-200nM鈣調(diào)蛋白、2mM CaCl2、和30μM BH4。通過加入0.5ml含有2mM EGTA和EDTA的20mMHEPES(pH5.5)來終止反應(yīng)。將反應(yīng)混和物置于Dowex AG50WX8中，并在Packard 1500液閃分析儀上對(duì)流經(jīng)液計(jì)數(shù)。
還原酶活性實(shí)驗(yàn)如Martasek等人(1999)和Masters等人(1967)以前所述，以550nm處的吸光率變化測(cè)量NADPH-細(xì)胞色素c還原酶活性和2，6-二氯酚靛酚(DCIP)還原，細(xì)胞色素c和DCIP都使用0.021μM-1cm-1的消光系數(shù)。簡(jiǎn)而言之，反應(yīng)混和物(1m1)含有細(xì)胞色素c(90μM)；DCIP(36μM)、HEPES緩沖液(50mM，pH7.6)、NaCl(250mM)、NADPH(100μM)、鈣調(diào)蛋白(120nM)、和CaCl2(200μM)；或已指明的其它物質(zhì)。加入eNOS后監(jiān)控反應(yīng)60秒鐘(于23℃)。當(dāng)需要加入EGTA(200-800μM)來測(cè)定還原酶活性的失活時(shí)，在反應(yīng)起始后1分鐘加入螯合劑，并再監(jiān)控1分鐘。用NADPH(100μM)起始含HEPES緩沖液(50mM，pH7.6)、CaM(120nM)、和CaCl2(200μM)的反應(yīng)。在檢驗(yàn)EGTA失活eNOS的反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中不加入NaCl，以模擬血紅蛋白捕獲實(shí)驗(yàn)的條件。加入的NOS抑制劑不影響細(xì)胞色素c還原的速率(未顯示)。如上文血紅蛋白捕獲實(shí)驗(yàn)所述，進(jìn)行eNOS的鈣EC50的測(cè)定。
數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)所有數(shù)據(jù)表述為平均值±S.E.。至少進(jìn)行3次測(cè)定，每個(gè)數(shù)據(jù)組至少使用3個(gè)不同批次的酶。同時(shí)純化野生型和突變型酶以控制制劑之間的活性變化。使用學(xué)生t-檢驗(yàn)法確定統(tǒng)計(jì)學(xué)差別明顯性，認(rèn)為p＜0.05在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差別是明顯的。
結(jié)果eNOS的表達(dá)和純化由大腸桿菌表達(dá)并純化野生型和S1179D eNOS。在1.6升培養(yǎng)物中，使用2’5’-ADP Sepharose 4B層析法通常可以回收大約2.5-4.0mg eNOS。如圖5A所示，根據(jù)考馬斯染色，兩種酶的純度都＞90％。如平行制備的野生型和S1179D eNOS的7份獨(dú)立制劑所示，這些結(jié)果具有代表性。如低溫SDS-PAGE所示(圖5B)，兩種酶都主要以其二聚體形式存在。
eNOS S1179D的NO合酶和還原酶活性比野生型eNOS高然后，通過測(cè)量NO生成的速率比較野生型和S1179D eNOS的活性。S1179D eNOS相對(duì)于野生型酶展示更高的轉(zhuǎn)換數(shù)(在最佳條件下)(84±6對(duì)27±1min-1，n＝6份分離的和配對(duì)的酶制劑)。野生型和S1179D eNOS與L-精氨酸的Km值相似(圖6A，分別為1.8對(duì)2.5μM；參閱表1)。

因?yàn)閺倪€原酶結(jié)構(gòu)域流向氧化酶結(jié)構(gòu)域的電子流速率對(duì)于NOS催化作用是決定性的，所以，為了確定能否歸功于還原酶活性的增強(qiáng)，檢測(cè)了S1179D eNOS活性的增加。在檢測(cè)DCIP和細(xì)胞色素c時(shí)，觀察到S1179D活性比野生型eNOS的顯著增加(圖6B)。此外，CaM的存在削弱這種增加，但增加了兩種酶的整體活性。當(dāng)不存在CaM時(shí)，S1179D的基礎(chǔ)細(xì)胞色素c還原比野生型eNOS高4倍。S1179D eNOS的CaM刺激的還原細(xì)胞色素c的數(shù)量級(jí)較高(野生型和S1179D eNOS依次為749±35對(duì)1272±55min-1，n＝3-5)；然而，野生型eNOS的CaM刺激水平是8倍，而S1179D eNOS只有3倍。
