專利名稱：通過干燥處理制備于環(huán)境溫度貯存的含有需穩(wěn)定化的敏感性生物制品的保存用混合物的制作方法
發(fā)明的背景相關(guān)領(lǐng)域的描述敏感性的生物分子、病毒、細(xì)菌、載體、真核細(xì)胞和小型多細(xì)胞標(biāo)本具有廣泛的用途，例如，包括人用和獸用藥劑、免疫處理和疫苗、分子生物學(xué)、基因治療以及食物工業(yè)等方面。一般而言，這些生物活性材料、病毒和細(xì)胞在含水環(huán)境中是活躍的；因而，這些樣品的常規(guī)制劑都是水溶液形式。但是，許多生物活性材料(尤其是病毒和細(xì)胞)對(duì)降解敏感，尤其是在環(huán)境溫度或更高的溫度下在水溶液中可喪失活性和/或生存能力。因此，這種樣品常常需要冷藏，否則在環(huán)境條件下保存期短。
本領(lǐng)域中已知的大量化學(xué)作用原理可破壞各種生物活性材料、病毒和細(xì)胞。在幾乎所有的這些破壞性途徑中，水是一種反應(yīng)劑。此外，水還可起到增塑劑的作用，使蛋白質(zhì)伸展和凝聚。由于水在幾乎所有的降解途徑中是參與者，所以，減少生物活性材料、病毒和細(xì)胞中的水溶液或懸浮液水分、使其成為干燥粉末，就可成為提高這些樣品的穩(wěn)定性的一種可選擇的制備方法?？墒褂酶鞣N技術(shù)使病毒和細(xì)胞干燥，這些技術(shù)包括凍干、發(fā)泡干燥(foam-drying)、噴霧干燥和晾曬干燥。對(duì)生物分子、病毒和細(xì)胞的水溶液進(jìn)行干燥處理，并以干燥粉末的形式貯存?zhèn)溆谩?br> 除了脫水處理外，玻璃化處理是另一種保存(穩(wěn)定化)敏感性生物分子、病含毒和細(xì)胞的有效方法。在環(huán)境溫度中的干燥狀態(tài)下、以及在低溫條件下(冷凍)在含水環(huán)境中都可實(shí)現(xiàn)玻璃化過程。有于許多理由表明，包括保存方便和節(jié)約、運(yùn)輸、發(fā)運(yùn)方法選擇的靈活性、緊急條件下的可應(yīng)用性和第三世界國家的可接受性等方面，在干燥狀態(tài)中的環(huán)境溫度下的穩(wěn)定性是極為理想的。因此，生物分子、病毒和細(xì)胞在干燥狀態(tài)下進(jìn)行玻璃處理是特別有用的。但是，未受保護(hù)的生物分子、病毒和細(xì)胞的干燥處理也象對(duì)這些樣品進(jìn)行冷凍處理一樣，很容易對(duì)它們?cè)斐蓳p傷。因此，需要發(fā)展一種保存用混合物，在該混合物中，生物分子、病毒和細(xì)胞可被脫水，并以最小的活性或生存能力的喪失而進(jìn)入玻璃化狀態(tài)。
例如在WO 99 27071 A、DE 17 92 196 A、WO 91 18091、GB 799 644和美國專利號(hào)5,290,765中公開了在干燥狀態(tài)下保存敏感性生物制品的相關(guān)背景技術(shù)。
發(fā)明概要本發(fā)明涉及一種保存用混合物，它含有對(duì)干燥和在環(huán)境溫度或更高溫度下貯存期間的活性或生存能力喪失敏感的生物制品、單糖的非還原性衍生物和選自非還原性二糖、非還原性寡糖、二糖的非還原性衍生物、寡糖的非還原性衍生物、蛋白質(zhì)、高分子保護(hù)劑和谷氨酸鈉(MSG)中的至少一種保護(hù)劑。
在一個(gè)最佳的方面，該保存用混合物中的生物制品可選自敏感性生物分子、病毒、細(xì)菌、其它的原核細(xì)胞、真核細(xì)胞。
該保存用混合物具有總的溶質(zhì)質(zhì)量。在一個(gè)模式中，單糖的經(jīng)修飾的非還原性衍生物約占總?cè)苜|(zhì)質(zhì)量的5-80wt％。更佳的是，該單糖的經(jīng)修飾的非還原性衍生物約占總?cè)苜|(zhì)質(zhì)量的20-60wt％。
本發(fā)明一個(gè)最佳模式的保存用混合物是甲基化單糖。具體而言，該甲基化單糖是甲基α-吡喃葡糖苷或甲基β-吡喃葡糖苷。
保存用混合物中所含有的非還原性二糖可能是蔗糖或海藻糖。保存用混合物中所含有的蛋白質(zhì)可以選自明膠、白蛋白、乳清白蛋白或球蛋白和應(yīng)激蛋白。在一種模式中，該蛋白質(zhì)可以是在約50℃以上的溫度、在pH約為9以上或小于約5的水性介質(zhì)中具有穩(wěn)定性的任何蛋白質(zhì)。較佳的是，該蛋白質(zhì)的濃度約大于3wt％，更佳的是約大于10wt％。用在本發(fā)明的一個(gè)模式中的高分子保護(hù)劑可以選自HES、PVP、環(huán)糊精和PEG。
在保存用混合物含有MSG、非還原性二糖和/或非還原性寡糖的情況中，這些補(bǔ)充保護(hù)劑可約占總?cè)苜|(zhì)質(zhì)量的5-80wt％，更佳約占總?cè)苜|(zhì)質(zhì)量的20-60wt％。對(duì)于保存用混合物中使用寡糖的情況，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，這些寡糖最佳不是棉子糖。
較佳將該保存用混合物制成在干燥處理和隨后至少2周的保存中不結(jié)晶的制劑。最佳的配制包括蔗糖∶甲基(α或β)葡萄糖約4∶1到1∶2；蔗糖∶MSG的約10∶1到1∶4。
本發(fā)明還涉及一種保存對(duì)干燥處理和在環(huán)境溫度或更高溫度下貯存期間喪失活性或生存能力敏感的生物制品的方法。該方法包括將該生物制品與保護(hù)劑混合，形成保存用混合物(如上述)，然后干燥該保存用混合物，所述保護(hù)劑含有單糖的經(jīng)修飾的非還原性衍生物和選自非還原性二糖、非還原性寡糖、二糖的非還原性衍生物、寡糖的非還原性衍生物、蛋白質(zhì)、高分子保護(hù)劑和谷氨酸鈉(MSG)中的至少一種額外的化合物；其中，干燥處理和隨后的在環(huán)境溫度或較高保存溫度下貯存期間，該生物制品的活性或生存能力至少有一部分被保留。這種方法很適合于病毒、細(xì)菌、其它原核細(xì)胞、和真核細(xì)胞的保存。
所公開的該方法可應(yīng)用于多種干燥處理方法，包括凍干、晾干、噴霧干燥、流化床干燥、真空干燥、在干燥氣體中干燥和發(fā)泡干燥。
在所公開的該方法的一個(gè)變化中，混合過程還至少包括兩步向病毒或細(xì)胞中加載單糖的非還原性衍生物，然后加入補(bǔ)充化合物中的至少一種，以形成保存用混合物。待生物制品在含有單糖的非還原性衍生物的溶液中平衡就可完成加料操作。
附圖的簡短說明


圖1A顯示在室溫下貯存期間還原性和非還原性糖對(duì)ICDH活性的影響。
圖1B顯示在37℃下貯存期間還原性和非還原性糖對(duì)ICDH活性的影響。
圖2顯示在50℃下貯存期間還原性和非還原性糖對(duì)ICDH活性的影響。
圖3顯示在50℃下貯存期間非還原性糖和麥芽糖精(maltrin)對(duì)ICDH活性的影響。
圖4顯示甲基化葡萄糖的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度。
圖5顯示甲基α-d-吡喃葡糖苷對(duì)馬鏈球菌(streptococcus equi)的保存過程的影響。圖6顯示在于37℃貯存期間在全氟萘烷中脫水的熒光素酶穩(wěn)定性的延長。
最佳實(shí)施例的詳細(xì)描述A.定義本文中使用的術(shù)語“化學(xué)穩(wěn)定性”和/或“保存”指經(jīng)由化學(xué)途徑如氧化、水解或酶作用引起的生物材料的降解不超出可接受的水平。換言之，該材料至少保留了一定水平的可滿足所需的商業(yè)用途的生物活性或生存能力。在本發(fā)明的模式中，制劑在37℃貯存1周后再水化還原，如果它仍保留至少20％的生物活性或生存能力，那么就可以認(rèn)為該制劑得到了保存。
術(shù)語“敏感性生物制品”包括肽、多肽、蛋白質(zhì)、酶和輔酶、血清、維生素、抗體和抗體片段。這些術(shù)語中包括天然的或純化的和重組產(chǎn)生的部分。此術(shù)語還包括脂蛋白和翻譯后經(jīng)修飾的形式，如糖基化蛋白質(zhì)。任何這些物質(zhì)的類似物、衍生物、激動(dòng)劑、拮抗劑和藥用鹽都可包括在這些術(shù)語中。該術(shù)語還包括具有D-或L-構(gòu)型的氨基酸的經(jīng)修飾的、衍生的或非天然的肽。
在本發(fā)明的優(yōu)選模式中，生物制品包括任何能夠誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的抗原性物質(zhì)。具體而言，抗原可以是在腫瘤的細(xì)胞外區(qū)域表達(dá)的蛋白質(zhì)或其片段(如對(duì)癌癥治療時(shí))、變應(yīng)原、或者傳染性因子的部分(如病毒或細(xì)菌)。術(shù)語“疫苗”指具體類型的免疫處理。其中，生物活性材料是一種傳染性因子(或其任何部分)，給予哺乳動(dòng)物這種疫苗時(shí)，可使該動(dòng)物對(duì)由這類因子引起的傳染性疾病產(chǎn)生抵抗力。疫苗可包括病毒、細(xì)菌和寄生物、病毒粒子和/或病毒或傳染性疾病因子或病原體的任何部分，也包括可能是免疫原性的、因此可用在疫苗制劑中的蛋白質(zhì)和/或核酸。
