專利名稱：角齒蘚△6－乙炔酶和△6－脫飽和酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備不飽和脂肪酸的方法，以及制備具有較高不飽和脂肪酸含量的甘油三酯的方法。本發(fā)明還涉及用編碼Δ6-乙炔酶/Δ6-脫飽和酶或Δ6-脫飽和酶的DNA序列生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因生物，優(yōu)選轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因微生物，該轉(zhuǎn)基因生物具有較高含量的具有Δ6三鍵和/或Δ6雙鍵的脂肪酸、油類或脂類。
本發(fā)明還涉及分離的核酸序列；涉及含有一種核酸序列的表達(dá)框，含有一種核酸序列或表達(dá)框的載體和生物。本發(fā)明還涉及具有較高含量不飽和脂肪酸的不飽和脂肪酸和甘油三酯及其用途。
脂肪酸和甘油三酯在食品業(yè)、動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)、化妝品和制藥行業(yè)有著多種用途。它們適合于多種用途，這要取決于它是游離飽和或不飽和脂肪酸或具有較高含量飽和或不飽和脂肪酸的甘油三酯；因此，例如，可將多不飽和脂肪酸添加到嬰兒食品中，以便提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。各種脂肪酸和甘油三酯主要是從諸如被胞霉屬的微生物或諸如大豆、油用油菜、向日葵等的產(chǎn)油植物中獲得的，通常得到的是它的甘油三酯形式。不過，也可以從諸如魚的動(dòng)物物種中獲得。游離脂肪酸優(yōu)選是通過皂化作用制備的。
根據(jù)其用途，優(yōu)選具有飽和或不飽和脂肪酸的油；因此，例如，具有不飽和脂肪酸，特別是多不飽和脂肪酸的脂類是人類營(yíng)養(yǎng)品所優(yōu)選的，因?yàn)樗鼘?duì)血液膽甾醇含量具有有利影響，并因此對(duì)發(fā)生心臟病的可能性具有有利影響。它們被用于各種人類飲食或藥品中。
由于它的有利特征，在過去一直不缺乏利用現(xiàn)有的與脂肪酸和甘油三酯合成相關(guān)的基因在各種生物中生產(chǎn)具有改變了的不飽和脂肪酸含量的油類的方法。因此，WO91/13972及其在美國(guó)的等同的專利申請(qǐng)披露了Δ9-脫飽和酶。WO93/11245要求保護(hù)一種Δ15-脫飽和酶，WO94/11516要求保護(hù)Δ12-脫飽和酶。Δ6-脫飽和酶披露于WO93/06712、US5614393、WO96/21022和WO99/27111中。例如，其他脫飽和酶披露于以下文獻(xiàn)中EP-A-0550162、WO94/18337、WO97/30582、WO97/21340、WO95/18222、EP-A-0794250、Stukey等，生物化學(xué)雜志256，199020144-20149；Wada等，自然347，1990200-253或Huang，脂類34，1999649-659。WO96/13591披露并且要求保護(hù)Δ6-棕櫚酰-ACP-脫飽和酶。不過，到目前為止對(duì)各種脫飽和酶的生化鑒定還不充分。因?yàn)橐蛛x和鑒定作為膜結(jié)合蛋白的這種酶難度很多(MaKeon，酶學(xué)方法，198112141-12147，Wang等，植物生理學(xué)生物化學(xué)，26，1988777-792)。
WO97/37033披露了Δ12-乙炔酶。這種酶可用于制備三鍵的不飽和C18-脂肪酸。這種類型的脂肪酸除了可用于人類食品之外，由于其反應(yīng)性還可用于制備聚合物。Sperling等在一次會(huì)議上(South LakeTahoe，加拿大，1999年6月9-13日)報(bào)導(dǎo)了一種酶的克隆，這種酶有可能將三鍵導(dǎo)入脂肪酸，但這種酶的底物與Δ12-乙炔酶底物不同，并且這種酶將三鍵引入不同的脂肪酸的不同位置。
在酵母中可以證實(shí)脂肪酸譜向不飽和脂肪酸的偏移和其產(chǎn)量的提高(參見Huang等，脂類34，1999649-659，Napier等，生物化學(xué)雜志，330卷，1998，611-614)。不過，各種不飽和酶在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)沒有表現(xiàn)出所需要的結(jié)果。它有可能表現(xiàn)出脂肪酸譜向不飽和脂肪酸的偏移，但與此同時(shí)也會(huì)發(fā)生這種轉(zhuǎn)基因植物的合成性能的顯著降低，就是說(shuō)，與原始植物相比只能分離到少量的油類。
迫切需要編碼與不飽和脂肪酸生物合成相關(guān)的酶的新型基因并可以利用它以工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)不飽和脂肪酸。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供合成不飽和鍵合脂肪酸(ungesttigterkonjugierter Fettsuren)的其他酶。
我們業(yè)已發(fā)現(xiàn)這一目的是通過選自下列一組的編碼具有Δ6-乙炔酶和/或Δ6-脫飽和酶活性的多肽的分離的核酸序列實(shí)現(xiàn)的a)具有SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO11所示序列的核酸序列，b)由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而由SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO11所示核酸序列衍生的核酸序列，c)SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO11所示核酸序列的衍生物，它編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽，并且在氨基酸水平上具有至少75％的同源性，這種多肽的酶促活性不具明顯的降低。
例如，衍生物表示由SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO11所編碼的酶或其酶促活性的功能同系物，就是說(shuō)，能催化與SEQ IDNO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO11所編碼的酶相同的酶促反應(yīng)的酶。所述基因有可能用于制備在Δ6號(hào)位置上具有三鍵和/或雙鍵的不飽和脂肪酸。在下文中，不飽和脂肪酸表示具有一個(gè)或多個(gè)不飽和度并具有三鍵和/或雙鍵的脂肪酸。所述三鍵和/或雙鍵可以是共軛的或非共軛的。SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO11所示序列編碼具有乙炔酶和/或Δ6-脫飽和酶活性的新型酶。
所述新型酶Δ6-乙炔酶/Δ6-脫飽和酶優(yōu)選將順式雙鍵導(dǎo)入甘油酯脂肪酸殘基的C6-C7位置和/或?qū)I(yè)已存在的C6-C7位置上的雙鍵轉(zhuǎn)化成三鍵(參見SEQ ID NO1或SEQ ID NO3)。另外，具有Δ6-脫飽和酶活性的酶優(yōu)選只能在甘油酯的脂肪酸殘基的C6-C7位置上引入順式雙鍵。具有SEQ ID NO11所示序列的酶也具有這種活性，并且是單一功能的Δ6-脫飽和酶。
所述新型核酸序列(對(duì)本申請(qǐng)來(lái)說(shuō)，單數(shù)形式可以包括復(fù)數(shù)形式，反之亦然)或其片段可優(yōu)選用于通過同源性篩選分離其他基因組序列。
例如，上述衍生物可以從其他生物中分離，例如，真核生物，如植物，特別是苔蘚、雙鞭甲藻(Dinoflagellaten)或真菌。
另外，舉例來(lái)說(shuō)，SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO11所示序列的衍生物或功能性衍生物表示等位變體，它在衍生的氨基酸水平具有至少70％的同源性，優(yōu)選至少75％的同源性，優(yōu)選至少80％的同源性，特別優(yōu)選85％的同源性，非常特別的優(yōu)選90％的同源性。所述同源性是基于完整氨基酸片段計(jì)算的。使用程序PileUp、BESTFIT、GAP，TRANSLATE或BACKTRANSLATE(＝UWGC程序包的部分，Wisconsin包，10.0版-UNIS，1999年1月，遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組公司，Deareux等，核酸研究(Nucleic.Acid Res.)，12，1984387-395)(分子進(jìn)化雜志(J.Mol.Evolution.)25，351-360，1987，Hizzins，CABIOS，5，1989151-153)。由所述核酸序列衍生的氨基酸序列示于SEQ IDNO2、SEQ ID NO4和SEQ ID NO12中。同源性表示同一性，就是說(shuō)氨基酸序列至少70％相同。所述新型序列在核酸水平上具有至少65％的同源性，優(yōu)選至少70％，特別優(yōu)選至少75％，非常特別優(yōu)選至少80％。
等位變體特別包括功能性變體，它可以通過核苷酸的缺失、插入或取代由SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO11所示序列獲得，同時(shí)保留了衍生合成蛋白的酶促活性。
所述DNA序列可以以SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO11所示DNA序列或這些序列的部分為原始材料分別得到，例如，使用常規(guī)雜交方法或PCR技術(shù)已從諸如上述真核生物的其他真核生物中獲得。所述DNA序列在標(biāo)準(zhǔn)條件下與上述序列雜交。優(yōu)選使用雜交短寡核苷酸，例如其保守區(qū)，該保守區(qū)可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法通過與其他乙炔酶和/或脫飽和酶進(jìn)行比較而確定。優(yōu)選使用組氨酸框序列，不過，還可將所述新型核酸的較長(zhǎng)的片段或其全長(zhǎng)序列用于雜交。所述標(biāo)準(zhǔn)條件根據(jù)所使用的核酸而有所不同根據(jù)所使用的是哪一種類型的核酸(DNA或RNA)將寡核苷酸、較長(zhǎng)片段或全長(zhǎng)序列用于雜交。因此，例如，DNADNA雜合體的解鏈溫度比相同長(zhǎng)度的DNARNA雜合體的解鏈溫度低大約10℃。
例如，標(biāo)準(zhǔn)條件表示，根據(jù)核酸的類型，在濃度為0.1-5×SSC(1×SSC＝0.15M氯化鈉，15mM檸檬酸鈉，pH7.2)的含水緩沖液中的溫度為42-58℃，或者另外存在50％的甲酰胺，例如，42℃在5×SSC，50％的甲酰胺中。DNADNA雜合體的雜交條件優(yōu)選為0.1×SSC，溫度為大約20-45℃，優(yōu)選大約30-45℃。DNARNA雜合體的雜交條件優(yōu)選為0.1×SSC，溫度為大約30-55℃，優(yōu)選大約45-55℃。上述雜交溫度是解鏈溫度，是通過在沒有甲酰胺的條件下用長(zhǎng)度為大約100個(gè)核苷酸并且G+C含量為55％的核酸計(jì)算的。DNA雜交的實(shí)驗(yàn)條件披露于相關(guān)遺傳學(xué)教科書中，例如，Sambrook等，分子克隆，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1989，并且，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的公式計(jì)算，例如，根據(jù)核酸的長(zhǎng)度，雜合體的性質(zhì)或G+C含量計(jì)算。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在以下教科書中找到雜交的進(jìn)一步的信息Ausubel等著，1985，當(dāng)代分子生物學(xué)方法，John Wiley&Sons，紐約，Hames和Higgins(著)，1985，核酸雜交實(shí)踐方法，牛津大學(xué)出版社IRL出版社，牛津；Brown(著)，1991，基礎(chǔ)分子生物學(xué)實(shí)踐方法，牛津大學(xué)出版社IRL出版社，牛津。
衍生物還表示SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO11的序列的同系物，例如，真核同系物、截短的序列、編碼和非編碼DNA序列的單鏈DNA，或編碼和非編碼DNA序列的RNA。
另外，SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO11的同系物表示衍生物，如啟動(dòng)子變體。所述變體可以通過一個(gè)或多個(gè)核苷酸的交換，通過插入和/或缺失而進(jìn)行修飾，不過，這種修飾不會(huì)損害啟動(dòng)子的功能和效力。另外，所述啟動(dòng)子可以通過修飾其序列而增強(qiáng)其效力，或者用甚至是來(lái)自異源生物的更有效的啟動(dòng)子來(lái)完全取代它。
