專利名稱：抗菌組合物及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于降低與各種病原體有關(guān)的感染性、發(fā)病率及死亡率的組合物和方法。本發(fā)明同樣還涉及用于凈化被病原體和微生物繁殖或感染的區(qū)域、樣本、溶液和食物的方法和組合物。
背景技術(shù)：
病原體，諸如細菌、真菌、病毒和細菌孢子是很多人類、動物疾病以及食品和生物學及環(huán)境學樣本被污染的主要原因。微生物引起的動物感染的第一步是皮膚或粘膜大規(guī)模的粘聯(lián)或移生，之后傳染性微生物侵入并廣泛散播。致病細菌的入侵通道主要是皮膚和粘膜。
具體的說，桿菌屬細菌能形成穩(wěn)定的孢子以對抗嚴峻的條件和極端的溫度。農(nóng)田感染上炭疽桿菌將會導致馴養(yǎng)動物、農(nóng)業(yè)和野生動物感染上致命的疾病(參見例如，Dragon和Rennie，Can.Vet.J.36295)。人類通常通過接觸感染的動物或者感染的動物制品而染上這種微生物(參見例如，Welkos等，Infect。Immun。51795)。人類的臨床并發(fā)癥包括快速發(fā)作的肺形式，通常是致命的癥狀。炭疽胃腸道和皮膚形式的并發(fā)癥，雖然發(fā)作不快，但是會導致死亡，除非經(jīng)激烈的治療(參見例如，F(xiàn)ranz等，JAMA 278399；和Pile等，Arch.Intem.Med.158429)。由于有效的動物控制，包括疫苗、抗生素和適當丟棄感染的牲畜，使得人類患桿菌炭疽感染變得不再普遍。然而，由于凈化土壤和農(nóng)場的困難，動物的炭疽感染仍然是嚴重的問題。此外，生物武器和/或恐怖分子的襲擊也導致了人類的感染。
即使能得到一種能用于阻止炭疽菌種的炭疽疫苗(參見例如，Ivins等，疫苗131779)，不同炭疽菌株的繁殖上的混合就能使得疫苗失效(參見例如，Mobley，Military Med。160547)。炭疽孢子作為生物武器使用的結(jié)果可從前蘇聯(lián)軍事微生物實驗室偶然泄漏炭疽桿菌的事故中得到見證。77例人類炭疽感染中，其中66例死亡，這都與該事故有關(guān)。一些炭疽感染發(fā)生在離實驗室4公里遠的地方(參見例如，Meselson等，Science 2661202)。對感染者的整體分析揭示他們感染了多種炭疽桿菌菌株或一種菌株的遺傳學變種(參見例如，Jackson等，Proc.Nat.Acad.of Sci.U.S.A.951224)。
另外，據(jù)報道，桿菌屬中的其他菌類也是導致人類許多疾病的病原試劑。蠟狀芽孢桿菌是一種常見病原體。它與食物傳染疾病有關(guān)，因為它的孢子在烹飪條件下仍能存活下來。它還與局部敗血癥、創(chuàng)傷及全身感染疾病有關(guān)(參見例如，Drobniewski，臨床微生物研究6324)。許多細菌正變得能耐受抗生素。生物體一旦感染了耐抗生素的菌株后，便面臨著嚴重及潛在的威脅生命的后果。
具耐藥性的細菌的例子包括經(jīng)常導致致命感染的葡萄球菌屬、導致肺炎和腦膜炎的肺炎雙球菌、導致腹瀉的沙門氏菌和大腸桿菌及導致血流、外科創(chuàng)傷和尿道感染的腸球菌(參見例如，Berkelman et。al。，J。Infcet。Dis。170(2)272)。
盡管有著巨大的進步，抗生素和抗微生物療法面臨著許多問題，尤其當不同的菌株具有抗生素耐藥性的時候。另外，消毒劑/殺蟲劑(例如，次氯酸鈉，甲醛和苯酚)雖然能有效對抗桿菌孢子，卻并不適合用于凈化環(huán)境、設(shè)備或傷亡情況。這是因為其毒性能導致組織壞死，且其揮發(fā)性氣體的吸入將導致肺損傷的緣故。這些化合物腐蝕性的特點使得它們同樣也不適合用于凈化敏感性設(shè)備(參見例如，Alasri等，Can.J.Micro.3952；Beauchamp等，Crit.Rev.Tox.22143；Hess等，Amer.J.dent.451；Lineaweaver等，Arch.Surg.120267；Morgan，Tox.Path.25291；和Russell，臨床微生物3；99)。
A型流感病毒是常見的呼吸系統(tǒng)病原體，其廣泛用體外作模型體系用以體外測試抗病毒試劑(參見例如，Karaivanova和Spiro生物化學雜志329511；Mammen等，醫(yī)學化學雜質(zhì)384179；和Huang等，F(xiàn)EBS Letters 291199)，及體內(nèi)測試(參見如，Waghorn和Goa，藥物55721；Mendel等，抗微生物劑化療42640；和Smith等，醫(yī)學化學雜志41787)。確定病毒亞型的抗原特異性的包膜糖蛋白，血細胞凝集素(HA)和神經(jīng)氨酸苷酶(NA)非常容易改變，而使得病毒能巧妙的躲避中和抗體?，F(xiàn)用抗病毒化合物和神經(jīng)氨酸苷酶抑制劑效果不顯著，而且普遍存在著病毒耐藥性。
明確的說，我們需要能夠降低與病原體暴露有關(guān)的感染、患病率和死亡率的抗病原體組合物及方法。所述組合物和方法優(yōu)選不含有導致微生物耐藥性的特性及對服藥者有毒等這些我們所不希望的特性。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于降低與不同病原體有關(guān)的感染、患病率及死亡率的組合物和方法。本發(fā)明同樣還涉及凈化被病原體繁殖或被病原體和微生物感染的區(qū)域、樣本、溶液和食物。所述組合物的某些實施方案是無毒的，且能被人和其它動物安全的服用。另外，本發(fā)明的某些實施方案是化學穩(wěn)定且不被污染的。
在一些實施方案中，本發(fā)明提供了適宜治療暴露于病原體或者受其威脅的動物，包括人的組合物和方法。在一些實施方案中，動物在暴露于致病生物體前，先與有效量的組合物接觸。在其它實施方案中，動物在暴露于致病生物體后，與有效量的組合物接觸。因此，本發(fā)明注重于預(yù)防和治療微生物感染。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供了適于凈化溶液和表面，包括暴露于病原體或可能含有病原體的有生命和無生命的樣本的組合物和方法。在另一些本發(fā)明的實施方案中，組合物還用來阻止在生物學或環(huán)境學樣本中的有害或不希望的微生物的生長。
在優(yōu)選的實施方案中，通過將致病微生物與一種水包油納米乳液相接觸以降低其引起的感染、患病率及死亡率，所述水包油納米乳液含有油相、水相和至少一種其他組分。在一些優(yōu)選的實施方案中，乳液進一步的含有一種溶劑。在一些優(yōu)選的實施方案中，溶劑包括一種有機磷酸酯溶劑。在其它實施方案中，有機磷酸酯基的溶劑包括含有磷酸二烷基酯或磷酸三烷基酯(例如，磷酸三丁酯)。在另一些優(yōu)選的實施方案中，所述乳液進一步的含有一種醇。在優(yōu)選使用溶劑的實施方案中，溶劑存在于組合物的油相中。
在一些實施方案中，本發(fā)明的組合物還含有一種或多種表面活性劑或洗滌劑。在一些實施方案中，表面活性劑是一種非陰離子洗滌劑。在優(yōu)選的實施方案中，所述非陰離子洗滌劑是聚山梨醇酯表面活性劑。在其它實施方案中，所述非陰離子洗滌劑是聚乙二醇醚。本發(fā)明表面活性劑包括但不僅限于表面活性劑例如TWEEN、TRITON及TYLOXAPOL族的化合物。
在某些其它實施方案中，本發(fā)明的組合物進一步的含有一種或多種陽離子含鹵化合物，包括但不限于氯化鯨蠟基吡啶鎓。在另一些實施方案，本發(fā)明的組合物還含有一種或多種能促進或加強某些微生物，尤其是某些細菌孢子的萌發(fā)(“萌發(fā)增強子”)的化合物。新組合物制劑所使用的萌發(fā)增強子包括但不僅限于，L-丙氨酸，肌苷，CaCl2，和NH4Cl，等等。在進一步的實施方案中，本發(fā)明的組合物還含有一種或多種能增加所述組合物與微生物之間相互作用的化合物(“相互作用增強劑”)(例如，緩沖劑中含有乙二胺四乙酸或亞乙基雙(氧化乙烯次氮基)四乙酸等螯合劑)。另外，在另一些本發(fā)明的實施方案中，所述制劑還含有著色劑或調(diào)味劑(例如，著色劑和薄荷油)。
在一些實施方案中，所述組合物進一步含有一種乳化劑以輔助形成乳液。乳化劑包括能聚集在油/水界面以形成一種阻止兩種液滴之間直接接觸的連續(xù)薄膜的化合物。在某些本發(fā)明的實施方案中特征性的水包油乳液組合物很容易在水中稀釋成所需濃度，同時又不削弱其抗病原體活性。
除了將油相不連續(xù)的分散到水相中，水包油乳液可含有其它的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，例如微型脂質(zhì)體(例如，脂質(zhì)球，其通常含有一些中間被水相層互相分離的同心脂質(zhì)雙分子層)、膠團(例如，兩性分子聚集在50-200分子量的微型分子聚集體中，其極性端基朝向外部水相，極性尾部藏于遠離水相的聚集體內(nèi)部)或?qū)訝钕?脂質(zhì)分散體，其中每一微粒中含有平行的被水薄膜分離的兩性雙分子層)。
形成這些脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的原因是疏水力將非極性殘基(例如，長烴鏈)推離于水。所述脂質(zhì)制劑可廣義的表述為表面活性劑脂質(zhì)制劑(SLPs)。SLPs對粘膜的毒性低，且據(jù)信在小腸內(nèi)代謝(參見例如，Hamouda等，傳染病雜志1801939)。與消毒劑如漂白劑相反，SLPs對于塑料和金屬沒有腐蝕性。由此，本發(fā)明基于SLPs的制劑可特別的用于對抗細菌、真菌、病毒和其它病原體。
本發(fā)明某些實施方案闡述了降低微生物(例如，致病性物質(zhì))感染的方法，包括將病原體與含水包油乳液的組合物相接觸。在某些實施方案中，乳液形式是油相均勻分布于含表面活性劑的水相中，所述油相包括一種有機磷酸酯基的溶劑和一種載體油。在一些實施方案中，將病原體暴露于兩種或更多種的不同乳液中。在優(yōu)選的實施方案中，乳液能導致融合和/或?qū)е氯芙?。在?yōu)選的實施方案中，方法中使用的油相包括一種非磷酸酯基的溶劑(例如，一種醇類)。
在特定的實施方案中，接觸足夠的時間以殺滅致病性物質(zhì)或抑制致病物質(zhì)的生長。在其它實施方案中，本發(fā)明提供了一種凈化含有害或不期望的病原體的環(huán)境學表面的方法。在一項這樣的實施方案中，致病性物質(zhì)與環(huán)境表面有關(guān)，所述方法包括將環(huán)境樣本與足以凈化表面的量的所述組合物相接觸。有時，凈化不一定已經(jīng)殺滅了全部的病原體。在一些實施方案中，所述組合物及方法還包括著色劑、涂料和其它標記及辨別化合物以保證處置表面已經(jīng)用本發(fā)明的組合物完全的處置干凈。
在某些實施方案中，動物用本發(fā)明組合物在內(nèi)部處置。在某些實施方案中，接觸經(jīng)真皮內(nèi)部、皮下、肌內(nèi)或腹腔注射。在其它實施方案中，接觸通過口服、鼻部、頰腔、直腸、陰道或局部給藥。當所述組合物以藥物給藥時，該組合物還應(yīng)含有藥學可接受的輔料、賦型劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑等等。在進一步的實施方案中，本發(fā)明組合物進一步含有附加的藥學可接受的生物活性分子(例如，抗體、抗生素、核酸轉(zhuǎn)染工具、維生素，礦物質(zhì)、輔助因子等)。
在某些實施方案中，本發(fā)明提供一種組合物，其含有一種水包油乳液，所述水包油乳液所含不連續(xù)的油相均勻分散于水相中，其中第一組分包括一種醇類或甘油，第二組分包括一種表面活性劑或一種含鹵化合物。水相可含有任意類型的水相，包括但不限于，水(例如，diH2O，蒸餾水、自來水)和溶液(例如，磷酸鹽緩沖的鹽水溶液)。油相可含有任一類型的油類，包括但不限于，植物油(例如，大豆油、鱷梨油、亞麻油、椰油、棉籽油、角鯊烯油、橄欖油、低芥酸菜籽油、玉米油、菜籽油、紅花油和葵花油)，動物油(例如，魚油)，調(diào)味油，水不溶性維生素，礦物油，和機油。在某些實施方案中，油相含有30-90體積％的水包油乳液(即，最終乳液總體積的30-90％)，更優(yōu)選50-80％。然而，本發(fā)明不限于所述醇組分的性質(zhì)，在某些實施方案中，醇可以是乙醇或甲醇。此外，本發(fā)明并不限于所述表面活性劑性質(zhì)，在某些實施方案中，表面活性劑是聚山梨醇酯表面活性劑(例如，TWEEN 20，TWEEN 40，TWEEN 60及TWEEN 80)、苯氧基聚乙氧基乙醇(例如，TRITONX-100，X-301，X-165，X-102及X-200，和TYLOXAPOL)或十二烷基硫酸鈉。同樣，本發(fā)明不限于所述含鹵化合物，在某些實施方案中，含鹵化合物包括一種鹵化鯨蠟基吡啶鎓，鯨蠟基三甲基鹵化銨，鹵化鯨蠟基二甲基乙銨，鹵化鯨蠟基二甲基芐銨，鹵化鯨蠟基三丁基磷鎓，月桂基三甲基鹵化銨，肉豆蔻基三甲基鹵化銨，氯化鯨蠟基吡啶鎓，鯨蠟基三甲基氯化銨，鯨蠟基芐基二甲基氯化銨，溴化鯨蠟基吡啶鎓，溴化鯨蠟基三甲銨，溴化鯨蠟基二甲乙銨，溴化鯨蠟基三丁基磷鎓，月桂基三甲基溴化銨，或肉豆蔻基三甲基溴化銨。
所述乳液還可含有第三、第四、第五等組分。在某些實施方案中，附加組分是表面活性劑(例如，一種第二表面活性劑)，一種萌發(fā)增強子，一種磷酸酯基的溶劑(例如，磷酸三丁酯)，一種neutramingen，L丙氨酸，氯化銨，胰胨豆胨培養(yǎng)液，酵母提取物，L-抗壞血酸，卵磷脂，對羥基苯甲酸甲酯、硫代硫酸鈉、檸檬酸鈉，肌苷，氫氧化鈉，右旋糖，和聚乙二醇(例如，PEG 200，PEG 2000等。)。
本發(fā)明同時還提供制備每種此文中所述乳液的方法。例如，本發(fā)明提供了一種制作水包油乳液的方法，包括乳化一種混合物，所述混合物含有一種油相、一種水性溶液，包括一種醇或甘油的第一組分，包括表面活性劑或含鹵化合物的第二組分。
本發(fā)明進一步的提供用以保護(例如，保護免受微生物污染)或凈化一片區(qū)域(例如，通過除去區(qū)域中微生物或降低微生物數(shù)量以凈化區(qū)域)的方法，包括將區(qū)域暴露于含水包油乳液(例如，任一文中所述的水包油乳液)的組合物中。該方法可用于任一類型的區(qū)域中。例如在一些實施方案中，該區(qū)域包括一種固體表面(例如，一種醫(yī)學裝置)、一種溶液、生物體的表面(例如，人類的外部或內(nèi)部部分)或一種食品。
本發(fā)明同時還給出了修改所述乳液的方法，包括提供乳液，向乳液加入或從中除去一組組分以制備一種修改乳液。在一些實施方案中，該方法進一步包括用生物學測試法測定修改乳液的方法(例如，抗微生物測試來判定乳液降低處置區(qū)域微生物數(shù)量的效果)。本發(fā)明同時還給出了商業(yè)使用修改乳液的方法。例如在一些實施方案中，該方法進一步含有售賣修改乳液廣告和/或售賣修改乳液的方法。
本發(fā)明同樣還提供了含傳輸系統(tǒng)的體系(例如，一種容器、分配器、包裝等等)，其含有所述任一含有水包油乳液。本發(fā)明進一步的包括一種將物料與任一所述水包油乳液相接觸的體系。本發(fā)明不限于物料與乳液相接觸的特性。例如，物料包括但不僅限于，醫(yī)學裝置、溶液、食品、洗滌產(chǎn)品、機油、霜劑和生物學材料(例如，人體組織)。