另一方面，本發(fā)明還包括在細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中有用的得自病毒、細(xì)菌和酵母的載體。這些載體可以用于基因治療以及分子生物學(xué)和遺傳工程。在最佳方面，術(shù)語“敏感性生物制品”還包括任何病毒、原核和真核細(xì)胞以及某些小型多細(xì)胞標(biāo)本。
“泡沫形成保存法”指使生物制品在環(huán)境溫度和更高的溫度下可延長保持活性或生存能力的時(shí)間的條件下，通過真空沸騰處理使敏感性生物制品干燥的一種可量度方法?！芭菽纬杀７ā彼ǖ木唧w的方法學(xué)上的局限性詳述如下，包括兩部分，(1)初級(jí)泡沫干燥處理和(2)穩(wěn)定性干燥/玻璃化處理，這些公開在Bronshtein的美國專利號(hào)5,766,520中。
本發(fā)明中使用的術(shù)語“修飾的非還原性單糖”指糖的一般等級(jí)。修飾可以是任何已知的化學(xué)修飾，優(yōu)選的是甲基化、乙基化和氯化的衍生物。甲基化衍生物包括α和β形式的單糖類。因而使用術(shù)語“甲基(α或β)葡萄糖”。在幾個(gè)實(shí)施例中，使用了一種特定的修飾的非還原性單糖甲基α-d-吡喃葡糖苷，此化合物的縮寫形式為MAG。B.生物材料的保存以提高溫度的方法對(duì)生物標(biāo)本的脫水可能是非常有破壞性的，尤其是例如當(dāng)干燥處理溫度高于適宜的蛋白質(zhì)變性溫度時(shí)。為了保護(hù)樣品不受到與提高溫度有關(guān)的破壞作用，可逐步進(jìn)行脫水過程，或者同時(shí)增加脫水的溫度和程度。初步脫水應(yīng)在足夠低的溫度下進(jìn)行，以不喪失生物制品的活性。本發(fā)明使用的保存方法是Bronshtein在美國專利號(hào)5,766,520中和未授權(quán)的美國專利申請(qǐng)第08/979,458、09/306,137、09/589,381、09/194,499和09/254,563號(hào)以及未授權(quán)的美國臨時(shí)申請(qǐng)的60/149,795、60/166,928和60/161,204號(hào)中所公開的方法，本文將這些文獻(xiàn)的公開內(nèi)容整體納入作為參考。
在本發(fā)明的優(yōu)選模式中，根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)選擇干燥處理參數(shù)，可以使病毒或細(xì)胞在脫水期間最大程度地保留其生物活性或生存能力(1)將保護(hù)性化學(xué)品加載到病毒或細(xì)胞中，使脫水的內(nèi)部和外部分子、外殼、包膜、和其它生物結(jié)構(gòu)的保護(hù)達(dá)到最優(yōu)化；(2)使病毒或細(xì)胞在含有滲透性保護(hù)劑的加載溶液中保持平衡狀態(tài)而實(shí)現(xiàn)加載要求；(3)最佳使加載了保護(hù)劑的病毒或細(xì)胞的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度提高到理想的環(huán)境保存溫度和/或輸送溫度之上；和(4)病毒或細(xì)胞與保護(hù)劑的混合制劑在干燥處理和隨后的保存期間較佳至少有一部分維持在非晶化狀態(tài)。
保護(hù)性制劑在本領(lǐng)域已知有各種多元醇和聚合物都可以用作保護(hù)劑，只要它們可提高生物活性材料耐受干燥和貯存的能力并且不干擾其特定的生物活性。實(shí)際上，除了可使生物材料在脫水過程中保持穩(wěn)定外，保護(hù)劑分子還可在保存期間提供其它優(yōu)點(diǎn)(參見下文，即有助于產(chǎn)生力學(xué)上穩(wěn)定的泡沫)。具體而言，本發(fā)明的保護(hù)劑可包括但不限于簡單的糖類(如蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、木酮糖、核糖、甘露糖、果糖、棉子糖和海藻糖)、單糖的各種非還原性衍生物和其它碳水化合物的衍生物、糖醇如山梨糖醇、合成的聚合物(如聚乙二醇、羥乙基淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺和聚乙烯胺)、糖的共聚物〔如FICOLL和葡聚糖(Dextran)〕和它們的混合物。低分子量、高度可溶的蛋白質(zhì)也可用作保護(hù)劑。
在本發(fā)明的一個(gè)最佳變動(dòng)中，當(dāng)受保護(hù)的材料是細(xì)胞、病毒、病毒粒子和/或病毒性和非病毒性載體時(shí)，該保護(hù)性組合物還可含有低分子量糖、二糖、寡糖和包括生物聚合物在內(nèi)的聚合物的混合物。在脫水過程中，低分子量糖可滲透到細(xì)胞內(nèi)，并保護(hù)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)。低分子量的可滲透性糖可從大量的在中性或更高pH下是非還原性的酮糖或者甲基化或乙基化的單糖中選擇。非還原性酮糖包括六碳糖果糖、山梨糖和阿洛酮糖；五碳糖核酮糖和木酮糖；四碳糖赤蘚酮糖；和三碳糖1，3-二羥基二甲(基)酮。甲基化單糖是α和β形式的吡喃葡糖苷、吡喃甘露糖苷和吡喃半乳糖苷。二糖如蔗糖已知是晾曬干燥過程中的有效保護(hù)劑，因?yàn)樗扇〈锬ず痛蠓肿颖砻嫔系乃献饔玫乃４送?，在真空中干燥處理時(shí)，也可有效地將蔗糖和/或其它填充物轉(zhuǎn)化成由濃縮糖的薄層非晶形膜組成的穩(wěn)定性泡沫。
將單糖與二糖和寡糖混合可有效地防止在脫水過程中寡糖形成結(jié)晶。此外，可使用聚合物來增加脫水的混合物的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg)，這種溫度可能會(huì)因?yàn)榈头肿恿繂翁堑募尤攵陆怠？墒褂萌魏慰扇芙庠跐獾奶侨芤褐械纳锞酆衔?。例如，多糖〔如FICOLL和葡聚糖(Dextran)〕、合成的聚合物(如羥乙基淀粉、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺)，以及高度可溶的天然的和合成的生物聚合物(如蛋白質(zhì))將有助于穩(wěn)定生物膜并增加Tg。
已知一些糖、糖醇和氨基酸如谷氨酸鈉(MSG)都具有在干燥處理和隨后的保存過程中保護(hù)生物制品不受破壞的能力。有幾篇出版物可證明二糖如蔗糖或海藻糖對(duì)生物大分子和膜細(xì)胞具有強(qiáng)大的保護(hù)作用。一些研究者在凍干過程中使用含有單糖(如葡萄糖、果糖等)或低分子量糖醇(甘露糖醇、山梨糖醇等)的較為復(fù)雜的混合物來保護(hù)細(xì)胞。與二糖不同，低分子量糖和它們的衍生物能更好地滲入細(xì)胞內(nèi)部以形成細(xì)胞內(nèi)的保護(hù)作用。因此，單糖和低分子量糖醇已被廣泛應(yīng)用于保護(hù)劑配方中以保護(hù)細(xì)胞和病毒不受脫水作用的破壞。
含有還原性單糖的保存用溶液在干燥處理后的保存期間可破壞敏感的酶，并且破壞的速率隨著保存溫度的增加而快速增加(見下文實(shí)施例1)。因此，目前假定還原性單糖僅可用在于4℃以下保存的凍干標(biāo)本的例子中?；蛘?，當(dāng)生物樣品在室溫或更高的溫度下貯存時(shí)，可選擇使用其中的保護(hù)劑的還原力最小的保護(hù)性制劑。在本發(fā)明的最佳模式中，糖類的還原性基團(tuán)都已被甲基化，以增強(qiáng)其保護(hù)作用。根據(jù)本發(fā)明，也可使單糖的還原性基團(tuán)乙基化等。
低分子量碳水化合物類添加劑可使保護(hù)性制劑中的細(xì)胞或病毒懸浮液的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg)下降。例如，無水果糖的Tg接近7℃；1∶1的果糖∶蔗糖混合物在無水狀態(tài)下時(shí)的Tg稍微低于40℃。葡萄糖的Tg要高得多。因此，使用葡萄糖衍生物可能更有效。例如，甲基化葡萄糖的Tg是29℃(圖4)。
保存用溶液中的低分子量添加劑的增塑效果可能會(huì)由于使用在無水狀態(tài)下可增加Tg的可溶性較高分子量添加劑而被部分抵消。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例，保護(hù)性制劑含有MSG、非還原性寡糖和可溶的蛋白質(zhì)。在本專利申請(qǐng)的范圍內(nèi)，我們將-20℃到+50℃的溫度定義為環(huán)境溫度，以廣泛地涵蓋最大范圍的實(shí)際用途。但是，較佳的是，本申請(qǐng)中公開的方法和制劑是針對(duì)在室溫(20-25℃)或以上的溫度下貯存和/或運(yùn)送的生物分子、病毒和細(xì)胞的保存。