衍生物還可以優(yōu)選表示這樣的變體，其核苷酸序列在起始密碼子上游的-1至-2000的片段上進(jìn)行過修飾，以便改變基因表達(dá)和/或蛋白表達(dá)，優(yōu)選增強(qiáng)基因表達(dá)。衍生物還表示在3’末端修飾過的變體。
衍生物還表示可用于抑制所述新型蛋白生物合成的反義DNA。所述反義DNA屬于本發(fā)明的無(wú)功能衍生物。如不具有酶促活性的衍生物。本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的生產(chǎn)無(wú)功能衍生物的其他方法有所謂的共抑制，核糖酶和內(nèi)含子的使用。核糖酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，它能夠裂解與它具有互補(bǔ)性的單鏈核酸，如mRNA。這樣就可以利用所述核糖酶催化裂解mRNA(Haselhoff和Gerlach，自然，334，1988585-591，從而抑制該mRNA的翻譯。這種類型的核糖酶可以就其目的特異性地添加或切割(hin zugeschnitten)(US4987071；US5116942和Bartel等，科學(xué)261，1993，1411-1418)。因此，可以利用反義DNA制備較高含量飽和脂肪酸的脂肪酸、脂類或油。
編碼Δ6-乙炔酶/Δ6-脫飽和酶和/或Δ6-脫飽和酶的新型核酸序列可以通過合成制備或者從天然來(lái)源分離或者包括合成的和天然DNA成分的混合物，并且包括來(lái)自各種生物的異源Δ6-乙炔酶/Δ6-脫飽和酶和/或Δ6-脫飽和酶基因片段。一般，合成核苷酸序列是用合適的宿主生物，例如植物所優(yōu)選的密碼子生產(chǎn)的。這通常會(huì)導(dǎo)致異源基因的最佳表達(dá)。所述植物優(yōu)選的密碼子是從具有最大蛋白頻率的密碼子中確定的，所述蛋白能在大多數(shù)感興趣的植物物種中表達(dá)。谷氨酸棒桿菌的一種例子披露于以下文獻(xiàn)Wada等(1992)核酸研究20，2111-2118。這種類型的實(shí)驗(yàn)可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。
編碼Δ6-乙炔酶/Δ6-脫飽和酶和/或Δ6-脫飽和酶基因的功能性等同序列是這種新型序列的這樣的衍生物，盡管它具有不同的核苷酸序列，但仍然具有所需功能，就是說(shuō)具有這種蛋白的酶促活性。因此，功能性等同物包括上述序列的天然變體，和人工核苷酸序列，例如，通過化學(xué)合成獲得并適應(yīng)植物的密碼子使用。
另外，人工DNA序列是合適的，只要它能如上文所述賦予所需特性，例如通過在作物中超量表達(dá)Δ6-乙炔酶/Δ 6-脫飽和酶和/或Δ6-脫飽和酶基因提高植物中脂肪酸、油或脂類的Δ6三鍵或Δ6雙鍵的含量。所述人工DNA序列可以通過具有Δ6-乙炔酶/Δ6-脫飽和酶和/或Δ6-脫飽和酶活性的構(gòu)建蛋白的分子模擬反翻譯或通過提外篩選建立。用于修飾或改進(jìn)DNA序列的DNA體外進(jìn)化的可能技術(shù)披露于以下文獻(xiàn)中Patten，P.A.等，生物技術(shù)當(dāng)代觀點(diǎn)(Current Opinion inBiotechnology)8，724-733(1997)，或Moore，J.C.分子生物學(xué)雜志(Journal of Molecular Biology)272，336-347(1997)。通過遵守宿主植物所特有的密碼子使用的多肽序列的反翻譯所獲得的編碼DNA序列是特別合適的。熟悉植物遺傳學(xué)方法的技術(shù)人員通過對(duì)要轉(zhuǎn)化的植物中的其他已知基因進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析可以很容易確定其特定的密碼子使用。
還要提到的其他合適的等同核酸序列是編碼融合蛋白的序列，其中，Δ6-乙炔酶/Δ6-脫飽和酶和/或Δ6-脫飽和酶多肽或其功能性等同部分是該融合蛋白的組成成分。該融合蛋白的第二部分可以是，例如，具有酶促活性的另一種多肽或一種抗原性多肽序列，借助于該序列可以檢測(cè)Δ6-乙炔酶/Δ6-脫飽和酶和/或Δ6-脫飽和酶表達(dá)(例如，myc標(biāo)記或his標(biāo)記)。不過，它優(yōu)選是調(diào)控蛋白序列，例如，ER的信號(hào)序列它能將Δ6-乙炔酶/Δ6-脫飽和酶和/或Δ6-脫飽和酶蛋白引導(dǎo)至需要的作用位點(diǎn)。
優(yōu)選將所述新型過程中的Δ6-乙炔酶/Δ6-脫飽和酶或Δ6-脫飽和酶基因與脂肪酸生物合成的其他基因融合。所述基因的例子有乙酰轉(zhuǎn)移酶、其他脫飽和酶或延伸酶。對(duì)于體內(nèi)，特別是體外合成來(lái)說(shuō)，優(yōu)選與諸如NADH細(xì)胞色素B5還原酶組合，這種酶能夠吸收或釋放還原等同物。
新型氨基酸序列表示含有SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或SEQ IDNO12所示序列的氨基酸序列或者多個(gè)氨基酸殘基的取代、倒轉(zhuǎn)、插入或缺失可以從所述序列獲得的序列的蛋白，SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或SEQ ID NO12所示蛋白的酶促活性得到了保留或僅有微不足道的減弱。微不足道的減弱表示所有的酶仍然具有原始酶的酶促活性的至少10％，優(yōu)選20％，更優(yōu)選30％。另外，還可以，例如，用具有相似物理化學(xué)特性(脹量、堿性、疏水性等)的氨基酸取代特定的氨基酸。例如，用賴氨酸取代精氨酸殘基；用異亮氨酸取代纈氨酸殘基；或用谷氨酸取代天冬氨酸殘基。不過，還可以有一個(gè)或多個(gè)氨基酸在其序列上發(fā)生轉(zhuǎn)座、添加或缺失，或者將上述若干措施組合在一起。
衍生物還表示功能等同物，具體地講，它還包括天然或編碼Δ6-乙炔酶/Δ6-脫飽和酶和/或Δ6-脫飽和酶的原始分離序列的人工突變，它還具有所需要的功能，就是說(shuō)其酶促活性只有微不足道的減弱。突變包括一個(gè)或多個(gè)核苷酸殘基的取代、添加、缺失、轉(zhuǎn)座或插入。因此，舉例來(lái)說(shuō)，本發(fā)明還包括通過修飾Δ6-乙炔酶/Δ6-脫飽和酶和/或Δ6-脫飽和酶的核苷酸序列而獲得的核苷酸序列。例如，所述修飾的目的可以是進(jìn)一步定位它所包含的編碼序列，或者，例如，還可以插入其他限制酶裂解位點(diǎn)。
功能等同物還可以是這樣的變體，其功能與原始基因或基因片段相比減弱(＝微不足道的減弱)或增強(qiáng)(＝酶促活性大于原始酶的酶促活性，就是說(shuō)該活性超過100％，優(yōu)選超過110％，特別優(yōu)選超過130％)。
例如，所述核酸序列還可以優(yōu)選是DNA或cDNA序列。例如，適合于插入新型表達(dá)框上的編碼序列有具有上述序列的編碼Δ6-乙炔酶/Δ6-脫飽和酶和/或Δ6-脫飽和酶的編碼序列，并且能賦予宿主超量產(chǎn)生在6號(hào)位置上具有三鍵和/或雙鍵的脂肪酸、油或脂類的能力。所述序列可以是同源或異源來(lái)源的。
所述新型表達(dá)框(＝核酸結(jié)構(gòu)或片段)表示SEQ ID NO1、SEQ IDNO3或SEQ ID NO11所示序列，并且它是由遺傳密碼和/或其功能性或非功能性衍生物產(chǎn)生的，該序列優(yōu)選與一種或多種調(diào)控信號(hào)功能性連接，以便增強(qiáng)基因表達(dá)，并且能操縱該編碼序列在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。所述調(diào)控序列的用途是使得所述基因能夠特異表達(dá)并使得蛋白能夠表達(dá)。例如，這可能意味著，根據(jù)宿主生物，所述基因是只能在誘導(dǎo)之后表達(dá)和/或超量表達(dá)，或者立即表達(dá)和/或超量表達(dá)。例如，所述調(diào)控序列是那些結(jié)合誘導(dǎo)劑或抑制劑的序列，并因此調(diào)控核酸的表達(dá)。除了所述新型調(diào)控序列之外或者作為所述序列的替代，在實(shí)際結(jié)合基因的前面可能還存在該序列的天然調(diào)控，如果必要，可以進(jìn)行遺傳學(xué)修飾，以便關(guān)閉所述天然調(diào)控，并增強(qiáng)所述基因的表達(dá)。不過，所述基因還可以具有簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)，就是說(shuō)在該核酸序列或其衍生物前面沒有其他調(diào)控信號(hào)，并且天然啟動(dòng)子及其調(diào)控沒有缺失。取而代之的是，對(duì)天然調(diào)控序列進(jìn)行誘變，以便該調(diào)控不再發(fā)生和/或基因表達(dá)得到增強(qiáng)。所述修飾啟動(dòng)子也可以部分序列形式(＝具有新型核酸序列部分的啟動(dòng)子)單獨(dú)存在于天然基因前面，以便增強(qiáng)其活性。另外，基因結(jié)構(gòu)可優(yōu)選包括一個(gè)或多個(gè)與啟動(dòng)子功能性連接的所謂增強(qiáng)子序列，它可以使得核酸序列表達(dá)加強(qiáng)。還可以DNA序列的3’末端插入其他有利的序列，如其他的調(diào)控因子或終止子。Δ6-乙炔酶/Δ6-脫飽和酶和/或Δ6-脫飽和酶可以一個(gè)或多個(gè)拷貝形式存在于表達(dá)框(＝基因結(jié)構(gòu))中。
另外，如上文所述，所述調(diào)控序列或因子優(yōu)選對(duì)插入基因的表達(dá)具有有利影響，并因此增強(qiáng)其表達(dá)。因此，通過使用諸如啟動(dòng)子和/或“增強(qiáng)子”的強(qiáng)轉(zhuǎn)錄信號(hào)，可以在轉(zhuǎn)錄水平上實(shí)現(xiàn)調(diào)控因子的有利的增強(qiáng)。不過，例如，通過改善mRNA的穩(wěn)定性也可以增強(qiáng)翻譯。
原則上講，所述表達(dá)框中的合適啟動(dòng)子是能夠在生物中，優(yōu)選在植物或真菌中控制外源基因表達(dá)的所有啟動(dòng)子。優(yōu)選使用特殊的植物啟動(dòng)子或源于植物病毒的啟動(dòng)子。例如，用于所述新方法的優(yōu)選調(diào)控序列存在于以下啟動(dòng)子中(cos-、tac-、trp-、tet-、trp-tet-、lpp-、lac-、lpp-lac-、lacIq-、T7-、T5-、T3-、gal-、trc-、ara-、SP6-、λ-PR-或存在于λ-PL啟動(dòng)子中，這些序列優(yōu)選用于革蘭氏陰性細(xì)菌中。其他優(yōu)選的調(diào)控序列存在于，例如，革蘭氏陽(yáng)性啟動(dòng)子amy和SPO2中，存在于酵母或真菌啟動(dòng)子ADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH或存在于植物啟動(dòng)子中，如CaMV/35S[Franck等，細(xì)胞(cell)21，1980，285-294]、SSU、OCS、lib4、STLS1、B33、nos(＝研制氨酸合成酶啟動(dòng)子)或存在于遍在蛋白啟動(dòng)子中。所述表達(dá)框還可以包括一個(gè)化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，通過該啟動(dòng)子可以在特定時(shí)間控制外源Δ6-乙炔酶/Δ6-脫飽和酶和/或Δ6-脫飽和酶基因在生物，優(yōu)選在植物中的表達(dá)。所述優(yōu)選植物啟動(dòng)子的例子有PRP1啟動(dòng)子[Ward等，植物分子生物學(xué)22，1993，361-366]，苯磺酰胺誘導(dǎo)型(EP388186)、四環(huán)素誘導(dǎo)型(Gatz等，1992，植物雜志，2，397-404)、水楊酸誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(WO95/19443)、脫落酸誘導(dǎo)型(EP335528)或乙醇或環(huán)己酮誘導(dǎo)型(WO93/21334)啟動(dòng)子。有源于馬鈴薯的細(xì)胞質(zhì)FBP酶啟動(dòng)子、源于馬鈴薯ST-LSI啟動(dòng)子(Stockhaus等，EMBO雜志8，1989，2445-245)、源于大豆的磷酸核糖焦磷酸轉(zhuǎn)酰胺酶(參見Genbank保藏號(hào)U87999)或披露于EP249676中的節(jié)專一性啟動(dòng)子。特別優(yōu)選的植物啟動(dòng)子是這樣的啟動(dòng)子它能確保在發(fā)生脂肪酸或其前體生物合成的組織或植物部分/器官中表達(dá)，例如，在胚乳或在發(fā)育中的胚胎中表達(dá)。優(yōu)選的啟動(dòng)子特別要提到能確保種子專一性表達(dá)的啟動(dòng)子，例如USP啟動(dòng)子或其衍生物，LEB4啟動(dòng)子，菜豆蛋白啟動(dòng)子或napin啟動(dòng)子。特別優(yōu)選的USP啟動(dòng)子或其衍生物能在種子發(fā)育的極早期階段介導(dǎo)基因表達(dá)(Baeumlein等，分子基因遺傳學(xué)，1991，225(3459-67)。可用于單子葉植物和雙子葉植物的其他優(yōu)選種子專一性啟動(dòng)子有適用于雙子葉植物的啟動(dòng)子，如源于油用油菜的napin基因啟動(dòng)子(US5608152)、源于擬南芥屬的油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子(WO98/45461)、源于(Phaseolus vulgaris)菜豆蛋白啟動(dòng)子(US5504200)、源于蕓薹屬(Brassica)的Bce4啟動(dòng)子(WO91/13980)或Leguminosen B4啟動(dòng)子(LeB4、Baeumlein等，植物雜志，2，2，1992233-239)或適合于單子葉植物的啟動(dòng)子，如源于大麥的lpt2或lpt1基因的啟動(dòng)子(WO95/15389和WO95/23230)或大麥醇溶蛋白基因啟動(dòng)子、水稻谷蛋白基因啟動(dòng)子、水稻米谷蛋白(Oryzin)基因啟動(dòng)子、水稻谷醇溶蛋白基因啟動(dòng)子、小麥麥醇溶蛋白基因啟動(dòng)子、小麥谷蛋白基因啟動(dòng)子、玉米醇溶蛋白基因啟動(dòng)子、燕麥谷蛋白基因啟動(dòng)子、高粱kasirin基因啟動(dòng)子或黑麥secalin基因啟動(dòng)子，這些啟動(dòng)子披露于WO99/16890中。