其次，確定了S1179D eNOS產(chǎn)生的過氧化物是否比野生型eNOS多，(過氧化物能夠還原細(xì)胞色素c)。正如預(yù)期的，當(dāng)不存在CaM時(shí)，沒有觀察到可抑制細(xì)胞色素c還原的過氧化物歧化酶(作為過氧化物陰離子生成指數(shù))，正如以前報(bào)導(dǎo)的，野生型eNOS為86±6對(duì)95±8min-1，S1179DeNOS為278±9對(duì)288±7min-1，n＝3-5。然而，當(dāng)存在CaM時(shí)，過氧化物歧化酶降低了野生型(610±51對(duì)866±8min-1)和S1179D(1179±43對(duì)1518±19min-1)eNOS還原細(xì)胞色素c的速率。當(dāng)存在過氧化物歧化酶時(shí)，兩種酶的細(xì)胞色素c活性的相對(duì)降低是相似的(野生型eNOS為30％，S1179D eNOS為22％)，說明S1179D與野生型相比，eNOS還原酶活性增強(qiáng)(通過細(xì)胞色素c還原測(cè)定)不能歸功于酶的未偶聯(lián)。
野生型和S1179D eNOs中依賴NADPH的NO形成和還原酶活性沒有差異因?yàn)镹ADPH結(jié)合位點(diǎn)位于eNOS第1179位絲氨酸附近，所以檢驗(yàn)了NO生成和細(xì)胞色素c還原對(duì)NADPH的依賴性。根據(jù)存在CaM時(shí)測(cè)定的NO生成，S1179D eNOS的最大轉(zhuǎn)換數(shù)(kcat)比野生型酶高(圖7A)。kcat的增加與S1179D eNOS的NADPH Km比野生型eNOS增加4倍有關(guān)(依次為36對(duì)8μM)。當(dāng)不存在CaM時(shí)，S1179D eNOS依賴NADPH還原細(xì)胞色素c的kcat比野生型eNOS高(依次為290對(duì)70min-1；圖7B)。當(dāng)存在CaM時(shí)，S1179D還原細(xì)胞色素c的kcat顯著高于野生型eNOS(依次為840對(duì)460min-1)。當(dāng)不存在或存在CaM時(shí)，NADPH的Km值沒有變化(當(dāng)存在或不存在CaM時(shí)，野生型eNOS依次為0.40和0.75μM，S1179D eNOS依次為2.0和1.9μM)。
在野生型和S1179DeNOS之間CaM的EC50值沒有變化為了評(píng)估S1179DeNOS的活性增加能否歸功于酶對(duì)CaM的親和力變化，當(dāng)所有NOS輔助因子過度存在時(shí)，檢驗(yàn)了作為CaM濃度函數(shù)的NOS活性和細(xì)胞色素c還原的動(dòng)力學(xué)。野生型和S1179D eNOS CaM激活NOS活性的kcat依次為22min-1和43min-1。數(shù)據(jù)變換(kcat差異的歸一化)揭示了S1179D eNOS的曲線略向左移，但是CaM的EC50差異很小，這與磷酸-eNOS報(bào)導(dǎo)的數(shù)據(jù)是一致的(Mitchell等人，1999)。野生型和S1179D eNOS的EC50值為8nM和7nM(圖8A)。測(cè)量了NADPH介導(dǎo)的細(xì)胞色素c還原。CaM激活S1179D eNOS還原細(xì)胞色素c的kcat比野生型酶高大約2倍(S1179D和野生型eNOS依次為1140和620min-1)。數(shù)據(jù)變換(kcat差異的歸一化)揭示了野生型與S1179D eNOS之間的CaM的EC50值略有差異(21對(duì)13nM；圖8B)。
eNOS的鈣激活和失活的比較在以前的實(shí)驗(yàn)中證明，在表達(dá)大量磷酸-eNOS或S1179D eNOS的細(xì)胞中，eNOS的“表面鈣敏感性”增強(qiáng)，說明磷酸化增強(qiáng)了鈣/CaM激活的親和力(Dimmeler等人，1999；Fulton等人，1999)。如圖8C所示，將最大活性差異歸一化之后，S1179D eNOS的鈣依賴性略有增加(p＜0.05，兩種分析的方差)。正如根據(jù)No生成所測(cè)定(當(dāng)存在250nM CaM時(shí))，野生型和S1179D eNOS的鈣EC50值也略有差異(依次為310和250nM鈣)。如圖8C插圖所示，游離鈣濃度的增加確實(shí)使S1179D eNOS的轉(zhuǎn)換比野生型酶大大增強(qiáng)。此外，由測(cè)定細(xì)胞色素c還原獲得的鈣EC50值與由測(cè)量NO生成獲得的相似(圖8D；野生型和S1179D eNOS依次為290和220nM)。此外，S1179D eNOS轉(zhuǎn)換的鈣激活的Vmax比野生型大(圖4D插圖)。