以下附圖是本說明書的一部分，用以進一步的闡明本發(fā)明的某些方面和實施方案。在一張或多張附圖與所述特定實施方案說明相結(jié)合作為參考時，人們能更好的理解本發(fā)明。
圖1描述了本發(fā)明乳液對蠟狀芽孢桿菌孢子的殺菌效果圖2A-圖2C描述了本發(fā)明乳液對蠟狀芽孢桿菌孢子殺菌效果的細菌涂片。
圖3描述了本發(fā)明乳液不同稀釋液對炭疽桿菌孢子的殺孢子活性。
圖4描述了本發(fā)明乳液和漂白劑在一段時間內(nèi)殺孢子活性的比較。
圖5描述了本發(fā)明乳液和漂白劑在一段時間內(nèi)殺孢子活性的比較。
圖6描述了在介質(zhì)中，本發(fā)明乳液的不同稀釋液對不同炭疽桿菌孢子的殺孢子活性。
圖7描述了本發(fā)明乳液對由Del Rio，TX得到的炭疽桿菌的殺孢子活性的時間過程。
圖8記錄了大腸桿菌的電子顯微圖(10,000X)。
圖9記錄了經(jīng)BCTP處置的大腸桿菌的電子顯微圖(10,000X)。
圖10記錄了經(jīng)W808P處置的大腸桿菌的電子顯微圖(10,000X)。
圖11記錄霍亂弧菌的電子顯微圖(25,000X)。
圖12記錄了經(jīng)W808P處置的霍亂弧菌的電子顯微圖(25,000X)。
圖13記錄了經(jīng)BCTP處置的霍亂弧菌的電子顯微圖(25,000X)。
圖14記錄了用X8W60PC處理的霍亂孤菌的電子顯微圖(25,000X)。
圖15描述了BCTP、W808P和X8W60PC對A型流感病毒活性的影響。
圖16描述BCTP對四種不同桿菌菌種的殺孢子活性與X8W60PC對兩種桿菌菌種殺孢子活性的比較。BCTP顯示在對蠟狀芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌的孢子處置4小時后具有顯著的殺孢子活性，但對枯草芽孢桿菌孢子沒有顯著效果。X8W60PC在4小時內(nèi)能有效的殺滅蠟狀芽孢桿菌且對耐BCTP的枯草芽孢桿菌也具有殺孢子活性。
圖17描述納米乳液對蠟狀芽孢桿菌的殺孢子活性的時間過程。與BCTP1∶100稀釋液培養(yǎng)4小時后能殺滅95％的孢子。與X8W60PC1∶1000稀釋液僅需培養(yǎng)30分鐘即能殺滅95％。
圖18記錄了蠟狀芽孢桿菌孢子用BCTP處置前和處置后的電子顯微圖片。注意，在用BCTP處置之前皮層有均勻的密度和清晰明確的孢子膜。用BCTP處置孢子4小時后，孢子膜和皮層都破裂了，同時伴有核內(nèi)物質(zhì)的缺失。
圖19描述了BCTP 1∶100稀釋液殺孢子活性中的萌發(fā)抑制和激動的影響。BCTP殺孢子活性在10mM D-丙氨酸(萌發(fā)抑制劑)存在下發(fā)生延遲，在50μM L-丙氨酸和50μM肌苷(萌發(fā)激動劑)存在下得到加速。
圖20A-圖20F記錄了皮下注射不同的BCTP和蠟狀芽孢桿菌孢子結(jié)合劑的動物的整體和組織學照片。圖20A和圖20B描述了單獨注射1∶10稀釋的BCTP的動物情況。圖片中沒有整體的組織損傷，組織學觀察也沒有炎癥狀況。圖20C和圖20D描述了單獨皮下注射4×107蠟狀芽孢桿菌孢子的動物情況。圖中有平均1.68cm2的大面積的壞死。該區(qū)域的組織學顯示皮膚和真皮包括皮下脂肪和肌肉組織基本壞死。圖20E和圖20F記錄了將4×107桿菌孢子與BCTP納米乳液快速預(yù)混合到最終濃度為1∶10，再注射到小鼠的情況。這些動物顯示有較輕的皮膚病灶，平均面積約為0.02cm2(與未處置的孢子感染相比降低了大約98％的壞死面積)。圖20F中的組織學顯示有一些炎癥，然而大多數(shù)表皮膚和真皮中的細胞結(jié)構(gòu)保持完好。所有組織病理學情況以4倍放大。
圖21A-圖21F記錄了具有感染蠟狀芽孢桿菌孢子的試驗傷口的動物整體和組織學照片。圖21A和圖21B記錄被2.5×107蠟狀芽孢桿菌孢子感染但未處置的小鼠試驗性傷口情況。創(chuàng)傷的組織學檢測顯示了擴大化的壞死和明顯的炎癥。圖21C和圖21D記錄了小鼠傷口被2.5×107蠟狀芽孢桿菌孢子感染，并在1小時后用鹽水沖洗的情況。48小時后，傷口周圍的壞死區(qū)域的平均面積為4.86cm2。另外，該組中80％的動物由于感染而死亡。這些壞死的組織學表明皮膚和真皮全部壞死且其中含有大量的桿菌。圖21E和圖21F記錄了小鼠傷口被2.5×107蠟狀芽孢桿菌孢子感染，并在1小時后用1∶10稀釋的BCTP沖洗的情況。在傷口附近有小面積的壞死(0.06cm2)，與進行孢子和鹽水沖洗處置的動物相比，壞死面積降低了98％。另外，只有20％的動物由于傷口感染而死亡。這些傷口的組織學顯示沒有本發(fā)明不同乳液的一些特定的實施方案中描述的桿菌。
圖22描述了表面活性劑脂質(zhì)制劑對A型流感病毒傳染的抑制。圖22A表示的是BCTP、W808P、SS和NN；圖22B表示的是BCTP和SS。病毒與SLPs培養(yǎng)30分鐘，隨后稀釋覆蓋于細胞上。使用ELISA測試法測量對A型流感病毒傳染的抑制。每一數(shù)據(jù)點表示3項重復(fù)試驗中的平均值+/-一項標準差。
圖23描述了與TRITON X-100相比，BCTP作為一種抗-A型流感病毒試劑的效果。A型流感病毒用BCTP、磷酸正三丁酯/TRITON X-100/大豆油(TTO)、TRITON X-100/大豆油(TO)、及單獨用TRITON X-100(T)處置30分鐘。所有處置中使用的TRITON X-100濃度都是一樣的。A型流感病毒的抑制效果用細胞ELISA測定法測量。每一數(shù)據(jù)點表示3項重復(fù)試驗中的平均值+/-一項標準差。
圖24顯示BCTP不能影響腺病毒的傳染性。腺病毒載體(AD.RSVntlacZ)用三種稀釋度的BCTP處置30分鐘，隨后轉(zhuǎn)染至293細胞中。5天以后進行β-半乳糖甙酶測試。每一數(shù)據(jù)點表示8項重復(fù)試驗中的平均值+/-一項標準差。
圖25描述了A型流感病毒和腺病毒在電子顯微鏡下的結(jié)構(gòu)。病毒未經(jīng)處置或用1∶100稀釋的BCTP在室溫下培養(yǎng)15和60分鐘，再用如實施例中所述的電子顯微鏡顯影操作。圖25A描述未處置的A型流感病毒；圖25B描述與BCTP培養(yǎng)15分鐘的A型流感病毒；圖25C描述未處置的腺病毒；圖25D描述與BCTP培養(yǎng)60分鐘的腺病毒。所有的影像放大數(shù)＝200,000X。棒條為200nm。
圖26描述1％和10％BCTP的抗細菌性質(zhì)。殺菌效果(％殺滅)用以下公式計算 圖27描述了經(jīng)斑點數(shù)降低測定法測定的10％和1％BCTP的抗病毒性質(zhì)。
圖28描述本發(fā)明的乳液適用的示例性生物體。
圖29描述本發(fā)明乳液組合物的一些特定的實施方案及所述乳液的某些用途。
圖30描述本發(fā)明乳液組合物的一些特定的實施方案及所述乳液的某些用途。
圖31如圖記錄了不同的常用制劑和本發(fā)明某些實施方案的使用方法。圖31A顯示在本發(fā)明納米乳液10％、1％和0.10％不同稀釋液處置下大腸桿菌數(shù)量的對數(shù)下降情況。圖31B顯示在本發(fā)明納米乳液10％、1％和0.10％不同稀釋液處置下，枯草芽孢桿菌孢子數(shù)量的對數(shù)下降情況。圖31C顯示在本發(fā)明納米乳液10％、1％和0.10％不同稀釋液處置下，A型流感病毒(pfu/ml)數(shù)量的對數(shù)下降情況。
圖32s顯示在40℃下用含EDTA的本發(fā)明乳液處置的鼠傷寒桿菌數(shù)量的對數(shù)下降情況。
圖33顯示在50℃下用含EDTA的本發(fā)明乳液處置的鼠傷寒桿菌數(shù)量的對數(shù)下降情況。
圖34顯示與其非乳化成分相比，本發(fā)明乳液的溶菌效果。
圖35在室溫和37℃下本發(fā)明乳液處置的偶發(fā)分枝桿菌數(shù)量的對數(shù)下降情況。
圖36記錄了使用本發(fā)明乳液凈化一表面的數(shù)據(jù)。
定義為了便于理解本發(fā)明，現(xiàn)將諸多術(shù)語與短語定義如下本文中所用的術(shù)語”微生物”是指顯微可見的生物體和屬于藻類、細菌、真菌(包括地衣)、原生動物門、病毒和亞病毒劑類的分類上相關(guān)的肉眼可見的生物體。術(shù)語”微生物”包括本身致病和導致另一生物體(例如動物，包括人；和植物)患病的生物體，和，能產(chǎn)生導致另一生物體患病的物質(zhì)，但其本身并不直接致病或者直接感染其他生物體的生物體。本文中所用的術(shù)語”病原體”和其同義詞，是指一種生物體，其包括能導致另一種生物體(例如，動物和植物)患病的微生物，或，產(chǎn)生能使另一種生物體患病的物質(zhì)的微生物(例如，產(chǎn)生致病毒素的細菌等)。
本文中所用的術(shù)語”疾病”是指與屬種成員正常或者平均水平的偏離，其在對屬種中大多數(shù)個體無害的情況下但對受感染個體有害的情況(例如，腹瀉、惡心、發(fā)燒、疼痛和炎癥等)。與微生物和/或病原體相接觸可引起或?qū)е录膊　?br> 此處所使用的術(shù)語“宿主”或“目標物”，指用本發(fā)明的組合物進行處置的生物體。此類生物體包括易被一種或多種病原體侵害，或者可能是容易被其侵害的生物體。此類生物體還包括用于避免不希望的病原體侵害而對其進行處置的生物體。生物體包括但不僅限于動物(例如，人、馴養(yǎng)動物、野生動物)和植物。
本文中所用的術(shù)語“滅活”及其同義詞，意為具有消滅、去除或者降低病原體對宿主的感染和/或在宿主中引起病理學反應(yīng)的能力。
本文中所用的術(shù)語“導致融合的”意指一種能與微生物物質(zhì)(例如，細菌或細菌孢子)的膜相融合的乳狀液。特定的導致融合的乳狀液的例子包括但不僅限于，在美國專利號5,618,840；5,547,677和5,549,901中記載的W808P以及在美國專利號5,700,679記載的NP9，每一文獻在此整體共同引入作為參考。NP9是一種支鏈聚(氧-1，2 ethaneolyl)，α-(4-nonyl phenal)-ω-羥基-表面活性劑。不限于如下所述，NP9和其他的可用于本發(fā)明的表面活性劑記載在美國專利5,662,957的表1中，在此其整體合并作為參考。
本文中所用的術(shù)語“生成溶素的”指一種具有分裂微生物物質(zhì)(例如，細菌或細菌孢子)的膜的能力的乳狀液。一種示例性的生成溶素的組合物是BCTP。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，一種生成溶素試劑和一種導致融合的試劑同時存在于同一組合物中，將產(chǎn)生比兩者單獨使用更強的滅活效果。使用了此種改良抗菌組合物的方法和組合物將在此詳細敘述。
在此使用的術(shù)語“乳液”，包括水包油分散體或者小滴，以及其它的脂性結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)能夠形成一種所需的疏水力量，當不可與水混合的油相與水相混合時，其能從水中除去極性殘留物(例如，碳氫化合物長鏈)及除去朝向水的極性端基。上述其它的脂性結(jié)構(gòu)包括但不僅限于，單室脂質(zhì)體、極少室脂質(zhì)體(paucilamellar)和多室脂質(zhì)體、膠團和層狀相。類似的，此處使用的術(shù)語“納米乳液”是指含有微小脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的水包油分散體。例如在優(yōu)選的實施方案中，該納米乳液含有其小滴的平均粒度約為0.5-5微米的油相。此處經(jīng)常使用的術(shù)語“乳液”和“納米乳液”，使用中可互相交換，是指本發(fā)明的納米乳液。
本文中所用的術(shù)語“相接觸”和“暴露”是指將一種或多種本發(fā)明的組合物與病原體或可抵抗病原體的樣本相接觸，以使本發(fā)明的組合物可以滅活微生物或者致病性物質(zhì)，如有可能(if present)。本發(fā)明注重于將公開的組合物以足夠體積和/或濃度的量與病原體或微生物相接觸以滅活病原體或微生物。
術(shù)語“表面活性劑”是指任一下述分子，其具有一極性端基，可以極其適于用水溶解；還具有一疏水性尾部，不能很好的溶于水。術(shù)語“陽離子表面活性劑”是指具有陽離子端基的表面活性劑。術(shù)語“陰離子表面活性劑”是指具有陰離子端基的表面活性劑。
術(shù)語“親水-親脂平衡系數(shù)”及“HLB系數(shù)”指將表面活性劑分子化學結(jié)構(gòu)與其表面活性相結(jié)合關(guān)聯(lián)的一種指標。HLB系數(shù)可以使用一系列經(jīng)驗公式進行計算，該公式如Meyers所描述(Meyers，表面活性劑科學和技術(shù)，VCH出版公司，紐約，231-245頁 )，在此引入作為參考。如此處所使用的，表面活性劑的HLB系數(shù)是記載在McCutcheon’s卷1乳化劑和洗滌劑，北美出版社，1996(在此引入作為參考)中分配給表面活性劑的HIB系數(shù)。HLB系數(shù)從0至約70或著，商用表面活性劑中更高。具有高水溶性和增溶特性的親水性表面活性劑可達到該范圍的較高端值；而具有低水溶性，又是一種優(yōu)良的油中水加溶劑的表面活性劑則在該范圍值的較低端。
本文中所用的術(shù)語“萌發(fā)增強子”描述化合物作用于增強某種菌株(例如，L-氨基酸[L-丙氨酸]，CaCl2，肌苷等)的萌發(fā)。
本文中所用的術(shù)語“相互作用增強劑”描述化合物作用于增強乳液與細菌(例如，革蘭氏陰性菌)細胞壁的相互作用。我們所注重的相互作用增強劑，包括但不僅限于螯合劑(例如，乙二胺四乙酸[EDTA]，亞乙基雙(氧化乙烯次氮基)四乙酸[EGTA]，等等)和某種生物學試劑(例如，牛血清蛋白[BSA]等等)。
術(shù)語“緩沖劑”指在向溶液加入時，能使溶液抵制pH值改變的物質(zhì)。
術(shù)語“還原劑”和“電子供體”指能向第二物質(zhì)貢獻電子以降低一種或多種第二物質(zhì)的原子的氧化狀態(tài)的物質(zhì)。
術(shù)語“一價鹽”是指其金屬(例如，Na，K，或Li)在溶液中具有凈1+電荷(即質(zhì)子比電子多一個)的任一鹽。
術(shù)語“二價鹽”是指其金屬(例如，Mg，Ca，或Sr)在溶液中具有凈2+電荷的任一鹽。
術(shù)語“螯合劑”指物質(zhì)中具有一個以上的原子各擁有一對可用于結(jié)合金屬離子的孤電子對的任一的物質(zhì)。
術(shù)語“溶液”是指一種水性的或非水的混合物。
本文中所用的術(shù)語“治療劑”是指能降低被致病微生物所感染的宿主感染、發(fā)病、或死亡的發(fā)生率或者防止被致病微生物所感染的宿主感染、發(fā)病或者死亡的發(fā)生率的組合物。這些治療劑可附加地含有藥學可接受的化合物(例如，輔料、賦型劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑等等)。在一些實施方案中，本發(fā)明所述之治療劑可以局部乳液、可注射組合物、可食用溶液的形式給藥等等。當采用局部途徑給藥時，其制劑形式可以是，例如乳液、軟膏、油膏或者噴霧劑。
此處使用的術(shù)語“藥物可接受的”或者“藥理學可接受的”，指當向宿主(例如，動物或人)給藥時，基本上不引起不良的過敏反應(yīng)或免疫學反應(yīng)的組合物。此外，在某些實施方案中，本發(fā)明的組合物可制成園藝和農(nóng)用的形式，包括浸劑、噴霧劑、種子包裹物、莖桿注射劑、莖桿噴霧劑和霧劑。“藥物可接受的載體”包括任意及所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣劑、濕潤劑(例如，十二烷基硫酸鈉)，等滲體和吸收延滯劑、崩解劑(例如，馬鈴薯淀粉或甘醇酸淀粉鈉)等等。
本文中所用的術(shù)語“局部”是指將本發(fā)明的組合物應(yīng)用于皮膚表面和粘膜細胞及組織(例如，牙槽、頰腔、舌部、咀嚼部位或鼻粘膜和其他的具有中空結(jié)構(gòu)的器官和體腔的組織和細胞)。
本文中所用的術(shù)語“局部活性劑”是指可在宿主的應(yīng)用(接觸)部位產(chǎn)生藥理學反應(yīng)的本發(fā)明組合物。
本文中廣泛使用的術(shù)語“系統(tǒng)性活性藥物”意指一種物質(zhì)或組合物，其能在遠離給藥位點或者進入宿主產(chǎn)生藥理學反應(yīng)。
本文中所用的術(shù)語“醫(yī)學裝置”包括任一在治療(例如，用于疾病或者損傷的)期間用在病人身體上、病人身體內(nèi)或者經(jīng)過病人體內(nèi)的物料和設(shè)備。醫(yī)學裝置包括但不僅限于，醫(yī)學植入物、創(chuàng)傷護理裝置、藥物給藥裝置和體腔及個人保護裝置。醫(yī)學植入物包括但不僅限于，導尿管、血管導管、透析分流器、創(chuàng)傷引流管、皮膚縫合線、血管移植物、可植入網(wǎng)孔、眼內(nèi)裝置、心瓣膜等等。創(chuàng)傷護理裝置包括但不僅限于，常規(guī)創(chuàng)傷敷料、生物移植材料、帶狀止血劑(tape closures)和敷料，及外科切割用的布簾(surgical incise drapes)。藥物給藥裝置包括但不僅限于、針頭、給藥用的皮膚貼片、給藥用的粘膜貼片和醫(yī)用海面。體腔和個體保護裝置，包括但不僅限于，塞子、海面、外科和檢測用手套及牙刷。生育控制裝置包括但不僅限于，子宮內(nèi)置裝置(IUD)、隔膜和男用避孕套。
本文中所用的術(shù)語“提純”是指將污染物或者不期望存在的化合物從樣本或者組合物中除去。本文中所用的術(shù)語“基本提純”是指從樣本或者組合物中除去了大約70到90％，最多100％污染物或者不期望存在的化合物。
本文中所用術(shù)語“表面”應(yīng)理解為其廣義。一方面，該術(shù)語是指能與本發(fā)明組合物接觸的生物體或無生命物質(zhì)(例如，載體、營造物和食品處理裝置等)的最外部的邊界(例如，對于動物皮膚、毛發(fā)和毛皮等，對于植物葉子、莖桿、花朵部分和果實等)。另一方面，該術(shù)語同樣也指動物或者植物體內(nèi)通過一系列經(jīng)皮給藥途徑(例如，注射、攝取、透皮給藥、吸入等等)而與組合物相接觸的內(nèi)膜和內(nèi)表面(例如，對于動物消化道、脈管組織等等，對于植物脈管組織等)。
本文中所用的術(shù)語“樣本”取其廣義。一方面，其指一種動物細胞或者組織。另一方面，其包括任一來源的樣品或者培養(yǎng)物，例如生物學樣本和環(huán)境樣本。生物學樣本可以得自于植物或動物(包括人)，還包括流體、固體、組織和和氣體。環(huán)境樣本包括環(huán)境物料例如表面物質(zhì)、土壤、水和工業(yè)樣本。上述例子不能認為是用以限制本發(fā)明適用的樣本類型。
發(fā)明詳述本發(fā)明包括用于降低與一系列微生物和致病生物體有關(guān)的感染、發(fā)病率和死亡率的組合物和方法。本發(fā)明同樣涉及用于凈化被致病生物體繁殖或者感染的區(qū)域的方法和組合物。此外，本發(fā)明涉及用于降低食物中致病物質(zhì)感染能力的方法和組合物。在優(yōu)選的實施方案中，降低致病生物體的感染能力、發(fā)病率和死亡率是通過用水包油組合物接觸致病生物體實現(xiàn)的，該水包油組合物含有水相和油相，及至少一種其他化合物。本發(fā)明特定例證性的具體實施方案在下文有所描述。本發(fā)明不僅限于所述特定的實施方案。詳細的描述分成如下章節(jié)I)示例性組合物；II)示例性制備技術(shù)；III)特性及活性；Iv)使用方法和V)特定實施例。
I.示例性組合物在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的乳液含有(i)水相；(ii)油相；和至少一種附加化合物。在本發(fā)明的一些實施方案中，我們將所述附加化合物可混合于組合物的水相或油相中。在其它實施方案中，將所述附加化合物混合入之前油相和水相已經(jīng)乳化的組合物中。在某些實施方案中，將一種或多種附加化合物在使用之前迅速混合入現(xiàn)有的乳液組合物中。在其它實施方案中，將一種或多種附加化合物在組合物立即使用之前混合入現(xiàn)有的乳液組合物。
適用于本發(fā)明的組合物的附加化合物包括但不僅限于一種或多種有機的，更特別的，有機磷酸基的溶劑、表面活性劑和洗滌劑、陽離子含鹵化合物、萌發(fā)增強子、相互作用增強劑、食品添加劑(例如調(diào)味劑、甜味劑、膨化劑等等)和藥物可接受的化合物。特定的種種用于本發(fā)明組合物的化合物的示例性實施方案將在下文中敘述。
A.水相在某些優(yōu)選的實施方案中，乳液含有約5-60，優(yōu)選10-40，更優(yōu)選15-30％(體積)的水相，以乳液的總體積計。在優(yōu)選的實施方案中，水相含有水pH約為4-10，優(yōu)選約6-8.當本發(fā)明的乳液中含有一種萌發(fā)增強子時，pH優(yōu)選6-8.水優(yōu)選去離子水(下文指“DiH2O”)。在一些實施方案中，水相中含有磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)。在用于為消耗和接觸的所用的本發(fā)明的這些實施方案中，宿主、水相和在水相中的任一附加化合物可進一步地滅菌或者滅除熱原物質(zhì)。
B.油相和溶劑在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明乳液中的油相(例如，載體油)含有30-90，優(yōu)選60-80，和更優(yōu)選60-70％(體積)的油類，以乳液的總體積計。適宜的油類包括但不僅限于大豆油、鱷梨油、亞麻油、椰油、棉籽油、角鯊烯油、橄欖油、低芥酸菜籽油、玉米油、菜籽油、紅花油、葵花油、魚油、調(diào)味油、水不溶性維生素維生素及其混合物。在特別優(yōu)選的實施方案中，使用的是大豆油。附加的可用的油類包括機油機油、礦物油、和黃油。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，油相優(yōu)選分散于水相中，以平均粒度在約1-2微米之間，更優(yōu)選0.2-0.8，和首選約0.8微米的液滴形式存在。在其它實施方案中，水相可以分散在油相。
在一些實施方案中，油相含有3-15，優(yōu)選5-10％(體積)的有機溶劑，以乳液的總體積計。當本發(fā)明不限于任一特定的機理時，乳液中的有機磷酸基的溶劑應(yīng)主要用于去除或者破壞病原體膜的脂質(zhì)。因此，能去除微生物膜中的固醇或磷脂的任一溶劑在本發(fā)明的乳液中都是可用的。適宜的有機溶劑包括但不僅限于，有機磷酸酯基溶劑或醇類。在優(yōu)選的實施方案中，有機磷酸酯基的溶劑包括但不僅限于，以任何形式結(jié)合的磷酸二烷基酯、磷酸三烷基酯(例如，正磷酸三丁酯[TBP])。在某些實施方案中特別優(yōu)選的磷酸三酯包括正磷酸三丁酯，它是一種增塑劑。此外，在一優(yōu)選的實施方案中，磷酸二酯或者三酯中的每一烷基具有1到10或者更多的碳原子，更優(yōu)選2到8個碳原子。同樣，本發(fā)明的磷酸二酯或者三酯中的每一烷基可以是或者可以不是相同的。在某些實施方案中，可以使用不同磷酸烷基酯和磷酸三酯的混合物。在那些以一種或多種醇作為溶劑的實施方案中，所述溶劑包括但不僅限于，甲醇、乙醇、丙醇和辛醇。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，使用的是乙醇。在本發(fā)明的這些用于消耗或者接觸的實施方案中，宿主、油相和油相中任一附加化合物，可以進一步的滅菌或者除去熱原。
C.表面活性劑和洗滌劑在一些實施方案中，本發(fā)明的組合物還含有一種或多種表面活性劑或洗滌劑(例如，約3-15％，優(yōu)選約10％)。當本發(fā)明不限于任一特殊的機理時，我們注意到組合物中使用表面活性劑將有助于組合物的穩(wěn)定性。可用非離子(非-陰離子)和離子表面活性劑。另外，可從表面活性劑BRIJ族中尋找適用于本發(fā)明組合物的表面活性劑。表面活性劑可以水相或者或油相的形式存在。適宜于同乳液一起使用的表面活性劑包括一系列的陰離子和非離子表面活性劑，以及其他能促進水包油乳液成形的成乳化合物。一般來說，成乳化合物是相對親水的，成乳化合物的混合物可以用于使所需產(chǎn)品達到所需的性質(zhì)。在某些制劑中，非離子表面活性劑要優(yōu)于離子型乳化劑，因為其能在較廣的pH范圍內(nèi)基本相容且比離子型(例如，皂類)乳化劑能形成更為穩(wěn)定的乳液。由此，在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的組合物含有一種或多種非離子表面活性劑，例如聚山梨醇酯表面活性劑(例如，聚氧乙烯醚)，聚山梨醇酯洗滌劑，苯氧基聚乙氧基乙醇等等。本發(fā)明使用的聚山梨醇酯洗滌劑的例子包括但不僅限于，TWEEN 20、TWEEN 40、TWEEN 60、TWEEN 80等。
TWEEN 60(聚氧乙烯脫水山梨醇單硬脂酸酯)、及TWEEN 20、TWEEN40和TWEEN 80，含有的聚山梨醇酯，其作為乳化劑用于許多藥物組合物。在本發(fā)明的一些實施方案中，所述化合物可與輔料一同用作合并組分。表面活性劑TWEEN還顯示出對脂質(zhì)包膜的病毒具有殺傷病毒的效果(參見例如，Eriksson等，Blood Coagulation and Fibtinolysis5(增補版.3)S37-S44頁 )。
本發(fā)明可用的苯氧基聚乙氧基乙醇和其聚合物的的例子包括但不僅限于，TRITON(例如，X-100、X-301、X-165、X-102、X-200)，和TYLOXAPOL。TRITON X-100是一種很強的非離子洗滌劑和分散劑，其廣泛用于從生物結(jié)構(gòu)中提取脂質(zhì)和蛋白質(zhì)。其還具有殺病毒效果，適用于廣譜包膜病毒(參見例如，Maha和Igarashi，Southeast AsianJ.Trop.Med.Pub.Health 28718 ；和Portocala等，Virologie27261 )。由于其抗病毒活性，其被用于滅活新鮮冷凍的人血漿中的病毒(參見例如，Horowitz等，血液79826 )。
在特別優(yōu)選的實施方案中，可使用表面活性劑TRITON X-100(叔-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)和/或TYLOXAPOL。一些其他的實施方案，使用的是殺精子劑(例如，壬苯醇醚-9(Nonoxynol-9))。本發(fā)明的組合物可使用的附加表面活性劑和洗滌劑可從參考書中確定(例如，McCutheon’s第1卷乳液和洗滌劑-北美版，2000)。
在一些實施方案中，如圖28所示，含有表面活性劑和有機溶劑的組合物可用于滅活包膜病毒和革蘭氏陽性菌。
D.陽離子含鹵化合物在一些實施方案中，本發(fā)明的組合物還含有一種陽離子含鹵化合物(例如，約0.5 to 1.0％重量，或更多，以乳液的總重量為計)。在優(yōu)選的實施方案中，陽離子含鹵化合物優(yōu)選與油相預(yù)先混合；然而，應(yīng)當理解，陽離子含鹵化合物可以與乳液組合物相結(jié)合的形式存在于不同的制劑中。適宜的含鹵化合物可選自，例如含氯、氟和碘離子的化合物。在優(yōu)選的實施方案中，適宜的陽離子含鹵化合物包括但不僅限于，鹵化鯨蠟基吡啶鎓、鯨蠟基三甲基鹵化銨、鹵化鯨蠟基二甲基乙銨、鹵化鯨蠟基二甲基芐銨、鹵化鯨蠟基三丁基磷鎓、月桂基三甲基鹵化銨，或肉豆蔻基三甲基鹵化銨。再一些特定的實施方案中，適宜的陽離子含鹵化合物含有但不僅限于，氯化鯨蠟基吡啶鎓(CPC)、鯨蠟基三甲基氯化銨、鯨蠟基芐基二甲基氯化銨、溴化鯨蠟基吡啶鎓(CPB)、溴化鯨蠟基三甲銨(CTAB)、溴化鯨蠟基二甲乙銨、溴化鯨蠟基三丁基磷磷鎓、月桂基三甲基溴化銨、和肉豆蔻基三甲基溴化銨。在特別優(yōu)選的實施方案中，陽離子含鹵化合物是CPC，雖然本發(fā)明的組合物并不限于用特定的含有陽離子的化合物來制得。
在一些實施方案中，向本發(fā)明的組合物乳液加入1.0％重量或者更多的含陽離子化合物可獲得適用于滅活滅活包膜病毒、革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌的組合物。
E.萌發(fā)增強子在本發(fā)明的實施方案中，組合物還含有一種或多種萌發(fā)增強化合物(例如，約1mM-15mM，及更優(yōu)選約5mM-10mM)。在優(yōu)選的實施方案中，在制備乳液之前，萌發(fā)增強化合物先存在于水相中。
本發(fā)明強調(diào)，當萌發(fā)增強子加入到所述組合物中時，將增強組合物殺死孢子的能力。本發(fā)明進一步強調(diào)，所述萌發(fā)增強子在近中性pH(pH6-8之間，和優(yōu)選7)下啟動殺孢子能力。所述中性pH乳液可用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)稀釋得到，或者通過中性乳液的預(yù)制得到。組合物的殺孢子活力最優(yōu)先在孢子開始萌發(fā)時起效。
在特定的實施方案中，證實了本發(fā)明的乳液具有殺孢子能力。當本發(fā)明不限于任一特定機理時，我們相信乳液中導致融合的組分啟動了萌發(fā)過程，及，在向營養(yǎng)型的逆轉(zhuǎn)完成之前，乳液中導致溶解的組分溶化了新萌發(fā)的孢子。這些乳液中的組分一致的使得易于被乳液破壞瓦解。萌發(fā)增強子的加入進一步的促進本發(fā)明的乳液的抗-殺孢子活性，如，在殺孢子活性出現(xiàn)時，加速(萌發(fā)增強子)的加入。
細菌內(nèi)孢子和真菌孢子的萌發(fā)與代謝加快和對熱及化學反應(yīng)物的抵抗力降低有關(guān)。為了萌發(fā)，孢子必須感應(yīng)環(huán)境是否能夠足夠的支持其增值和復(fù)制。氨基酸L-丙氨酸能刺激孢子的萌發(fā)(參見，如，Hills，J.Gen.Micro.438 ；及Halvorson和Church，Bacteriol.Rev.21112 )。L-丙氨酸和L-脯氨酸據(jù)報道能啟動孢子的萌發(fā)(Yanagita，Arch Mikrobiol 26329 )。簡單的α-氨基酸，例如甘氨酸和L-丙氨酸，處于代謝的重要地位。α-氨基酸的氨基轉(zhuǎn)換作用或脫氨基作用產(chǎn)生了糖原或者酮原碳水化合物及代謝和生長所需的氮。例如，L-丙氨酸的氨基轉(zhuǎn)換作用或脫氨基作用產(chǎn)生了糖酵解代謝(Embden-Meyerhof-Pamas循環(huán))最終的產(chǎn)物--丙酮酸酯。丙酮酸酯脫氫酶復(fù)合物導引起的丙酮酸酯氧化反應(yīng)產(chǎn)生了乙酰輔酶A、NADH、H+、和CO2.乙酰輔酶A是三羧酸循環(huán)(Kreb’s循環(huán))的啟動物質(zhì)，該循環(huán)依次供應(yīng)著線粒體的電子輸送鏈。乙酰輔酶A是合成脂肪酸和合成固醇所需碳的最根本來源。簡單α-氨基酸能提供氮、CO2、萌發(fā)及隨后的代謝活動所需的糖原和/或酮原等價物。
在某些實施方案中，本發(fā)明適宜的萌發(fā)增強劑包括但不僅限于，α-氨基酸，包括甘氨酸和丙氨酸左旋對映體、纈氨酸、白氨酸、異白氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸及其烷基酯。氨基酸對于萌發(fā)過程的其他的資料可參見美國專利號5,510,104，此處以其整體形式合并作為參考。在一些實施方案中，也可使用葡萄糖、果糖、天冬酰胺、氯化鈉(NaCl)、氯化銨(NH4Cl)、氯化鈣(CaCl2)和氯化鉀(KCI)的混合物。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方案中，制劑中含有萌發(fā)增強子L-丙氨酸、CaCI2、肌苷和NH4Cl。在一些實施例中，組合物中還含有一種或多種以普通形式存在的生長介質(zhì)，其自身附加含有或者不含有萌發(fā)增強子和緩沖劑(例如，胰胨豆胨培養(yǎng)液，等等)。
上述化合物僅是示例性的萌發(fā)增強子，應(yīng)當理解，其他已知的萌發(fā)增強子也可用于本發(fā)明的組合物。本發(fā)明的組合物中可用的萌發(fā)增強子必須符合兩項標準其必須能與本發(fā)明的乳液相混合，及，當其與本發(fā)明的乳液混合時能加速靶孢子的萌發(fā)速度。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過如下方式判斷一種特定試劑是否具有可以作為萌發(fā)增強子的功能將該試劑與本發(fā)明組合物相結(jié)合作用于靶物質(zhì)，及將所得的滅活效果與不使用該試劑時，將本發(fā)明的組合物的混合體施用于靶物質(zhì)時引起的滅活效果相比較。任一一種能加速萌發(fā)，且因此降低或者抑制生物體生長的試劑可以認為是適用于本發(fā)明的增強子。
在其它實施方案中，向中性乳液組合物中加入萌發(fā)增強子(或，生長介質(zhì))產(chǎn)生了一種除能對付包膜病毒，革蘭氏陰性菌、和革蘭氏陽性菌之外還能對付細菌孢子的組合物。
F.相互作用增強劑在其它實施方案中，本發(fā)明的組合物含有一種或多種能增強組合物與靶病原體(例如，革蘭氏陰性菌、如弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌和假單胞菌的細胞壁)相互作用的化合物(即，“相互作用增強劑”)。在優(yōu)選的實施方案中，相互作用增強劑優(yōu)選與油相相混合；然而，在其他的實施方案中，相互作用增強劑在乳化作用之后以與組合物相結(jié)合的形式施用。在某些優(yōu)選的實施方案中，相互作用增強劑是一種螯合劑(例如，存在于緩沖劑[例如，tris緩沖劑]中的乙二胺四乙酸[EDTA]或亞乙基雙(氧化乙烯次氮基)四乙酸[EGTA])。應(yīng)當理解螯合劑僅是示例性的相互作用增強化合物。事實上，其他能加強本發(fā)明的組合物與微生物和/或病原體相互作用的化合物也可以使用。在特別優(yōu)選的實施方案中，相互作用增強劑的濃度約為50至約250M。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過如下方法判斷一種特定的試劑是否具有作為相互作用增強劑使用的功能將該試劑和本發(fā)明的組合物結(jié)合施用于一靶物質(zhì)，及將靶物質(zhì)的滅活情況與在不含該試劑時，向靶物質(zhì)施用本發(fā)明組合物時的情況相比較。與不含該物質(zhì)時的情況參數(shù)相比較，任一一種能增強相互作用及因此降低或抑制細菌生長的試劑可以作為相互作用增強劑使用。
在一些實施方案中，向本發(fā)明的組合物中加入相互作用增強劑能產(chǎn)生出適用于處置包膜病毒、某些革蘭氏陽性菌和某些革蘭氏陰性菌的組合物。
II.示例性制劑如下所述，在章節(jié)A中，本發(fā)明描述了制備所述組合物的常用制劑的的示例性工藝。另外，在章節(jié)B中，本發(fā)明記載了一組特殊的，也是示例性的制劑(如下所述)。
A.制劑工藝本發(fā)明的滅活病原體的水包油乳液可使用標準乳液制備工藝進行制備。簡單的說，在相對較高的剪切力下攪拌混合物油相和水相(例如，使用高速的水力和機械力)以獲得一種含有油滴的水包油乳液，所含油滴的粒徑為大約0.5 to 5微米，優(yōu)選1-2微米。形成乳液的油相水相的混合體積基本上在約1∶9-5∶1范圍，優(yōu)選約5∶1-3∶1，首選4∶1，油相水相。油相和水相可用任一能產(chǎn)生足以形成乳液的剪切力的設(shè)備進行混合，例如French Presses或高速剪切混合器(如，經(jīng)FDA認證的高速剪切混合器，可從Admix，Inc，Manchester，NH購得)。生產(chǎn)所述乳液的方法可見于美國專利號5,103,497和4,895,452，中，此處共同引入作為參考。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法含中使用的組合物，其不連續(xù)的油相分散于連續(xù)的水相中(例如水)。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的組合物是穩(wěn)定的，且即使在長時間(例如，一年或幾年)的貯存后也不會分解。某些本發(fā)明的組合物即使被吞咽、吸入或者與宿主的皮膚相接觸，也不會產(chǎn)生毒性。這一點和某些具有刺激性的化學微生物殺滅劑有所不同。另外，在一些實施方案中，組合物對于植物同樣沒有毒性。
本發(fā)明的組合物可大量的生產(chǎn)且在較大溫度范圍下可穩(wěn)定數(shù)月。如果不稀釋，則它們具有半固體膏狀的性質(zhì)，可以用手涂抹局部或者用與水混合使用。若進行稀釋，則其具有粘性，且外觀與脫脂乳液相似，可以噴在已除污的表面上或者在吸入前能潛在的與霧化的孢子發(fā)生相互作用。這些性質(zhì)使得其具有廣譜抗微生物的用途。另外，這些特性還使得本發(fā)明的組合物尤其適用于凈化除污。
如上所述，至少部分乳液是液體結(jié)構(gòu)的形式，該結(jié)構(gòu)包括，但不限于，單室脂質(zhì)體、多室脂質(zhì)體和極少室脂質(zhì)體、膠團和層狀相。
在本發(fā)明的一些實施方案中，油相中含有乙醇。例如在一些實施方案中，本發(fā)明的乳液含有(i)水相；(ii)含有乙醇作為有機溶劑的油相且任意的，含有萌發(fā)增強子；(iii)作為表面活性劑的TYLOXAPOL(優(yōu)選2-5％，更優(yōu)選3％)。該制劑對微生物非常有效且對哺乳動物沒有刺激性和毒性(因此可與粘膜相接觸)。
在一些其它的實施方案中，本發(fā)明的乳液含有在第二乳液中被乳化的第一乳液，其中(a)第一乳液含有(i)水相；(ii)含油和有機溶劑的油相；(iii)表面活性劑；(b)第二乳液含有(i)水相；(ii)含有油類和含有陽離子的化合物的油相；(iii)表面活性劑。
B.示例性制劑以下的描述給出了一組示例性的乳液，其中包括用于BCTP和X8W60PC組合物的制劑。BCTP含有油包水的納米乳液，其中的油相源于大豆油、正磷酸三丁酯及在80％水中的TRITON X-100.含有相同體積的BCTP和W808P的混合物的X8W60PC。W808P是一種由甘油單硬脂酸酯、精煉大豆固醇(例如，GENEROL固醇)、TWEEN 60、大豆油、陽離子含鹵CPC和薄荷油制得的類脂質(zhì)體化合物。The GENEROL族物質(zhì)是一組聚乙氧基化的大豆固醇(亨克爾公司Ambler，賓夕法尼亞)。一些本發(fā)明實施方案中的乳液制劑描述于表1中。這些特定的制劑也可以記載在美國專利號5,700,679(NN)；5,618,840；5,549,901(W808P)；和5,547,677中，此處合并作為整體參考。某些乳液制劑在圖29中有記載。此外，圖30依圖記載了本發(fā)明常用制劑及某些本發(fā)明實施方案的使用情況。
X8W60PC乳液的通過以下方法制備先單獨制備W808P乳液和BCTP乳液，然后將兩種乳液的混合物重新乳化制得一種新的乳液組合物，稱為X8W60PC。制備所述乳液的方法記載在美國專利號5,103,497和4,895,452(此處合并作為整體參考)。這些化合物具有廣譜的抗微生物活性，且能通過破壞細胞膜滅活無性繁殖的細菌。
表1