出乎意料的是，含有甲基化單糖的保護(hù)性制劑在保護(hù)病毒和細(xì)胞方面特別有效。例如，α-甲基葡萄糖(甲基α-d-吡喃葡糖苷)在保存經(jīng)干燥處理的敏感性生物制品方面已被證明具有獨(dú)特的保護(hù)特征。這可能是由于甲基比該分子中的其余部分更具有疏水性的緣故。因此，甲基化糖具有一些兩性分子的行為，可優(yōu)先被吸附到蛋白質(zhì)、病毒包膜和其它細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的疏水性區(qū)域。這種行為可部分解釋甲基化葡萄糖的保護(hù)作用。此外，很可能能夠加載葡萄糖的細(xì)胞，也有可能加載α-甲基葡萄糖，以便形成在胞內(nèi)的保護(hù)作用。實(shí)際上，已廣泛使用α-甲基葡萄糖來研究葡萄糖的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)?，F(xiàn)有技術(shù)還未使用過甲基化單糖來保存干燥狀態(tài)的生物樣品。
可惜的是，α-甲基葡萄糖的水溶液在干燥處理過程會(huì)形成結(jié)晶。因此，α-甲基葡萄糖應(yīng)與其它填充物〔即蔗糖、海藻糖、麥芽糖精、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、蛋白質(zhì)等〕一起使用，以盡量減少α-甲基葡萄糖形成結(jié)晶，并在干燥處理和隨后的貯存期間提高非結(jié)晶狀態(tài)的穩(wěn)定性。例如，如實(shí)施例3所討論和顯示，蔗糖/α-甲基葡萄糖溶液在干燥處理期間形成結(jié)晶的可能性依賴于蔗糖/α-甲基葡萄糖的質(zhì)量比。此外，在含有α-甲基葡萄糖的保護(hù)性制劑中加入分子量較高的添加劑，將會(huì)提高Tg在干燥狀態(tài)下可達(dá)到的值。
初級(jí)發(fā)泡干燥處理為了易于進(jìn)行大規(guī)模的加工操作，泡沫形成保存法涉及通過真空沸騰處理形成力學(xué)上穩(wěn)定的多孔結(jié)構(gòu)。在-15℃到70℃溫度范圍進(jìn)行干燥處理步驟。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，初級(jí)干燥處理步驟中的樣品溫度小于或等于約5℃。泡沫形成保存法在玻璃化處理之前特別適用于大樣品量的有效干燥處理，并且可作為制備適合商業(yè)用途的易于磨碎的干燥產(chǎn)品的一種輔助手段。發(fā)泡干燥處理的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是該方法可進(jìn)行規(guī)?；庸ぁ＠?，該方法可應(yīng)用于幾毫升(分析和最優(yōu)化操作)到幾百升(工業(yè)規(guī)模生產(chǎn))含有敏感性生物活性材料的任何體積的溶液或懸浮液的保存。在Bronshtein的美國專利第5,766,520和6,306,345號(hào)中對(duì)于泡沫形成保存法有更詳細(xì)的描述。
在本發(fā)明中所作的變動(dòng)是，在真空中進(jìn)行發(fā)泡干燥處理之前，可以先部分除去水分，使稀的生物樣品濃縮。這一初級(jí)濃縮步驟可在將樣品注入處理室之前或之后進(jìn)行，取決于所選擇的濃縮方法。在需要增加生物活性材料的濃度的情況中，預(yù)期可用在初級(jí)濃縮處理的方法包括凍干、從液態(tài)或部分凍干狀態(tài)中蒸發(fā)、反向滲透、其它膜技術(shù)或本領(lǐng)域中已知的任何其它各種濃縮方法。
將樣品放在真空中，使它們?cè)诖蟠蟮陀?00℃的溫度下沸騰進(jìn)行干燥處理。當(dāng)對(duì)含有生物活性材料的溶液或懸浮液使用減壓時(shí)，該溶液或懸浮液就會(huì)發(fā)生沸騰而產(chǎn)生泡沫，在形成泡沫的過程中，溶劑會(huì)被進(jìn)一步排除，最終形成力學(xué)上穩(wěn)定的開放孔或封閉孔的多孔狀泡沫。該力學(xué)上穩(wěn)定的多孔狀結(jié)構(gòu)或泡沫是由濃縮的填充物組成的薄的無晶形薄膜的形成。
進(jìn)行沸騰步驟中的真空較佳是0-10Torr，最佳小于約4Torr。本文中沸騰處理指含有水蒸氣而不是空氣或其它氣體的成核作用和氣泡生長。實(shí)際上，在某些溶液中，通過在室溫下使用低真空(約0.1-0.9大氣壓)驅(qū)除溶解的氣體可能是有利的。這種“脫氣處理”可能有助于防止溶液噴出干燥處理容器。
穩(wěn)定性干燥/玻璃化處理使初級(jí)干燥處理形成的力學(xué)上穩(wěn)定的泡沫在提高溫度的條件下進(jìn)行次級(jí)干燥處理或稱“穩(wěn)定性”干燥處理。由于玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg)取決于樣品中的水含量，并且Tg隨著脫水程度的增加而增加，所以可根據(jù)所需的貯存溫度采用不同的穩(wěn)定性干燥處理方案，以產(chǎn)生與玻璃化(即形成固態(tài)無晶形玻璃)一致的Tg。但是，因?yàn)椴牧弦坏┻M(jìn)入玻璃狀態(tài)，在事實(shí)上就不可能進(jìn)行脫水處理，所以在可能是理想的環(huán)境貯存溫度時(shí)，本發(fā)明玻璃化處理的關(guān)鍵，是在明顯高于環(huán)境溫度的溫度下進(jìn)行穩(wěn)定性干燥處理。
最終的貯存溫度較佳為0-70℃。更佳的是，通常的貯存溫度選擇是大于或等于0、4、20、40和50℃。在有些情況下，可能優(yōu)選冷卻貯存時(shí)，可在室溫中進(jìn)行穩(wěn)定性干燥處理，隨后冷卻至貯存溫度或以下。但是，在其它的例子中，當(dāng)需要在室溫中保持穩(wěn)定時(shí)，就應(yīng)使用高于室溫的溫度進(jìn)行脫水處理，接著冷卻至室溫。
對(duì)于任何要保存的具體標(biāo)本，該標(biāo)本的性質(zhì)和穩(wěn)定性特性將決定它在初級(jí)干燥處理步驟中所能承受的最大溫度。據(jù)酶保存的例子顯示，在室溫下進(jìn)行初級(jí)干燥處理后，其穩(wěn)定性干燥處理的溫度可提高到50℃而酶的活性不會(huì)喪失。然后，可在更高的溫度中繼續(xù)進(jìn)行的穩(wěn)定性干燥過程中進(jìn)行脫水處理。從而，通過連續(xù)的或逐步的增加脫水處理的溫度，就可將不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)保存在大大高于它們的變性溫度的溫度中而保持熱穩(wěn)定狀態(tài)。
除了在高于所選擇的貯存溫度的溫度下進(jìn)行穩(wěn)定性干燥處理外，關(guān)鍵的問題是這種干燥處理要進(jìn)行足夠長的時(shí)間，以確實(shí)將Tg提高到貯存溫度之上。從10μl 15％蔗糖+15％棉子糖溶液液滴進(jìn)行干燥處理獲得的經(jīng)驗(yàn)結(jié)果可以證明，為了將Tg提高至25℃以上，就要在70℃以上進(jìn)行穩(wěn)定性干燥處理12小時(shí)以上。在這些實(shí)驗(yàn)中的初級(jí)干燥處理是在室溫下(20℃)進(jìn)行12小時(shí)。結(jié)果表明，為了有效將Tg提高至室溫以上，可能需要延長穩(wěn)定性干燥處理的時(shí)間(在70℃要超過12小時(shí)，在50℃要超過60小時(shí))。對(duì)于一些不是熱不穩(wěn)定性的生物材料，在較高溫度下進(jìn)行的初級(jí)干燥處理將使為增加Tg至所選擇的貯存溫度之上而需要的在更高的溫度下進(jìn)行的穩(wěn)定性干燥處理的時(shí)間減少。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，使從穩(wěn)定性干燥處理所獲得的泡沫冷卻至研磨溫度，經(jīng)研磨后，將所獲得的粉末在真空中或在大氣壓下進(jìn)行次級(jí)干燥處理。隨后的干燥處理溫度范圍為0-100℃。這種干燥處理可繼續(xù)進(jìn)行，直到玻璃化轉(zhuǎn)變溫度提高到約0-70℃范圍中所選擇的貯存溫度之上。
為了確保Tg事實(shí)上大于貯存溫度，已知至少有兩種方法可進(jìn)行熱量分析以評(píng)估Tg。示差掃描量熱法(DSC)是最常用的技術(shù)。但是，本發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)，用DSC測(cè)量含有聚合物的樣品中的Tg方面可能并不可靠。另一種方法是熱刺激偏振法(TSP)，特別適用于對(duì)聚合物的分析。TSP法是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼘?duì)所有的樣品都是可靠的，不過它需要的樣品量較大。
下面的一些實(shí)施例闡明了本發(fā)明的各種特殊方面，涉及含有病毒或細(xì)胞與保護(hù)劑的保存用混合物，其中，這類混合物適用于使這些樣品在脫水處理和隨后的在環(huán)境溫度或更高的溫度下的貯存過程中保持穩(wěn)定化。