其他特別優(yōu)選的啟動(dòng)子是那些能夠確保在脂肪酸、油類和脂類或其前體生物合成發(fā)生的組織或植物部分中表達(dá)的啟動(dòng)子。特別要提到的是能確保種子專一性表達(dá)的啟動(dòng)子。應(yīng)當(dāng)提到的是有源于油用油菜的napin基因啟動(dòng)子(US5608152)、源于蠶豆(Vicia faba)的USP啟動(dòng)子(USP＝未知種子蛋白，Baeumlein等，分子基因遺傳學(xué)，1991，225(3)459-69)、源于擬南芥屬的油質(zhì)蛋白基因啟動(dòng)子(WO98/45461)、菜豆蛋白啟動(dòng)子(US5504200)或豆球蛋白B4基因啟動(dòng)子(LeB4、Baeumlein等，植物雜志，2，2，1992233-239)。還應(yīng)當(dāng)提到的有諸如源于大麥的lpt2或lpt1基因的啟動(dòng)子(WO95/15389和WO95/23230)，該啟動(dòng)子能在單子葉植物中進(jìn)行種子專一性表達(dá)。
如上文所述，表達(dá)框(＝基因結(jié)構(gòu)，核酸結(jié)構(gòu))可以包括需要導(dǎo)入生物的其他基因。這些基因可以分別受到調(diào)控或者受相同區(qū)的調(diào)控，如Δ6-乙炔酶/Δ6-脫飽和酶和/或Δ6-脫飽和酶基因。所述基因的例子還有生物合成基因，優(yōu)選脂肪酸生物合成基因，它能實(shí)現(xiàn)表達(dá)的增強(qiáng)?？梢蕴岬降睦佑芯幋aΔ15-、Δ12-、Δ9-、Δ6-、和Δ5-脫飽和酶、各種羥化酶Δ12-乙炔酶、?；鵄CP硫酯酶、β-酮脂酰ACP合成酶或β-酮脂酰ACP還原酶的基因。優(yōu)選將脫飽和酶基因用于核酸結(jié)構(gòu)中。
如下文所述，原則上講，可以將所有天然啟動(dòng)子連同它的調(diào)控序列，如上文所提到的啟動(dòng)子用于所述新型表達(dá)框和新的方法中。另外，還可以并且優(yōu)選適用合成啟動(dòng)子。
為了制備表達(dá)框，可以對(duì)各種DNA片段進(jìn)行操作，以便獲得能方便地按正確方向閱讀并且具有正確讀框的核苷酸序列。為了將這些DNA片段(＝新型核酸)連接在一起，可以在所述片段上連接接頭。
在啟動(dòng)子和終止子區(qū)沿轉(zhuǎn)錄方向提供接頭或多接頭是可行的和方便的，這些接頭含有一個(gè)或多個(gè)用于插入該序列的限制位點(diǎn)。所述接頭一般具有1-10、通常1-8個(gè)、優(yōu)選2-6個(gè)限制位點(diǎn)。所述調(diào)控區(qū)內(nèi)的接頭的大小一般小于100bp，通常小于60bp，但至少為50bp。所述啟動(dòng)子與宿主生物，例如宿主植物的關(guān)系可以是天然的或同源的以及外源的或異源的。所述表達(dá)框沿轉(zhuǎn)錄的5’-3’方向包括啟動(dòng)子、編碼Δ6-乙炔酶/Δ6-脫飽和酶和/或Δ6-脫飽和酶基因的DNA序列，和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。根據(jù)需要，各種終止區(qū)可以相互取代。
其他的可能性是采用能夠提供合適的限制裂解位點(diǎn)或消除多余的DNA或限制裂解位點(diǎn)的操作。當(dāng)涉及到插入、缺失或取代時(shí)，如轉(zhuǎn)換和顛換時(shí)，可以使用體外誘變、啟動(dòng)子修復(fù)、限制或連接?？梢酝ㄟ^合適的操作，例如限制、回粘(-chewing-back-)或補(bǔ)平突出端形成平端來(lái)提供所述片段的互補(bǔ)末端用于連接。
對(duì)于優(yōu)選的高水平表達(dá)來(lái)說(shuō)，特殊的ER固位信號(hào)SEKDEL的連接可能是特別重要的(Schouten，A.等，植物分子生物學(xué)30，1996，781-792)，這可以使表達(dá)的平均水平翻三番或翻四番。還可以采用植物和動(dòng)物蛋白天然存在的其他固位信號(hào)來(lái)構(gòu)建表達(dá)框，這些信號(hào)位于ER中。
優(yōu)選的聚腺苷酸化信號(hào)是植物聚腺苷酸化信號(hào)，優(yōu)選基本上相當(dāng)于來(lái)自根癌農(nóng)桿菌的T-DNA聚腺苷酸化信號(hào)的信號(hào)，特別是Ti質(zhì)粒pTiACH5的T-DNA的基因3(章魚氨酸合成酶)(Gielen等，EMBO雜志3，1984，835ff)或相應(yīng)的功能性等同物。
表達(dá)框是通過諸如披露于下列文獻(xiàn)中的常規(guī)重組和克隆技術(shù)將合適的啟動(dòng)子與合適的Δ6-乙炔酶/Δ6-脫飽和酶和/或Δ6-脫飽和酶DNA序列融合并與聚腺苷酸化信號(hào)融合而制備的T.Maniatis，E.S.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，NY(1989)，和T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，基因融合實(shí)驗(yàn)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，NY(1984)和Ausubel，S.M.等，當(dāng)代分子生物學(xué)方法，Greene出版協(xié)會(huì)，和Wiley-Interscience(1987)。
為了制備表達(dá)框，可以對(duì)各種DNA片段進(jìn)行操作，以便獲得便于沿正確方向閱讀并且具有正確讀框的核苷酸序列。為了將DNA片段連接在一起，可以在這些片段上連接接頭。
沿轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閱?dòng)子和終止子區(qū)提供接頭或多接頭是可行的和方便的，這些接頭含有一個(gè)或多個(gè)限制位點(diǎn)以便插入該序列。所述接頭一般具有1-10、通常1-8個(gè)、優(yōu)選2-6個(gè)限制位點(diǎn)。所述調(diào)控區(qū)內(nèi)的接頭的大小一般小于100bp，通常小于60bp，但至少為5bp。所述啟動(dòng)子與宿主植物的關(guān)系可以是天然的或同源的以及外源的或異源的。所述表達(dá)框沿轉(zhuǎn)錄的5’-3’方向包括啟動(dòng)子、編碼Δ6-乙炔酶/脫飽和酶基因的DNA序列和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。根據(jù)需要，各種終止區(qū)可以相互取代。
為了制備表達(dá)框，可以對(duì)各種DNA片段進(jìn)行操作，以便獲得便于沿正確方向閱讀并且具有正確讀框的核苷酸序列。為了將DNA片段連接在一起，可以在這些片段上連接接受體或接頭。
沿轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閱?dòng)子和終止子區(qū)提供接頭或多接頭是可行的和方便的，這些接頭含有一個(gè)或多個(gè)限制位點(diǎn)以便插入該序列。所述接頭一般具有1-10、通常1-8個(gè)、優(yōu)選2-6個(gè)限制位點(diǎn)。所述調(diào)控區(qū)內(nèi)的接頭的大小一般小于100bp，通常小于60bp，但至少為5bp。所述啟動(dòng)子與宿主植物的關(guān)系可以是天然的或同源的以及外源的或異源的。所述表達(dá)框沿轉(zhuǎn)錄的5’-3’方向包括啟動(dòng)子、編碼Δ6-乙炔酶/Δ6-脫飽和酶或Δ6-脫飽和酶基因的DNA序列和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。根據(jù)需要，各種終止區(qū)可以相互取代。
源于角齒蘚(Ceratodon purpureus)的編碼Δ6-乙炔酶/Δ6-脫飽和酶和/或Δ6-脫飽和酶的DNA序列包括實(shí)現(xiàn)脂肪酸、脂類或油類生物合成位點(diǎn)正確定位所必需的所有序列特征。因此，不需要其他引導(dǎo)序列本身。不過，所述定位可能是需要的和有利的，并因此進(jìn)行人工修飾或增強(qiáng)，以便所述融合結(jié)構(gòu)同樣也是本發(fā)明的優(yōu)選的和有利的實(shí)施方案。
特別優(yōu)選的序列是能確保在質(zhì)體中定向的序列。在某些場(chǎng)合下，還可以需要在其他區(qū)室中的定向(披露于Kermode，Crit.Rev.BlantSci.15，4，1996，285-423)，例如，在液泡、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)、過氧化物酶體、脂質(zhì)體中，或者通過缺失相應(yīng)操縱序列(operativerSequenzen)保留在生產(chǎn)區(qū)室、細(xì)胞質(zhì)中。
優(yōu)選將所述基因型核酸序列與至少一個(gè)報(bào)導(dǎo)基因一起克隆到表達(dá)框上，通過載體將該表達(dá)框?qū)肷铮蛑苯訉?dǎo)入基因組。該報(bào)導(dǎo)基因應(yīng)當(dāng)可以通過生長(zhǎng)、熒光、化學(xué)或生物發(fā)光或抗性測(cè)定或通過光學(xué)測(cè)定方便地檢測(cè)?？梢蕴岬降膱?bào)導(dǎo)基因的例子有抗生素或除草劑抗性基因、水解酶基因、熒光蛋白基因、生物發(fā)光基因、糖或核苷酸代謝基因或生物合成基因，如Ura3基因、Ilv2基因、熒光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因、gfp基因、2-脫氧葡萄糖-6-磷酸磷酸酶基因、β-葡糖醛酸酶、β-內(nèi)酰胺酶基因、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因或BASTA(＝草甘膦抗性基因)。通過這些基因可以方便地測(cè)定并量化轉(zhuǎn)錄活性，并因此測(cè)定并量化基因的表達(dá)。因此，可以確定基因組中在產(chǎn)量方便表現(xiàn)出差異的位點(diǎn)。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，在表達(dá)框上游，即位于編碼序列的5’末端包括一個(gè)啟動(dòng)子，和下游，即位于其3’末端一個(gè)聚腺苷酸化信號(hào)，以及，如果需要的話還包括可操作地與編碼序列連接的調(diào)控因子，該因子位于Δ6-乙炔酶/Δ6-脫飽和酶和/或Δ6-脫飽和酶基因DNA序列之間?？刹僮鞯剡B接表示啟動(dòng)子、編碼序列、終止子以及如果必要的話還有調(diào)控因子按順序的排列，其排列方式使得每一個(gè)調(diào)控因子能夠在編碼序列的表達(dá)中實(shí)現(xiàn)其預(yù)定功能。用于可操作連接的優(yōu)選序列是引導(dǎo)序列，用于確保在質(zhì)體中的亞細(xì)胞定位。不過，如果需要的話還可以使用確保在線粒體中、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中、細(xì)胞核中、油質(zhì)體或其他區(qū)室中亞細(xì)胞定位的引導(dǎo)序列，以及翻譯增強(qiáng)子，如源于煙草花葉病毒的5’前導(dǎo)序列(Gallie等，核酸研究15，1987，8693-8711)。
例如，表達(dá)框可以包括組成型啟動(dòng)子(優(yōu)選USP或napin啟動(dòng)子)、要表達(dá)的基因和ER固位信號(hào)(Retentionssignal)。優(yōu)選使用的ER固位信號(hào)的氨基酸序列為KDEL(賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸)。