上述列出的組合物只是示例性的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過改變上述組分的量來獲得適用于本發(fā)明目標的納米乳液組合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解油相對水的比例以及對單個油類載體、表面活性劑CPC和有機磷酸鹽緩沖劑的比例，及對油類對每一組合物中組分的比例都可以是不同的。
盡管某些組合物，包括BCTP其水對油的比例為4∶1，我們應(yīng)當理解制備BCTP時可以使用更多或者更受的水相。例如，在一些實施方案中，水相對油相的比例是3、4、5、6、7、8、9、10或更多。這對于W808P制劑也是一樣的。
同樣的，正磷酸三丁酯TRITON X-100大豆油的比例也是可以改變的。
盡管表1列出了特定量的，用于制備W808P的聚山梨醇酯60、GENEROL 122、氯化鯨蠟基吡啶鎓和載體油類，這些都僅僅是示例性的。可以使用濃度與之不同的組分或者能得到相同效果但卻與之不同的組分制出具有W808P性質(zhì)的乳液。例如乳液的最初油相中可含有大約80-100g之間的甘油單油酸酯。在其它實施方案中，乳液的最初油相中可含有大約15至30g的聚山梨醇酯60.在另一個實施方案中，組合物的最初油相中可含有約20-30g之間的GENEROL固醇。
本發(fā)明乳液的某種實施方案的納米乳液在其殺生物活性中起一定的作用，而且也是乳液不含毒性的一個原因。例如BCTP中的活性組分，TRITON-X100在與11％BCTP等價的濃度時，顯示出微弱的抗生物活性。向洗滌劑和溶劑中加入油相能顯著的降低相同濃度的這些試劑對組織培養(yǎng)物的毒性。當不限于任何理論時，(對該機理的理解對于實踐本發(fā)明并不是必須的，且本發(fā)明不局限于任一特定機理)，該現(xiàn)象表明納米乳液能增強組分與病原體的相互作用，因此能促進病原體的滅活及降低單一組分的毒性。我們必須注意到，當所用的BCTP中所有的組分結(jié)合成一個組合物但是卻非納米乳液結(jié)構(gòu)時，該混合物的抗微生物活性不及納米乳液結(jié)構(gòu)的有效。
使用相似組合物的一組制劑的其他實施方案將在下文敘述。作為抗病材料使用的多種所述組合物的效果在圖31中所示。下述組合物使用了不同組分比例和其不同的混合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠領(lǐng)會以下描述的制劑示示例性的，且含有相同比例所述組分的其他的組合物也屬于本發(fā)明的范圍。
在本發(fā)明某些實施方案中，所公開的制劑中含有約3-8％(體積)的TYLOXAPOL，約8％(體積)的乙醇，約1％(體積)的氯化鯨蠟基吡啶鎓(CPC)，約60-70％(體積)的油類(例如，大豆油)，約15-25％(體積)的水相(例如，DiH2O或PBS)，在一些制劑中含有少于約1％(體積)的1N的NaOH。一些實施方案中含有PBS。在某些實施方案中加入1N的NaOH和/或PBS使得操作者能夠方便的控制制劑的pH值，如此使得pH范圍為約7.0至約9.0，更優(yōu)選為約7.1-8.5.例如，在本發(fā)明的一項實施方案中，含有約3％(體積)的TYLOXAPOL，約8％體積的乙醇，約1％(體積)的CPC，約64％(體積)的大豆油，和約24％(體積)的DiH2O(在此稱為Y3EC)。另一實施方案中含有約3.5％體積的TYLOXAPOL，約8％(體積)的乙醇，約1％(體積)的CPC，約64％(體積)的大豆油，和約23.5％(體積)的DiH2O(此處稱為Y3.5EC)。還有在另一實施方案中，含有約3％(體積)的TYLOXAPOL，約8％(體積)的乙醇，約1％(體積)的CPC，約0.067％(體積)1N的NaOH，如此該制劑的pH可以達到約7.1，及約64％(體積)的大豆油，約23.93％(體積)DiH2O(此處稱作Y3EC pH7.1)。還又的實施方案中含有約3％(體積)的TYLOXAPOL，約8％(體積)的乙醇，約1％(體積)CPC，約0.67％(體積)1N的NaOH，如此制劑的pH可達到約8.5，及約64％(體積)大豆油，約23.33％體積DiH2O(此處稱作Y3ECpH8.5)。另一相似的實施方案中含有約4％TYLOXAPOL，約8％(體積)乙醇，約1％CPC，及約64％(體積)大豆油，約23％(體積)DiH2O(此處稱作Y4EC)。在另一實施方案中，制劑含有約8％TYLOXAPOL，約8％乙醇，約1％(體積)CPC，及約64％(體積)大豆油，約19％(體積)DiH2O(此處稱作Y8EC)。一項進一步的實施方案中含有約8％(體積)TYLOXAPOL，約8％(體積)乙醇，約1％(體積)CPC，約64％(體積)大豆油，及約19％(體積)1x PBS(此處稱作Y8EC PBS)。
在本發(fā)明的一些實施方案中，新制劑含有約8％(體積)乙醇，和約1％(體積)CPC，和約64％(體積)的油類(例如，大豆油)，和約27％(體積)的水相(例如，DiH2O或PBS)(此處稱作EC)。
在本發(fā)明中，一些實施方案含有約8％(體積)十二磺(月桂基)基硫酸鈉(SDS)，約8％(體積)磷酸三丁酯(TBP)，和約64％(體積)的油類(例如，大豆油)，和約20％(體積)的水相(例如DiH2O或PBS)(此處稱作S8P)。
在本發(fā)明的某些實施方案中，新制劑含有約1-2％(體積)TRITONX-100，約1-2％(體積)TYLOXAPOL，約7-8％(體積)乙醇，約1％(體積)氯化鯨蠟基吡啶鎓(CPC)，約64-57.6％(體積)油類(例如，大豆油)和約23％(體積)的水相(例如，DiH2O或PBS)。另外，一些這樣的制劑還含有約5mM的L丙氨酸/肌苷，和約10mM氯化銨。一些此類制劑含有PBS。我們注意到，在一些實施方案中加入PBS，使得操作者能便利的控制制劑的pH值。例如本發(fā)明的一個實施方案中含有約2％(體積)TRITON X-100，約2％(體積)TYLOXAPOL，約8％(體積)的乙醇，約1％(體積)CPC，約64％(體積)的大豆油，和約23％(體積)的DiH2O水相。另一實施方案的制劑含有約1.8％(體積)TRITON X-100，約1.8％(體積)TYLOXAPOL，約7.2％(體積)乙醇，約0.9％(體積)CPC，約5mM L-丙氨酸/肌苷，和約10mM氯化銨，約57.6％(體積)大豆油，還有1xPBS(此處稱作90％X2Y2EC/GE)。
在本發(fā)明可替換的另一實施方案中，制劑含有約5％(體積)TWEEN80，約8％(體積)乙醇，約1％(體積)CPC，約64％(體積)的油類(例如，大豆油)，和約22％(體積)DiH2O(此處稱作W805EC)。
在本發(fā)明的另一實施方案中，制劑含有約5％(體積)TWEEN 20，約8％(體積)乙醇，約1％(體積)CPC，約64％(體積)的油類(例如，大豆油)，和約22％(體積)DiH2O(此處稱作W205EC)。
在本發(fā)明另一實施方案中，所述制劑含有約2-8％(體積)的TRITONX-100，約8％(體積)的乙醇，約1％(體積)CPC，約60-70％(體積)的油類(例如，大豆油或橄欖油)，和約15-25％(體積)水相(例如，DiH2O或PBS)。例如，本發(fā)明優(yōu)選制劑含有約2％(體積)TRITON X-100，約8％(體積)乙醇，約64％(體積)大豆油，和約26％(體積)DiH2O(此處稱作X2E)。在另一相似的實施方案中，所述制劑含有約3％(體積)TRITON X-100，約8％(體積)乙醇，約64％(體積)大豆油，和約25％(體積)DiH2O(此處稱作X3E)。在進一步的實施方案中，所述制劑含有約4％(體積)TRITONX-100，約8％(體積)乙醇，約64％(體積)大豆油，和約24％(體積)DiH2O(此處稱作X4E)。在另一實施方案中，所述制劑含有約5％(體積)TRITON X-100，約8％(體積)乙醇，約64％(體積)大豆油，和約23％(體積)DiH2O(此處稱作X5E)。本發(fā)明的另一實施方案中含有約6％(體積)TRITON X-100，約8％(體積)乙醇，約64％(體積)大豆油，和約22％(體積)DiH2O(此處稱作X6E)。本發(fā)明進一步的實施方案中，所述制劑含有約8％(體積)TRITON X-100，約8％(體積)乙醇，約64％(體積)大豆油，和約20％(體積)DiH2O(此處稱作X8E)。本發(fā)明進一步的實施方案中，所述制劑含有約8％(體積)TRITON X-100，約8％體積的乙醇，約64％(體積)的橄欖油，和約20％(體積)DiH2O(此處稱作X8E O)。在另一實施方案中，含有8％(體積)TRITON X-100，約8％(體積)乙醇，約1％(體積)CPC，約64％(體積)大豆油，和約19％(體積)DiH2O(此處稱作X8EC)。
在本發(fā)明另一可替代的實施方案中，所述制劑含有約1-2％(體積)的TRITON X-100，約1-2％(體積)TYLOXAPOL，約6-8％(體積)TBP，約0.5-1.0％(體積)CPC，約60-70％(體積)的油類(例如，大豆油)，和約1-35％(體積)的水相(例如，DiH2O或PBS)。另外，某些制劑還可含有約1-5％(體積)的胰胨豆胨培養(yǎng)液，約0.5-1.5％(體積)酵母提取物，約5mM L丙氨酸/肌苷，約10mM氯化銨，和約20-40％(體積)液態(tài)嬰兒制劑。在某些實施方案中含有液態(tài)嬰兒用制劑，該制劑含有一種酪蛋白水解產(chǎn)物(例如，Neutramigen或Progestimil等等)。在一些實施方案，新制劑還含有約0.1-1.0％(體積)的硫代硫酸鈉，和約0.1-1.0％(體積)的檸檬酸鈉。其他相似的實施方案中含有使用磷酸酯緩沖的鹽水(PBS)作為水相的堿性組分。例如一種實施方案中含有約2％(體積)的TRITON X-100，約2％(體積)的TYLOXAPOL，約8％(體積)TBP，約1％(體積)的CPC，約64％(體積)的大豆油，約23％(體積)的DiH2O(此處稱作X2Y2EC)。在其它實施方案中，新制劑含有約2％(體積)TRITONX-100，約2％(體積)TYLOXAPOL，約8％(體積)TBP，約1％(體積)CPC，約0.9％(體積)的硫代硫酸鈉，約0.1％(體積)的檸檬酸鈉，約64％(體積)的大豆油，和約22％(體積)的DiH2O(此處稱作X2Y2PC STS1)。在另一相似的實施方案中，所述制劑含有約1.7％(體積)TRITON X-100，約1.7％(體積)TYLOXAPOL，約6.8％(體積)TBP，約0.85％CPC，約29.2％NEUTRAMIGEN，約54.4％(體積)的大豆油，和約4.9％(體積)的DiH2O(此處稱作85％X2Y2PC/嬰兒用)。在本發(fā)明的另一實施方案中，所述制劑含有約1.8％(體積)TRITON X-100，約1.8％(體積)TYLOXAPOL，約7.2％(體積)TBP，約0.9％(體積)的CPC，約5mM L-丙氨酸/肌苷，約10mM氯化銨，約57.6％(體積)的大豆油，還有0.1x％(體積)PBS(此處稱作90％X2Y2 PC/GE)。在另一實施方案中，所述制劑含有約1.8％(體積)的TRITON X-100，約1.8％(體積)的TYLOXAPOL，約7.2％(體積)TBP，約0.9％(體積)CPC，和約3％(體積)胰胨豆胨培養(yǎng)液，約57.6％(體積)大豆油，和約27.7％(體積)的DiH2O(此處稱作90％X2Y2PC/TSB)。在本發(fā)明的另一實施方案中，所述制劑含有約1.8％(體積)TRITON X-100，約1.8％(體積)TYLOXAPOL，約7.2％(體積)TBP，約0.9％(體積)CPC，約1％(體積)酵母提取物，約57.6％(體積)大豆油，和約29.7％(體積)DiH2O(此處稱作90％X2Y2PC/YE)。
在本發(fā)明的一些實施方案中，所述新制劑含有約3％(體積)的TYLOXAPOL，約8％(體積)的TBP，和約1％(體積)的CPC，約60-70％(體積)的油類(例如，大豆油或橄欖油)，和約15-30％(體積)的水相(例如，DiH2O或PBS)。在本發(fā)明特定的一項實施方案中，所述新制劑含有約3％(體積)的TYLOXAPOL，約8％(體積)的TBP，和約1％(體積)的CPC，約64％(體積)的大豆油，和約24％(體積)的DiH2O(此處稱作Y3PC)。
在本發(fā)明的一些實施方案中，所述新制劑含有約4-8％(體積)的TRITON X-100，約5-8％(體積)的TBP，約30-70％(體積)的油類(例如，大豆油或橄欖油)，和約0-30％(體積)的水相(例如，DiH2O或PBS)。另外，某些實施方案還含有約1％(體積)的CPC，約1％(體積)芐烷氯銨，約1％(體積)溴化鯨蠟基吡啶鎓，約1％(體積)溴化鯨蠟基二甲基乙銨，500μM EDTA，約10mM氯化銨，約5mM肌苷，和約5mM L-丙氨酸。例如，在某些實施方案中，所述新制劑含有約8％(體積)的TRITONX-100，約8％(體積)的TBP，約64％(體積)的大豆油，和約20％(體積)的DiH2O(此處稱作X8P)。在本發(fā)明的另一實施方案中，所述新制劑含有約8％(體積)的TRITON X-100，約8％(體積)的TBP，約1％的CPC，約64％(體積)的大豆油，和約19％(體積)的DiH2O(此處稱作X8PC)。在另一實施方案中，所述制劑含有約8％(體積)的TRITON X-100，約8％(體積)的TBP，約1％(體積)的CPC，約50％(體積)的大豆油，和約33％(體積)的DiH2O(此處稱作ATB-X1001)。在另一個實施方案中，所述制劑含有約8％(體積)的TRITON X-100，約8％(體積)的TBP，約2％(體積)的CPC，約50％(體積)的大豆油，和約32％(體積)的DiH2O(此處稱作ATB-X002)。在本發(fā)明的另一個實施方案中含有約4％(體積)TRITONX-100，約4％(體積)的TBP，約0.5％(體積)的CPC，約32％(體積)的大豆油，和約59.5％(體積)的DiH2O(此處稱作50％X8PC)。在另一相關(guān)的實施方案中含有約8％(體積)的TRITON X-100，約8體積％的TBP，約0.5％(體積)CPC，約64％(體積)的大豆油，和約19.5％(體積)的DiH2O(此處稱作X8PCI1/2)。在本發(fā)明的一些實施方案中，所述新制劑含有約8體積％的TRITON X-100，約8％(體積)的TBP，約2％(體積)的CPC，約64％(體積)的大豆油，和約18％(體積)的DiH2O(此處稱作X8PC2)。在其它實施方案中，所述新制劑含有約8％(體積)的TRITON X-100，約8％的TBP，約1％芐烷氯銨，約50％(體積)的大豆油，和約33％(體積)的DiH2O(此處稱作X8P BC)。在本發(fā)明一項可選擇的實施方案中，所述制劑含有約8％(體積)的TRITON X-100，約8％(體積)的TBP，約1％(體積)溴化鯨蠟基吡啶鎓，約50％(體積)的大豆油，和約33％(體積)的DiH2O(此處稱作X8P CPB)。在本發(fā)明另一項示例性的實施方案中，所述制劑含有約8％(體積)的TRITON X-100，約8％(體積)的TBP，約1％(體積)的溴化鯨蠟基二甲基乙銨，約50％(體積)的大豆油，和約33％(體積)的DiH2O(此處稱作X8P CTAB)。在進一步的實施方案中，本發(fā)明含有約8％(體積)的TRITON X-100，約8％(體積)的TBP，約1％(體積)的CPC，約500μM的EDTA，約64％(體積)的大豆油，和約15.8％(體積)DiH2O(此處稱作X8PC EDTA)。在其他相似的實施方案中含有8％(體積)的TRITONX-100，約8％(體積)的TBP，約1％(體積)的CPC，約10mM氯化銨，約5mM肌苷，約5mM L-丙氨酸，約64％(體積)的大豆油，和約19％(體積)的DiH2O或PBS(此處稱作X8PC GE1x)。在本發(fā)明的另一實施方案中，所述新制劑還含有約5％(體積)的TRITON X-100，約5％的TBP，約1％(體積)的CPC，約40％(體積)的大豆油，和約49％(體積)的DiH2O(此處稱作X5P5C)。
在本發(fā)明的一些實施方案中，所述新制劑含有約2％(體積)TRITONX-100，約6％(體積)的TYLOXAPOL，約8％(體積)乙醇，約64％(體積)的大豆油，和約20％(體積)的DiH2O(此處稱作X2Y6E)。
本發(fā)明另一其他實施方案中，所述制劑含有約8％(體積)的TRITONX-100，和約8％(體積)的甘油，約60-70％(體積)的油類(例如，大豆油或橄欖油)，和約15-25％(體積)的水相(例如，DiH2O或PBS)。某些相關(guān)的實施方案中還含有約1％(體積)L-抗壞血酸。例如某項特定的實施方案中含有約8％(體積)的TRITON X-100，約8％(體積)的甘油，約64％(體積)的大豆油，和約20％(體積)的DiH2O(此處稱作X8G)。在另一實施方案中，所述新制劑含有約8％(體積)的TRITON X-100，約8％(體積)的甘油，約1％(體積)的L-抗壞血酸，約64％(體積)的大豆油，和約19％(體積)的DiH2O(此處稱作X8GVc)。
在進一步的實施方案中，所述新制劑含有約8％(體積)的TRITONX-100，約0.5-0.8％(體積)的TWEEN 60，約0.5-2.0％(體積)的CPC，約8％(體積)的TBP，約60-70％(體積)的油類(例如，大豆油或橄欖油)，和約15-25％(體積)的水相(例如，DiH2O或PBS)。例如在某項特定的實施方案中的所述制劑含有約8％(體積)的TRITON X-100，約0.70％(體積)的TWEEN 60，約1％(體積)的CPC，約8％(體積)的TBP，約64％(體積)大豆油，約18.3％(體積)的DiH2O(此處稱作X8W60PC1)。另一項相關(guān)的實施方案含有約8％(體積)的TRITON X-100，約0.71％(體積)的TWEEN 60，約1％(體積)的CPC，約8％(體積)的TBP，約64％(體積)的大豆油，和約18.29％(體積)的DiH2O(此處稱作W600.7X8PC)。在另一實施方案中，所述新制劑含有約8％(體積)的TRITON X-100，約0.7％(體積)TWEEN 60，約0.5％(體積)的CPC，約8％(體積)的TBP，約64-70％(體積)的大豆油，和約18.8％(體積)的DiH2O(此處稱作X8W60PC2)。在另一實施方案中，本發(fā)明含有約8％(體積)的TRITON X-100，約0.71％(體積)的TWEEN 60，約2％(體積)的CPC，約8％(體積)的TBP，約64％(體積)的大豆油，和約17.3％(體積)的DiH2O。在本發(fā)明的另一實施方案中，所述制劑含有約0.71％(體積)的TWEEN 60，約1％(體積)的CPC，約8％(體積)的TBP，約64％(體積)的大豆油，和約25.29％(體積)的DiH2O(此處稱作W600.7PC)。
在本發(fā)明的另一實施方案中，所述新制劑含有約2％(體積)磺基琥珀酸二辛酯，約8％(體積)的甘油，或約8％(體積)TBP，此外含有約60-70％(體積)的油類(例如，大豆油或橄欖油)，和約20-30％(體積)的水相(例如，DiH2O或PBS)。例如在本發(fā)明的一項實施方案中，含有約2％(體積)磺基琥珀酸二辛酯，約8％(體積)的甘油，約64％(體積)的大豆油，和約26％(體積)的DiH2O(此處稱作D2G)。在另一相關(guān)的實施方案中，所述新制劑含有約2％(體積)的磺基琥珀酸二辛酯，和約8％(體積)的TBP，約64％(體積)的大豆油，和約26％(體積)的DiH2O(此處稱作D2P)。
在本發(fā)明的另一實施方案中，所述新制劑含有約8-10％(體積)的甘油，和約1-10％(體積)的CPC，約50-70％(體積)的油類(例如，大豆油或橄欖油)，和約15-30％(體積)的水相(例如，DiH2O或PBS)。另外，在某些實施方案中，組合物中還含有約1％(體積)的L-抗壞血酸。例如某項特定的實施方案中含有約8％(體積)的甘油，約1％(體積)的CPC，約64％(體積)的大豆油，和約27％(體積)的DiH2O(此處稱作GC)。其他相關(guān)的實施方案含有約10％(體積)的甘油，約10％(體積)的CPC，約60％(體積)的大豆油，和約20％(體積)的DiH2O(此處稱作GC10)。在本發(fā)明的另一實施方案中，所述新制劑含有約10％(體積)的甘油，約1％(體積)的CPC，約1％(體積)的L-抗壞血酸，約64％(體積)的大豆油，和約24％(體積)的DiH2O(此處稱作GCVc)。
在本發(fā)明的一些實施方案中，所述新制劑含有約8-10％(體積)的甘油，約8-10％(體積)的SDS，約50-70％(體積)的油類(例如，大豆油或橄欖油)，和約15-30％(體積)的水相(例如，DiH2O或PBS)。另外，在某些實施方案中，組合物還含有約1％(體積)卵磷脂，和約1％(體積)的對-羥基苯甲酸甲酯。所示制劑的示例性的實施方案制劑含有約8％(體積)SDS，8％(體積)的甘油，約64％(體積)的大豆油，和約20％(體積)的DiH2O(此處稱作S8G)。一種相關(guān)的制劑含有約8％(體積)的甘油，約8％(體積)SDS，約1體積％的卵磷脂，約1％(體積)的對-羥基苯甲酸甲酯，約64％(體積)的大豆油，和約18％(體積)的DiH2O(此處稱作S8GL1B1)。
在本發(fā)明的另一實施方案中，所述新制劑含有約4％(體積)的TWEEN 80，約4％(體積)的TYLOXAPOL，約1％(體積)的CPC，約8％(體積)的乙醇，約64％(體積)的大豆油，和約19％(體積)的DiH2O(此處稱作W804Y4EC)。
在本發(fā)明的一些實施方案中，所述新制劑含有約0.01％(體積)的CPC，約0.08％(體積)的TYLOXAPOL，約10％(體積)的乙醇，約70％(體積)的大豆油，和約19.91％(體積)的DiH2O(此處稱為Y.08EC.01)。
在本發(fā)明的另一實施方案中，所述新制劑含有約8％(體積)的十二烷基硫酸鈉，和約8％(體積)的甘油，約64％(體積)的大豆油，和約20％(體積)的DiH2O(此處稱作SLS8G)。
C.其它制劑上述特定的制劑僅是簡單的作為實施例來說明本發(fā)明適用組合物的其他形式。本發(fā)明意在表明本發(fā)明方法中所述制劑的形式以及其它納米乳液的多種形式。判斷一種乳液是否適宜本發(fā)明，必須分析三項標準。按照此處所述的方法和標準，經(jīng)過簡單的測試就能判斷選用的乳液是否適用。首先，采用所述方法制備備選組分的乳液，判斷這些組分是否能形成一種乳液。如果不能形成乳液，則不能使用這些備選組分。例如，由4.5％硫代硫酸鈉，0.5％檸檬酸鈉，10％正丁醇，64％大豆油，和21％DiH2O組成的一種備選組合物，就不能形成乳液。
其次，備選乳液必須是穩(wěn)定的乳液。在足夠長的時段中仍能保持其穩(wěn)定性的乳液是允許使用的。例如，用于貯存或者運輸?shù)娜橐罕仨毮茉跀?shù)月至數(shù)年內(nèi)保持乳液的形式。一般的乳液相對不穩(wěn)定些，在一天內(nèi)就解體了。例如一種由8％1-丁醇，5％Tween 10，1％CPC，64％大豆油，和22％DiH2O組成的備選組合物就不能形成穩(wěn)定的乳液。以下備選乳液使用所述方法測定的結(jié)果都是穩(wěn)定的0.08％Triton X-100，0.08％甘油，0.01％氯化鯨蠟基吡啶鎓，99％黃油，和0.83％diH2O(此處稱作1％X8GC黃油)；0.8％Triton X-100，0.8％甘油，0.1％氯化鯨蠟基吡啶鎓，6.4％大豆油，1.9％diH2O，和90％黃油(此處稱作10％X8GC黃油)；2％W205EC，1％Natrosol 250L NF，和97％diH2O(此處稱作2％W205ECL凝膠)；1％氯化鯨蠟基吡啶鎓，5％Tween 20，8％乙醇，64％70粘性礦物油，和22％diH2O(此處稱作W205EC 70礦物油)；1％氯化鯨蠟基吡啶鎓，5％Tween 20，8％乙醇，64％350粘性礦物油，和22％diH2O(此處稱作W205EC 350礦物油)。
再次，備選乳液必須能用于本發(fā)明的目的。例如一種抗菌乳液必須能殺滅或者滅活細菌、這種效應(yīng)必須是能檢測到的。如此處所示，本發(fā)明的某種乳液具有對抗特定微生物，而非其他微生物的能力。使用所述方法，人們可以判斷一種特殊乳液用于對抗特定微生物的適用性。一般來說，此方法涉及在并列試驗中，伴隨適宜控制樣本(例如，一種負面的控制，例如水)將微生物置于乳液長達一段或多時段中，再判斷乳液是否殺滅或滅活微生物，及效果到達何種程度。例如，一種由1％氯化銨，5％Tween 20，8％乙醇，64％大豆油，和22％DiH2O組成的備選組合物，就不能成為有效的乳液。以下備選乳液采用所述方法測定是有效的5％Tween 20，5％氯化鯨蠟基吡啶鎓，10％甘油，60％大豆油，和20％diH2O(此處稱作W205GC5)；1％氯化鯨蠟基吡啶鎓，5％Tween 20，10％甘油，64％大豆油，和20％diH2O(此處稱作W205GC)；1％氯化鯨蠟基吡啶鎓，5％Tween 20，8％乙醇，64％橄欖油，和22％diH2O(此處稱作W205EC橄欖油)；1％氯化鯨蠟基吡啶鎓，5％Tween 20，8％乙醇，64％亞麻油，和22％diH2O(此處稱作W205EC亞麻油)；1％氯化鯨蠟基吡啶鎓，5％Tween20，8％乙醇，64％玉米油，和22％diH2O(此處稱作W205EC玉米油)；1％氯化鯨蠟基吡啶鎓，5％Tween 20，8％乙醇，64％椰油，和22％diH2O(此處稱作W205EC椰油)；1％氯化鯨蠟基吡啶鎓，5％Tween 20，8％乙醇，64％棉籽油，和22％diH2O(此處稱作W205EC棉籽油)；8％右旋糖，5％Tween10，1％氯化鯨蠟基吡啶鎓，64％大豆油，和22％diH2O(此處稱作W205C右旋糖)；8％PEG 200，5％Tween 10，1％氯化鯨蠟基吡啶鎓，64％大豆油，和22％diH2O(此處稱作W205C PEG 200)；8％甲醇，5％Tween 10，1％氯化鯨蠟基吡啶鎓，64％大豆油，和22％diH2O(此處稱作W205C甲醇)；8％PEG 1000，5％Tween 10，1％氯化鯨蠟基吡啶鎓，64％大豆油，和22％diH2O(此處稱作W205C PEG 1000)；2％W205EC，2％Natrosol 250H NF，和96％diH2O(此處稱作2％W205EC Natrosol 2，也稱為2％W205EC凝膠)；2％W205EC，1％Natrosol 250H NF，和97％diH2O(此處稱作2％W205ECNatrosol 1)；2％W205EC，3％Natrosol 250H NF，和95％diH2O(此處稱作2％W205EC Natrosol 3)；2％W205EC，0.5％Natrosol 250H NF，和97.5％diH2O(此處稱作2％W205EC Natrosol 0.5)；2％W205EC，2％MethocelA，和96％diH2O(此處稱作2％W205EC Methocel A)；2％W205EC，2％Methocel K，和96％diH2O(此處稱作2％W205EC Methocel K)；2％Natrosol，0.1％X8PC，0.1xPBS，5mM L-丙氨酸，5mM肌苷，10mM氯化銨，和diH2O(此處稱作0.1％X8PC/GE+2％Natrosol)；2％Natrosol，0.8％Triton X-100，0.8％磷酸三丁酯，6.4％大豆油，0.1％氯化鯨蠟基吡啶鎓，0.1xPBS，5mM L-丙氨酸，5mM肌苷，10mM氯化銨，和diH2O(此處稱作10％X8PC/GE+2％Natrosol)；1％氯化鯨蠟基吡啶鎓，5％Tween 20，8％乙醇，64％Lard，和22％diH2O(此處稱作W205ECLard)；1％氯化鯨蠟基吡啶鎓，5％Tween 20，8％乙醇，64％礦物油，和22％diH2O(此處稱作W205EC礦物油)；0.1％氯化鯨蠟基吡啶鎓，2％橙花叔醇，5％Tween 20，10％乙醇，64％大豆油，和18.9％diH2O(此處稱作W205EC0.1N)；0.1％氯化鯨蠟基吡啶鎓，2％金合歡醇，5％Tween 20，10％乙醇，64％大豆油，及18.9％dix20(此處稱作W205EC0.1F)；0.1％氯化鯨蠟基吡啶鎓，5％Tween 20，10％乙醇，64％大豆油，和20.9％diH2O(此處稱作W205EC0.1)；10％氯化鯨蠟基吡啶鎓，8％磷酸三丁酯，8％TritonX-100，54％大豆油，和20％diH2O(此處稱作X8PC10)；5％氯化鯨蠟基吡啶鎓，8％Triton X-100，8％磷酸三丁酯，59％大豆油，和20％diH2O(此處稱作X8PC5)；0.02％氯化鯨蠟基吡啶鎓，0.1％Tween 20，10％乙醇，70％大豆油，和19.88％diH2O(此處稱作W200.1EC0.02)；1％氯化鯨蠟基吡啶鎓，5％Tween 20，8％甘油，64％Mobil 1，和22％diH2O(此處稱作W205GCMobil 1)；7.2％Triton X-100，7.2％磷酸三丁酯，0.9％氯化鯨蠟基吡啶鎓，57.6％大豆油，0.1x PBS，5mM L-丙氨酸，5mM肌苷，10mM氯化銨，和25.87％diH2O(此處稱作90％X8PC/GE)；7.2％Triton X-100，7.2％磷酸三丁酯，0.9％氯化鯨蠟基吡啶鎓，57.6％大豆油，1％EDTA，5mML-丙氨酸，5mM肌苷，10mM氯化銨，0.1x PBS，和diH2O(此處稱作90％X8PC/GE EDTA)；和7.2％Triton X-100，7.2％磷酸三丁酯，0.9％氯化鯨蠟基吡啶鎓，57.6％大豆油，1％硫代硫酸鈉，5mM L-丙氨酸，5mM肌苷，10mM氯化銨，0.1x PBS，和diH2O(此處稱作90％X8PC/GESTS)。
III.性質(zhì)及活性本發(fā)明的特定組合物具有有益的活性和性質(zhì)。示例性的有益活性和特性在下文中詳述A)殺滅微生物及抗微生物活性；B)殺孢子及抗孢子活性；C)殺病毒及抗病毒活性；D)殺真菌及抗真菌活性；和E)體內(nèi)活性。另外，圖31A-C顯示了本發(fā)明某種示例性制劑的特性。
A.殺微生物及抗微生物活性本發(fā)明的方法可用于快速滅活細菌。在某些實施方案中，所述組合物對滅活革蘭氏陽性菌尤其有效。在優(yōu)選的實施方案中，大約在五到十分鐘之后細菌失活。這樣，細菌在用本發(fā)明乳液培養(yǎng)后，將被以快速及高效的方式滅活。我們希望當細菌與乳液直接相接觸的時候，接觸與滅活之間的時段能盡量在5-10之內(nèi)或者更短。然而，應(yīng)當理解，當本發(fā)明乳液用于治療背景或者全身性的使用時，滅活將在較長的一段時間后發(fā)生，該時段包括，但不限于給藥后5、10、15、20、25、30、60分鐘。進一步的，其他的實施方案中，滅活發(fā)生在2、3、4、5或者6小時之后。
在其它實施方案中，本發(fā)明的組合物和方法也能滅活某些革蘭氏陰性菌。在一些實施方案中，細菌滅活乳液先與能增強乳液和細胞壁間相互作用的化合物預(yù)先混合。所述本發(fā)明的組合物的增強子的用途將在下文中討論。我們必須注意到某些乳液，尤其是含有增強子的乳液，對于革蘭氏陽性及陰性菌非常有效，且其可以口服給藥，使其與腸內(nèi)細菌接觸。
在特定的實施方案中，表明本發(fā)明的乳液具有潛在的，選擇性的殺生物活性，同時對于無性繁殖細菌具有很小的活性。BCTP對蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)，環(huán)狀芽孢桿菌(B.circulans)和巨大芽孢桿菌(B.megaterium)，產(chǎn)氣莢膜桿菌(C.perfringens)，流感嗜血菌(H.influenzae)，淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoeae)，無乳鏈球菌(S.agalactiae)，肺炎鏈球菌(S.pneumonia)，化膿鏈球菌(S.pyogenes)和霍亂弧菌(V.cholerae)classical和Eltor具有很高的活性(圖26)。此種針對易感微生物的滅活反應(yīng)只要接觸就發(fā)生得非?？?，且在15-30分鐘之內(nèi)完成。
圖31A顯示了本發(fā)明的幾種示例性的納米乳液對大腸桿菌的效果B.殺孢子及抗孢子活性在某些特定的實施方案中，本發(fā)明表明本發(fā)明的乳液具有殺孢子活性。不拘泥于任一理論(理解本發(fā)明機理對于實施本發(fā)明并不必要，且本發(fā)明也不限于任一特定機理)，我們認為這些乳液的殺孢子活性貫穿于萌發(fā)初期，而孢子無需完全轉(zhuǎn)化成易于被乳液破壞的營養(yǎng)型。乳液或其組分的反應(yīng)可介導萌發(fā)的啟動。
電子顯微鏡研究的結(jié)果表明，在接受BCTP處置之后，伴隨著孢子核內(nèi)物質(zhì)的瓦解，孢子膜和皮層破裂。殺孢子活性似乎是由TRITONX-100和正磷酸三丁酯組分介導的，因為不含這些組分的納米乳液沒有體內(nèi)活性。乳液的這項獨特的活性(與1％漂白劑的效果相似)很吸引人，因為細菌孢子通常能抵抗大多數(shù)的消毒劑，包括多種常用的洗滌劑(Russell，臨床微生物3；99 )。
本發(fā)明證實將BCTP和蠟狀芽孢桿菌孢子混合后再向小鼠注射，能預(yù)防蠟狀芽孢桿菌的病理效應(yīng)的產(chǎn)生。進一步的，本發(fā)明表明使用BCTP處置被蠟狀芽孢桿菌孢子感染的模擬創(chuàng)傷，能顯著的降低小鼠感染的危險及降低死亡率。用BCTP1∶10稀釋后注射的動物沒有反映出任何感染的結(jié)果，該效果證明BCTP對小鼠沒有皮膚毒性。這些結(jié)果表明在孢子暴露前后快速的孢子處置能有效的降低試驗性皮膚感染中的組織損害的嚴重度。