實(shí)施例1——研究在室溫和37℃貯存期間還原性和非還原性糖和PVP對(duì)異檸檬酸脫氫酶(ICDH)的影響。此實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)是為了測(cè)試添加劑如糖的還原能力。這種還原作用是以產(chǎn)生美拉德反應(yīng)或酶褐變反應(yīng)的能力來鑒定。對(duì)于單糖或簡單的糖，C鍵上的糖羥基或OH易于與含有NH或NH2的氨基酸殘基如賴氨酸、天冬酰胺發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。
ICDH酶由供應(yīng)廠商配制成50％的甘油制劑。使用下述保存用溶液(1)30％蔗糖+10％PVP溶液；(2)20％葡萄糖+20％PVP溶液；(3)20％果糖+20％PVP溶液；和(4)20％甲基α-d-吡喃葡糖苷+10％PVP溶液。
在15-17℃使ICDH(200μl)在冷的0.1M Tris HCl中透析5小時(shí)。緩緩攪拌該緩沖液，使小分子均勻地分散在溶液中。透析后，將ICDH(總體積為180μl)轉(zhuǎn)移到1.7ml微離心管中，在該管中加入250μl、0.1M的Tris HCl緩沖液(pH7.8)。將該管放在冰上。
分別將上述4種不同的保存用溶液之一加到ICDH中后，將所得的ICDH溶液(100μl等分試樣)保存在1.7ml微離心管中。這些保存用混合物經(jīng)攪勻，將其等分至40個(gè)試管中，每管10μl。在零時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)四種不同的保存用混合物中每一種的一份樣品。剩余的樣品以室溫在真空中干燥處理過夜。經(jīng)干燥處理后，檢測(cè)各保存用混合物的另一份樣品。將余下的樣品分成兩組，一組在室溫下貯存，另一組在37℃貯存。每隔兩周檢測(cè)在各貯存溫度下的每種保存用混合物的一份樣品的活性。
用0.1M、pH7.8的Tris HCl稀釋所有要檢測(cè)的樣品至10倍，通過攪勻使它們混合。將各稀釋樣品(10μl)與3ml 0.1M、pH7.8的Tris HCl、10μl 10mM的MnSO4、10μl 50mM異檸檬酸鹽和10μl、10mM NADP+溶液混合一起培養(yǎng)。在340nm波長測(cè)量隨著時(shí)間變化的吸光度。以4厘米/分鐘的記錄紙速測(cè)定在20mV的吸光度變化評(píng)估其相對(duì)活性。結(jié)果顯示在
圖1A和1B中。
實(shí)施例2——研究在50℃貯存過程中還原過程和非還原性糖以及PVP對(duì)異檸檬酸脫氫酶(ICDH)的影響。設(shè)計(jì)此實(shí)驗(yàn)是測(cè)試添加劑如糖的還原能力。這種還原過程的特性以產(chǎn)生美拉德反應(yīng)或酶褐變反應(yīng)的能力來鑒定。對(duì)于一些單糖或簡單的糖，C鍵上的糖羥基或OH易于與含有NH或NH2的氨基酸殘基如賴氨酸、天冬酰胺發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。
ICDH酶由供應(yīng)廠商配制成50％的甘油制劑。使用下述保存用溶液(1)30％蔗糖+10％PVP的溶液；(2)20％葡萄糖+20％PVP的溶液；(3)20％果糖+20％PVP的溶液；和(4)20％甲基α-d-吡喃葡糖苷+10％PVP的溶液。
在15-17℃將ICDH(200μl)在冷的0.1M Tris HCl中透析5小時(shí)。輕微攪拌該緩沖液，使小分子均勻地分散在整個(gè)溶液中。透析后，將ICDH(總體積為180μl)轉(zhuǎn)移到1.7ml微離心管中，在該管中加入250μl、0.1M的Tris HCl緩沖液(pH7.8)。將該管放在冰上。
分別將上述4種不同的保存用溶液之一加到ICDH中后，將所得的ICDH溶液(100μl等分試樣)分別保存在各1.7ml微離心管中。這些保存用混合物經(jīng)攪勻旋渦處理后，將其等分至40個(gè)試管中，每管10μl。在零時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)四種不同的保存用混合物中每一種的一份樣品。剩余的樣品在室溫下真空中干燥處理過夜。干燥處理后，檢測(cè)各保存用混合物的另一樣品。在50℃保存余下的樣品。每隔兩周檢測(cè)每種保存用混合物的一份樣品的活性。
用0.1M、pH7.8的Tris HCl稀釋所有要檢測(cè)的樣品至10倍，通過旋渦處理使它們混合。將各份稀釋樣品(10μl)與3ml 0.1M、pH7.8的Tris HCl、10μl 10mM的MnSO4、10μl 50mM異檸檬酸鹽和10μl、10mM NADP+溶液混合一起培養(yǎng)。在340nm波長測(cè)量隨著時(shí)間變化的吸光度。以4厘米/分鐘的記錄紙速測(cè)定在20mV的吸光度的變化以評(píng)估其相對(duì)活性。結(jié)果顯示在圖2中。
實(shí)施例3——研究在50℃貯存過程中還原作用和非還原性糖以及麥芽糖精對(duì)異檸檬酸脫氫酶(ICDH)的影響。設(shè)計(jì)此實(shí)驗(yàn)是測(cè)試添加劑如糖的還原能力。這種還原特性是以產(chǎn)生美拉德反應(yīng)或酶褐變反應(yīng)的能力來鑒定。對(duì)于一些單糖或簡單的糖，C鍵上的糖羥基或OH易于與含有NH或NH2的氨基酸殘基如賴氨酸、天冬酰胺發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。
ICDH酶由供應(yīng)廠商配制成50％的甘油制劑。使用下述保存用溶液(1)30％蔗糖+10％麥芽糖精的溶液；(2)20％葡萄糖+20％麥芽糖精的溶液；(3)20％果糖+20％麥芽糖精的溶液；和(4)20％甲基α-d-吡喃葡糖苷+10％麥芽糖精的溶液。
在15-17℃使ICDH(200μl)在冷的0.1M Tris HCl中透析5小時(shí)。輕微攪拌該緩沖液，使小分子均勻地分散在整個(gè)溶液中。透析后，將ICDH(總體積為180μl)轉(zhuǎn)移到1.7ml微離心管中，在該管中加入250μl、0.1M的Tris HCl緩沖液(pH7.8)。將該管放在冰上。
在分別將上述4種不同的保存用溶液之一加到ICDH中后，將所得的ICDH溶液(100μl等分試樣)分別保存在各1.7ml微離心管中。這些保存用混合物經(jīng)旋渦處理，然后將其等分至40個(gè)試管中，為每份10μl。在零時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)四種不同的保存用混合物中每一種的一份樣品。使剩余的樣品在室溫下的真空中干燥處理過夜。干燥后，檢測(cè)各保存用混合物的另一份樣品。在50℃保存余下的樣品。每隔兩周檢測(cè)每種保存用混合物的一份樣品的活性。
用0.1M、pH7.8的Tris HCl稀釋所有要檢測(cè)的樣品至10倍，通過旋渦處理使它們混合。將各份稀釋樣品(10μl)與3ml 0.1M、pH7.8的Tris HCl、10μl 10mM的MnSO4、10μl 50mM異檸檬酸鹽和10μl、10mM NADP+溶液混合一起培養(yǎng)。在340nm波長測(cè)量隨著時(shí)間變化的吸光度。以4厘米/分鐘的記錄紙速測(cè)定在20mV的吸光度的變化以評(píng)估其相對(duì)活性。結(jié)果顯示在圖3中。
實(shí)施例4——為了測(cè)量甲基α-d-吡喃葡糖苷的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，將各種晶體密封在鋁皿中，用于DSC研究。樣品首先加熱熔化，然后使其迅速冷卻到-100℃。樣品在冷卻過程中形成玻璃化。在溫?zé)崞陂g(10℃/分鐘)要測(cè)量玻璃化轉(zhuǎn)變溫度。如圖4中所示為從玻璃態(tài)到液態(tài)轉(zhuǎn)變相關(guān)的比熱變化Tg＝29℃。
實(shí)施例5——為了能夠評(píng)估各制劑在脫水處理和隨后的貯存過程中保持非晶形(玻璃)狀態(tài)的穩(wěn)定性的能力，進(jìn)行下述各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。產(chǎn)品在結(jié)晶過程中可能發(fā)生損傷或者在玻璃態(tài)基質(zhì)內(nèi)裂解。結(jié)晶作用是在過飽和或過冷的溶液中發(fā)生的兩個(gè)步驟的過程。第一步是形成擬結(jié)晶相的穩(wěn)定核的晶核化過程。晶核的形成在實(shí)驗(yàn)上依賴于材料中的雜質(zhì)。這些晶核的穩(wěn)定化依賴于各種溶質(zhì)或互溶質(zhì)的溫度和濃度。第二步是通過晶體生長過程在晶核上形成結(jié)晶增長。這一步也依賴于各種材料中不同成分的溫度和濃度。當(dāng)樣品被干燥到接近完全脫水狀態(tài)時(shí)(如果溶質(zhì)晶體過程是純凈的)晶核形成最佳，如果粘度由于生長的固有動(dòng)力學(xué)而降低時(shí)，則將會(huì)有利于晶體生長。