為了表達(dá)，將所述表達(dá)框插入原核或真核宿主生物中，例如，插入微生物中，如真菌或植物，優(yōu)選插入載體中，例如，質(zhì)粒、噬菌體或其他DNA，所述其他DNA能夠優(yōu)化所述基因在宿主生物中的表達(dá)。合適質(zhì)粒的例子有存在于大腸桿菌中的pLG338、pACYC184、pBR系列，如pBR322、pUC系列，如pUC18或pUC19，M113mp系列、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pLBM24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11或pBdCI，存在于鏈霉屬中的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361，存在于芽孢桿菌屬中的pUB110、pC194或pBD214，存在于棒桿菌中的pSA77或pAJ667，存在于真菌中的pALS1、pIL2或pBB116，其他優(yōu)選的真菌載體披露于以下文獻(xiàn)中Romanos，M.A.等[1992，“酵母中的外源基因表達(dá)，綜述”酵母8423-488]和van den Hondel，C.A.M.J.J.等[1991，“絲狀真菌的異源基因表達(dá)”]和真菌中的多基因操縱[J.W.Bennet&L.L.Lasure著，396-428頁(yè)學(xué)術(shù)出版社SanDiego]，以及“用于絲狀真菌的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)和載體開發(fā)”[van denHondel，C.A.M.J.J.&Punt，P.J.，1991，真菌的應(yīng)用分子遺傳學(xué)，Peberdy，J.F.等著，1-28頁(yè)，劍橋大學(xué)出版社，劍橋]。優(yōu)選酵母啟動(dòng)子的例子有2μM、pAG-1、YeP6、YeP13和pEMBLYe23。藻類或植物啟動(dòng)子的例子有pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004、pVKH和pDH51(參見Schmidt，R.和Willmitzer，L.1988)。上述載體或上述載體的衍生物只代表了少數(shù)可選自使用的質(zhì)粒。其他質(zhì)粒為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，并且可以參考以下教科書，例如克隆載體(Pouwels P.H.等Elsevier著，阿姆斯特丹-紐約-牛津，1985，ISBN0444904018)。合適的植物載體特別披露于植物分子生物學(xué)和生物工程方法(CRC出版社)，6/7章，71-119頁(yè)。優(yōu)選載體是能夠在大腸桿菌和農(nóng)桿菌屬?gòu)?fù)制的穿梭載體和二元載體。
除了質(zhì)粒之外，載體還可以表示本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的所有其他載體，例如噬菌體、病毒，如SV40、CMV、桿病毒、腺病毒、轉(zhuǎn)座子、IS因子、噬粒、粘粒、線性或環(huán)狀DNA。這些載體在宿主生物中可以自主復(fù)制或進(jìn)行染色體復(fù)制；優(yōu)選染色體復(fù)制。
在載體的其他實(shí)施方案中，所述新型表達(dá)框還可以優(yōu)選以線性DNA形式導(dǎo)入所述生物，并通過異源或同源重組進(jìn)入該宿主生物的基因組。該線性DNA可以包括線性化的質(zhì)粒，或者僅包括作為載體的表達(dá)框或新型核酸序列。
在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，所述新型核酸序列還可以單獨(dú)導(dǎo)入生物中。
除了所述新型核酸序列之外，如果還要將其他基因?qū)胨錾?，可以將存在于同一個(gè)載體上的所有基因連同報(bào)導(dǎo)基因一起導(dǎo)入生物，或者將存在于一個(gè)載體上的每一個(gè)基因連同報(bào)導(dǎo)基因分別導(dǎo)入生物，在后一種情況下，所述各種載體可以同時(shí)導(dǎo)入或順序?qū)搿?br>
所述載體優(yōu)選包括至少一個(gè)拷貝的新型核酸序列和/或新型表達(dá)框。
例如，可以將植物表達(dá)框整合到煙草轉(zhuǎn)化載體pBinAR中。
圖1表示具有35S啟動(dòng)子的煙草轉(zhuǎn)化載體pBinAR(C)和具有USP啟動(dòng)子的pBin-USP(D)。原始載體如
圖1(A)和
圖1(B)所示。另一種可能性是重組載體(＝表達(dá)載體)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄和翻譯，例如通過使用T7和T7RNA聚合酶。
用于原核生物的表達(dá)載體通常使用有或沒有融合蛋白或融合寡肽的誘導(dǎo)型系統(tǒng)，所述融合可以發(fā)生在N-末端和C-末端或其他結(jié)構(gòu)域上，這些結(jié)構(gòu)域可用于蛋白中。這種類型的融合載體通常用于i)提高RNA表達(dá)速度，ii)提高可以得到的蛋白合成速度，iii)提高蛋白的溶解度，或iv)通過一種可用于親和層析的結(jié)合序列簡(jiǎn)化其純化。通常還通過融合蛋白導(dǎo)入蛋白裂解位點(diǎn)，無(wú)論融合蛋白部分如何裂解都能完成純化過程。蛋白酶可識(shí)別的序列如因子Xa、凝血酶和腸激酶。
典型的優(yōu)選融合和表達(dá)載體由pGEX[Pharmacia生物技術(shù)公司；Smith，D.B.和Johnson，K.S.1988基因6731-40]pMAL(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，它包括谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖結(jié)合蛋白或蛋白V。
大腸桿菌表達(dá)載體的其他例子有pTrc[Amann等，1988基因69301-315]和pET載體[Studier等，基因表達(dá)技術(shù)酶學(xué)方法185，學(xué)術(shù)出版社，San Diego，Caiifornia，1990，60-89；Stratagene，阿姆斯特丹，荷蘭]。
用于酵母的其他優(yōu)選載體包括pYepSecl(Baldari等，1987，EMBO雜志6229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，1982，細(xì)胞30933-943)、pJRY88(Schultz等，1987，基因54113-123)，和pYES衍生物(Invitrogen公司，San Diego，CA)。用于絲狀真菌中的載體披露于以下文獻(xiàn)中van den Hondel，C.A.M.J.J.和Punt，P.J.1991“用于絲狀真菌基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)和載體開發(fā)”，真菌的應(yīng)用分子遺傳學(xué)，J.F.Peberdy等著，1-28頁(yè)，劍橋大學(xué)出版社，劍橋。
其他的并且是優(yōu)選的可能性是使用昆蟲細(xì)胞表達(dá)載體，例如，用于在Sf9細(xì)胞中表達(dá)的載體。其例子有pAc系列的載體(Smith等1983分子細(xì)胞生物學(xué)32156-2165)和pyal系列的載體(Lucklow和Summers1989病毒學(xué)17031-39)。
同樣可能和優(yōu)選的是將植物細(xì)胞或藻類細(xì)胞用于基因表達(dá)。植物表達(dá)載體的例子可以參見D.等1992“具有位于靠近左臂的選擇標(biāo)記的新型植物二元載體”，植物分子生物學(xué)201195-1197，或者參見Bevan，M.W.1984“植物轉(zhuǎn)化的二元農(nóng)桿菌屬載體”，核酸研究128711-8721。
所述新型核酸序列還可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。合適表達(dá)載體的例子有pCDM8和pMT2PC，披露于Seed，B.1987自然329840或Kaufman等1987EMBO雜志187-195。在上述情況下，優(yōu)選使用的啟動(dòng)子是來(lái)源于病毒的啟動(dòng)子，例如多瘤病毒、腺病毒2、巨噬細(xì)胞病毒或猿病毒40的啟動(dòng)子。其他原核和真核表達(dá)系統(tǒng)披露于Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，NY，1989的第16和17章。
原則上講，將新型核酸、表達(dá)框或載體導(dǎo)入生物，例如植物，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的所有方法進(jìn)行。
在以下教科書中技術(shù)人員可以找到適用于微生物的方法Sambrook，J.等1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，F(xiàn).M.Ausubel等，1994當(dāng)代分子生物學(xué)方法，John Wiley和Sons，D.M.Glover等，DNA克隆，1卷，1995，IRL出版社(ISBN019-963476-9)，Kaiser等，1994，酵母遺傳學(xué)方法，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，或Guthrie等，酵母遺傳學(xué)和分子生物學(xué)指南，酶學(xué)方法，1994，學(xué)術(shù)出版社。
外源基因向植物基因組中的轉(zhuǎn)移被稱為轉(zhuǎn)化。在這種情況下，使用所披露的用于瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的從植物組織或植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化和再生的方法。合適的方法包括通過聚乙二醇誘導(dǎo)的DNA攝取的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，使用基因槍的轟擊方法-所謂的粒子轟擊方法，電穿孔，在含有DNA的溶液中培養(yǎng)干燥胚胎，顯微注射和農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。例如，上述方法披露于以下文獻(xiàn)中B.Jenes等，基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，轉(zhuǎn)基因植物，1卷，工程和應(yīng)用，S.D.Kung和R.Wu著，學(xué)術(shù)出版社(1993)128-143和Potrykus植物生理學(xué)植物分子生物學(xué)年度綜述42(1991)205-225。優(yōu)選將要表達(dá)的結(jié)構(gòu)克隆到適合轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌的載體中，例如pBin19(Bevan等，核酸研究12，1984，8711)。用所述載體轉(zhuǎn)化過的農(nóng)桿菌隨后可以已知方式用于轉(zhuǎn)化植物，特別是作物類植物，例如，煙草植物，例如，通過將受傷的葉片或葉子碎片浸泡在農(nóng)桿菌溶液中，然后在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。例如，用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的方法披露于Hofgen和Willmitzer，核酸研究(1988)16，9877，或者特別披露于F.F.White，用于高等植物基因轉(zhuǎn)移的載體；轉(zhuǎn)基因植物，1卷，工程和應(yīng)用，S.D.Kung和R.Wu著，學(xué)術(shù)出版社，1993，15-38頁(yè)。
用新型表達(dá)載體轉(zhuǎn)化過的農(nóng)桿菌同樣可以已知方式用于轉(zhuǎn)化植物，如試驗(yàn)植物，如擬南芥屬或作物類植物，如谷類、玉米、燕麥、黑麥、大麥、小麥、大豆、水稻、棉花、甜菜、canola、向日葵、亞麻、大麻、馬鈴薯、煙草、番茄、胡蘿卜、辣椒、油用油菜、木薯、木薯、葛、萬(wàn)壽菊、苜蓿、萵苣和各種樹木、堅(jiān)果和藤本植物，特別是產(chǎn)油的作物類植物，如大豆、花生、蓖麻、向日葵、玉米、棉花、亞麻、油用油菜、椰子、油用棕櫚、紅花或可可豆，例如，通過將受傷的葉片或葉子碎片浸泡在農(nóng)桿菌溶液中，然后在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
遺傳學(xué)修飾過的植物細(xì)胞可以通過技術(shù)人員所公知的任何方法再生。合適的方法可以在上述S.D.Kung和R.Wu，Potrykus或Fofgen和Willmitzer的文獻(xiàn)中找到。