在本發(fā)明過程中的其他的試驗比較了BCTP和其它BCTP衍生乳液對不同的桿菌孢子的滅活效果。BCTP稀釋至最高1∶1000(v/v)能在四小時內(nèi)滅活超過90％的炭疽桿菌孢子，還能殺死三種桿菌的孢子，同時清楚可見破碎的孢子膜。X8W60PC稀釋至1∶1000對炭疽桿菌、蠟狀芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌具有更高的殺孢子的活性，且不到30分鐘即能起效。將BCTP與蠟狀芽孢桿菌混合后對小鼠進行皮下注射，或者，小鼠皮膚用孢子接種后用BCTP沖洗傷口1小時，結(jié)果是98％的皮膚損傷范圍得到恢復(fù)(治愈)。在近期的試驗中，死亡率減少了4倍。與其他使用的殺孢子試劑相比，所述組合物穩(wěn)定、易于分散、無刺激且無毒。
本發(fā)明的方法中使用的細菌-滅活水包油乳液可通過與其接觸以滅活一系列細菌和細菌孢子。例如，新乳液可用于滅活桿菌、包括蠟狀芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌、還包括梭狀芽孢桿菌(例如，肉毒梭菌和破傷風梭菌)。本發(fā)明的方法可尤其用于滅活某種生化武器(例如，炭疽桿菌)。另外，還發(fā)現(xiàn)本發(fā)明所述制劑可用于對抗產(chǎn)氣莢膜桿菌、流感嗜血菌、淋病奈瑟氏球菌、無乳鏈球菌、肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌和霍亂弧菌classical和Eltor(圖26)。
BCTP含有TRITON X-100，SS和W808P含有TWEEN 60，NN含有壬苯醇醚-9表面活性劑。每一項都是非離子表面活性劑，但是化學和生物學特性卻各不相同。壬苯醇醚-9具有強的殺精子活性，其廣泛用作陰道用避孕產(chǎn)品的組分(Lee，1996)。有人宣稱它對包膜病毒具有殺病毒效果(Hermonat等，1992；Zeitlin等，1997)。然而，壬苯醇醚-9未顯示對非包膜病毒有效(Hermonat等，1992)。
圖31B顯示了本發(fā)明的一組示例性納米乳液對枯草芽孢桿菌孢子的效果。
C.殺病毒和抗病毒活性在其他實施方案中，已被證明，本發(fā)明的納米乳液組合物具有抗病毒性質(zhì)。乳液對病毒試劑的效果使用斑點數(shù)降低測定法(PRA)、細胞酶聯(lián)免疫吸著測定法(ELISA)、β-半乳糖甙酶測定法和電子顯微鏡(EM)進行檢測，細胞毒性脂質(zhì)制劑的細胞毒性使用(4，5-二甲噻唑-2-基)-2，5二苯基四唑(MTT)染色法測定(Mosmann 1983)。
通過細胞ELISA試驗測定以及由PRA試驗作后續(xù)的確認，顯示MDCK細胞的A型流感傳染性顯著的降低。BCTP和SS在1∶10的稀釋下降低病毒感染為95％以上。其他兩種乳液在1∶10的稀釋下降低病毒感染約40％，顯示其只有前者一半的效果。BCTP是最具潛力的制劑，即使稀釋到1∶100，其殺病毒的能力絲毫沒有減弱。動力學研究表明病毒與1∶10稀釋的BCTP共存5分鐘，便完全失去了感染力。TRITON X-100，是BCTP的活性化合物，當其稀釋至1∶5000時，與BCTP相比，只能部分的抑制病毒的感染力，這表明納米乳液其本身就具有抗病毒能力。為了進一步檢測BCTP的抗病毒性質(zhì)，研究其對非-包膜病毒的活性。β-半乳糖甙酶測定法檢測結(jié)果顯示，BCTP處置并不能影響293細胞中l(wèi)acZ腺病毒構(gòu)造的復(fù)制。當用EM檢測時，A型流感病毒在用BCTP培養(yǎng)后被完全的破壞而腺病毒保存完好。
另外病毒用10％及1％的BCTP在PBS中預(yù)先浸潤，皰疹病毒、仙臺病毒、新培斯病毒和牛痘病毒被完全的消除，該結(jié)果通過斑點數(shù)降低測定法(圖27)測定。時間過程的分析顯示滅活作用快速且完全的發(fā)生在用10％BCTP培養(yǎng)的5分鐘內(nèi)、1％BCTP培養(yǎng)的30分鐘內(nèi)。用不同稀釋度的BCTP處置腺病毒，病毒的感染力沒有任何下降。
某些以BCTP為基礎(chǔ)的組合物對抗各種病毒感染的效果及其對粘性膜的微弱毒性證明了其有可能用作有效預(yù)防包膜病毒感染所引起疾病的消毒劑及試劑。
圖31C顯示一組本發(fā)明示例性納米乳液對抗A型流感病毒的效果。
D.殺真菌和抗真菌活性本發(fā)明的納米乳液的另一性質(zhì)是其具有抗真菌活性。真菌感染的普通試劑包括多種念珠菌和曲霉屬及其各種類型，還包括其他試劑。外部真菌感染相對輕微，體內(nèi)真菌感染可引起嚴重的醫(yī)療結(jié)果。人體真菌感染的發(fā)生率在上升，這部分歸結(jié)為缺損免疫系統(tǒng)病人數(shù)量的的增加。真菌疾病，尤其是體內(nèi)真菌疾病，對缺損免疫系統(tǒng)的病人具有生命威脅。
本發(fā)明研究過程中實施的試驗表明1％BCTP應(yīng)用于白色念珠菌時，其具有大于92％的抗真菌活性。念珠菌以每晚37oC的速度生長。然后將細胞清洗后用血球計數(shù)器計數(shù)。已知數(shù)量的細胞用不同濃度的BCTP混合后培養(yǎng)24小時。念珠菌在右旋糖瓊脂上生長，培養(yǎng)一夜，然后計算菌落。BCTP的抗真菌效果用以下公式判斷 本領(lǐng)域技術(shù)人員能將本發(fā)明所述制劑制成適合真菌疾病的治療的制劑。本發(fā)明的納米乳液find use in對抗感染例如足癬、念珠菌病和其他急性或體內(nèi)真菌感染。
E.體內(nèi)效果動物研究證實了本發(fā)明組合物和方法的保護效果和治療效果。試驗動物蠟狀芽孢桿菌感染用于事先提供研究炭疽的一種模型系統(tǒng)(參見例如，Burdon和Wende，感染疾病雜質(zhì)170(2)272 ；Lamanna和Jones，細菌雜質(zhì)85532 ；和Burdon等感染疾病雜質(zhì)117307 )。動物實驗性蠟狀芽孢桿菌感染誘發(fā)的疾病綜合癥與炭疽相似(Drobniewski，臨床微生物研究6324 ；和Fritz等，實驗室研究73691 )。本發(fā)明研究過程中實施的試驗證實混合BCTP與蠟狀芽孢桿菌孢子后想小鼠注射，能預(yù)防蠟狀芽孢桿菌的致病效果。進一步的，我們證實了BCTP處置蠟狀芽孢桿菌孢子感染的模擬傷口顯著的降低小鼠感染的危險和其死亡率。用1∶10稀釋的BCTP單獨注射的試驗動物沒有顯示任何的炎癥跡象，這表明BCTP對小鼠沒有皮膚毒性。這些結(jié)果表明在(感染)暴露前后迅速的進行孢子處置能有效的在試驗性皮膚感染中降低組織損傷的危險性。
在已特定的實施例中，幾內(nèi)亞豬作為試驗動物以研究產(chǎn)氣莢膜桿菌感染。制作1.5cm的皮膚傷口，弄碎皮下肌肉且用5×107cfu的產(chǎn)氣莢膜桿菌造成感染，不施用其他的處置。另一組則先用相同數(shù)量的細菌造成感染，1小時后用鹽水或者或BCTP沖洗以模擬post-exposure凈化。使用鹽水沖洗實驗性的感染創(chuàng)傷沒有產(chǎn)生任何明顯的益處。然而，用BCTP沖洗產(chǎn)氣莢膜桿菌感染引起的創(chuàng)傷顯示出能顯著的減少水腫、炎癥反應(yīng)炎癥反應(yīng)和壞死。如此證明了本發(fā)明的某些制劑能用于對抗細菌感染。
進一步的，一種10％BCTP的皮下注射劑不會引起試驗動物的不適且不會產(chǎn)生組織學上的組織損傷。在口服毒性試驗中的所有大鼠的體重在研究期間都有所增加。我們沒有發(fā)現(xiàn)大鼠有不良的臨床跡象，且所有的組織經(jīng)檢查都在正常范圍內(nèi)。從試驗動物糞便中獲得的細菌培養(yǎng)物與那些未經(jīng)處理的(正常的)動物相比沒有顯著的不同。
IV.示例性的使用以下詳細敘述的時一組示例性的本發(fā)明組合物的使用方法A)藥物和療法；B)凈化和滅菌；C)制備食物；和D)器具，以及E)改進、制備和引用本發(fā)明組合物的方式方法的說明
A.藥物和療法本發(fā)明的制劑可用于藥物和治療組合物，還適用于對抗和/或處置微生物引起的感染。所述組合物可用于降低感染、殺滅微生物、抑制微生物生長或者用于消除微生物感染導致的不良效果。
用于體內(nèi)時，組合物能以任何有效的藥學可接受的形式向恒溫動物，包括人類和動物對象給藥。一般來說，這些制備的組合物基本上不含其他對人或者動物有害的熱原和雜質(zhì)。
藥學可接受形式的特定例子包括但不僅限于口服、鼻部、頰腔頰腔，直腸，陰道、局部或鼻噴或其他能有效的向微生物感染的部位施用本發(fā)明組合物的任一形式。在優(yōu)選的實施方案中，給藥路徑設(shè)計成組合物與感染性微生物直接接觸的形式。在其它實施方案中，可通過正位、真皮內(nèi)的、皮下、肌內(nèi)或腹腔內(nèi)注射給藥。組合物也可通過非腸道或腹腔內(nèi)向?qū)ο蠼o藥。所述組合物可作為藥學可接受的組合物給藥。只有當任一常用的藥學可接受的介質(zhì)或試劑不能與本發(fā)明的乳液相容時，這些特定實施方案中公開的藥學可接受介質(zhì)及制劑的應(yīng)用需要仔細的研究。在其它的實施方案中，也可以在組合物中同時使用具有其他活性的成分。
局部給藥時，藥學可接受的載體可以是液體、霜劑、泡沫劑、洗劑或凝膠，也可附加的含有有機溶劑、乳化劑、凝膠劑、增濕劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑、增濕劑、防腐劑、時控釋放劑(time release agents)及少量的濕潤劑、螯合劑、著色劑、香料及其他常用于局部藥物組合物的組分。
乳液制成口服或局部給藥的藥片和制劑形式包括液體膠囊和栓劑。制備用于口服給藥的固體制劑，組合物可以與一種或多種基本無活性的稀釋劑(例如，蔗糖、乳糖或淀粉，等等)混合，還可以附加的含有潤滑劑、緩沖劑、腸溶衣及其他本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的組分。
在本發(fā)明的另一實施方案中，本發(fā)明組合物可以特定的設(shè)計成體外使用的方式，例如醫(yī)用消毒或滅菌儀器和裝置、隱形眼鏡等等，尤其當裝置或者眼鏡本身被病患或者佩帶者使用。例如，在藥物和外科裝置及用品與對象接觸之前，可用該組合物清除凈化上述物件。另外，該組合物還可用于術(shù)后，或在任一侵害過程發(fā)生后，輔助降低術(shù)后感染的發(fā)生率。在特別優(yōu)選的實施方案中，該組合物還可以采用保守或者有效的免疫學防御手段向?qū)ο笫┮运幬?例如，老年和幼兒患者，燒傷和外傷患者，及感染HIV的患者等等)。當組合物用于這些類型的用途時，它可以方便的制成液體、泡沫劑、貼劑或凝膠的形式，也可以與乳化劑、表面活性劑、緩沖劑、濕潤劑、防腐劑、金屬離子、抗生素和其它該類型中常見的組分共同使用。
在其它實施方案中，組合物可填充入吸收性材料中，例如縫合線、繃帶、和紗布，或者包在固體材料的表面，例如外科釘針，拉鏈和導管的表面，用以將組合物傳輸?shù)椒乐刮⑸锔腥镜牟课?。其他的此類型的傳輸系統(tǒng)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見的。
在另一個實施方案中，組合物可用于個人護理業(yè)中，如除臭劑，肥皂，粉刺/真菌治療劑，口臭治療劑、陰道酵母菌感染治療劑等等。組合物還可用于其他的內(nèi)部和外部微生物引起的感染(例如，流感，H.simplex等)。在這些用途中，乳液的制備可含有上文所述的治療載體。
在某些實施方案中，本發(fā)明抗菌組合物和方法還包含一組聯(lián)合療法。例如單一的抗微生物制劑抑制微生物的效果弱于多種試劑互相聯(lián)合應(yīng)用的效果。這樣能有利于避免多種藥物耐藥性帶來的問題。這在具有藥物傳輸器以介導藥物從器官中射流的細菌中也非常通用。本發(fā)明進一步的闡述本發(fā)明及組合物在聯(lián)合療法中的應(yīng)用。
可用于治療細菌、真菌和病毒感染的抗微生物試劑的數(shù)量非常巨大。關(guān)于所述藥物及其作用機理的理解性論文，本領(lǐng)域技術(shù)人員可參考Goodman&Gilman的《治療學的藥理學基礎(chǔ)》。Hardman等，第9版，Pub.McGraw Hill，43-50章，1996，(此處以其整體形式合并作為參考)。通常，這些試劑中包括抑制細胞壁合成的試劑(例如，青霉素、頭孢菌素、環(huán)絲氨酸，萬古霉素、桿菌肽)及咪唑抗真菌試劑(例如，咪康唑、酮康唑和克霉唑)；直接破壞微生物細胞膜的試劑(例如，洗滌劑例如多粘菌素和colistimethate和抗真菌制霉菌素和兩性霉素B)；影響核蛋白體亞單元以抑制蛋白質(zhì)合成的的試劑(例如，氯霉素、四環(huán)素、erthromycin和克林霉素)；改變蛋白質(zhì)合成及導致細胞死亡的試劑(例如，氨基甙類物質(zhì))；影響核酸代謝的試劑(例如，利福霉素和喹諾酮)；抗代謝試劑(例如，三甲氧芐二氨嘧啶和磺胺類藥物)；和核酸類似物，例如疊氮胸苷、丙氧鳥苷、阿糖腺苷和阿昔洛偉，這些物質(zhì)抑制病毒DNA合成所必須的酶?？梢圆捎貌煌N類的抗菌劑的多種結(jié)合。
可以改變組合物和任一組合物中的促進劑的真實劑量用以以在治療點獲得有效量的殺滅營養(yǎng)型、芽孢型微生物及中和毒性產(chǎn)物的劑量的乳液和促進劑。事實上，可選擇的劑量依賴于本身和治療點、所期望的反應(yīng)、所期望生物反應(yīng)的持續(xù)時間及其他的因素。通常，本發(fā)明的乳液可在每毫升液體組合物中含有至少0.001％至100％，優(yōu)選0.01至90％，的乳液?？梢灶A(yù)見，病毒感染可以使用每毫升液體組合物含約0.01％到100％之間濃度的乳液進行治療。細菌感染可使用每毫升液體組合物含約0.001％至約100％濃度的的乳液進行治療。孢子可用每毫升液體組合物含約0.001％至約100％的乳液的乳液殺滅。這些僅僅是示例性的范圍?？梢灶A(yù)見，所述制劑的每毫升液體組合物可含有約0.001％，約0.0025％，約0.005％，約0.0075％，約0.01％，約0.025％，約0.05％，約0.075％，約0.1％，約0.25％，約0.5％，約1.0％，約2.5％，約5％，約7.5％，約10％，約12.5％，約15％，約20％，約25％，約30％，約35％，約40％，約50％，約55％，約60％，約65％，約70％，約75％，約80％，約85％，約90％，約95％或約100％的乳液。應(yīng)當理解，上述兩個數(shù)值之間的范圍是包含在本發(fā)明特定的步長和范圍中的。而根據(jù)處置對象的狀況所作的某些劑量的改變是必須的。
負責給藥的人，在任何情況下，必須判斷個體對象給藥的大致劑量。此外，在向人類給藥時，制劑必須符合如FDA生物制劑標準所要求的無菌、無熱原、常規(guī)安全性和純度標準。
B.凈化和除菌一般來說，本發(fā)明的組合物和方法可用于環(huán)境凈化裝置和用于軍事及恐怖襲擊中的受傷的治療。對多種病原體，包括營養(yǎng)型細菌和包膜病毒(參見例如，Chatlyyne等，《一種對HIV-1和其他常見病毒具有有效殺病毒活性的乳液》，逆轉(zhuǎn)錄病毒和人類健康的基礎(chǔ)，關(guān)于逆轉(zhuǎn)錄和機會感染的第三次會議，華盛頓特區(qū)，美國 )及細菌孢子的滅活，結(jié)合在試驗動物中表現(xiàn)的低毒性，使得該乳液適宜用作常用的凈化劑(在對某病原體作出判斷之前)。優(yōu)選的本發(fā)明的組合物迅速大量的生產(chǎn)，且在較寬的溫度下穩(wěn)定數(shù)月。這些特性提供了一種使其能廣泛用于凈化應(yīng)用的適應(yīng)性。
例如本發(fā)明的某些制劑對于破壞多種細菌孢子生化武器種的試劑特別的有效。由此可見，本發(fā)明的組合物和方法可有效用于凈化被生化武器污染的個人或者材料。本發(fā)明組合物的溶液可直接從地面向受污染的材料或者個人噴灑，也可以使用空中噴灑系統(tǒng)。在某些方面的應(yīng)用中，本發(fā)明有效量的組合物在凈化時與污染材料或者個人相接觸。另外可替換的，個人凈化工具可裝備于有可能被生化武器污染的軍事或者民用裝置。
廣譜病原體，包括營養(yǎng)型細菌和包膜病毒(參見例如，Chatlyyne等，《一種對HIV-1和其他常見病毒具有有效殺病毒活性的乳液》，逆轉(zhuǎn)錄病毒和人類健康的基礎(chǔ)，關(guān)于逆轉(zhuǎn)錄和機會感染的第三次會議，華盛頓特區(qū)，美國 )和細菌孢子(參見例如，Hamouda等，感染疾病雜志1801939 )結(jié)合低毒性的(對動物)滅活，舍得本發(fā)明組合物特別適用于，在對一種特定的病原體作出判斷之前，作為凈化試劑使用。
因此，本發(fā)明的某些實施方案特別提出，可使用本發(fā)明組合物用作凈化土壤、機械、車輛和其他設(shè)備，及可能被不期望的病原體感染的水道的消毒劑和洗滌劑。所述凈化操作涉及簡單的以液體噴霧劑形式的應(yīng)用，或者涉及更為嚴格的操作制度。同樣的，該乳液可用于治療不同植物病毒的疹(代替常規(guī)抗生素或與之共同使用)。
在用于土壤或者設(shè)備的凈化之外，所述制劑還可用于制備以常規(guī)消毒為目的的家用洗滌劑。此外，本發(fā)明的一些實施方案可用于防止食物被細菌和真菌污染(例如，無毒組合物)。該操作可在食品制備過程中進行，或?qū)⒔M合物作為食品添加劑、消毒劑或防腐劑另外的加入食品中。
新乳液優(yōu)選用于固體的硬質(zhì)表面。相應(yīng)的，上述組分與一種或多種水性載體液混合。水性載體的選擇并不嚴格。然而，它必須時安全的，與本發(fā)明乳液在化學上是相容的乳液。在一些實施方案中，水性載體液中含有常用于硬質(zhì)表面清潔組合物的溶劑。所述溶劑必須與新乳液相容且在乳液pH下化學穩(wěn)定。其必須還具有優(yōu)良的成膜/剩余性質(zhì)。用于硬質(zhì)表面清洗的溶劑在，例如美國專利號5,108,660中有所記載，此處以其整體形式合并作為參考。
在優(yōu)選的實施方案中，水性載體是水或醇、水可混容的混合物。醇可用于調(diào)節(jié)組合物的粘度。在一些實施方案中，醇優(yōu)選C2-C4的醇類。在特別優(yōu)選的實施方案中，使用的是乙醇。例如在一優(yōu)選的實施方案中，水性載體液是水或一種含約0至約50％乙醇的水-乙醇混合物。本發(fā)明同時還包括非液體的組合物。這些非液體的組合物可以是顆粒、粉末或凝膠形式的，優(yōu)選為顆粒形式。
任選的，一些組合物含有增進清洗能力及美觀的輔料，條件是其不影響新乳液的活性。組合物可任選的含有一種無活性的輔料表面活性劑。可任選的使用多種的有機類、水-溶性的表面活性劑。輔料表面活性劑的選擇依賴于組合物的使用目的的要求和表面活性劑商業(yè)的可利用性。其他任選的添加劑，例如香料，增亮劑、酶、著色劑等等可用于組合物中以增加美觀和/或清洗性能。洗滌組分液可用于組合物中。洗滌組分能螯合可與輔料表面活性劑或輔助表面活性劑相結(jié)合且降低效果的鈣和鎂硬度離子。洗滌及組分在含有輔料表面活性劑或輔助表面活性劑時尤其的有用，而且當組合物在使用前用特別硬的水(例如，超過約12grains/加侖)稀釋時，洗滌組分更為有用。
在其它實施方案中，所述組合物進一步的含有，泡沫消除劑。在這些實施方案，組合物優(yōu)選含有足夠量的泡沫消除劑以預(yù)防當組合物與硬質(zhì)表面接觸時產(chǎn)生的過量的泡沫。泡沫消除劑尤其在制劑中用于組合物免洗用途。泡沫消除劑可用熟知及傳統(tǒng)的方法得到。泡沫消除劑根據(jù)其組合物制備的能力，及組合物殘余及清洗情況進行選擇。泡沫消除劑必須與組合物中的組分是化學可容的，其在所述pH范圍那是有效的，且不能在清洗過的表面留下可見的殘余物。低泡沫輔助表面活性劑可作為泡沫消除劑使用以介導組合物的泡沫性質(zhì)。輔助表面活性劑的濃度在約1份到約3％之間是比較充足的。
在此可使用的適宜的輔助表面活性劑的離子包括塊狀共聚物(如PLURONIC和TETRONIC凝膠[聚(乙烯氧基)-b-聚(丙二醇氧基)-b-聚(乙烯氧基)聚合物凝膠，BASF公司，Parispany，NJ])及烷基化物(例如，羥乙基化物/丙氧基化物) 伯醇和仲醇(例如，TERIGTOL[UnionCarbide，Danbury，CT]；POLY-TERGENTO[Olin公司，Nowalk，CT])。任選的泡沫消除劑優(yōu)選含有一種硅樹脂基材料。這些材料很低的濃度即可有效的作為泡沫消除劑使用。在的濃度下，此硅樹脂基泡沫消除劑不易影響組合物的清洗效果。適宜的硅樹脂基的泡沫消除劑的使用實例是Dow Corning DSE。該任選的，但是優(yōu)選的硅樹脂基的泡沫消除劑可用熟知及傳統(tǒng)方法結(jié)合到所述組合物中。
在其它實施方案中，組合物可由健康護理工作者使用，或由任何接觸微生物感染的人或者區(qū)域的人使用，用于滿足健康安全和凈化的需要。另外，本發(fā)明乳液可制成噴霧劑用于醫(yī)院和家庭使用，例如清潔及消毒醫(yī)學裝置和病房、家用器具、廚房和浴室表面等。在相同的實施方案中，當環(huán)衛(wèi)及環(huán)境服務(wù)工人、食品處理和農(nóng)業(yè)工人及實驗室人員有可能與感染性生物試劑接觸時使用該組合物。另外，組合物可在旅行者及有可能接觸隱藏感染物質(zhì)和致病試劑的人上使用。
C.食品的制備本發(fā)明此處記載的某些組合物也可用于食品的加工和制備工業(yè)，以預(yù)防和處置由生長于食品中的細菌、真菌和毒素導致的食品污染。因此，所述組合物可用于降低或抑制微生物的生長或者消除微生物污染食品的有害結(jié)果。為了實施這些應(yīng)用，該乳液組合物以食品工業(yè)可接受的形式使用，例如添加劑、防腐劑或調(diào)味劑。
術(shù)語“食品工業(yè)可接受的”是指當被人或動物口服時基本上不產(chǎn)生負反應(yīng)或過敏反應(yīng)的組合物。正如此處所指的，“食品工業(yè)介質(zhì)中可接受的”包括任一及所有溶劑、分散物質(zhì)、任一及所有香料和草藥及其提取物。除了任一常用添加劑之外，防腐劑和調(diào)味劑與本發(fā)明的乳液是不相容的，它們用于預(yù)防或者處置食物中生長的微生物和它們的毒性產(chǎn)物。追加的活性成分也可合用加入組合物中。在用于這些應(yīng)用時，可接受的載體可以形成液體、霜劑、泡沫劑且可以附加的含有溶劑、乳化劑、凝膠劑、增濕劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑、防腐劑、螯合劑、著色劑、香料和其他常用于食品加工業(yè)中的組分。
在本發(fā)明的另一實施方案中，組合物可特別設(shè)計成用于例如消毒或滅菌食品工業(yè)裝置、設(shè)備及食品操作、包裝合儲藏區(qū)域所用。為實施此類應(yīng)用，組合物可便利的以液體或泡沫的形式使用，且可以與乳化劑、表面活性劑、緩沖劑、濕潤劑、防腐劑和其他此類組合物中常見的組分一起使用。在一些實施方案中，組合物在運輸產(chǎn)品或者農(nóng)業(yè)產(chǎn)品期間或之前用于這些貨物上。本發(fā)明的組合物可以充入到吸收性材料中，其通常用于包裝材料中以防止食物在運輸合儲存中被污染(例如，卡紙板或紙包裝)。其他此類型的傳輸系統(tǒng)都是為本領(lǐng)域技術(shù)人員所顯而易見的。
本發(fā)明組合物中乳液合增強劑的確切的量可以改變，從而得到適宜濃度的乳液及增強劑以有效的預(yù)防或抑制由食物中生長的微生物及其毒素感染造成的食物污染。相應(yīng)的，濃度的選擇根據(jù)食品的性質(zhì)、包裝、儲存方式和其他因素而決定。通常的，本發(fā)明乳液組合物可在液體組合物中含有至少0.001％至約90％的乳液?？梢韵胍姡鲋苿┟亢辽后w組合物中可含有約0.001％，約0.0025％，約0.005％，約0.0075％，約0.01％，約0.025％，約0.05％，約0.075％，約0.1％，約0.25％，約0.5％，約1.0％，約2.5％，約5％，約7.5％，約10％，約12.5％，約15％，約20％，約25％，約30％，約35％，約40％，約50％，約55％，約60％，約65％，約70％，約75％，約80％，約85％，約90％，約95％或約100％的乳液。應(yīng)當理解，上述在任意兩數(shù)字之間的范圍是特定的范圍，其屬于本發(fā)明步長及范圍之內(nèi)的。
在特定的實施方案中，乳液可用作消毒劑和洗滌劑以凈化和預(yù)防食品、土壤、水、機械及其他設(shè)備和動物的微生物感染。
本發(fā)明乳液可用于食品工業(yè)以防止污染。例如在食品中含有該乳液可以有效的殺滅可偶然導致肉類或家禽污染的細菌。這樣還允許食品業(yè)使用一種潛在的廣譜(抗菌)食品以降低成本。
本發(fā)明的某些實施方案也可用于飲料工業(yè)。例如新乳液可加入到汁液產(chǎn)品中以預(yù)防某種真菌的生長，該生長引起污染及導致霉菌毒素產(chǎn)生的，對消費者是很危險的。通過加入少量的本發(fā)明乳液，可以預(yù)防果汁中最普通的真菌污染。只需乳液的萬分之一(不會改變果汁的味道及其組分的量)即可達到該效果。
新乳液可用于基本去除機械及其他設(shè)備上傳染性試劑的。例如乳液可用于除去肉加工植物(車間)，尤其是有機物，例如單核細胞增生李斯特菌，該應(yīng)用通過在連續(xù)的基低上用乳液清除屠宰場或食品包裝設(shè)備進行。
負責給藥的人員，在任何情況下，判斷作為個體使用的適宜劑量。此外，所述應(yīng)用必須符合FDA要求的通常的安全性和純度標準。
D.試劑盒在本發(fā)明的其他實施方案中，方法和組合物，或方法和組合物中的組分可以制在單一的制劑中，或者在獨立制劑中分開，在使用時再混合，以適應(yīng)特殊的應(yīng)用需要。所述組分可有利的置于試劑盒中以對抗微生物引起的感染、凈化儀器等等。在一些實施方案中，所述器具含有所有向反應(yīng)點傳輸本發(fā)明所述制劑所必須的材料和試劑。
在一些實施方案中，用于體內(nèi)使用時，本發(fā)明的方法和組合物可制備成單一的或分離的藥學可接受的可注射的組合物。在這種情況下，容器本身可以是吸入器、注射器、移液管、眼滴管，或其他相似儀器，所述制劑通過這些器具供應(yīng)到身體的感染部位(例如肺部)，及注射到動物中，或者用這些器具容器中的其他組分混合。
本發(fā)明的試劑盒也可典型的包括容納小瓶的裝置，該小瓶為接近分娩中使用的，市場有售(例如，注射劑或氣模塑料容器，在其中留有所需的小瓶)。與容器的數(shù)量和型號無關(guān)的，本發(fā)明器具還可含有協(xié)助注射/給藥或在動物體內(nèi)放置最終的復(fù)合組合物的儀器，或與該儀器在同包裝內(nèi)。所述儀器可以是吸入器、注射器和消毒凸輪、移液管、鑷子、量匙、眼藥水滴管或任一所述醫(yī)學許可的傳輸載體工具。
E.修飾、制備和傳輸本發(fā)明進一步的提供多種用于修飾本發(fā)明納米乳液的方法和體系，將納米乳液與其他產(chǎn)品、包裝的結(jié)合及傳輸本發(fā)明的組合物，以及與使用或處理可能被微生物污染的物料或樣本相關(guān)的費用的降低方法。以下說明書意在簡單的提供一些修飾、制備、及傳輸本發(fā)明組合物的例子。本領(lǐng)域技術(shù)人員能理解所述方法的變換形式。
在一些實施方案中，本發(fā)明提供用于改進和改變所述納米乳液的方法。這些方法包括，例如取出所述的納米乳液，然后改變納米乳液的一種或多種組分。這樣的改變包括但不僅限于，加入或除去一種或多種組分。改變的納米乳液可進行測試以判斷其是否具有所需的或可用的性質(zhì)。在本發(fā)明的一些實施方案中，對本發(fā)明的納米乳液，或從本發(fā)明衍生的納米乳液進行稀釋。稀釋的樣本可經(jīng)測試判斷其是否保留了所需的功效。在本發(fā)明的另一實施方案中，本發(fā)明的納米乳液，或從本發(fā)明衍生的納米乳液可通過質(zhì)量控制(QC)和/或質(zhì)量保證(QA)程序以確保售賣的納米乳液，或者，向使用者或零售業(yè)主遞交的納米乳液的適應(yīng)性。
在本發(fā)明的一些實施方案中，本發(fā)明的納米乳液可加到另一種產(chǎn)品中以提高或者改進產(chǎn)品的抗菌能力，或者對懷疑的污染進行測定，或者，產(chǎn)品的抗微生物能力在感觀上有所改進(即，本發(fā)明納米乳液的附加成分加入到產(chǎn)品中是屬于本發(fā)明范圍之內(nèi)的，無論其是否具有可檢測的，或者，任一的抗微生物活性)。例如在一些實施方案中，將本發(fā)明的納米乳液加入到清洗或者消毒物料中(例如，家用清洗劑)。在其它實施方案中，可將納米乳液加入到醫(yī)用或急救物料中。例如，可將納米乳液加入到(或直接作為)滅菌劑和創(chuàng)傷護理產(chǎn)品而使用。在另一些實施方案中，納米乳液可加入到工業(yè)產(chǎn)品中。例如在一些實施方案中，納米乳液可加入到機油中以防止或減輕，如真菌污染。如上所述，可以使用機油作為油相組分合成有效的，穩(wěn)定的乳液(例如，W205GCMobil 1)。在其它實施方案中，納米乳液可加入到食品中。例如可將納米乳液加到飲料中以防止不期望的生物在其中生長。
本發(fā)明的納米乳液，無論是單獨使用，或與其他物料結(jié)合使用，均可提供多種不同類型的容器和傳輸體系。例如在本發(fā)明的一些實施方案中，納米乳液是霜劑或其他固體或半固體的形式。在本發(fā)明研究過程中，人們認為本發(fā)明的乳液可以在保持其抗微生物活性的同時(與其他組分)合制成水凝膠制劑。水凝膠中使用乳液可獲得多種有用的性質(zhì)。例如水凝膠可以制成具有所需尺寸和形狀的半固體的結(jié)構(gòu)。這樣就使得，例如，水凝膠材料能插入到試管或其他通路中制備抗微生物的過濾器(即，本發(fā)明的乳液可凈化穿過水凝膠的材料)。
納米乳液可在任一適宜的容器傳輸(例如，向使用者或消費者的傳輸)。適用的容器能提供所需的一種或多種單一用途的納米乳液劑量或多用途劑量。在本發(fā)明的一些實施方案中，納米乳液可以是混懸液或液體的形式。所述納米乳液可用任一適宜的容器包括噴灑壺(例如，壓力噴灑壺)傳輸。當用于工業(yè)或者其他大規(guī)模的使用，大體積(例如，幾十到幾千升)的納米乳液可放置在單個的容器中，該容器經(jīng)適當?shù)难b配適合納米乳液的分發(fā)及使用。
在本發(fā)明某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明納米乳液可與現(xiàn)行的商業(yè)運作相結(jié)合以降低與商業(yè)運作中安全操作有關(guān)的費用及，用于改進安全操作的費用。例如使用本發(fā)明的納米乳液可降低與使用或處置可能被微生物感染的物料或樣本有關(guān)的費用。在一些實施方案中，本發(fā)明的納米乳液可用于改善安全性或降低與醫(yī)療工業(yè)有關(guān)的費用。例如納米乳液可用于醫(yī)用物料(例如，與動物、人類或生物樣本接觸的表面)或用于病人的(例如，體內(nèi)的或體外的)廉價有效的滅菌劑。納米乳液還可用作食品加工和處理及食品工業(yè)應(yīng)用的廉價有效的滅菌劑。在某些這樣的實施方案中，本發(fā)明提供了一種無毒的納米乳液。例如，最近，此處納米乳液含有的組分在醫(yī)學、農(nóng)業(yè)和食品上的應(yīng)用通過了相應(yīng)控制機構(gòu)(例如，F(xiàn)DA、USDA等)的認證。此外，此處還提供了含所需功能的附加納米乳液的生產(chǎn)方法，該乳液可組成完全無毒及通過(檢驗)的物質(zhì)。如此，本發(fā)明的納米乳液的應(yīng)用無需長時間的消耗及為了獲得規(guī)定的認證所進行的高價的操作。事實上，乳液的毒性要小于單獨組分毒性的總和。例如，X8PC被測試用于比較乳液對血瓊脂平板上測定的綿羊血細胞的溶血效果，該效果與非乳化成分的混合物溶血效果相比較。比較數(shù)據(jù)見圖34.圖34中的兩條粗線顯示X8PC納米乳液的溶血效果，其效果與所有組分的非乳化混合物的溶血效果相比較。
V.具體實施例以下實施例用以闡述某些本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案及方面，其不能理解為用以限制本發(fā)明的范圍。
在以下的實驗發(fā)現(xiàn)中，使用如下的縮寫符號eq(等價物)；μ(微米)；M(每摩爾)；μM(每微摩爾)；mM(每毫摩爾)；N(正常)；mol(摩爾)；mmol(毫摩爾)；μmol(微摩爾)；nmol(納摩爾)；g(克)；mg(毫克)；μg(微克)；ng(納克)；L(升)；ml(毫升)；μl(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nM(每納摩爾)；℃(攝氏度)；和PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)。
實施例1制備乳液的方法所述乳液按如下步驟制備將有機溶劑、油類和表面活性劑混合，然后加熱所得混合物至37-90℃持續(xù)至多1小時，得到油相。再使用交互注射器或Silverson高速剪切混合器制備。向油相中加入水相且混合1-30分鐘，優(yōu)選5分鐘。若乳液含有揮發(fā)性的組分，這些組分應(yīng)與水相一起加入。
在一特定的實施方案中，按以下步驟制備該乳液混合磷酸三丁酯、大豆油和表面活性劑(如，TRITON X-100)，然后加熱所得混合物至86℃下1小時，得到油相。以體積/體積比例為一份油相對四份水的比例向油相中注射水分以制備乳液。乳液可以人工的，使用往復(fù)注射器，或分批的，或使用連續(xù)流動器進行生產(chǎn)。制備這些乳液的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員匙熟知的，且記載在，例如，美國專利號5,103,497；和4,895,452中，(此處合并作為整體參考)。表2顯示的是每一組分的比例、pH值和乳液的粒度，乳液粒度是在安裝有循環(huán)水浴的庫爾特LS 130激光尺寸測量器(Coulter LS 130 laser sizinginstrument)上測定的。
表2