為了檢驗(yàn)S1179D eNOS與野生型酶的失活是否不同，測(cè)量了用EGTA螯和鈣后的eNOS活性衰退。在這些實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)存在鈣時(shí)(200μM)，加入所有NOS輔助因子，并監(jiān)控NO生成1分鐘，隨后加入不同濃度的EGTA并再監(jiān)控1分鐘。如圖9A所示，向野生型和S1179D eNOS加入EGTA以依賴濃度的方式降低NO生成。然而，S1179D eNOS的NO生成對(duì)加入EGTA較不敏感；即在較低濃度的EGTA時(shí)，野生型eNOS的活性比S1179D eNOS的活性降低得更快。于400μMEGTA時(shí)，發(fā)現(xiàn)酶之間的活性差異最大。此外，于600μM EGTA時(shí)，沒有檢測(cè)到野生型eNOS的活性，而仍能檢測(cè)到S1179D eNOS的殘余活性。細(xì)胞色素c還原實(shí)驗(yàn)獲得了相似結(jié)果(圖9B)向反應(yīng)中加入400和600μM螯合劑時(shí)發(fā)現(xiàn)顯著的活性差異。然而，在EGTA的濃度最高時(shí)，野生型和S1179D eNOS都發(fā)現(xiàn)了有殘余的還原酶活性。
總而言之，牛內(nèi)皮一氧化氮合酶(eNOS)是直接由蛋白激酶Akt在第1179位絲氨酸磷酸化的(Fulton等人，1999)，而人內(nèi)皮一氧化氮合酶是直接由蛋白激酶Akt在第1177位絲氨酸磷酸化的(Dimmeler等人，1999)。在不存在拮抗劑攻擊時(shí)，牛eNOS第1179位殘基向帶負(fù)電荷的天冬氨酸的突變，組成性地增加了一氧化氮(NO)生成。
應(yīng)當(dāng)這樣理解，上述討論和實(shí)施例僅僅是某些優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)說明。因此，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下進(jìn)行各種修改和等同變化。在上文或下文標(biāo)明的所有參考文獻(xiàn)、文章、和專利全部引入作為參考。
參考文獻(xiàn)此外完整引入的未給出完整引文的其它文獻(xiàn)。
Alessi等人，歐洲分子生物學(xué)雜志(EMBO J.)156541-6551，1996。
Bredt等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87682-685，1990。
Corson等人，循環(huán)研究(Circulation Research)79984-991，1996。
Dimmeler等人，自然(Nature)399601-605，1999。
Downward，現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)評(píng)論(Curr.Opin.Cell Biol.)10262-267，1998。
Fulton等人，自然(Nature)399597-601，1999。
Garcia-Cardena等人，自然(Nature)392821-824，1998。
Garcia-Cardena等人，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)27127237-27240，1996。
Garcia-Cardena等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)936448-6453，1996a。
Huang等人，自然(Nature)377239-242，1995。
Kantor等人，科學(xué)(Science)2741744-1748，1996。
Kelm等人，生化和生理學(xué)研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Commun.)154236-244，1988。
Klatt等人，歐洲分子生物學(xué)雜志(EMBO J.)143687-3695，1995。
Liu等人，生化(Biochemistry)3513277-13281，1996。
Liu等人，細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell Biol.)1371525-1535，1997。
Martasek等人，酶學(xué)方法(Methods Emzymol.)30170-78，1999。
Martasek等人，生化和生理學(xué)研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Commun.)219359-365，1996。
Masters等人，酶學(xué)方法(Methods Enzymol.)10565-573，1967。
Michel等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)906252-6256，1993。
Michell等人，當(dāng)代生物學(xué)(Curr.Biol.)9845-848，1999。
Murohara等人，臨床調(diào)查雜志(J.Clin.Invest.)1012567-2578，1998。