原則上講，所述新型核酸、表達(dá)框或載體的適合的和優(yōu)選的生物或宿主生物是能夠合成脂肪酸，特別是不飽和脂肪酸或適合表達(dá)重組基因的所有生物?？梢蕴岬降睦佑兄参?，如擬南芥屬、紫菀屬，如金盞花屬或作物類植物，如大豆、花生、蓖麻、向日葵、玉米、棉花、亞麻、油用油菜、椰子、油棕櫚、紅花或可可豆，微生物，如真菌，例如，被胞霉屬、水霉屬或腐霉屬，細(xì)菌，如埃希氏菌屬，酵母，如酵母屬、蘭細(xì)菌屬、纖毛蟲、藻類或原生動(dòng)物，如雙鞭甲藻，如crypthecodinium。優(yōu)選能夠以較大的產(chǎn)量天然合成油類的生物，如真菌，如高山被胞霉、Pythium insidiosum或植物，如大豆、油用油菜、椰子、油棕櫚、紅花、蓖麻、金盞花屬、花生、可可豆或向日葵或酵母，如釀酒酵母，特別優(yōu)選的是大豆、油用油菜、向日葵、金盞花屬或釀酒酵母。原則上講，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物也適合用作宿主生物，例如，C.elegans。
可以使用的宿主細(xì)胞還披露于以下文獻(xiàn)中Goeddel，基因表達(dá)技術(shù)酶學(xué)方法185，學(xué)術(shù)出版社，San Diego，CA(1990)。
可以使用的表達(dá)菌株，例如，具有較低蛋白酶活性的菌株披露于以下文獻(xiàn)中Gottesman，S.基因表達(dá)技術(shù)酶學(xué)方法185，學(xué)術(shù)出版社，San Diego，CA(1990)119-128。
本發(fā)明還涉及用含有編碼Δ6-乙炔酶/Δ6-脫飽和酶和/或Δ6-脫飽和酶基因的DNA序列或能與該序列雜交的DNA序列的表達(dá)框轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織或部分。該用途的目的是為了提高在6號(hào)位置上具有較高含量的三鍵和雙鍵的脂肪酸、油類或脂類的含量。
另外，根據(jù)啟動(dòng)子的選擇，可以讓?duì)?-乙炔酶/Δ6-脫飽和酶和/或Δ6-脫飽和酶基因的表達(dá)專一性地在植物的葉片、種子、塊莖或其他部分進(jìn)行。本發(fā)明的其他方面有能超量產(chǎn)生所述具有Δ6三鍵或Δ6雙鍵的脂肪酸、油類或脂類的轉(zhuǎn)基因植物、及繁殖材料及其植物細(xì)胞、組織或部分。本發(fā)明優(yōu)選涉及含有新型功能性或非功能性(＝反義DNA或酶促活性失活的酶)核酸序列或功能性或非功能性表達(dá)框的轉(zhuǎn)基因植物。
含有Δ6-乙炔酶/Δ6-脫飽和酶和/或Δ6-脫飽和酶基因序列的表達(dá)框或新型核酸序列可用于轉(zhuǎn)化上述生物，例如細(xì)菌、蘭細(xì)菌、酵母、絲狀真菌、纖毛蟲和藻類，其目的是提高具有Δ6三鍵或Δ6雙鍵的脂肪酸、油類或脂類的含量。
例如，對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，提高具有Δ6三鍵或Δ6雙鍵的脂肪酸、油類或脂類的含量意味著人工獲得的通過在新型生物，優(yōu)選新型轉(zhuǎn)基因植物中功能性超量表達(dá)Δ6-乙炔酶/Δ6-脫飽和酶和/或Δ6-脫飽和酶基因人工獲得的較高的生物合成能力，這種提高是相對(duì)沒進(jìn)行過遺傳修飾的原始植物而言的，這種提高至少能持續(xù)一個(gè)植物世代。
例如，脂肪酸、油類或脂類的生物合成部位一般是種子或種子的細(xì)胞層，因此Δ6-乙炔酶/Δ6-脫飽和酶和/或Δ6-脫飽和酶基因的種子專一性表達(dá)是有效的。不過，很顯然，脂肪酸、油類或脂類的生物合成不一定局限于種子組織，而且還可以組織專一性形式在植物的所有其他部分進(jìn)行，例如，在上皮細(xì)胞或在塊莖中進(jìn)行。
另外，優(yōu)選外源Δ6-乙炔酶/Δ6-脫飽和酶和/或Δ6-脫飽和酶基因的組成型表達(dá)。不過，另一方面，誘導(dǎo)型表達(dá)也是需要的。
可以測(cè)定轉(zhuǎn)基因Δ6-乙炔酶/Δ6-脫飽和酶和/或Δ6-脫飽和酶基因的表達(dá)效果，例如，在體外通過芽分生組織繁殖測(cè)定(Spro Bmeristemvermehrung)。另外，可以在溫室實(shí)驗(yàn)中用試驗(yàn)植物測(cè)定Δ6-乙炔酶/Δ6-脫飽和酶和/或Δ6-脫飽和酶基因的性質(zhì)改變和表達(dá)水平，及其對(duì)脂肪酸、油類或脂類生物合成活性的影響。
本發(fā)明還涉及用含有Δ6-乙炔酶/Δ6-脫飽和酶和/或Δ6-脫飽和酶基因序列或能與這些序列雜交的DNA序列的表達(dá)框轉(zhuǎn)化過的轉(zhuǎn)基因植物，并且涉及所述植物的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、組織、部分和繁殖材料。在這一方面，特別優(yōu)選的是轉(zhuǎn)基因作物類植物，例如大麥、小麥、黑麥、燕麥、玉米、大豆、水稻、棉花、甜菜、油用油菜和canola、向日葵、亞麻、大麻、馬鈴薯、煙草、番茄、辣椒、木薯淀粉(Tapioka)、木薯、葛、苜蓿、萵苣和各種樹木、堅(jiān)果和藤本植物。
用于本發(fā)明的植物有單子葉植物和雙子葉植物或藻類。
另一種新的實(shí)施方案包括上文所述的轉(zhuǎn)基因植物，該轉(zhuǎn)基因植物包括功能性的或非功能性的新型核酸序列或功能性的或非功能性的新型表達(dá)框。非功能性表示不再有具有酶促活性的蛋白合成。另外，非功能性核酸或核酸結(jié)構(gòu)還表示所謂反義DNA，它會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出酶促活性的降低或無(wú)酶促活性。反義技術(shù)，特別是當(dāng)新型核酸序列與反義DNA上的其他脂肪酸合成基因組合時(shí)可用于合成具有較高飽和脂肪酸含量的甘油三酯或合成飽和脂肪酸。轉(zhuǎn)基因植物表示單個(gè)的植物細(xì)胞及其在固體培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物或液體培養(yǎng)物，植物的部分和全植株。
本發(fā)明還涉及-一種轉(zhuǎn)化植物的方法，該方法包括將含有Δ6-乙炔酶/Δ6-脫飽和酶和/或Δ6-脫飽和酶的基因序列或能與該序列雜交的DNA序列的表達(dá)框?qū)胫参锛?xì)胞、愈傷組織、全植株或原生質(zhì)體。
-將Δ6-乙炔酶/Δ6-脫飽和酶和/或Δ6-脫飽和酶DNA基因序列或能與該序列雜交的DNA用于通過在植物中表達(dá)該Δ6-乙炔酶/Δ6-脫飽和酶DNA生產(chǎn)具有較高含量的具有三鍵或Δ6雙鍵的脂肪酸、油類或脂類。
-一種含有SEQ ID NO8所示氨基酸序列的蛋白。
-一種含有SEQ ID NO10所示氨基酸序列的蛋白。
-將具有SEQ ID NO8和SEQ ID NO10所示序列的蛋白用于生產(chǎn)不飽和脂肪酸。
本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)不飽和脂肪酸的方法，該方法包括將至少一種上述新型核酸序列或至少一種新型核酸結(jié)構(gòu)導(dǎo)入優(yōu)選的產(chǎn)油生物中，培養(yǎng)該生物，并分離該生物所含的油，并釋放所述油中所含的脂肪酸。所述不飽和脂肪酸優(yōu)選含有Δ6三鍵和/或Δ6雙鍵。例如，所述脂肪酸可以通過堿性水解，例如用氫氧化鈉或氫氧化鉀水解從油類或脂類中釋放。
本發(fā)明還涉及一種制備具有較高不飽和脂肪酸含量的甘油三酯的方法，該方法包括將至少一個(gè)上述新型核酸序列或至少一個(gè)新型表達(dá)框?qū)氘a(chǎn)油生物中，培養(yǎng)該生物，并分離該生物所含的油。
本發(fā)明還涉及一種制備具有較高不飽和脂肪酸含量的甘油三酯的方法，該方法是這樣實(shí)現(xiàn)的，將具有飽和或不飽和或飽和和不飽和脂肪酸的甘油三酯與由SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、或SEQ ID NO11的序列之一所編碼的至少一種蛋白一起培養(yǎng)。該方法優(yōu)選是在有能夠攝取或釋放還原性等同物的化合物存在的條件下進(jìn)行的。然后，可以從甘油三酯中釋放出脂肪酸。
如權(quán)利要求16或17所述的方法，其中，脂肪酸是從甘油三酯中釋放的。
上述方法優(yōu)選可以合成具有較高含量的具有Δ6三鍵和/或Δ6雙鍵的脂肪酸的脂肪酸或甘油三酯。
還可將所謂的反義技術(shù)用于制備具有較高含量飽和脂肪酸或甘油三酯的方法中。
所述方法可以使用的生物的例子有植物，如擬南芥屬、大麥、小麥、黑麥、燕麥、玉米、大豆、水稻、棉花、甜菜、油用油菜和canola、向日葵、亞麻、大麻、馬鈴薯、煙草、番茄、辣椒、木薯淀粉、木薯、葛、苜蓿、花生、蓖麻、椰子、油棕櫚、紅花(Carthamus tinctorius)或可可豆、微生物，如真菌被胞霉屬、水霉屬或腐霉屬，細(xì)菌，如埃希氏菌屬、蘭細(xì)菌，酵母，如酵母屬、藻類或原生動(dòng)物，如雙鞭甲藻，如crypthecodinium。優(yōu)選能夠以較大產(chǎn)量天然合成油類的生物，如微生物，如真菌，如高山被胞霉(Mortierella alpina)、Pythiuminsidiosum或植物，如大豆、油用油菜、椰子、油棕櫚、紅花、蓖麻、金盞花屬、花生、可可豆或向日葵或酵母，如釀酒酵母；特別優(yōu)選的是大豆、油用油菜、向日葵、金盞花屬或釀酒酵母。
在所述方法中，根據(jù)宿主生物，用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法生長(zhǎng)或培養(yǎng)生物。微生物通常是在0-100℃，優(yōu)選10-60℃，同時(shí)通氧氣的條件下在液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)的，培養(yǎng)基中含有碳源，通常是蔗糖形式的，氮源，通常是有機(jī)氮形式的，如酵母提取物或鹽，如硫酸銨，微量元素，如鐵、錳、鎂鹽，如果需要的話還可以有維生素。在此期間營(yíng)養(yǎng)液的pH可以保持在固定的值，就是說(shuō)，在培養(yǎng)期間進(jìn)行控制或不控制。培養(yǎng)可以批量形式、半批量形式或連續(xù)形式進(jìn)行。養(yǎng)分可以在發(fā)酵開始時(shí)引入或者隨后半連續(xù)或連續(xù)地供給。
在轉(zhuǎn)化之后，首先按上述方法再生植物，然后按常規(guī)方法培養(yǎng)或生長(zhǎng)。
在培養(yǎng)之后，用常規(guī)方法從生物中分離脂類。為此，在收獲之后可以首先將生物粉碎或直接使用。優(yōu)選用合適的溶劑提取脂類，如非極性溶劑，如己烷或乙醇，異丙醇或混合物，如己烷/異丙醇，苯酚/氯仿/異戊醇，溫度為0-80℃，優(yōu)選20-50℃。通常用過量的溶劑提取生物物質(zhì)，例如相對(duì)生物物質(zhì)為1∶4的過量的溶劑。然后除去溶劑，例如，通過蒸餾除去。所述提取還可以用超臨界二氧化碳進(jìn)行?？梢猿ヌ崛≈笏鶜埩舻纳镂镔|(zhì)，例如通過過濾除去。
用這種方法所獲得的粗制油隨后可做進(jìn)一步的純化，例如，通過添加諸如丙酮或氯仿的極性溶劑除去濁度，隨后過濾或離心。還可以在柱上做進(jìn)一步的純化。
為了從甘油三酯中分離游離脂肪酸，可以常規(guī)方法水解甘油三酯。
本發(fā)明還涉及用上述方法制備的具有較高不飽和脂肪酸含量的不飽和脂肪酸和甘油三酯，并且涉及將其用于生產(chǎn)人類食品、動(dòng)物飼料、化妝品或藥品的用途。為此，以常規(guī)用量將其添加到人類食品、動(dòng)物飼料、化妝品或藥品中。
通過以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說(shuō)明