*該乳液通過將BCTP乳液用水以1∶9的比例稀釋本發(fā)明的乳液非常穩(wěn)定。事實上，按上述方法制備的乳液貯存在密封的50-1000mL的聚丙烯試管中，在室溫下放置存在一整夜。然后檢查乳液的分離跡象。沒有顯示分離跡象的乳液被認為是“穩(wěn)定的”。穩(wěn)定的乳液再經(jīng)一年的監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)其仍然保持其穩(wěn)定狀態(tài)。
再次用上述方法制備乳液，然后在密封的50mL聚丙烯試管中，在-20℃下放置一整夜。然后監(jiān)測乳液的分離跡象。沒有分離跡象的乳液被認為是“穩(wěn)定的”。BCTP和BCTP 0.1乳液在室溫下儲存，至少24個月內(nèi)基本無變化。
實施例2本發(fā)明一種以液滴中乳化的脂質(zhì)體的形式存在的示例性細菌-滅活乳液的特性本發(fā)明的一種細菌滅活乳液，定義為X8W60PC，經(jīng)一種含脂質(zhì)的水包油乳液與BCTP混合而成。確切的說，一種，一種含脂質(zhì)的水包油乳液(此處指GMO/CPC脂質(zhì)乳液或“W808P”)，含有作為初級脂質(zhì)的甘油單油酸酯(GMO)，和作為正電荷制備劑的氯化鯨蠟基吡啶鎓(CPC)和BCTP以1∶1(體積比體積)的比例混合。美國專利號5,547,677(此處以其整體形式合并作為參考)，記載了能與BCTP相結(jié)合以制備本發(fā)明細菌-滅活水包油乳液的GMO/CPC脂質(zhì)乳液和其他相關(guān)的脂質(zhì)乳液。
實施例3體外殺菌效果的研究I-革蘭氏陽性菌為了研究本發(fā)明的乳液殺菌效果，將乳液與多種細菌混合10分鐘，然后用標準微生物介質(zhì)覆蓋以進行不同稀釋。與未經(jīng)處理的培養(yǎng)物比較菌落的數(shù)量以判斷經(jīng)過處置后殺滅的細菌百分數(shù)。表3概括了該試驗的結(jié)果。
表3