如下表中所示，在各成分間的質(zhì)量比不同的各種化合物的溶解度范圍內(nèi)，以總?cè)苜|(zhì)占30-50％w/w的比例制備各種溶液。使用0.02μm Acrodisc過濾裝置過濾所有各份溶液。
如下述，將溶液滴在顯微鏡平板上，然后分別對(duì)其進(jìn)行快速完全的干燥處理或緩慢而未完成的脫水過程。使用20μl移液管分別將10滴(每滴10μl)液滴加到經(jīng)酒精清潔的各顯微鏡玻片上，每份樣品40滴。準(zhǔn)備一組鋪有DRIERITE(干燥劑)層的盒子。將樣品玻片放到DRIERITE盒中，然后使用石蠟?zāi)っ芊狻y(cè)量晶體隨著時(shí)間形成的數(shù)量并做記錄。2周后，將樣品轉(zhuǎn)移到52％相對(duì)濕度(RH)環(huán)境〔經(jīng)Mg(NO3)2飽和處理〕中。再次隨著時(shí)間測(cè)量晶體數(shù)量，并做記錄。結(jié)果列在表1-6中(下文)。
表150％蔗糖∶MSG液滴結(jié)晶過程
*DRIERITE**Mg(NO3)2
表250％蔗糖∶MSG液滴結(jié)晶過程(僅用Drierite)
表350％蔗糖∶肌醇液滴結(jié)晶過程
*DRIERITE**Mg(NO3)2表450％蔗糖∶甲基α-d-吡喃葡糖苷(MAG)液滴結(jié)晶過程
*DRIERITE**Mg(NO3)2
表550％MSG∶甲基α-d-吡喃葡糖苷(MAG)液滴結(jié)晶過程
*DRIERITE**Mg(NO3)2當(dāng)使用50％MSG和甲基α-d-吡喃葡糖苷時(shí)，應(yīng)注意的是，分別為40∶1和30∶1比率的溶液在室溫下貯存過夜后形成結(jié)晶(表5)。
根據(jù)表6(下文)所示的結(jié)果可以看出，50％的1∶10、1∶20、1∶30和1∶40的MSG∶海藻糖溶液在室溫下過夜而形成結(jié)晶。因而，這些制劑沒有用于液滴分析。
表650％MSG∶海藻糖也結(jié)晶(僅用Drierite)
實(shí)施例6——分別培育并收集牛呼吸道合胞體病毒(BRSV)、年傳染性鼻氣管炎(IBR)病毒、牛病毒性腹瀉病毒(BVD)和副流感病毒3(PI3)。收集后，用穩(wěn)定劑混合所得病毒，然后將其分散成大約40ml的等分試樣，在-80℃冰庫中冷凍直至使用。
在0.01M磷酸鹽緩沖液中配制下述70％w/w的各種保存用溶液，并用Corning0.22μm PES(聚醚砜)過濾系統(tǒng)進(jìn)行無菌過濾(1)2∶1的蔗糖∶甲基α-d-吡喃葡糖苷；(2)6∶1蔗糖∶肌醇；(3)2∶1蔗糖∶異麥芽糖(isomalt)；(4)5∶2的蔗糖∶山梨糖醇；(5)海藻糖；(6)5∶2的蔗糖∶MSG。
所有各產(chǎn)品的制備都在18℃的房間中進(jìn)行。從-80℃的冰庫中取出病毒，將其放到冷的自來水中解凍(大約1小時(shí))。使用無菌技術(shù)，在無菌的50ml聚丙烯錐管中按確定的比例制備四種病毒的混合物。將2份無菌保存用溶液加到1份病毒混合物中。經(jīng)旋渦處理獲得均質(zhì)混合物。將2.4g病毒/保存用溶液混合物加載到無菌的30ml硼硅酸鹽玻璃血清瓶(Wheaton型)中。然后將無菌的13mm長的終止凍干塞子分別放到各瓶口的第一級(jí)上，使塞子上的槽口開放，以便在保存期間由泡沫形成而使水分蒸發(fā)。然后將瓶子放到金屬的干燥處理盤中。將這些盤子裝載到經(jīng)過修改的預(yù)冷的(5℃)冷凍干燥器中，以進(jìn)行泡沫形成保存法。將熱電偶放到在其中一個(gè)瓶子中，以監(jiān)測(cè)干燥處理期間樣品的溫度。然后進(jìn)行干燥處理。結(jié)束泡沫形成保存法后，在真空下塞好瓶子，然后從干燥器中取出。用鋁鋸片卷邊密封瓶子，在4℃保存。采用下述各種方法測(cè)試保存的樣品以及冷凍的對(duì)照樣品。
將Madin-Darby牛腎(MDBK)細(xì)胞維持在含有5％供體馬血清(JRH Biologicals)的Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中。該血清是抗體，并且不含有BVD、IBR、PI3和BRSV。從NVSL獲得下述病毒中和的血清，并將其應(yīng)用于每一份疫苗的病毒滴定BVDV抗血清NVSL批號(hào)4X；PI3抗血清NVSL批號(hào)86.2；IBRV抗血清NVSL批號(hào)10X；和BRSV抗血清NVSL批號(hào)88.5X。
通過使用經(jīng)病毒特異性抗血清中和其它三部分的4-聯(lián)疫苗對(duì)BRSV、IBR、BVD和PI3各樣品每一份進(jìn)行病毒滴定。用胰蛋白酶-EDTA(批號(hào)#7B2028，JRHBioscience)取出培育在490cm2搖瓶中的MDBK細(xì)胞的培養(yǎng)物，以1.5×105細(xì)胞/毫升的密度將其懸浮在DMEM+5％馬血清中。在96孔平板中每孔接種200μl的細(xì)胞懸浮液。該微滴定板培育過夜，一般在第二天當(dāng)細(xì)胞匯后成單層約鋪滿80％時(shí)進(jìn)行病毒滴定。
每瓶保存的病毒(4-聯(lián)疫苗)用15.5ml DMEM再水合還原成溶液。將此溶液作為10-0稀釋液。將4瓶分別再水合的疫苗混合，用于病毒滴定。對(duì)照病毒是冷凍的病毒。取得0.1ml的再水合疫苗樣品，將其加到無菌的含有其它三種病毒各自的抗血清的1ml小瓶中，每種抗血清有0.3ml。例如，如果滴定BVD，則將0.1ml的疫苗加到含有0.3ml抗IBR血清、0.3ml抗BRSV血清和0.3ml抗PI3血清的小瓶中。此階段的總體積是1.0ml，病毒稀釋度為10-1。室溫下培育該混合物40分鐘。
將22μl中和的(10-1)樣品加到96孔平板第一排的孔(200μl)中，制備稀釋成10倍的病毒液?；旌细骺椎娜芤?這是10-2稀釋度)，然后取22μl轉(zhuǎn)移到第二排，依次類推，直至最后一排。在第1到第10列進(jìn)行病毒滴定。第11和12列留作未感染的細(xì)胞對(duì)照組。在37℃、在5％的CO2境中培育該平板4天。據(jù)致細(xì)胞致病作用(CPE)變化讀數(shù)測(cè)定病毒的感染情況。最后，使用Reed-Muench法計(jì)算病毒效價(jià)。記錄從各對(duì)照病毒和保存的各種疫苗獲得的4種病毒的效價(jià)，比較保存期間病毒的損失情況。結(jié)果列在表7中，兩份數(shù)據(jù)表示重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
表7甲基α-d-吡喃葡糖苷和糖醇對(duì)保存BRSV、IBR、BVD和PI3病毒的保護(hù)效果
實(shí)施例7——分別培育并收集新城疫病毒和支氣管炎病毒。收集后，用穩(wěn)定劑混合所得病毒，然后將其分配成大約200ml的等分試樣，然后在-80℃冷庫中冷凍直至使用。
在0.01M磷酸鹽緩沖液中配制下述70％w/w的各種保存用溶液，并用Corning0.22μm PES(聚醚砜)濾器系統(tǒng)無菌過濾(1)2∶1的蔗糖甲基α-d-吡喃葡糖苷；(2)4∶1蔗糖∶MSG；(3)4∶1蔗糖∶麥芽糖醇；(4)13∶1的蔗糖∶甘露糖醇。
所有的產(chǎn)品制備工作都在18℃的房間中進(jìn)行。從-80℃的冷庫中取出病毒，將其放到冷的自來水中解凍(大約2小時(shí))。使用無菌技術(shù)，在無菌的50ml聚丙烯錐形管中制備1∶1的兩種病毒的混合物。將2份無菌保存用溶液加到1份病毒混合物中。經(jīng)旋渦處理獲得均質(zhì)的混合物。每份病毒/保存用溶液混合物取3.0g加載到無菌的30ml硼硅酸鹽玻璃血清瓶(Wheaton型)中。然后將無菌的13mm長的終止凍干塞子的第一級(jí)塞入到各瓶子口中，使瓶塞上的槽口開放，以使保存期間泡沫形成時(shí)的水分蒸發(fā)。然后將瓶子放到金屬干燥處理盤中。將這些盤子疊放到經(jīng)修改成可執(zhí)行本發(fā)明的泡沫形成保存法的預(yù)冷的(5℃)冷凍干燥器中。將熱電偶放到其中的一個(gè)瓶子中，以監(jiān)測(cè)干燥處理期間樣品的溫度。保存結(jié)束后，在真空下塞好瓶子，然后從干燥器中取出。用鋁片卷邊封蓋密封瓶子，在室溫或4℃下保存根據(jù)進(jìn)行干燥處理的Td值而定(即如果Td＝30℃，樣品在室溫下保存；如果Td＝20℃，則冷藏保存樣品)。
如上述實(shí)施例6所述檢測(cè)病毒效價(jià)。單項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果列在表8中。
表8甲基α-d-吡喃葡糖苷和糖醇對(duì)保存新城疫病毒和支氣管炎病毒的保護(hù)效果
實(shí)施例8——對(duì)于馬鏈球菌的保存，要用0.01M磷酸鹽緩沖液配制下述70％w/w的各種保存用溶液，并用Corning 0.22μm PES(聚醚砜)過濾器無菌過濾(1)4∶1的蔗糖∶甲基α-d-吡喃葡糖苷；(2)1∶1蔗糖∶甲基α-d-吡喃葡糖苷；(3)5∶2蔗糖∶谷氨酸鹽。