Papapetropoulos等人，臨床調(diào)查雜志(J.Clin.Invest.)1003131-3139，1997。
Roman等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)928428-8432，1995。
Rudic等人，臨床調(diào)查雜志(J.Clin.Invest.)101731-736，1998。
Sessa等人，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)27017641-17644，1995。
Shaul等人，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)2716518-6522，1996。
Shesely等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)9313176-13181，1996。
Yano等人，自然(Nature)396584-587，1998。
權(quán)利要求
1.編碼選自下組的NOS多肽的分離的核酸分子有組成性活性的NOS多肽、NO生成速率增加了的NOS多肽、和還原酶活性增加了的NOS多肽。
2.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中NOS多肽在牛eNOS第1179位殘基、人eNOS第1177位殘基、大鼠nNOS第1412位殘基、或人nNOS第1415位殘基具有替代氨基酸殘基。
3.權(quán)利要求2的分離的核酸分子，其中在牛eNOS第1179位殘基、人eNOS第1177位殘基、大鼠nNOS第1412位殘基、或人nNOS第1415位殘基的替代氨基酸殘基模擬了磷酸絲氨酸。
4.權(quán)利要求2的分離的核酸分子，其中在牛eNOS第1179位殘基、人eNOS第1177位殘基、大鼠nNOS第1412位殘基、或人nNOS第1415位殘基的絲氨酸已經(jīng)用天冬氨酸或谷氨酸殘基替代。
5.權(quán)利要求2的分離的核酸分子，其中替代氨基酸的R基團(tuán)模擬磷酸基團(tuán)。
6.權(quán)利要求1-5的任一項(xiàng)分離的核酸分子編碼的多肽。
7.選自下組的分離的NOS多肽具有組成活性的NOS多肽、NO生成速率增加了的NOS多肽、和還原酶活性增加了的NOS多肽。
8.權(quán)利要求7的NOS多肽，該多肽在牛eNOS第1179位殘基、人eNOS第1177位殘基、大鼠nNOS第1412位殘基、或人nNOS第1415位殘基含有替代氨基酸殘基。
9.權(quán)利要求8的有組成性活性的NOS多肽，其中替代氨基酸已經(jīng)用天冬氨酸或谷氨酸殘基替代。
10.刺激患者冠狀動(dòng)脈側(cè)副管發(fā)育的方法，包括以有效促進(jìn)冠狀動(dòng)脈側(cè)副管發(fā)育的方式遞送編碼權(quán)利要求7的多肽或Akt多肽的轉(zhuǎn)基因的步驟。
11.權(quán)利要求10的方法，其中轉(zhuǎn)基因是從心室肌細(xì)胞特異啟動(dòng)子、平滑肌細(xì)胞特異啟動(dòng)子、或內(nèi)皮細(xì)胞特異啟動(dòng)子表達(dá)的。
12.權(quán)利要求11的方法，其中特異于心室肌細(xì)胞的啟動(dòng)子包含心室肌球蛋白輕鏈-2或肌球蛋白重鏈啟動(dòng)子序列。
13.刺激外周血管缺陷病患者血管發(fā)育的方法，包括以有效促進(jìn)外周血管發(fā)育的方式向患者外周血管系統(tǒng)遞送編碼權(quán)利要求7的多肽或Akt多肽的轉(zhuǎn)基因的步驟。
14.治療心肌缺血的方法，包括以有效治療心肌缺血的方式向心肌膜遞送編碼權(quán)利要求7的多肽或Akt多肽的步驟。
15.權(quán)利要求14的方法，其中轉(zhuǎn)基因的表達(dá)限制在心肌細(xì)胞。
16.權(quán)利要求15的方法，其中轉(zhuǎn)基因的表達(dá)限制在心室心肌細(xì)胞。
17.權(quán)利要求10-16任一項(xiàng)的方法，其中轉(zhuǎn)基因是由復(fù)制缺陷型載體編碼的。
18.權(quán)利要求17的方法，其中復(fù)制缺陷型載體是腺病毒。
19.權(quán)利要求10-16任一項(xiàng)的方法，其中轉(zhuǎn)基因在體外轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞。
20.權(quán)利要求19的方法，其中將已轉(zhuǎn)染細(xì)胞遞送至患者。
21.表達(dá)權(quán)利要求7的多肽的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