為了研究本發(fā)明的乳液對不同桿菌種營養(yǎng)型的殺菌效果，一種乳夜稀釋成三份稀釋液，與四種桿菌種型混合10分鐘，然后用微生物介質(zhì)覆蓋。與未經(jīng)處理的培養(yǎng)物比較菌落的數(shù)量以判斷經(jīng)過處置被殺滅的細菌百分數(shù)。表4包含了概括從幾項試驗得到殺菌結(jié)果，括號中是平均殺菌百分數(shù)。
表4

實施例4體外殺菌效果的研究II-革蘭氏陰性菌為了增加革蘭氏陰性菌細胞壁對細菌滅活乳液的攝取，因此加強了乳液對耐受革蘭氏陰性菌殺微生物的效果，EDTA(乙二胺四乙酸)先與乳液預(yù)混合。試驗中使用低濃度的EDTA(50-25μM)，混合物用不同的革蘭氏陰性菌培養(yǎng)15分鐘?；旌衔锏臍⒕Ч谝入硕闺伺囵B(yǎng)液上測定。結(jié)果在下文表5中詳述。使用BCTP 1/100的稀釋液能導致99％細菌數(shù)量的減少。細菌數(shù)的降低不能歸結(jié)為EDTA單獨的殺滅效果，因為在控制組中單獨使用250μM EDTA的結(jié)果顯示其不能在15分鐘內(nèi)降低細菌的數(shù)量。
表5