從-80℃冷庫中取出一瓶冷的種子原液(批號(hào)WS012696)，然后在冷水中解凍。將全部內(nèi)容物(1.0ml)轉(zhuǎn)移到150ml“馬鏈球菌生長培養(yǎng)基”(批號(hào)0757)中。根據(jù)制劑的重量，在每升該培養(yǎng)基中加入20g 50％的右旋糖。將瓶塞松開，放在37℃下的100rpm的搖床上培育大約20-24小時(shí)。使該培養(yǎng)物生長至其600nm波長的光密度(OD)達(dá)到0.8-1.5(～12小時(shí))。用接種環(huán)挑一環(huán)培養(yǎng)物接種到TSA II+5％血瓊脂(批號(hào)K1RUWW)上作純菌劃線培養(yǎng)。在37℃培育24-48小時(shí)后，檢測(cè)平板，沒有檢測(cè)到污染情況。
培育大約23.5小時(shí)后，將10ml預(yù)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到含有250ml生長培養(yǎng)基的500ml燒瓶中。在先前所述的條件下培育該預(yù)培養(yǎng)物約4小時(shí)。再作純菌劃線接種到TSAII+5％血瓊脂上。在37℃培育24-48小時(shí)后，檢測(cè)該平板，并未發(fā)現(xiàn)有污染情況。在600nm波長測(cè)量該預(yù)培養(yǎng)物的吸光度是1.888。
大約5小時(shí)后，將第二份預(yù)培養(yǎng)物50ml接種到含有100ml馬鏈球菌的肉湯+右旋糖的發(fā)酵罐中。發(fā)酵的條件是以為1升/分鐘的條件通入加壓氧氣、攪拌速率為100rpm，在37℃溫度下用2.5N HCl和2.5N NaOH調(diào)節(jié)pH值。
一旦培養(yǎng)物達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，即以1∶1的重量比例混合該細(xì)胞培養(yǎng)物和保存用溶液。經(jīng)旋渦處理得到均質(zhì)的混合物。每份病毒/保存用溶液混合物取1.0g，將其加載到無菌的10ml硼硅酸鹽玻璃血清瓶(Wheaton型)中。然后用無菌的13mm長的終止凍干塞子分別將其第一級(jí)塞入各瓶子口中，使瓶塞上槽口開放，以使保存期間的水分蒸發(fā)。然后將瓶子放到金屬干燥處理盤中。將這些盤子放到經(jīng)修改以執(zhí)行泡沫干燥方法的預(yù)冷的(5℃)冷凍干燥器中。將熱電偶放入其中的一個(gè)瓶子中，以監(jiān)測(cè)干燥處理期間樣品的溫度。保存結(jié)束后，在真空下塞好瓶子，然后從干燥器中取出。用鋁質(zhì)卷邊封蓋密封瓶子，在室溫保存。
用PBS將各對(duì)照樣品的等分試樣(1g)(細(xì)胞培養(yǎng)物+保存用溶液)稀釋10倍。用10ml PBS再水合用血瓊脂分別制備3個(gè)10-5-10-6的涂布平板。各份保存的細(xì)胞的樣品瓶。進(jìn)一步將各份對(duì)照的和保存的樣品稀釋到10-4和10-5。用分別制備3個(gè)涂布10-5和10-6用血瓊脂分別制備3個(gè)10-5-10-6的涂布平板上。在37℃培育這些平板48小時(shí)。分別計(jì)算各平板上形成的菌落數(shù)。使用產(chǎn)生30-300個(gè)菌落的平板計(jì)算每毫升中菌落形的單位(CFU/ml)。然后將保存樣品的CFU/ml除以對(duì)照樣品(細(xì)胞培養(yǎng)物)的CFU/ml，以計(jì)算保存后的存活％。結(jié)果列在圖5中。
實(shí)施例9——分別培育并收集牛呼吸道合胞體病毒(BRSV)、牛傳染性鼻氣管炎(IBR)病毒、牛病毒性腹瀉病毒(BVD)和副流感病毒3(PI3)。收集后，用穩(wěn)定劑混合所得病毒，然后將其分配成若干大約40ml的等分試樣，然后在-80℃冷庫中冷凍直至使用。
用0.01M磷酸鹽緩沖液配制下述70％w/w的各種保存用溶液，并用Corning(康寧)0.22μm PES(聚醚砜)過濾器系列(Filter Systems)無菌過濾(1)2∶1的蔗糖∶甲基α-d-吡喃葡糖苷；(2)4∶1蔗糖∶甲基α-d-吡喃葡糖苷；(6)5∶2的蔗糖∶棉子糖。
所有的產(chǎn)品制備工作都在18℃的房間中進(jìn)行。從-80℃的冷庫中取出病毒，將其放到冷的自來水中解凍(大約1小時(shí))。使用無菌技術(shù)，在無菌的一組50ml聚丙烯錐形管中，按預(yù)定比例制備四種病毒的混合物。將2份無菌保存用溶液加到1份病毒混合物中。經(jīng)旋渦處理獲得均質(zhì)的混合物。將各份病毒/保存用溶液混合物分別取2.4g加載到一組無菌的30ml硼硅酸鹽玻璃血清瓶(Wheaton型)中。然后將無菌的13mm長的終止凍干塞子的第一級(jí)放入各瓶子口中，使瓶塞上的槽口開放，以使保存期間泡沫形成時(shí)的水分能夠蒸發(fā)。然后將瓶子放到金屬干燥處理盤中。將這些盤子放到經(jīng)修改可進(jìn)行泡沫形成保存法的預(yù)冷的(5℃)冷凍干燥器中。將熱電偶放入一個(gè)瓶子其中的中，以監(jiān)測(cè)干燥處理期間樣品的溫度。然后進(jìn)行干燥處理。泡沫形成保存法結(jié)束后，在真空下塞好瓶子，然后從干燥器中取出。用鋁質(zhì)卷邊封蓋密封瓶子，然后在4℃保存。采用下述條件方法評(píng)估各份保存的樣品以及冷凍的對(duì)照樣品。
將Madin-Darby牛腎(MDBK)細(xì)胞維持在含有5％供體馬血清(JRH Biologicals)的Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基中。該血清是抗體，并且不含有BVD、IBR、PI3和BRSV。從NVSL獲得下述條件病毒中和的血清，并將其應(yīng)用于每人疫苗的病毒滴定中BVDV抗血清NVSL批號(hào)4X；PI3抗血清NVSL批號(hào)86.2；IBRV抗血清NVSL批號(hào)10X；和BRSV抗血清NVSL批號(hào)88.5X。
通過使用經(jīng)病毒特異性抗血清中和其它三部分的4-聯(lián)疫苗來對(duì)BRSV、IBR、BVD和PI3的各部分樣品進(jìn)行病毒滴定。用胰蛋白酶-EDTA(批號(hào)#7B2028，JRHBioscience)取出培育在490cm2搖瓶中的MDBK細(xì)胞的培養(yǎng)物，以1.5×105細(xì)胞/毫升的密度將其懸浮在DMEM+5％馬血清中。在一組96孔平板中每孔接種200μl的細(xì)胞懸浮液。過夜培育各該微滴定板，第二天當(dāng)細(xì)胞匯合成單層約鋪滿80％時(shí)進(jìn)行病毒滴定。
使用15.5ml DMEM再水合每瓶保存的病毒(4-聯(lián)疫苗)。將此溶液作為10-0稀釋液。將4瓶分別再水合的疫苗混合，用于病毒滴定。對(duì)照病毒是各份冷凍的病毒。取得0.1ml的再水合的疫苗樣品，將其加到無菌的含有其它三種病毒各自的抗血清的1ml小瓶中，每種抗血清有0.3ml。例如，如果滴定BVD，則將0.1ml的疫苗加到含有0.3ml抗IBR血清、0.3ml抗BRSV血清和0.3ml抗PI3血清的小瓶中。此階段的總體積是1.0ml，病毒稀釋度為10-1。室溫下培育該混合物40分鐘。
分別將22μl中和的(10-1)樣品加到一組96孔平板第一排的孔(200μl)中，制備稀釋了10倍的病毒液。混合各孔的溶液(這是10-2稀釋度)，然后取22μl轉(zhuǎn)移到第二排，依次類推，直至最后一排。對(duì)第1到第10列進(jìn)行病毒滴定。第11和12列鹵作未感染的細(xì)胞對(duì)照組。在37℃、在5％的CO2環(huán)境中培育各份平板4天。以細(xì)胞致病作用(CPE)讀數(shù)測(cè)定病毒的感染情況。最后，使用Reed-Muench法計(jì)算病毒效價(jià)。記錄從對(duì)照病毒和保存的疫苗獲得的4種病毒的效價(jià)，比較保存期間病毒的損失情況。結(jié)果列在表9中。
表9
實(shí)施例10——制備懸浮在全氟萘烷中的熒光素酶(Sigma#L-9560)的保存用制劑并測(cè)試其穩(wěn)定性。用含有1mg/ml BSA的1ml 0.1M、pH7.4的Tris緩沖液溶解凍干的熒光素酶(1mg)。在4℃，在含有1mg/ml BSA的500ml 0.1M、pH7.4的Tris緩沖液中透析所得的1mg/ml熒光素酶溶液3.5小時(shí)。將經(jīng)透析的熒光素酶轉(zhuǎn)移到微離心管中，使用下述方程測(cè)算該熒光素酶的濃度熒光素酶濃度＝初始的熒光素酶(μg)/透析后的熒光素酶的最終體積(ml)將500μl、1μ/μl經(jīng)透析的熒光素酶和99.5g、50％的10∶1的蔗糖∶MSG保存用溶液混合制備保存用混合物。然后將這些保存用混合物稱重分別，加到9個(gè)無菌的100ml血清瓶中，每瓶10±0.05g。將剩余的經(jīng)透析的熒光素酶等分裝到20個(gè)微離心管中，每管20μg，在-80℃保存，以進(jìn)一步用作標(biāo)準(zhǔn)的熒光素酶。在20℃干燥處理該保存用混合物4.5小時(shí)，然后在45℃干燥處理60小時(shí)、60℃干燥處理8小時(shí)、65℃干燥處理16.5小時(shí)。然后各份樣品瓶在真空中加上塞。將這些瓶子轉(zhuǎn)移到干燥的房間中(環(huán)境相對(duì)濕度～14％)。再將各瓶子開啟，將其中的泡沫刮到無菌的研磨瓶中，將泡沫磨碎，再將所得的粉末稱重加到無菌小瓶中，每瓶1.07-1.11g。然后在各瓶中加入2ml全氟萘烷(Aldrich#p-990-0)，并在干燥環(huán)境空氣中塞上瓶塞，然后轉(zhuǎn)移到37℃的恒溫箱中。