用存在于根癌農(nóng)桿菌C58C1pGV2260或大腸桿菌中的二元載體生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因油用油菜植物(Deblaere等，1984，核酸研究13，4777-4788)。用存在于含有3％蔗糖的MS培養(yǎng)基(Murashige和Skoog1962，植物生理學(xué)15，473)(3MS培養(yǎng)基)中的有效轉(zhuǎn)化過的農(nóng)桿菌屬菌落的過夜培養(yǎng)物的1∶50的稀釋液轉(zhuǎn)化油用油菜植物(品種為Drakkar，NPZ Nordeutsche Pflanzenzucht，Hohenlieth，德國(guó))。在培養(yǎng)皿中用農(nóng)桿菌的1∶50的稀釋液培養(yǎng)從新發(fā)芽的無(wú)菌油用油菜植物上獲得的葉柄或下胚軸(分別為大約1平方厘米)5-10分鐘。然后在25℃下在含有0.8％細(xì)菌用瓊脂的3MS培養(yǎng)基中在黑暗中培養(yǎng)3天，然后以16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗的光照周期在含有500毫克/升頭孢氨噻，50毫克/升卡那霉素、20微摩爾芐基氨基嘌呤(BAP)和1.6克/升葡萄糖的MS培養(yǎng)基中的繼續(xù)培養(yǎng)1周。將生長(zhǎng)中的芽轉(zhuǎn)移到含有2％蔗糖、250克/升頭孢氨噻和0.8％細(xì)菌用瓊脂的MS培養(yǎng)基上。如果3周之后還沒有根形式的話，將生長(zhǎng)激素2-吲哚丁酸添加到該培養(yǎng)基中誘導(dǎo)長(zhǎng)根。例4轉(zhuǎn)基因擬南芥植物的生產(chǎn)通過Bechtold，N.，Ellis，J.和Pelletier，G.所披露的花浸潤(rùn)方法(參見植物，通過浸潤(rùn)層聯(lián)擬南芥植物由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，C.R.Acad.Sci.Paris，生命科學(xué)316，1993，1194-119[有遺漏])或者通過根轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化擬南芥哥倫比亞Col0變種(Lehle種子，Round Rock，Texas，美國(guó))。例5用Pareddy，D.，Petolino，J.，Skokut，T.，Hopkins，N.，Miller，M.，Welter，M.，Smith，K.，Clayton，D.，Pescitelli，S.，Gould，A.，所披露的方法轉(zhuǎn)化玉米植物(通過氦轟擊進(jìn)行的玉米轉(zhuǎn)化，Maydica42(2)143-154，1997)。例6從角齒蘚中分離并克隆Δ6-乙炔酶/Δ6-脫飽和酶和Δ6-脫飽和酶為了從角齒蘚中分離編碼Δ6-乙炔酶/Δ6-脫飽和酶和Δ6-脫飽和酶的DNA序列，用編碼Δ5-(EMBL保藏號(hào)Z81122)和Δ6-脂肪酸脫飽和酶(U79010，AJ222980，AF031477)的DNA序列制備各種簡(jiǎn)并寡核苷酸引物引物A5’-TGG TGG AA(A/G)TGG A(A/C)I CA(C/T)AA-3’，由氨基酸序列WWKW(N/T/K)H(N/K)推測(cè)的正向引物引物B5’-(T/G)GI TGG AA(A/G)(T/G)(G/A)I(A/C)AI CA(C/T)AA-3’由氨基酸序列(G/W)WK(E/D/W)(N/Q/K)H(N/K)推測(cè)的正向引物引物C5’-AT(A/T/G/C)T(T/G) (A/T/G/C)GG (A/G)AA(A/T/G/C)A(A/G) (A/G)TG(A/G)TG-3’，由氨基酸序列(I/M)(H/Q/N)PF(L/F)HH推測(cè)的反向引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，用引物A和引物C擴(kuò)增單鏈角齒蘚cDNA，兩個(gè)長(zhǎng)度為557bp(Cer3)和575bp(Cer16)的cDNA片段，并用引物B和引物C擴(kuò)增長(zhǎng)度為560bp的DNA片段(Cer1)。擴(kuò)增時(shí)使用以下程序94℃10分鐘，暫停，在72℃下熱啟動(dòng)，然后94℃20秒共進(jìn)行32輪，45℃1分鐘(退火溫度Tm)，和72℃1分鐘，72℃10分鐘進(jìn)行1輪，并在4℃下結(jié)束。擴(kuò)增時(shí)使用Taq DNA聚合酶(GibcoBRL)。
將來(lái)自上述兩個(gè)PCR擴(kuò)增的雙鏈DNA片段連接到pGM-T載體(Promega)上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌XL1blue MRF’Kan(Stratagene)中，并用ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing ReadyReaction試劑盒(Perkin-Elmer，Weiterstadt)測(cè)序。Cer1和Cer3DNA亞序列具有70％的同一性。對(duì)于Cer1來(lái)說(shuō)，上述DNA亞序列編碼具有173個(gè)氨基酸的開放讀框(SEQ ID NO5＝Cer1的沒有引物的部分核苷酸序列，而SEQ ID NO6＝Cer1的部分推測(cè)的氨基酸序列)，對(duì)于Cer3來(lái)說(shuō)，具有172個(gè)氨基酸(SEQ ID NO7＝Cer3的沒有引物的部分核苷酸序列，而SEQ ID NO8＝Cer3的部分推測(cè)的氨基酸序列)，而對(duì)于Cer16來(lái)說(shuō)，具有178個(gè)氨基酸(SEQ ID NO9＝Cer16的沒有引物的部分核苷酸序列，而SEQ ID NO10＝Cer16的部分推測(cè)的氨基酸序列)。Cer1的衍生蛋白序列與Cer3具有64％的氨基酸同一性，而與Cer16的衍生蛋白序列與Cer3具有28％的氨基酸同一性；而Cer3和Cer16具有27％的氨基酸同一性。
Cer1和Cer3蛋白表現(xiàn)出與展葉劍葉蘚(Physcomitrellapatens)Δ6-?；擄柡兔妇哂凶畲蟮南嗨菩?Girke等，植物雜志15，1998，39-48)，而Cer16表現(xiàn)出與來(lái)自高等植物的Δ6-?；擄柡兔负挺?-鞘脂脫飽和酶具有最大的相似性。
慕尼黑大學(xué)植物學(xué)系的Fritz Thummler提供了直接的角齒蘚(Ceratodon purpureus)λZAP cDNA文庫(kù)(Pasentsis等，植物雜志，13，1，199851-61)。對(duì)該角齒蘚文庫(kù)進(jìn)行PCR測(cè)試，其中，特定的引物來(lái)自上述DNA亞序列Cer1、Cer3和Cer16具有的正向和反向引物是Cer15’CGAATGAGTGCGACGAAC-3’+5’-AATAACCTGGGCTCTCAC-3’
Cer35’-ATGAGGATATTGATACTCTC-3’+5’-GCAATCTGGGCATTCACG-3’Cer165’-GACATCAAAGCTCTTCTC-3’+5’-GGCGATGAGAAGTGGTTC-3’對(duì)通過PCR由所述cDNA文庫(kù)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行的限制分析(HindIII和EcorV)證實(shí)，在三種情況下都具有與來(lái)自ss-cDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具有相同的限制圖譜，即角齒蘚cDNA文庫(kù)含有三種克隆Cer1、Cer3和Cer16。例7cDNA文庫(kù)和全長(zhǎng)克隆的測(cè)序?qū)⒂蓅s-cDNA(參見例6)擴(kuò)增的三個(gè)大約570bp的PCR片段Cer1、Cer3、Cer16的在pGEM-T中的DNA微量制備物交給M.Lee和S.Stymne，對(duì)來(lái)自角齒蘚λZAP cDNA文庫(kù)的完整長(zhǎng)度的克隆做進(jìn)一步的篩選。該DNA文庫(kù)篩選同樣得到了具有大約2.2kb插入片段的兩種完整長(zhǎng)度Cer1和Cer3克隆，將其以EcoRI/KpnI片段形式由λZAP載體克隆到pUC19載體的EcoRI/KpnI裂解位點(diǎn)上(新英格蘭實(shí)驗(yàn)室)，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM105。
用Cer1和Cer3作為低嚴(yán)格雜交探針對(duì)該cDNA文庫(kù)進(jìn)行進(jìn)一步的篩選發(fā)現(xiàn)，至少含有一個(gè)克隆存在Cer1同源性，它可能編碼Δ5-脫飽和酶。
對(duì)兩種大腸桿菌克隆Cer1-50和Cer3-50進(jìn)行全面測(cè)序。Cer1-50的長(zhǎng)度為2003bp(SEQ ID NO1＝源于角齒蘚的Δ6-乙炔酶/Δ6-脫飽和酶的核苷酸序列，具有5’和3’非翻譯區(qū)和polyA)，并且編碼具有483個(gè)氨基酸的開放讀框(SEQ ID NO2＝源于角齒蘚的Δ6-乙炔酶/Δ6-脫飽和酶的推測(cè)的氨基酸序列)。Cer3-50的長(zhǎng)度為2142bp(SEQ ID NO11＝源于角齒蘚的Δ6-脫飽和酶的核苷酸序列[2142bp]，具有5’和3’非翻譯區(qū))，編碼具有520個(gè)氨基酸的開放讀框(SEQ ID NO12＝源于角齒蘚的Δ6脫飽和酶的推測(cè)的氨基酸序列)。這兩種蛋白在N-末端都具有來(lái)自細(xì)胞色素b5的高度保守的HPGG基序(Lederer F.，生物化學(xué)76，1994674-692)，以及在C-末端具有脫飽和酶所特有的三個(gè)組氨酸框(Shanklin等，生物化學(xué)，33，199412787-12794)。因此，它們是不斷增長(zhǎng)的細(xì)胞色素B5融合蛋白家族的新的成員(Napier等，植物科學(xué)趨勢(shì)，4，1，19992-4)。所述三個(gè)框的第一個(gè)組氨酸被替換成谷氨酰胺，這是Δ5-和Δ6-?；擄柡兔负挺?-鞘脂脫飽和酶的另一種特征。例8通過PCR克隆具有完整功能活性的Δ6-乙炔酶/Δ6-脫飽和酶和Δ6-脫飽和酶序列，將該序列克隆到載體，并在酵母中進(jìn)行功能性表達(dá)。
由角齒蘚制備編碼具有Δ6-乙炔酶/Δ6-脫飽和酶活性的酶的cDNA。以類似于本文所披露的實(shí)施例的形式克隆Δ6-脫飽和酶(參見SEQ ID NO2、SEQ ID NO4和SEQ ID NO12)。
這一目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，首先根據(jù)源于角齒蘚的編碼Δ6-乙炔酶/脫飽和酶的Cer1cDNA制備用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的寡核苷酸。Cer1 5′-CC GGTACC ATG GCC CTC GTT ACC GAC-3′ +5′-CC GAATTC TTA GTG AGC GTG AAG CCG-3′Cer3 5′-CC GGTACC ATG GTG TCC CAG GGC GGC-3′+5′-CC GAATTC TCA ACT CGC AGC AAG CTG-3′源于Cer1的以下引物適用于在酵母中表達(dá)5’引物5′-AAAAGGATCCAAAATGGCCCTCGTTACCGAC-3′3’引物5′-AAAAGTCGACTTAGTGAGCGTGAAGCC-3′在PCR中將源于角齒蘚的Δ6-乙炔酶/脫飽和酶cDNA用做模板。通過引物在Δ6-乙炔酶/脫飽和酶cDNA的起始密碼子的前面引入一個(gè)BamHI限制裂解位點(diǎn)。為了進(jìn)行直接克隆，在終止密碼子后面引入一個(gè)SalI限制裂解位點(diǎn)。在Perkin Elmer PCR儀中培養(yǎng)含有大約1納克/微升模板DNA、0.5微摩爾寡核苷酸和200微摩爾脫氧核苷酸(Pharmacia)、50mM氯化鉀、10mMTris-HCl(pH8.3，25℃，1.5mM氯化鎂)和0.02U/微升Pwo聚合酶(Boehringer Mannheim)的反應(yīng)混合物，采用以下溫度方案退火溫度50℃52秒變性溫度95℃52秒延伸溫度72℃90秒循環(huán)次數(shù)30
將所得到的1467bp的片段連接到用EcoRV裂解過的載體pBluescript SK-(Stratagene)上。通過對(duì)照裂解pBS-Cer1鑒定到一個(gè)克隆，可以用BamHI/SalI切除它的完整的插入片段(1452bp+15個(gè)核苷酸的限制裂解位點(diǎn))，并且具有以下序列(在起始和終止密碼子下面劃線，裂解位點(diǎn)用斜體字表示)。同樣可以使用克隆Cer50的cDNA序列。它是一種單功能的Δ6-脫飽和酶(參見SEQ ID NO3)。由它衍生的氨基酸序列如SEQ ID NO4所示。
為了檢驗(yàn)所編碼的酶在微生物中的功能，將來(lái)自pBS-Cer1的1467bp的BamHI/SalI片段連接到用BamHI/XhoI裂解過的表達(dá)載體pYES2(Invitrogen，Groningen，荷蘭)上，并按照標(biāo)準(zhǔn)方法用新產(chǎn)生的質(zhì)粒pYES2-Cer1轉(zhuǎn)化酵母(參見Invitrogen轉(zhuǎn)化方法，Groningen，荷蘭)。在含有棉籽糖的培養(yǎng)基上培養(yǎng)所得到的菌落，并用半乳糖誘導(dǎo)Δ6-乙炔酶/脫飽和酶的基因表達(dá)(見下文)。例9轉(zhuǎn)化酵母的脂類分析酵母不僅能將內(nèi)源脂肪酸(160、161、180和181)而且能將外源脂肪酸整合到它的膜脂中。為了測(cè)定所表達(dá)的特定脫飽和酶的底物專一性，在培養(yǎng)之前將1％Targitol NP-40(w/v，Sigma)補(bǔ)充到CM-2％棉籽糖培養(yǎng)基中，以便溶解外源脂肪酸和相關(guān)的0.003％脂肪酸(母液0.3％或3％脂肪酸，溶解在5％Targitol NP-40，w/v)。預(yù)培養(yǎng)是這樣進(jìn)行的將轉(zhuǎn)基因酵母菌落與3毫升CM-2％棉籽糖培養(yǎng)基/1％Targitol NP-40一起培養(yǎng)，然后在30℃下在滾動(dòng)裝置中培養(yǎng)該培養(yǎng)物2天，使其在600nm下的光學(xué)密度(OD600)達(dá)到4.0-4.3。對(duì)于主培養(yǎng)來(lái)說(shuō)，用1等份的預(yù)培養(yǎng)物(200倍的稀釋液)接種10毫升CM-2％棉籽糖/1％Targitol NP-40培養(yǎng)基±0.003％脂肪酸，使其OD600為0.02，并在30℃下，在搖床上以250rpm的速度搖動(dòng)培養(yǎng)24小時(shí)。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段(OD600為0.5-0.6)，通過添加半乳糖至1.8％的濃度誘導(dǎo)試驗(yàn)培養(yǎng)物。讓誘導(dǎo)過的細(xì)胞在30℃下再有氧生長(zhǎng)24小時(shí)，然后在OD600為4.0-4.3時(shí)收獲。