實施例5體外殺菌效果的研究III-營養(yǎng)型和孢子型蠟狀芽孢桿菌(B.cereus，ATCC #14579)用作炭疽桿菌的模型體系。開展使用BCTP稀釋制劑用以研究本發(fā)明化合物對營養(yǎng)型(活躍生長的)蠟狀芽孢桿菌的殺菌效果的試驗。評估在37℃下在介質(zhì)中的處置10分鐘情況。如表6所示，BCTP乳液能有效對抗營養(yǎng)型蠟狀芽孢桿菌。在所有測試濃度(包括高至1∶100的稀釋濃度)的所述制劑中暴露10分鐘足以完全殺滅營養(yǎng)型蠟狀芽孢桿菌。
表6

試驗次數(shù)＝4孢子型炭疽桿菌是作為生物武器使用的常用生物體之一。人們熟知，孢子對大多數(shù)消毒劑具有高的耐受力。如上文所述，有效的殺滅孢子通常要求使用毒性和刺激性的化學物質(zhì)，例如甲醛或次氯酸鈉(如，漂白劑)。因此對孢子型蠟狀芽孢桿菌進行同樣的試驗。如表7所示，在37℃下的所有的介質(zhì)中處置10分鐘不能有效的殺滅孢子型蠟狀芽孢桿菌。
表7

試驗次數(shù)＝2為了評估本發(fā)明化合物對孢子型蠟狀芽孢桿菌長時間的效果，BCTP以1∶100的稀釋度加入到固體凝膠介質(zhì)中，孢子則不均勻的涂在介質(zhì)表面上，在37℃下培養(yǎng)96小時。在加入BCTP的固體凝膠介質(zhì)中沒有發(fā)生(細菌)生長，96小時以外(即，＞99％的殺滅率，平均值＞99％，試驗三次)。
為了更接近的確定BCTP存在時殺滅孢子的時間，實施了以下試驗。簡單的說，一種孢子制劑用1∶100稀釋的BCTP處置，且與未處置的組比較。分別測定0.5、1、2、4、6和8小時后每毫升菌落形成單位(CFU/ml)的數(shù)量。如圖1所示，在最初的4小時的培養(yǎng)后，未處置組的CFU/ml有增加，然后到達一個坪濃度。在0時間和1、2、4和6小時制作用孢子結(jié)構(gòu)接種的細菌涂片，涂片顯示2個小時內(nèi)孢子結(jié)構(gòu)已經(jīng)不存在了(圖2A-2C)。因此，在未處置組中在2小時的點，孢子發(fā)生100％的萌發(fā)。在用BCTP處置的孢子制劑中，CFU/ml在最初2小時內(nèi)沒有顯示增加的跡象，然后在2-4小時后快速的下降。2-4小時后從CFU/ml基線水平的下降大約1000倍。在相同時間點制作的用孢子結(jié)構(gòu)接種的細菌涂片顯示孢子結(jié)構(gòu)在8小時內(nèi)一直保持到試驗?zāi)?。因此，在用BCTP熟知的組中沒有發(fā)生孢子萌發(fā)，這可歸結(jié)為萌發(fā)過程被抑制，或，由于孢子被破壞不能進行萌發(fā)。為了判斷乳液是否能有效的殺滅除蠟狀芽孢桿菌以外其他桿菌屬種，我們按以上方法實施了相同的試驗，其中孢子制劑用乳液和處置，并在培養(yǎng)4小時后與未處置組進行比較。試驗結(jié)果如下述表8所示，其中的數(shù)字表示從幾項試驗中得出的平均殺孢子活性。
表8

實施例6體內(nèi)殺菌效果的研究我們通過進行動物研究以闡述本發(fā)明乳液體內(nèi)的保護和治療效果。事先以試驗動物的蠟狀芽孢桿菌感染作為研究炭疽的模型體系(Burdon和Wende，1960；Burdon等，1967；Lamanna和Jones，1963)。試驗動物蠟狀芽孢桿菌感染誘發(fā)的疾病綜合癥在某些方面與炭疽桿菌相似(Drobniewski，1993；Fritz等，1995)。在向小鼠注射前，先將新乳液與蠟狀芽孢桿菌的孢子進行混合。
沖洗皮膚創(chuàng)傷用2.5×107蠟狀芽孢桿菌孢子感染1cm的皮膚傷口，感染接種后不再進行進一步的處置。其他的試驗組用相同數(shù)量的孢子感染。一小時后，傷口用新乳液或者鹽水沖洗以模擬后-暴露(post-exposure)凈化。48小時后，在傷口周圍出現(xiàn)了大面積的壞死，其平均面積為4.86cm2。此外，該組中60％的the動物由于感染而死亡。這些損害情況的組織學研究顯示真皮及皮下全部的壞死，且存在大量的營養(yǎng)型桿菌生物體。用鹽水沖洗試驗性感染的傷口沒有任何明顯的效果。
用新乳液沖洗蠟狀芽孢桿菌孢子感染的傷口產(chǎn)生了顯著的效果，其結(jié)果是損傷面積持續(xù)從4.86cm2降低到0.06cm2。伴隨著損傷面積的降低，與沒有處置或者用鹽水沖洗的試驗動物相比，動物的死亡率也下降了三倍(從60％到20％)。這些損害情況的組織學研究顯示營養(yǎng)型桿菌生物體已不存在，且真皮的損壞降低到了最小(Hamouda等，1999)。
皮下注射用鹽水1∶10稀釋的新乳液注射的CD-1小鼠作為對照組，且無論在整體或組織學上均未顯示出痛苦或炎癥反應(yīng)的跡象。為了測試蠟狀芽孢桿菌孢子的體內(nèi)致病效果及新乳液的殺孢子能力，將含4×107蠟狀芽孢桿菌孢子的混懸液與鹽水或者新乳液混合并最終稀釋成1∶10濃度，隨之立即在CD-1小鼠背上進行皮下注射。
皮下感染蠟狀芽孢桿菌孢子且未經(jīng)新乳液處置的小鼠在6-8小時內(nèi)出現(xiàn)了水腫。之后18-24小時在針孔周圍出現(xiàn)了灰色的壞死面積，在48小時后伴有嚴重的皮膚腐肉，并留下一個干燥、紅色的病灶。
同時注射孢子和新乳液的小鼠(即當孢子預(yù)先與新乳液混合時)，其壞死病灶面積的降低超過了98％，從1.68cm2降低到0.02cm2。該情況與水腫和炎癥的減輕有關(guān)(Hamouda等，1999)。
兔眼角膜用不同濃度的新乳液沖洗兔眼角膜，并監(jiān)測24及48小時。當使用治療劑量的組合物時，未觀察到刺激及反常現(xiàn)象。
粘膜在小鼠的每只鼻孔內(nèi)輸入25uL4％的納米乳液以測定乳液的鼻內(nèi)毒性。結(jié)果小鼠身上未發(fā)現(xiàn)臨床或病理組織學上的變化。
向大鼠給予最多8mL每kg的25％納米乳液以測定乳液口服毒性。結(jié)果大鼠未顯示體重減輕跡象或臨床上或病理組織學上的毒性跡象。我們也未觀察到乳液口服給藥引起的腸道菌群變化。
在一特定的實施方案中，蠟狀芽孢桿菌在血液瓊脂(含5％綿羊血液TSA，REMEL)上傳遞三次。從第三次傳遞的平板上卸下蠟狀芽孢桿菌，并與胰胨豆胨培養(yǎng)液(TSB)(可從BBL中得到)重新混懸。該蠟狀芽孢桿菌混懸液分成分裝入兩根試管中。向一根試管加入相同體積的消毒鹽水，并將0.1cc的蠟狀芽孢桿菌混懸液/鹽水混合物對5只小鼠進行皮下注射。向另一試管加入相同體積的BCTP(用消毒鹽水1∶5稀釋)并混合，最終得到BCTP1∶10的稀釋液。蠟狀芽孢桿菌混懸液/BCTP在37℃培養(yǎng)10分鐘，即用0.1cc蠟狀芽孢桿菌混懸液/BCTP的混合物對5只小鼠進行皮下注射。混合相同體積的BCTP(用消毒鹽水1∶5稀釋)和TSB，最終得到以1∶10稀釋的BCTP。將0.1cc該BCTP/TSB對5只小鼠皮下注射。
用如下方法計算蠟狀芽孢桿菌在接種物上的菌落形成單位(cfu)數(shù)量用蒸餾水制成蠟狀芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌/BCTP混懸液的10倍數(shù)系列稀釋液。每一稀釋液各接種在TSA復(fù)制平板上(10μl每平板)。TSA平板在37℃下培養(yǎng)一整夜。再計量菌落數(shù)，計算cfu/cc的數(shù)量。小鼠壞死病灶的尺寸比用預(yù)先作BCTP處置的蠟狀芽孢桿菌接種的小鼠要小一些。以下表9給出了試驗結(jié)果。
表9

蠟狀芽孢桿菌在營養(yǎng)瓊脂(Difco)上生長，該瓊脂含有用以誘導孢子成形的0.1％酵母提取物(Difco)和50μg/ml MnSO4。將平板卸下，在滅菌的50％乙醇中混懸，并在室溫下培養(yǎng)2小時，伴隨著激烈的攪拌以溶解剩余的營養(yǎng)型細菌?；鞈乙河?,500×g離心20分鐘，棄去上清液。余下顆粒物用diH2O重新混懸，再用2,500×g離心20分鐘，棄去上清液。孢子混懸液終于分開了。剩余顆粒物用TSB再混懸。0.1cc蠟狀芽孢桿菌孢子混懸液用鹽水1∶2稀釋，然后對3只CD-1小鼠皮下注射。混合相等體積的BCTP(用1∶5消毒鹽水稀釋)和蠟狀芽孢桿菌孢子混懸液，最終得到BCTP1∶10的稀釋液(預(yù)溫育時間)。向3只CD-1小鼠皮下注射0.1ccBCTP/蠟狀芽孢桿菌孢子混懸液。在培養(yǎng)液中蠟狀芽孢桿菌的菌落形成單位(cfu)的數(shù)量用以下方法計算用蒸餾水將蠟狀芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌BCTP混懸液稀釋成10倍數(shù)的稀釋液。用每一稀釋液(10ul每平板)接種TSA的復(fù)制平板。TSA平板在37℃培養(yǎng)一整夜。計量菌落數(shù)以計算cfu/cc的數(shù)量。小鼠壞死病灶的尺寸比用預(yù)先作BCTP處置的蠟狀芽孢桿菌孢子接種的小鼠要小一些。表10給出了所作研究的觀察結(jié)果。
表10

蠟狀芽孢桿菌在營養(yǎng)瓊脂(Difco)上生長，該瓊脂含有用以誘導孢子成形的0.1％酵母提取物(Difco)和50g/ml MnSO4。將平板卸下，在滅菌的50％乙醇中混懸，并在室溫下培養(yǎng)2小時，伴隨著激烈的攪拌以溶解剩余的營養(yǎng)型細菌?；鞈乙河?,500×g離心20分鐘，棄去上清液。余下顆粒物用diH2O重新混懸，再用2,500×g離心20分鐘，棄去上清液。顆粒物用TSB再次混懸。蠟狀芽孢桿菌孢子混懸液分裝入3只試管。將相同體積的消毒鹽水加到一根試管中，進行混合。對10只CD-1小鼠皮下注射0.1cc蠟狀芽孢桿菌混懸液/鹽水。將同體積的BCTP(用1∶5消毒鹽水稀釋)加到第二根試管中，并混合，得到BCTP以1∶10稀釋的最終稀釋液。將混合后的蠟狀芽孢桿菌孢子混懸液/BCTP(1∶10)在37℃下培養(yǎng)4小時。向10只CD-1小鼠皮下注射0.1cc蠟狀芽孢桿菌孢子混懸液/BCTP(1∶10)。將相同體積的BCTP(用消毒鹽水1∶50稀釋)加入到第三根試管中，并混合，得到以1∶100稀釋的BCTP稀釋液。將混合后的蠟狀芽孢桿菌孢子混懸液/BCTP(1∶100)在37℃下培養(yǎng)4小時。向10只CD-1小鼠皮下注射0.1cc蠟狀芽孢桿菌孢子混懸液/BCTP(1∶100)。將相同體積的(以消毒鹽水1∶5稀釋)和TSB混合，得到以1∶10稀釋的BCTP稀釋液。向10只CD-1小鼠皮下注射0.1cc的BCTPFTSB。將相同體積BCTP(用消毒鹽水1∶50稀釋)和TSB混合，得到以1∶100稀釋的BCTP稀釋液。向10只CD-1小鼠皮下注射0.1cc的BCTP/TSB。從這些研究中得出的觀察結(jié)果見于表11和表12。
表11

注意皮膚損傷為灰色，伴隨有水腫，壞死部位紅色/干燥。
表12

從小鼠的皮膚病灶、血液、肝臟和脾臟中嘗試重新分離蠟狀芽孢桿菌(表13)。皮膚病灶用70％消毒異丙醇沖洗后用betadine清洗干凈。在病灶和擦洗處邊緣作一切口。小鼠胸部用70％消毒異丙醇沖洗后用betadine清洗干凈。用心臟穿刺術(shù)抽出血液。其腹部用70％消毒異丙醇沖洗后用betadine清洗干凈。皮膚和腹部肌肉用分別的消毒儀器斷開。使用分別的消毒儀器取出肝臟和脾臟樣本。先將肝臟和脾臟樣本快速通過火焰，再用消毒儀器剪切。新鮮暴露的表面用于接種。接種BHI瓊脂(Difco)且在37℃下有氧培養(yǎng)一整夜。
表13

*盡管小鼠無病灶，但是生物體從注射點轉(zhuǎn)移。
在向試驗動物中引入蠟狀芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌孢之前，先將兩者進行預(yù)處理以降低其引起疾病綜合癥的能力。其結(jié)果反映在皮膚病灶尺寸的減小及從病灶處回收的蠟狀芽孢桿菌的數(shù)量普遍降低上。另外，蠟狀芽孢桿菌從血液、肝臟和脾臟重分離頻率的降低顯示其能防止敗血癥。
實施例7體內(nèi)毒性研究ICD-1小鼠皮下注射0.1cc本發(fā)明化合物，并對其炎癥和/或壞死的情況觀察4天。用消毒鹽水制作該化合物的稀釋液。從小鼠得到的組織樣本保存于10％中性福爾馬林緩沖液中以供組織病理學檢查。送與組織學觀察的皮膚和肌肉樣本(從用未稀釋化合物注射的小鼠中得到)的觀察結(jié)果顯示其有組織壞死的跡象。從注射稀釋化合物小鼠中得到的組織樣本沒有進行組織學檢查。表14和15顯示了兩項獨立試驗的結(jié)果。
表14

表15

幾內(nèi)亞豬用1.0cc/位點本發(fā)明化合物進行肌內(nèi)注射(在兩條后腿上)，并對炎癥和/或壞死跡象觀察4天。用消毒鹽水制作該化合物的稀釋液。
從幾內(nèi)亞豬得到組織樣本的保存于10％中性福爾馬林緩沖液中以供組織病理學檢查。組織樣本未經(jīng)組織學檢查。
表16

體內(nèi)毒性研究I的結(jié)果顯示皮下和肌內(nèi)注射測試性化合物不會引起可觀測到的組織損壞，且未在試驗動物中引起痛苦反應(yīng)。
實施例8體內(nèi)毒性研究II將一組Sprague-Dawley大鼠，每組含有五只雄性五只雌性大鼠，將該組大鼠置于單獨的籠子中，且在給藥前先讓其適應(yīng)五天。之后大鼠持續(xù)14天每天給藥。在第0-13天內(nèi)，組1中的每只大鼠在14天內(nèi)連續(xù)的用管飼法連續(xù)給予三毫升1∶100濃度的BCTP。三毫升劑量是確定的對于大鼠來說的最高口服劑量。在給藥的第0天和第7天之前，對每只大鼠進行稱重。之后在研究期間，大鼠每星期稱重一次。每天觀察動物的痛苦癥狀與死亡率。給動物休息(不給藥)14天。在第28天，大鼠稱重后實施安樂死?？诜拘匝芯恐行∈蟮钠骄亓渴居诒?7中17。第0、7、14、21和28天中的雄性和雌性大鼠的平均重量，及從第0-28天內(nèi)的平均重量也示于表17中。在第14天的給藥中，有一只大鼠死于操作管飼管時的機械創(chuàng)傷。所有存活的大鼠在研究進行的28天內(nèi)體重有所增加且未報告有疾病產(chǎn)生。因此，雖然大家知道單獨使用磷酸三丁酯具有毒性且刺激粘膜，但是當與本發(fā)明的乳液相結(jié)合時，這些特征都消釋了。相應(yīng)的根據(jù)16 CFR§1500.3，1∶100濃度的BCTP乳液同樣用于在兔子上測試其皮膚毒性。在動物試驗中，乳液不刺激皮膚。
表17

毒性試驗的常用方法包括皮膚刺激測試、眼睛刺激測試、皮下測試、肌內(nèi)測試、沖洗開放式傷口、比內(nèi)測試和口服測試。皮膚測試可在兔子上測試，其中0.5ml的10％乳液施于皮膚或兔子上保持4小時。皮膚反應(yīng)的記錄最長為72小時。Draize標度用于標記刺激度。進行眼睛刺激測試時，0.1ml 10％乳液施于兔子的眼部，所記錄的眼部反應(yīng)最長為72小時。用Draize標度標記刺激度。皮下和肌內(nèi)測試中向小鼠注射0.1ml 10％乳液。沖洗開放式傷口測試中向小鼠施用2ml10％乳液。進行鼻內(nèi)測試時，0.25m/兩鼻孔劑量的2-4％乳液施用于小鼠。進行口服測試時，用4ml/kg/天10％乳液劑量口服給藥一周或單獨給予8ml/kg量100％乳液。
實施例9使用炭疽桿菌的體外研究使用X8W60PC制劑以研究本發(fā)明化合物對炭疽桿菌孢子的殺菌效果。不同X8W60PC(水中)稀釋液對6種不同炭疽桿菌菌株的殺孢子活性示于圖3.如圖4和5所示，X8W60PC 能在4小時內(nèi)殺滅超過98％的7種不同炭疽菌株(圖3和Ames中的菌株，USAMRID)，效果與1-10％的漂白劑相似。X8W60PC在介質(zhì)中不同的稀釋液也具有相似的殺孢子活性in media(圖6)。圖7顯示了X8W60PC在室溫下與零時間相比，其對炭疽桿菌Del Rio、TX菌株殺孢子活性的時間過程。如圖所示，X8W60PC能在30分鐘內(nèi)殺滅炭疽孢子。
實施例10作用機理以下實施例探詢本發(fā)明乳液預(yù)期的作用機理以表明其殺孢子活性。該機理并不意在此限定本發(fā)明范圍，理解其機理對于實踐本發(fā)明并不是必須的，且本發(fā)明不限于任一特定機理。檢測GMO/CPC脂質(zhì)乳液(“W808P”)和BCTP對大腸桿菌的影響。W808P能殺滅大腸桿菌(在去離子水中)，然而BCTP對此生物體無效。圖8顯示檢測結(jié)果，圖9顯示用BCTP處置的大腸桿菌。如圖9所示，用BCTP處置的大腸桿菌看起來很正常，其確定結(jié)構(gòu)及脂質(zhì)細胞膜未被破壞。圖10顯示用P10處置的大腸桿菌細菌體內(nèi)有空泡且其內(nèi)容物發(fā)生了溶脹，因此生物體失去了其確定的結(jié)構(gòu)。與某一特定的理論無關(guān)(理解其機理對于實踐本發(fā)明并不是必須的，且本發(fā)明不限于任一特定機理)，此觀察結(jié)果表明W808P殺滅細菌并不靠溶解細菌，相反通過改變其內(nèi)部結(jié)構(gòu)，確切的是形成空泡及溶脹，來殺滅細菌的。第二項研究使用霍亂弧菌。盡管霍亂弧菌與大腸桿菌相類似，但是BCTP、W808P和X8W60PC都能殺滅生物體。與對照的電子顯微圖(圖11)相比，W808P處置的霍亂弧菌(圖12)再次顯示了溶脹及生物體內(nèi)部的變化，然而其細胞壁卻完好。相反，BCTP處置的霍亂弧菌(圖13)完全溶解了細菌，只剩下細胞碎片。X8W60PC(圖14)顯示了上述的聯(lián)合效果，其中一些生物體溶脹但未被破壞，一些則被溶解。這清楚的表明BCTP、W808P和X8W60PC的工作機理不同。
進行第三項對比性研究以評估不同濃度乳液的效果。如表18所示，X8W60PC在低濃度下(較高稀釋度)作為殺蟲劑對W808P或BCTP敏感的細菌更為有效。另外，6種耐W808P和BCTP的其它細菌都能被X8W60PC影響。所述活力上的不同之處也可在比較W808P、BCTP和X8W60PC的流感傳染性試驗的結(jié)果中看出來。如圖15所示，BCTP和X8W60PC在1∶10和1∶100稀釋時有效，另外，X8W60PC能在最低濃度1∶1,000稀釋時依然有效。相反，W808P在1∶10稀釋時已幾乎沒有活力了，表明其在對付這種包膜生物體時，不是一種有效的治療劑。另外，X8W60PC能殺滅W808P或BCTP不能殺滅的酵母菌株。
表18殺滅90％所選微生物所需的最低納米乳液濃度