將熒光素酶檢測(cè)試劑和含有1mg/ml BSA的PBS放在室溫(RT)下使之平衡至少30分鐘。將9.42ml含有1mg/ml的BSA的PBS加到研磨好的樣品(1μg/ml)中，然后攪拌混和。使用此溶液1μg/ml按10倍系數(shù)制備系列稀釋液，得到最終濃度為1×10-5μg/ml。混合100μl室溫(RT)熒光素酶檢測(cè)試劑和20μl稀釋的熒光素酶，制備反應(yīng)混合物。將該反應(yīng)混合物放到光度計(jì)中，每10秒鐘測(cè)量所產(chǎn)生的光，共測(cè)1分鐘。以每秒鐘的相對(duì)光單位(RLU/s)對(duì)相對(duì)酶濃度(μg/ml)作曲線圖。
每次測(cè)量在全氟萘烷中的研磨的熒光素酶樣品的同時(shí)，要測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)的熒光素酶樣品作為對(duì)照。首先用10ml熒光素酶檢測(cè)緩沖液溶解1瓶熒光素酶檢測(cè)物質(zhì)，使其在室溫下平衡至少30分鐘，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)熒光素酶檢測(cè)。制備混合100μl室溫(RT)熒光素酶檢測(cè)試劑和20μl稀釋的熒光素酶，制備反應(yīng)混合物。將該反應(yīng)混合物放到光度計(jì)中，每10秒鐘測(cè)量所產(chǎn)生的光，共測(cè)1分鐘。以每秒鐘的相對(duì)光單位(RLU/s)對(duì)相對(duì)酶濃度(μg/ml)作曲線圖。然后比較過氟十氫萘中的研磨的熒光素酶與標(biāo)準(zhǔn)熒光素酶的活性。結(jié)果顯示在圖6中。
實(shí)施例11——使用對(duì)嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)特定的標(biāo)準(zhǔn)方法在兩升容量的發(fā)酵罐中培育該菌菌株。該發(fā)酵罐細(xì)胞的群落計(jì)數(shù)為8.10.73×108。離心收集細(xì)胞，得到200ml群落數(shù)為7.830.75×109的細(xì)胞富集體。將該細(xì)胞富集體稀釋在由800ml的40％蔗糖、10％甲基α-d-吡喃葡糖苷在50％緩沖液(w/w)中的溶液組成的保存用溶液中。將所得的混合物300ml注入聚乙烯Petri培養(yǎng)皿袋中。余下部分保存起來，另有他用。用位于由鋁架支持的4.5×19英寸圓柱形玻璃小室內(nèi)的夾具夾住空的聚乙烯袋。此玻璃室用作進(jìn)行泡沫形成保存法過程的大批量干燥處理用小室。借助于聚硅酮管的長度，將測(cè)試溶液充填到該聚乙烯袋中。也可沿著整個(gè)管的長度給該玻璃室外部安裝一層玻璃的水夾套。該夾套與再循環(huán)的可控溫度的水浴器相連接。該水夾套可在操作過程提供熱源。該玻璃室在流出端連接到凍干機(jī)的冷凝器上。在通過形成泡沫而實(shí)現(xiàn)保存的方法結(jié)束時(shí)，加入干燥氮?dú)饨獬婵諣顟B(tài)。取出該袋子進(jìn)行檢測(cè)?？汕宄吹狡渲幸旬a(chǎn)生了干燥的、力學(xué)上穩(wěn)定的易碎的泡沫。用手輕輕揉壓該材料，就可將其壓碎成具有沙子質(zhì)感的碎粒。割開該袋子，將其中的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到干凈的容器中。分3次抽取該容器中的樣品。然后將干燥氮?dú)獯等朐撊萜髦?，將其密封。培育該樣品，并將所得的?xì)胞群落與采用相同的方法在10ml小瓶中經(jīng)泡沫干燥的1ml的干燥嗜酸乳桿菌的對(duì)照培養(yǎng)物進(jìn)行比較。證明受測(cè)試細(xì)菌菌株的存活情況的結(jié)果列在表10中。
表10
對(duì)于本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員來說，根據(jù)本文所述的本發(fā)明的一系列技術(shù)對(duì)本發(fā)明各項(xiàng)實(shí)施方式按上述模式進(jìn)行的修改是顯而易見的。上述各實(shí)施例并不具有約束性，而僅僅是作為本發(fā)明的范例，其范圍須由下述的權(quán)利要求予以限定。
權(quán)利要求
1.一種保存用混合物，它含有在干燥和在環(huán)境溫度或更高溫度下貯存過程中對(duì)生存能力的喪失敏感的病毒、細(xì)菌或其它細(xì)胞；非還原性的甲基化單糖；和從非還原性二糖、非還原性寡糖、二糖的非還原性衍生物、寡糖的非還原性衍生物、蛋白質(zhì)、高分子保護(hù)劑和谷氨酸鈉(MSG)中選出的至少一種補(bǔ)充保護(hù)劑。
2.如權(quán)利要求1所述的保存用混合物，其特征在于，該保存用混合物具有總的溶質(zhì)質(zhì)量，并且所述非還原性甲基化單糖約占該總?cè)苜|(zhì)質(zhì)量的5-80wt％。
3.如權(quán)利要求1所述的保存用混合物，其特征在于，所述非還原性甲基化單糖約占該總?cè)苜|(zhì)質(zhì)量的20-60wt％。
4.如權(quán)利要求1所述的保存用混合物，其特征在于，所述非還原性甲基化單糖是甲基(α或β)-d-葡萄糖。
5.如權(quán)利要求1所述的保存用混合物，其特征在于，所述非還原性二糖是蔗糖或海藻糖。
6.如權(quán)利要求1所述的保存用混合物，其特征在于，所述蛋白質(zhì)選自明膠、白蛋白、乳清白蛋白或球蛋白和應(yīng)激蛋白。
7.如權(quán)利要求1所述的保存用混合物，其特征在于，所述高分子保護(hù)劑是HES、PVP、環(huán)糊精和PEG。
8.如權(quán)利要求1所述的保存用混合物，其特征在于，所述蛋白質(zhì)可以是在溫度約大于50℃、pH約高于9或約小于5的水性介質(zhì)中穩(wěn)定的任何蛋白質(zhì)。
9.如權(quán)利要求1所述的保存用混合物，其特征在于，所述蛋白質(zhì)的濃度約大于3wt％。
10.如權(quán)利要求9所述的保存用混合物，其特征在于，所述蛋白質(zhì)的濃度約大于10wt％。
11.如權(quán)利要求1所述的保存用混合物，其特征在于，該混合物具有總的溶質(zhì)質(zhì)量，并且混合物中的MSG約占該總?cè)苜|(zhì)質(zhì)量的5-80wt％。
12.如權(quán)利要求11所述的保存用混合物，其特征在于，所述MSG約占該總?cè)苜|(zhì)質(zhì)量的20-60wt％。
13.如權(quán)利要求1所述的保存用混合物，其特征在于，該混合物具有總的溶質(zhì)質(zhì)量，并且所述非還原性二糖約占該總?cè)苜|(zhì)質(zhì)量的5-80wt％。
14.如權(quán)利要求13所述的保存用混合物，其特征在于，所述非還原性二糖約占該總?cè)苜|(zhì)質(zhì)量的20-60wt％。
15.如權(quán)利要求1所述的保存用混合物，其特征在于，該混合物具有總的溶質(zhì)質(zhì)量，并且所述非還原性寡糖約占該總?cè)苜|(zhì)質(zhì)量的5-80wt％。
16.如權(quán)利要求15所述的保存用混合物，其特征在于，所述非還原性寡糖約占該總?cè)苜|(zhì)質(zhì)量的20-60wt％。
17.如權(quán)利要求1所述的保存用混合物，其特征在于，所述寡糖不是棉子糖。
18.如權(quán)利要求1所述的保存用混合物，其特征在于，配制的該混合物在干燥和隨后的至少兩周的貯存期間不結(jié)晶。
19.一種保存在干燥和在環(huán)境溫度或更高的溫度下貯存過程中對(duì)生存能力的喪失具有敏感性的病毒、細(xì)菌或其它細(xì)胞的方法，它包括將病毒、細(xì)菌或其它細(xì)胞與保護(hù)劑混合，形成保存用混合物，所述保護(hù)劑含有非還原性甲基化的單糖和從非還原性二糖、非還原性寡糖、二糖的非還原性衍生物、寡糖的非還原性衍生物、蛋白質(zhì)、高分子保護(hù)劑和谷氨酸鈉(MSG)中選出的至少一種補(bǔ)充化合物；然后干燥該保存用混合物，其中，在干燥處理和隨后的在環(huán)境溫度或較高貯存溫度下保存過程中，所述病毒、細(xì)菌或其它細(xì)胞至少保留了一部分生存能力。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述病毒、細(xì)菌或其它細(xì)胞還含有疫苗或載體。