通過以2000g的速度離心10分鐘收獲誘導(dǎo)過的酵母細(xì)胞，重新懸浮在3毫升蒸餾水中，在100℃下煮沸10分鐘，然后在冰上冷卻，再次沉降。在90℃下用1N甲磺酸和2％二甲氧基丙烷水解細(xì)胞沉淀1小時(shí)。用石油醚提取所得到的脂肪酸甲酯(FAMEs)。通過液相層析分析提取的FAMEs，使用毛細(xì)管柱(Chrompack，WCOT融合的硅，CP-Wax-52CB，25m，0.32mm)，在170-240℃的溫度梯度下20分鐘，在240℃下5分鐘。通過與合適的FAME標(biāo)準(zhǔn)物(Sigma)比較證實(shí)單烯酸、二烯酸、三烯酸和四烯酸甲酯的性質(zhì)。沒有triynoic和tetraynoic酸的參考物質(zhì)。通過對(duì)FAME混合物進(jìn)行合適的化學(xué)衍生，例如形成4，4-二甲氧基噁唑啉衍生物，通過GC-MS分析其性質(zhì)和三鍵的位置(Christie，1998)。在表1中示出了來(lái)自用空白載體pYES2、用pYES2-Cer1(Δ6-乙炔酶)轉(zhuǎn)化過的轉(zhuǎn)基因酵母的脂肪酸甲酯的GC分析。在沒有外源脂肪酸的條件下，或者在添加亞油酸(182)、γ-亞麻酸(γ-183)、α-亞麻酸(α-183)或ω-3-十八碳四烯酸(184)。
表1表示來(lái)自用空白載體pYES2、Δ6-乙炔酶(Cer1/pYES2)和Δ6-脫飽和酶(Cer3/pYES2)轉(zhuǎn)化過的轉(zhuǎn)基因酵母的脂肪酸甲酯進(jìn)行的GC分析。在沒有外源脂肪酸的條件下(-)或者在添加亞油酸(182)、γ-亞麻酸(γ-183)、α-亞麻酸(α-183)或ω-3-十八碳四烯酸(184)之后分析轉(zhuǎn)基因酵母細(xì)胞。示出飼喂添加脂肪酸(粗體、黑色)，脫飽和產(chǎn)物(紅色)以及總的脫飽和產(chǎn)物(最后一行)的個(gè)體總的脂肪酸組成[摩爾％]。例10制備能超量表達(dá)具有Δ6-乙炔酶/脫飽和酶活性的酶的轉(zhuǎn)基因植物。
為了轉(zhuǎn)化植物，制備一種通過將來(lái)自pBS-Cer1的BamHI/SalI片段連接到用BamHI/SalI裂解過的載體pBin-USP或連接到pBinAR上制備轉(zhuǎn)化載體。pBin-USP和pBinAR是質(zhì)粒pBin19的衍生物。PBinAR是通過將35S CaMV啟動(dòng)子以EcoRI-KpI片段形式(相當(dāng)于花椰菜花葉病毒的6909-7437號(hào)核苷酸)(Franck等，1980，細(xì)胞，21，285)插入pBin19(Bevan等，1980，核酸研究12，8711)中而由pBin19產(chǎn)生的。以PvuII-HindIII片段形式分離Ti質(zhì)粒的T-DNA的基因3的聚腺苷酸化信號(hào)(Gielen等，1984，EMBO雜志3，835)，11749-11939號(hào)核苷酸，在PuvII裂解位點(diǎn)上添加SphI接頭，然后克隆到該載體的SphI-HindIII裂解位點(diǎn)，由此得到了質(zhì)粒pBinAR(Hofgen和Willmitzer，1990，植物科學(xué)66，221-230)，由于從pBluescript進(jìn)行了再次克隆，在啟動(dòng)子和終止子之間有若干可供利用的限制裂解位點(diǎn)。USP啟動(dòng)子相當(dāng)于1-684號(hào)核苷酸(Genbank保藏號(hào)X56240)，在該啟動(dòng)子上存在USP基因的部分非編碼區(qū)。用標(biāo)準(zhǔn)方法通過PCR擴(kuò)增大小為684bp的啟動(dòng)子片段，使用商業(yè)化的T7標(biāo)準(zhǔn)引物(Stratagene)，并使用合成的引物(引物SEQ ID NO5′-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCCGGATCTGCTGGCTATGAA-3′)。然后用EcoRI/SalI裂解該P(yáng)CR片段，并插入載體pBinAR。所得到的質(zhì)粒被pBinUSP。
用該結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化擬南芥和油用油菜植物。
在含有卡那霉素和頭孢氨噻的2MS培養(yǎng)基上獲得了再生芽，并在長(zhǎng)根之后轉(zhuǎn)移到土壤中，在空氣調(diào)節(jié)箱或溫室中培養(yǎng)2周之后誘導(dǎo)開花，收獲成熟的種子，并通過脂類分析研究Δ6-乙炔酶/脫飽和酶表達(dá)。鑒定具有較高含量乙炔類脂肪酸或在Δ6位置上具有雙鍵的品系。在能功能性表達(dá)轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因品系中發(fā)現(xiàn)了與未轉(zhuǎn)化的對(duì)照植物相比具有較高含量的乙炔脂肪酸和位于Δ6位置上的雙鍵。例11從種子中提取脂類以類似分析酵母脂類的方法分析來(lái)自植物種子的脂類。不過，首先用研缽對(duì)植物材料進(jìn)行機(jī)械勻漿，以便能夠?qū)λM(jìn)行提取。
表1
序列表<110>BASF Aktiengesellschaft<120>源于角齒蘚(Ceratodon purpureus)的Δ6-乙炔酶和Δ6-脫飽和酶<130>99 1388<140><141><150>19925718.3<151>1999.06.07<160>12<170>Patentln Vers.2.0<210>1<211>2040<212>DNA<213>角齒蘚(Ceratodon purpureus)<220><221>CDS<222>(176)..(1627)<400>1ctcaggcagg tctcagttga tgagacgctg agttctgaat cctttgagct gtgtcaggct 60cggcacttgt gggatggtga aggagtgatc gatcaggagt gcaggagctg cattagtttc 120tcagggtcga tcaggttatt ctgaaaaagg ctgcgtctgt gagcagtttg caaaa atg 178Met1gcc ctc gtt acc gac ttt ctg aac ttt ctg ggc acg aca tgg agc aag 226Ala Leu Val Thr Asp Phe Leu Asn Phe Leu Gly Thr Thr Trp Ser Lys5 10 15tac agc gtg tac acc cat agc tat gct gga aac tat ggg cct acd ttg 274Tyr Ser Val Tyr Thr His Ser Tyr Ala Gly Asn Tyr Gly Pro Thr Leu20 2530aag cac gcc aaa aag gtt tct gct caa ggt aaa act gcg gga cag aca 322Lys His Ala Lys Lys Val Ser Ala Gln Gly Lys Thr Ala Gly Gln Thr35 4045ctg aga cag aga tcg gtg cag gac aaa aag cca ggc act tac tct ctg 370Leu Arg Gln Arg Ser Val Gln Asp Lys Lys Pro Gly Thr Tyr Ser Leu50 5560 65gcc gat gtt gct tct cac gac agg cct gga gac tgc tgg atg atc gtc 418Ala Asp Val Ala Ser His Asp Arg Pro Gly Asp Cys Trp Met Ile Val707580aaa gag aag gtg tat gat att agc cgt ttt gcg gac gac cac cct gga 466Lys Glu Lys Val Tyr Asp Ile Ser Arg Phe Ala Asp Asp His Pro Gly85 9095ggg acg gta att agc acc tac ttt ggg cgg gat ggc acg gac gtt ttc 514Gly Thr Val Ile Ser Thr Tyr Phe Gly Arg Asp Gly Thr Asp Val Phe100 105 110gca aca ttc cat cca cct gcc gca tgg aag caa ctc aat gac tac tac 562Ala Thr Phe His Pro Pro Ala Ala Trp Lys Gln Leu Asn Asp Tyr Tyr115 120 125att gga gac ctt gct agg gaa gag ccc ctt gat gaa ttg ctt aaa gac 610Ile Gly Asp Leu Ala Arg Glu Glu Pro Leu Asp Glu Leu Leu Lys Asp130 135 140 145tac aga gat atg aga gcc gag ttt gtt aga gaa ggg ctt ttc aag agt 658Tyr Arg Asp Met Arg Ala Glu Phe Val Arg Glu Gly Leu Phe Lys Ser150 155160tcc aag gcc tgg ttc ctg ctt cag act ctg att aat gca gct ctc ttt 706Ser Lys Ala Trp Phe Leu Leu Gln Thr Leu Ile Asn Ala Ala Leu Phe165 170 175gct gcg agc att gcg act atc tgt tac gac aag agt tac tgg gct att 754Ala Ala Ser Ile Ala Thr Ile Cys Tyr Asp Lys Ser Tyr Trp Ala Ile180 185 190gtg ctg tca gcc agt ttg atg ggt ctc ttc gtc caa cag tgt gga tgg 802Val Leu Ser Ala Ser Leu Met Gly Leu Phe Val Gln Gln Cys Gly Trp195 200 205ctt gcc cat gat ttc ctt cat caa cag gtc ttt gag aac cgt acc gcg 850Leu Ala His Asp Phe Leu His Gln Gln Val Phe Glu Asn Arg Thr Ala210 215 220 225aac tcc ttc ttt ggc tat ttg ttc ggc aat tgc gtg ctt ggc ttt agt 898Asn Ser Phe Phe Gly Tyr Leu Phe Gly Asn Cys Val Leu Gly Phe Ser230 235240gta tca tgg tgg agg acg aag cac aac att cat cat act gct ccg aat 946Val Ser Trp Trp Arg Thr Lys His Asn Ile His His Thr Ala Pro Asn