22.鑒定調(diào)節(jié)NOS受Akt調(diào)控的活性的試劑的方法，包括下列步驟a)將表達(dá)NOS的細(xì)胞與試劑接觸；并b)測(cè)量NOS受Akt調(diào)控的活性，由此鑒定調(diào)節(jié)NOS受Akt調(diào)控的活性的試劑。
23.權(quán)利要求22的方法，其中步驟(b)包括測(cè)定在牛eNOS第1179位殘基、人eNOS第1177位殘基、大鼠nNOS第1412位殘基、或人nNOS第1415位殘基的氨基酸殘基處的NOS磷酸化狀態(tài)。
24.權(quán)利要求23的方法，其中NOS由試劑激活。
25.權(quán)利要求24的方法，其中試劑模擬Akt介導(dǎo)的eNOS磷酸化。
26.權(quán)利要求25的方法，其中試劑抑制在牛eNOS第1179位殘基、人eNOS第1177位殘基、大鼠nNOS第1412位殘基、或人nNOS第1415位殘基的氨基酸殘基處的脫磷酸化。
27.權(quán)利要求22的方法，其中步驟(b)包括測(cè)量NO生成。
28.權(quán)利要求27的方法，其中通過測(cè)量亞硝酸鹽濃度或3H-L-精氨酸向3H-L-瓜氨酸的轉(zhuǎn)變來檢測(cè)NO。
29.鑒定調(diào)節(jié)NOS受Akt調(diào)控的活性的試劑的方法，包括下列步驟c)將Akt和NOS蛋白質(zhì)或肽與試劑接觸；并d)測(cè)量NOS活性。
30.權(quán)利要求29的方法，其中通過測(cè)定NOS依賴Akt的磷酸化狀態(tài)來測(cè)量NOS活性。
31.權(quán)利要求30的方法，其中NOS肽包含SEQ ID NO2。
32.權(quán)利要求30的方法，其中在步驟(b)中的NOS活性是還原酶活性。
33.權(quán)利要求30的方法，其中在步驟(b)中的NOS活性是由NOS生成NO。
34.編碼選自下組的NOS多肽的分離的核酸分子在第1177位殘基有替代氨基酸殘基的牛eNOS、在第1179位殘基有替代氨基酸殘基的人eNOS、在第1412位殘基有替代氨基酸殘基的大鼠nNOS、和在第1415位殘基有替代氨基酸殘基的人nNOS，其中替代氨基酸殘基的R基團(tuán)不帶負(fù)電。
35.權(quán)利要求34的分離的核酸分子，其中替代氨基酸殘基是丙氨酸。
36.選自下組的分離的NOS多肽在第1177位殘基有替代氨基酸殘基的牛eNOS、在第1179位殘基有替代氨基酸殘基的人eNOS、在第1412位殘基有替代氨基酸殘基的大鼠nNOS、和在第1415位殘基有替代氨基酸殘基的人nNOS，其中替代氨基酸殘基的R基團(tuán)不帶負(fù)電。
37.權(quán)利要求36的NOS多肽，其中替代氨基酸殘基是丙氨酸。
38.權(quán)利要求11的方法，其中內(nèi)皮細(xì)胞特異啟動(dòng)子是Tie-2啟動(dòng)子、內(nèi)皮啟動(dòng)子、或eNOS啟動(dòng)子。
39.權(quán)利要求11的方法，其中平滑肌細(xì)胞啟動(dòng)子是SM22啟動(dòng)子或SMα-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。
40.治療患者心血管疾病的方法，包括向患者遞送編碼權(quán)利要求7的多肽或Akt多肽的轉(zhuǎn)基因的步驟。
41.權(quán)利要求40的方法，其中心血管疾病選自下組心力衰竭、心肌梗死、再狹窄、血管成形術(shù)后狹窄、支架狹窄、和旁路移植失敗。
42.用于治療患者勃起障礙的方法，包括向患者遞送編碼權(quán)利要求7的多肽或Akt多肽的轉(zhuǎn)基因的步驟。
43.權(quán)利要求10、13、14、40、或42任一項(xiàng)的方法，其中轉(zhuǎn)基因是向血管內(nèi)、肌肉內(nèi)、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、或動(dòng)脈內(nèi)遞送的。
全文摘要
本發(fā)明涉及在依賴Akt的磷酸化位點(diǎn)具有結(jié)構(gòu)變化的新的NOS變異體和突變體。改變后的NOS蛋白質(zhì)或肽(尤其是人eNOS蛋白質(zhì)或肽)、Akt蛋白質(zhì)或肽、及其編碼核酸分子,可以作為基因治療劑治療血管成形術(shù)后再狹窄、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、心力衰竭、糖尿病、和血管發(fā)生缺陷等疾病。NOS蛋白質(zhì)和肽還可用于篩選調(diào)節(jié)NOS活性的試劑的方法。
文檔編號(hào)A01K67/027GK1347283SQ00806325
公開日2002年5月1日 申請(qǐng)日期2000年4月14日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月16日
發(fā)明者W·C·塞薩 申請(qǐng)人:耶魯大學(xué)