21.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述甲基化單糖是甲基(α或β)-d-葡萄糖。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述干燥方法包括凍干、晾干、噴霧干燥、流化床干燥、真空干燥、在干燥氣體中干燥和發(fā)泡干燥。
23.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述保存用混合物具有總的溶質(zhì)質(zhì)量，所述非還原性單糖約占該總?cè)苜|(zhì)質(zhì)量的5-80wt％。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述非還原性甲基化單糖約占該總?cè)苜|(zhì)質(zhì)量的20-60wt％。
25.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述非還原性二糖是蔗糖或海藻糖。
26.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)選自明膠、白蛋白、乳清白蛋白或球蛋白和應(yīng)激蛋白。
27.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述高分子保護(hù)劑是HES、PVP、環(huán)糊精和PEG。
28.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)可以是在溫度約大于50℃、pH約大于9或約小于5的水性介質(zhì)中保持穩(wěn)定的任何蛋白質(zhì)。
29.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)的濃度約大于3wt％。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)的濃度約大于10wt％。
31.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述保存用混合物具有總的溶質(zhì)質(zhì)量，所述MSG約占該總?cè)苜|(zhì)質(zhì)量的5-80wt％。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述MSG約占該總的溶質(zhì)質(zhì)量的20-60wt％。
33.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述保存用混合物具有總的溶質(zhì)質(zhì)量，所述非還原性二糖約占該總?cè)苜|(zhì)質(zhì)量的5-80wt％。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述非還原性二糖約占該總的溶質(zhì)質(zhì)量的20-60％。
35.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述保存用混合物具有總的溶質(zhì)質(zhì)量，所述非還原性寡糖約占該總?cè)苜|(zhì)質(zhì)量的5-80wt％。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述非還原性寡糖約占該總的溶質(zhì)質(zhì)量的20-60wt％。
37.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述寡糖不是棉子糖。
38.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，配制的所述保存用混合物在干燥和隨后的至少兩周的貯存期間不結(jié)晶。
39.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述至少一種補(bǔ)充化合物是蔗糖，并且蔗糖與甲基(α或β)-d-葡萄糖的比例約為4∶1到1∶2。
40.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述至少一種補(bǔ)充化合物包括蔗糖和MSG，并且蔗糖與MSG的比例約為10∶1到1∶4。
41.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述混合處理還包括至少兩個(gè)步驟，包括將病毒、細(xì)菌或其它細(xì)胞加載到非還原性甲基化單糖中，然后加入至少一種補(bǔ)充化合物，形成保存用混合物。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，使病毒、細(xì)菌或其它細(xì)胞在含有非還原性甲基化單糖的溶液中保持平衡而實(shí)現(xiàn)所述加載操作。
43.(新)如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，該方法還包括第二次干燥處理步驟。
44.(新)如權(quán)利要求43所述的方法，其特征在于，所述第二次干燥處理是在0-100℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。
45.(新)如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，持續(xù)進(jìn)行所述第二次干燥處理，直到玻璃化轉(zhuǎn)變溫度升高到所選定的0-70℃溫度范圍內(nèi)的貯存溫度之上。
46.(新)如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述干燥步驟包括在真空中沸騰，形成穩(wěn)定的泡沫。
47.(新)如權(quán)利要求46所述的方法，其特征在于，該方法還包括將所述穩(wěn)定泡沫研磨成粉末的步驟。
48.(新)如權(quán)利要求47所述的方法，其特征在于，該方法還包括第二次干燥處理所述粉末的步驟。
49.(新)一種對(duì)在干燥和在環(huán)境溫度或更高的溫度下貯存期間的生存能力的喪失敏感的病毒、細(xì)菌或其它細(xì)胞的保存方法，它包括將病毒、細(xì)菌或其它細(xì)胞與保護(hù)劑混合，形成保存用混合物，所述保護(hù)劑含有非還原性單糖和從非還原性二糖、非還原性寡糖、二糖的非還原性衍生物、寡糖的非還原性衍生物、蛋白質(zhì)、高分子保護(hù)劑和谷氨酸鈉(MSG)中選出的至少一種補(bǔ)充化合物；該保存用混合物在真空中沸騰形成穩(wěn)定的泡沫從而干燥，其中，在干燥處理和隨后的在環(huán)境溫度或較高溫度下貯存期間，所述病毒、細(xì)菌或其它細(xì)胞至少保留了一部分生存能力。
50.(新)如權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于，所述非還原性單糖是甲基化單糖。
51.(新)如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述甲基化單糖是甲基(α或β)-d-葡萄糖。
52.(新)如權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于，該方法還包括在進(jìn)行沸騰處理之前，對(duì)部分冷凍狀態(tài)進(jìn)行蒸發(fā)，從而濃縮所述病毒、細(xì)菌或其它細(xì)胞的步驟。
53.(新)如權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于，該方法還包括在進(jìn)行沸騰處理之前，采用反滲透法濃縮所述病毒、細(xì)菌或其它細(xì)胞的步驟。
54.(新)如權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于，該方法還包括在0-100℃溫度范圍內(nèi)對(duì)所述穩(wěn)定性泡沫進(jìn)行第二次干燥處理的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過干燥保存敏感的生物制品、病毒、細(xì)菌和真核細(xì)胞的制劑和方法。具體而言，本發(fā)明涉及含有病毒或細(xì)胞和保護(hù)劑，包括甲基化的單糖的保存混合物，其中，該混合物適宜于使這些樣品在脫水和隨后在環(huán)境溫度和更高溫度下的貯存時(shí)保持穩(wěn)定。
文檔編號(hào)A01N1/02GK1420721SQ00817902
公開日2003年5月28日 申請(qǐng)日期2000年11月22日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月22日
發(fā)明者V·布龍施泰因, L·林科夫斯基 申請(qǐng)人:環(huán)球保藏技術(shù)股份有限公司