245 250 255gag tgc gac gaa cag tac aca cct cta gac gaa gac att gat act ctc 994Glu Cys Asp Glu Gln Tyr Thr Pro Leu Asp Glu Asp Ile Asp Thr Leu260 265 270ccc atc att gcc tgg agc aag gaa att ttg gcc acc gtt gag agc aag 1042Pro Ile Ile Ala Trp Ser Lys Glu Ile Leu Ala Thr Val Glu Ser Lys275 280 285aga att ttg cga gtg ctt caa tat cag cac tac atg att ctg cct cta 1090Arg Ile Leu Arg Val Leu Gln Tyr Gln His Tyr Met Ile Leu Pro Leu290 295 300 305ttg ttc atg gcc cgg tac agt tgg act ttt gga agt ttg ctc ttc aca 1138Leu Phe Met Ala Arg Tyr Ser Trp Thr Phe Gly Ser Leu Leu Phe Thr310 315 320ttc aat cct gat ttg agc acg acc aag gga ttg ata gag aag gga aca 1186Phe Asn Pro Asp Leu Ser Thr Thr Lys Gly Leu Ile Glu Lys Gly Thr325 330 335gtt gct ttt cac tac gcc tgg ttc agt tgg gct gcg ttc cat att ttg 1234Val Ala Phe His Tyr Ala Trp Phe Ser Trp Ala Ala Phe His Ile Leu340345 350ccg ggt gtc gct aag cct ctt gcg tgg atg gta gca act gag ctt gtg 1282Pro Gly Val Ala Lys Pro Leu Ala Trp Met Val Ala Thr Glu Leu Val355360 365gcc ggt ttg ttg ttg gga ttc gtg ttt acg ttg agt cac aat gga aag 1330Ala Gly Leu Leu Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu Ser His Asn Gly Lys370 375 380 385gag gtt tac aat gaa tcg aag gac ttc gtg aga gcc cag gtt att acc 1378Glu Val Tyr Asn Glu Ser Lys Asp Phe Val Arg Ala Gln Val Ile Thr390 395 400acc cgt aac acc aag cga ggc tgg ttc aac gat tgg ttc act ggg gga 1426Thr Arg Asn Thr Lys Arg Gly Trp Phe Asn Asp Trp Phe Thr Gly Gly405 410 415ctc gac acc cag att gag cat cac ctg ttt cca aca atg ccc agg cac 1474Leu Asp Thr Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro Thr Met Pro Arg His420 425430aac tac ccc aag atc gca cct cag gtc gag gct ctt tgc aag aag cac 1522Asn Tyr Pro Lys Ile Ala Pro Gln Val Glu Ala Leu Cys Lys Lys His435440 445ggc ctc gag tac gat aat gtc tcc gtc gtt ggt gcc tct gtc gcg gtt 1570Gly Leu Glu Tyr Asp Asn Val Ser Val Val Gly Ala Ser Val Ala Val450 455 460465gtg aag gcg ctc aag gaa att gct gat gaa gcg tca att cgg ctt cac 1618Val Lys Ala Leu Lys Glu Ile Ala Asp Glu Ala Ser Ile Arg Leu His470475 480gct cac taa gaaatcgtcg aactttgact attcattttt ttcgcctggc 1667Ala Histacctcaaat gttcgggagc aggtgcttgg cagtgtgttc aaccggagcg cactgaaaat 1727gtgcagaatc catttccaga aattaccatt cctagctaaa tcttcttttt accaggtcgg 1787atatatgaaa cttttttgat gcaacaagta gcattcaatt gaagacattg ttcgagatat 1847aattcgcagt gtttctattc agcgggcata cgtactagtc catatcggcg gttgccgaga 1907gtttacatta ttagttggca caacgagtag atctagtgta aatttctatt tccgcatgta 1967atattactct gaatatatac cgttatctat tttcctaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2027aaaaaaaaaa aaa 2040<210>2<211>483<212>PRT<213>角齒蘚(Ceratodon purpureus)<400>2Met Ala Leu Val Thr Asp Phe Leu Asn Phe Leu Gly Thr Thr Trp Ser15 10 15Lys Tyr Ser Val Tyr Thr His Ser Tyr Ala Gly Asn Tyr Gly Pro Thr20 2530Leu Lys His Ala Lys Lys Val Ser Ala Gln Gly Lys Thr Ala Gly Gln3540 45Thr Leu Arg Gln Arg Ser Val Gln Asp Lys Lys Pro Gly Thr Tyr Ser505560Leu Ala Asp Val Ala Ser His Asp Arg Pro Gly Asp Cys Trp Met Ile65 70 75 80Val Lys Glu Lys Val Tyr Asp Ile Ser Arg Phe Ala Asp Asp His Pro
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tgg tgg agg acg aag cac aac att cat cat act 771Gly Phe Ser Val Ser Trp Trp Arg Thr Lys His Asn Ile His His Thr240 245250gct ccg aat gag tgc gac gaa cag tac aca cct cta gac gaa gac att 819Ala Pro Asn Glu Cys Asp Glu Gln Tyr Thr Pro Leu Asp Glu Asp Ile255 260 265 270gat act ctc ccc atc att gcc tgg agc aag gaa att ttg gcc acc gtt 867Asp Thr Leu Pro Ile Ile Ala Trp Sar Lys Glu Ile Leu Ala Thr Val275 280285gag agc aag aga att ttg cga gtg ctt caa tat cag cac tac atg att 915Glu Ser Lys Arg Ile Leu Arg Val Leu Gln Tyr Gln His Tyr Met Ile290 295 300ctg cct cta ttg ttc atg gcc cgg tac agt tgg act ttt gga agt ttg 963Leu Pro Leu Leu Phe Met Ala Arg Tyr Ser Trp Thr Phe Gly Ser Leu305 310 315ctc ttc aca ttc aat cct gat ttg agc acg acc aag gga ttg ata gag 1011Leu Phe Thr Phe Asn Pro Asp Leu Ser Thr Thr Lys Gly Leu Ile Glu320 325 330aag gga aca gtt gct ttt cac tac gcc tgg ttc agt tgg gct gcg ttc 1059Lys Gly Thr Val Ala Phe His Tyr Ala Trp Phe Ser Trp Ala Ala Phe335 340 345 350cat att ttg ccg ggt gtc 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權(quán)利要求
1.一種選自下列一組的編碼具有Δ6-乙炔酶和/或Δ6-脫飽和酶活性的多肽的分離的核酸序列a)具有SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO11所示序列的核酸序列，b)由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而由SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO11所示核酸序列衍生的核酸序列，c)SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO11所示核酸序列的衍生物，它編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽，并且在氨基酸水平上具有至少75％的同源性，這種多肽的酶促活性具有可以忽略的降低。
2.一種由權(quán)利要求1的核酸序列所編碼的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求2的氨基酸序列，它是由SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO11所示序列編碼的。
4.一種表達(dá)框，含有權(quán)利要求1的核酸序列，其中，該核酸序列與一個(gè)或多個(gè)調(diào)控信號(hào)連接。
5.一種載體，含有權(quán)利要求1的核酸序列或權(quán)利要求4的表達(dá)框。
6.一種生物，含有至少一種權(quán)利要求1的核酸序列或至少一種權(quán)利要求4的表達(dá)框或至少一種權(quán)利要求5的載體。
7.如權(quán)利要求6的生物，其中，該生物是植物、微生物或動(dòng)物。
8.一種轉(zhuǎn)基因植物，含有權(quán)利要求1的功能性的或非功能性的核酸序列或權(quán)利要求4的功能性的或非功能性的表達(dá)框。
9.一種制備不飽和脂肪酸的方法，該方法包括將至少一種權(quán)利要求1的核酸序列或至少一種權(quán)利要求4的表達(dá)框?qū)氘a(chǎn)油的生物中，培養(yǎng)該生物并分離該生物所含有的油，釋放出所述油中所含的脂肪酸。
10.一種制備具有較高含量不飽和脂肪酸的甘油三酯的方法，該方法包括將至少一種權(quán)利要求1的核酸序列或至少一種權(quán)利要求4的表達(dá)框?qū)氘a(chǎn)油的生物中，培養(yǎng)該生物并分離該生物所含有的油。
11.如權(quán)利要求9或10的方法，其中，所述不飽和脂肪酸具有較高含量的在6號(hào)位置上具有三鍵或雙鍵或者在6號(hào)位置上具有三鍵和雙鍵的不飽和脂肪酸。
12.如權(quán)利要求9-11中任一項(xiàng)的方法，其中，所述生物是植物或微生物。
13.一種含有SEQ ID NO8所示氨基酸序列的蛋白。
14.一種含有SEQ ID NO10所示氨基酸序列的蛋白。
15.將權(quán)利要求13或14的蛋白用于制備不飽和脂肪酸的用途。
16.一種制備具有較高含量的不飽和脂肪酸的甘油三酯的方法，該方法是通過將具有飽和或不飽和或飽和和不飽和脂肪酸的甘油三酯與至少一種權(quán)利要求2、13、14的蛋白一起溫孵。
17.如權(quán)利要求16的方法，其中，所述甘油三酯是在有能夠攝取或釋放還原性等同物的化合物存在的條件下制備的。
18.如權(quán)利要求16或17的方法，其中，所述脂肪酸是從甘油三酯中釋放出來(lái)的。
19.一種用權(quán)利要求9或18的方法制備的不飽和脂肪酸。
20.一種用權(quán)利要求10、16、17的方法制備的具有較高含量不飽和脂肪酸的甘油三酯。
21.將權(quán)利要求1的核酸序列或權(quán)利要求4的表達(dá)框用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的用途。
22.將權(quán)利要求1的核酸序列或其片段用于通過同源性篩選分離基因組序列的用途。
23.將權(quán)利要求19的不飽和脂肪酸或權(quán)利要求20的具有較高含量不飽和脂肪酸的甘油三酯用于生產(chǎn)人類食品、動(dòng)物飼料、化妝品或藥品的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備不飽和脂肪酸的方法,以及制備具有較高不飽和脂肪酸含量的甘油三酯的方法。本發(fā)明還涉及用編碼角齒蘚Δ6－乙炔酶/Δ6－脫飽和酶或Δ6－脫飽和酶的DNA序列生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因生物,優(yōu)選轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因微生物,該轉(zhuǎn)基因生物具有較高含量的具有Δ6三鍵和/或Δ6雙鍵的脂肪酸、油類或脂類。本發(fā)明還涉及分離的核酸序列;涉及含有一種核酸序列的表達(dá)框,含有一種核酸序列的表達(dá)框的載體和生物。本發(fā)明還涉及具有較高含量不飽和脂肪酸的不飽和脂肪酸和甘油三酯及其用途。
文檔編號(hào)A01K67/033GK1369012SQ00811423
公開日2002年9月11日 申請(qǐng)日期2000年6月7日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月7日
發(fā)明者E·海恩茨, S·施蒂姆尼, M·李, T·吉爾克, P·施佩林, U·采林格 申請(qǐng)人:巴斯夫植物科學(xué)股份有限公司