*無法得到更低濃度的數(shù)據(jù)#除了在去離子水中外未殺死細菌10 ND＝未測定實施例11納米乳液對桿菌菌種的殺孢子活性的進一步研究本實施例給出了本發(fā)明特定實施方案的乳液對不同桿菌孢子的滅活能力的附加研究的結(jié)果。這些研究所用方法和結(jié)果在下文中概述。
表面活性劑液體制劑BCTP，一種油包水型納米乳液，其中油相源于大豆油、正磷酸三丁酯、和在80％水中的TRITON X-100?；旌贤w積的BCTP和W808P(一種由甘油單酯、精煉大豆固醇、TWEEN 60、大豆油、一種陽離子含鹵CPC和薄荷油制成的類似脂質(zhì)體的化合物)以制成X8W60PC。
孢子制劑為了誘導孢子成形，在37℃下，將蠟狀芽孢桿菌(ATTC14579)、環(huán)狀芽孢桿菌(ATC 4513)、巨大芽孢桿菌(ATCC 14581)和枯草芽孢桿菌(ATCC 11774)置于NAYEMn瓊脂上(含0.1％酵母提取物和5mg/l MnSO4的營養(yǎng)瓊脂)培養(yǎng)生長一周。剔除平板，細菌/孢子混懸于50％無菌乙醇中，且在室溫下(27℃)培養(yǎng)2小時，培養(yǎng)時伴有攪拌以溶解殘余的營養(yǎng)型細菌?；鞈乙涸?,500×g下離心20分鐘，沉淀顆粒用冷diH2O沖洗兩遍。沉淀的孢子顆粒重新混懸于胰胨豆胨培養(yǎng)液(TSB)中，且迅疾用于試驗中。將Bruce Ivins博士(USAMRIID，F(xiàn)ortDetrick，F(xiàn)rederick，MD)提供的炭疽桿菌孢子Ames和Vollum 1B菌株用前述方法預(yù)制備(Ivins等，1995)。其他四種炭疽菌株由MartinHugh-Jones博士(LSU，Baton Rouge，LA)提供。這些獨立提供的菌株與南非、莫桑比克、加拿大Bison；和德克薩斯Del Rio(菌株)在等位(基因)上有很大的不同。
體外殺孢子測試For assessment of評估固體介質(zhì)的殺孢子活性時，先將胰胨豆胨瓊脂(TSA)高壓滅菌，再冷卻至55℃。將最終稀釋度為1∶100的BCTP加入到TSA中，并在傾斜平板時不斷的攪拌。不斷的稀釋孢子制劑(10倍)，并將等量的10μl制作兩份平板(最高接種為105孢子每平板)。平板在有氧37℃條件下48小時，并評估其生長情況。
在評估液體介質(zhì)中的殺孢子活性時，孢子用TSB重新混懸。1ml孢子混懸液含有含有2×106孢子(最終濃度為106孢子/ml)，該混懸液與1ml BCTP或X8W60PC在試管中混合(在diH2O中的最終濃度為2X)。試管在37℃旋轉(zhuǎn)管中培養(yǎng)4小時。經(jīng)處置，混懸液在diH2O中稀釋了10倍。從每一稀釋液中量取二等份(25μl)在TSA上劃線，再再37℃下培養(yǎng)一整夜，然后清點菌落數(shù)量。以百分率表示的殺孢子活性計算如下 試驗重復(fù)3次，計算其平均殺滅值。
電子顯微鏡用TSB稀釋的最終稀釋度為1∶100的BCTP處置蠟狀芽孢桿菌孢子，在37℃搖擺式恒溫器中使用Erlenmeyer燒瓶進行處置。間隔時取出50ml樣本，并在2,500×g下離心20分鐘，棄去上清液。沉淀顆粒在0.1M二甲胂酸鹽(pH7.3)中與4％戊二醛結(jié)合固定。經(jīng)加工的孢子沉淀顆粒用透射電子顯微鏡檢測，同時經(jīng)乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后用薄切片檢測。
萌發(fā)抑制劑/激動劑蠟狀芽孢桿菌孢子(最終濃度為106孢子/ml)與萌發(fā)抑制劑D-丙氨酸(最終濃度為1μM)或與萌發(fā)激動劑L-丙氨酸+肌苷(每種最終濃度為50μM)在TSB中混合(Titball和Manchee，1987；Foster和Johnston，1990；Shibata等，1976)，然后立刻與BCTP(最終濃度為1∶100)混合且在不等時間段內(nèi)培養(yǎng)。然后將混合物連續(xù)的稀釋、鋪板、培養(yǎng)一整夜。第二天清點平板并計算殺孢子活性的百分數(shù)。
體內(nèi)殺孢子活性建立兩類動物模型；在第一組中，蠟狀芽孢桿菌孢子(混懸于消毒鹽水中)與等體積最終稀釋都為1∶10的BCTP混合。作為對照，相同的蠟狀芽孢桿菌孢子混懸液與同體積的消毒鹽水混合。每100ul含有4×107孢子的混懸液隨后立即皮下注射入CD-1小鼠中。
在第二組中，在小鼠背部開一切口制作模擬傷口。用麻醉解剖法分離皮膚與其下的肌肉。分離后形成的“袋囊”用200μl含2.5×107孢子(在鹽水中)接種后用創(chuàng)傷鉗封合傷口。一小時后，拆掉創(chuàng)傷鉗，并用2ml消毒鹽水或2ml BCTP(在1∶10消毒鹽水中)沖洗傷口。再用創(chuàng)傷鉗封合傷口。觀察動物的臨床跡象。整體和組織病理學研究后5天對試驗動物實施安樂死。傷口尺寸的計算用如下公式1/2a×1/2b×π，其中a和b是傷口上相互垂直的直徑。
體外殺孢子活性為了評估BCTP的殺孢子活性，我們測試了從四種桿菌菌種(蠟狀芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、和枯草芽孢桿菌)中得到的孢子。BCTP 1∶100稀釋度顯示其在4小時內(nèi)對蠟狀芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌具有91％殺孢子活性(圖16)。對BCTP不甚敏感的環(huán)狀芽孢桿菌減少了80％孢子數(shù)量，而枯草芽孢桿菌在4小時顯示對BCTP具有耐受性。使用1∶100稀釋度的漂白劑(即，0.0525％次氯酸鈉)來比較BCTP(1∶10和1∶100稀釋度)對蠟狀芽孢桿菌孢子殺孢子效果，結(jié)果在殺孢子力的速度和程度上都沒有明顯的差別。另一種納米乳液，X8W60PC，能有效的殺死桿菌孢子。在以1∶1000稀釋時，其在4小時內(nèi)能殺滅98％蠟狀芽孢桿菌孢子(與47％BCTP以1∶1000稀釋時相比)。與枯草芽孢桿菌孢子對BCTP具有耐受性相反，X8W60PC1∶1000稀釋液在4小時內(nèi)能殺滅97.6％枯草芽孢桿菌孢子。
蠟狀芽孢桿菌孢子殺滅的時程我們對時間過程進行研究以分析稀釋成1∶100的BCTP和稀釋成1∶1000的X8W60PC在超過8小時的時段內(nèi)對蠟狀芽孢桿菌的殺孢子活性。BCTP 1∶100稀釋液與蠟狀芽孢桿菌孢子培養(yǎng)，其結(jié)果是在1小時內(nèi)，活力孢子的數(shù)量減少了77％，4小時后減少了95％。結(jié)果仍然是X8W60PC 1∶1000稀釋液比BCTP 1∶100稀釋液更有效，其在30分鐘后使孢子數(shù)降低了95％(圖17)。
BCTP對炭疽桿菌的殺孢子活性在初期體外試驗之后，我們測試了BCTP對兩種炭疽桿菌惡性菌株(Ames和Vollum 1B)的殺孢子活性。我們發(fā)現(xiàn)BCTP1∶100稀釋液加入到細菌生長介質(zhì)中能完全抑制1×105炭疽桿菌孢子的生長。同時，用最高稀釋到1∶1000的BCTP稀釋液在室溫下培養(yǎng)混合物4小時，其無論對Ames菌株還是Vollum 1B菌株的孢子都有91％的殺孢子活性，在37℃下培養(yǎng)混合物時，其具有超過96％的殺孢子活性(表19)。
表19BCTP對2種不同炭疽桿菌的菌株的殺孢子活性用菌落減少測試(殺滅％)判斷。最高稀釋到1∶1000的BCTP稀釋液在27℃或37℃下，在4小時內(nèi)能有效的殺滅＞91％的兩種孢子菌株；其在孢子萌發(fā)程度上有明顯的不同。殺孢子活性連續(xù)起效的孢子濃度最多為1×106/ml。

X8W60PC炭疽桿菌殺孢子活性由于X8W60PC在高稀釋度時較BCTP能更有效的對抗多種桿菌孢子，我們測試了其最高1∶10,000稀釋液在室溫下抑制4種不同炭疽桿菌菌株萌發(fā)的效果。結(jié)果顯示X8W60PC1∶1000稀釋液的最高殺滅率在86％和99.9％之間(表20)。
表20X8W60PC對4種不同炭疽桿菌菌株的殺孢子活性表明了其不同的臨床分離(clinical isolates)。用X8W60PC不同稀釋度在室溫下處置孢子以減少萌發(fā)。在較低的稀釋度下，沒有顯著的殺死孢子。1∶1000的稀釋度的殺孢子效果最高。

孢子的電子顯微鏡檢測使用蠟狀芽孢桿菌進行研究，因為它是最接近炭疽桿菌的微生物。在TSB中用1∶100稀釋的BCTP處置蠟狀芽孢桿菌孢子4小時，透射電子顯微鏡的檢測結(jié)果顯示蠟狀芽孢桿菌孢子發(fā)生物理損傷，包括孢膜和皮層進一步的破壞，伴有孢核畸變及密度降低(圖18)。
萌發(fā)激動和抑制為了研究BCTP殺桿菌孢子作用中對萌發(fā)啟動的效果，萌發(fā)抑制劑D-丙氨酸(Titball和Manchee，1987；Foster和Johnston，1990)和萌發(fā)促進劑L-丙氨酸和肌苷(Shibata等，1976)與孢子及BCTP一起培養(yǎng)1小時。當10mM D-丙氨酸時存在時，BCTP的殺孢子效果被延遲，而當50μM L-丙氨酸和50μM肌苷存在時，其效果被加速(圖19)。
體內(nèi)殺孢子活性試驗動物蠟狀芽孢桿菌感染之前已用作用以研究炭疽的模型系統(tǒng)，其引起的疾病與試驗性炭疽感染相似(Welkos等，1986；Drobniewski，1993；Burdon和Wende，1960；Burdon等，1967；Fritz等1995等，1995；Welkos和Friedlander，1988)。建立兩組皮膚蠟狀芽孢桿菌疾病的動物模型以研究BCTP的體內(nèi)效果。由于這些模型涉及皮下給予納米乳液，在此之前先進行BCTP體內(nèi)毒性的測試。用BCTP 1∶10鹽水稀釋液注射CD-1小鼠作為對照，其未顯示整體或組織病理學分析上的痛苦或炎癥反應(yīng)的跡象(圖20A，圖20B)。為了測試蠟狀芽孢桿菌孢子體內(nèi)的致病效果及BCTP的殺孢子效果，將含4×107蠟狀芽孢桿菌孢子的混懸液與鹽水或與BCTP混合，其最終稀釋度為1∶10，然后立刻向CD-1小鼠背部進行皮下注射。皮下感染蠟狀芽孢桿菌孢子而未注射BCTP的小鼠在6-8小時產(chǎn)生了嚴重的浮腫。之后18-24小時在注射點周圍產(chǎn)生了灰色的壞死區(qū)域，并在48小時產(chǎn)生了嚴重的皮膚腐肉，留下一干燥、紅色的病灶(圖20C，圖20D)。當孢子與BCTP預(yù)先混合時，同時注射孢子和BCTP能降低98％的壞死病灶，病灶大小從1.68cm2下降到0.02cm2。此結(jié)果與浮腫或炎癥的減輕有關(guān)(圖20E，圖20F)。
在其他研究中，用2.5×107蠟狀芽孢桿菌孢子感染1cm的皮膚傷口，然后未經(jīng)任何處置即封合傷口(圖21A，圖21B)。其他組用相同數(shù)量的孢子感染，1小時后用BCTP或鹽水沖洗傷口以模擬后暴露(post-exposure)凈化。用鹽水沖洗實驗性感染傷口沒有產(chǎn)生任何顯著的效果(圖21C，圖21D)。用BCTP沖洗被蠟狀芽孢桿菌孢子感染的傷口產(chǎn)生了相當好的效果，病灶面積連續(xù)從4.86cm2降低到0.06cm2(圖21E，圖21F)。與未經(jīng)處理的小鼠或用鹽水沖洗的小鼠比較，改組小鼠在病灶面積的降低的同時，死亡率也降低了4倍(80％到20％)。
實施例12表面活性劑脂質(zhì)制劑(SLPS)對A型流感病毒的體外影響包膜病毒是重要的病原體。他們傳播迅速且能在宿主體外存活較長的時間。選用A型流感病毒的原因是其是抗病毒試劑試驗中廣泛使用的模型(Karaivanova和Spiro，1998；Mammen等，1995；Huang等，1991)。流感病毒是臨床上重要的呼吸系統(tǒng)病原體，其傳播廣泛且能引起嚴重的大面積流行疾病(Mulder and Hers，1972)。
包膜糖蛋白、血細胞凝集素(HA)和神經(jīng)氨酸苷酶(NA)不僅能判斷流感病毒亞型的抗原特性(Schulze，1997)，還能隨之迅速的發(fā)生改變，結(jié)果使得病毒巧妙的躲避了宿主防御系統(tǒng)。這將導致對相關(guān)菌株具免疫性的個體患上疾病。下文將詳細敘述用于判斷SLPs對A型流感病毒傳染性的預(yù)防效果的方法及組合物。
表面活性劑脂質(zhì)制劑(SLPs)SLPs制備需兩個步驟將大豆油及表1所列試劑混合并加熱至86℃1小時，得到油相(Florence，1993)。使用循環(huán)注射泵將注射水或含1％鉍的水(SS)以體積/體積比例加入到油相中，形成SLPs。
病毒A/AA/6/60型流感病毒(Hedocher等，1996)由HuneinF.Maassab博士(密歇根大學公共衛(wèi)生學院)提供。進行標準操作(Barrett和Inglis，1985)使A型流感病毒在已受精的不含病原體的卵細胞的尿囊腔內(nèi)繁殖(SPAFAS，Norwich，CT)。病毒貯庫以整數(shù)量保持(108pfu/ml)在80℃下易傳染的尿囊液。腺病毒載體(AD.RSV ntlacZ)由Vector Core Facility(密歇根大學醫(yī)學中心，Ann Arbor，密歇根)提供，以整數(shù)量保持(80℃下1012pfu/ml)。該載體基于人類去除了核苷酸序列E1A和E1B段及部分E3段的腺病毒(血清型5)基因主鏈。這樣削弱了病毒復(fù)制或轉(zhuǎn)變成非許可性細胞的能力。在肉瘤病毒長末端重復(fù)序列(RSV-LTR)的啟動子控制下，它攜帶了大腸桿菌LacZ基因、編碼、β-半乳糖甙酶。其含有與LacZ基因5’末端相連接的核導向(或作為核導向)的表位以促進蛋白質(zhì)表達的檢測(Baragi等，1995)。
細胞從美國樣本培養(yǎng)收集中心(ATCC；Rockville，MD)購買到Madin Darby Canine Kidney(MDCK)細胞；從Vector Core Facility(密歇根大學醫(yī)學中心，Ann Arbor，密歇根州)處獲得293細胞(CRL 1573；轉(zhuǎn)化初生胚人類腎臟)。293細胞表達腺病毒5的轉(zhuǎn)換基因，因此能恢復(fù)Ad.RSV ntlacZ載體在宿主細胞中復(fù)制的能力(Graham等，1977)。
細胞保持介質(zhì)MDCK細胞與Earle’s鹽類、2mM L-谷氨酰胺、1.5g/l含有10％胚胎牛血清(FBS；Hyclone實驗室，Logan，UT)的碳酸氫納(Mediatech公司，Hemdon，VA)一起保存在Eagle’s最低必須介質(zhì)中。介質(zhì)中需不斷添加0.1mM非必須氨基酸、1.0mM丙酮酸鈉、100U青霉素/ml和鏈霉素100μg/ml(生命技術(shù)，Gaithersburg，MD)作為補充。293細胞保存在Dulbecco’s修飾的Eagle介質(zhì)中(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)，該介質(zhì)含有2mM L-谷氨酰胺、0.1mM非必須氨基酸和1.0mM丙酮酸鈉。其還含有100U青霉素/ml和鏈霉素100μg/ml(生命技術(shù)，Gaithersburg，MD)并添加10％FBS(Hyclone實驗室，Logan，UT)作為補充。
病毒傳染介質(zhì)A型流感病毒傳染介質(zhì)為MDCK細胞的保存介質(zhì)(without FBS)，該介質(zhì)添加3.0μg/ml經(jīng)甲苯磺酰苯丙酰胺氯甲基酮(TPCK)-處置的胰蛋白酶(Worthington生化公司Lakewood，NJ)作為補充。腺病毒傳染介質(zhì)是293細胞的保存介質(zhì)，介質(zhì)所含的血清濃度較低(2％FBS)。
A型流感病毒覆蓋介質(zhì)(overlay medium)覆蓋介質(zhì)由等量的2x傳染介質(zhì)和1.6％SEAKEM ME瓊脂糖組成(FMC生物產(chǎn)品，Rockland，MD)。染色瓊脂糖覆蓋介質(zhì)由瓊脂糖覆蓋介質(zhì)加上0.01％中性紅溶液(Life Technologies，Gaithersburg，MD)組成，其中不含TPCK-處置的胰蛋白酶。
斑點數(shù)(plaque)降低測定法(PRA)將別處記載的斑點數(shù)降低測定法(Hayden等，1980)作修改后，即是我們所用的斑點數(shù)降低測定法。MDCK以1×105細胞/孔的量接種于12-孔FALCON平板上，在37℃/5％CO2下培養(yǎng)3天。大約1×108pfu的A型流感病毒按以下方法用表面活性劑脂質(zhì)制劑培養(yǎng)。A型流感病毒-SLP處置組和對照組用傳染介質(zhì)稀釋使之含有30-100pfu/250μl。融合細胞單分子層以三倍量接種在3塊平板上，在37℃/5％CO2下培養(yǎng)1小時。抽出接種物/介質(zhì)，加入1ml/孔的瓊脂糖覆蓋介質(zhì)，平板在在37℃/5％CO2下培養(yǎng)至出現(xiàn)斑點。單分子層沾染上瓊脂糖覆蓋介質(zhì)時，繼續(xù)在37℃/5％CO2下培養(yǎng)。染色后6-12小時計算斑點數(shù)目。比較具有液體濃度的9孔中計算出的平均斑點數(shù)與未處置的含病毒孔的平均斑點數(shù)。
原位細胞酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)優(yōu)選原位細胞ELISA以檢測及定量在MDCK細胞內(nèi)感染A型流感病毒的病毒蛋白。簡單的說，將100μl完全介質(zhì)中的2×104MDCK細胞加入到96-孔平底微量平板和培養(yǎng)一整夜。第二天，除去培養(yǎng)介質(zhì)，用不含保存介質(zhì)的血清洗滌細胞。將100μl病毒接種體加入到小孔中培養(yǎng)1小時。之后初期病毒接種體，代替加入100μlMDCK細胞保存介質(zhì)與2％FBS。受感染的MDCK細胞再培養(yǎng)24小時。然后再將細胞用PBS沖洗一次，用冰冷的乙醇∶丙酮(1∶1)混合物將其結(jié)合固定，于-20℃保存。在測定的當天，含固定化細胞的小孔用PBS沖洗，且用存在于PBS中的1％干乳在37℃下阻滯30分鐘。100μl以1∶1000稀釋的ferret抗-A型流感病毒多系抗體(由Hunein F.Maassab博士提供，密歇根大學公共衛(wèi)生學院)在37℃下加入到小孔中持續(xù)1小時。細胞用洗滌緩沖液(PBS和0.05％TWEEN-20)洗滌四次，在37℃下與100μl以1∶1000稀釋的山羊抗-ferret過氧化物酶結(jié)合抗體(Kirkegaard & Perry實驗室，Gaithersburg，MA)培養(yǎng)30分鐘。細胞洗滌四次后與100μl 1-STEPTURBO TMB-ELISA底物(Pierce，Rockford，IL)一起培養(yǎng)至顏色發(fā)生變化。加入1N硫酸中斷反應(yīng)，平板用ELISA微量讀取器在450nm波長下讀取。
β-半乳糖甙酶測定法和其他文獻描述的一樣，在細胞提取物中使用β-半乳糖甙酶測定法(Lim，1989)。簡單的說，293細胞以大約4×104細胞/孔的濃度接種在96-孔“U”型-底部的組織接種平板上，在保持介質(zhì)中于37℃/5％CO2下培養(yǎng)一整夜。的二天，除去介質(zhì)，細胞用100μl Dulbecco’s磷酸酯緩沖的鹽水(DPBS)洗滌。腺病毒貯庫用傳染介質(zhì)稀釋至濃度未5×107pfu/mi，并與下文中不同濃度的BCTP混合。用BCTP處置后，病毒用傳染介質(zhì)稀釋至濃度為1×104pfu/mi，并用293細胞覆蓋。細胞在37℃/5％ CO2下培養(yǎng)5天，之后離心平板，除去介質(zhì)并用不含Ca++和Mg++的PBS洗滌細胞三次。在第三次洗滌后，抽出PBS，將100μl 1×Reporter Lysis緩沖劑(Promega，Madison，WI)加入到每一孔中。為了增加細胞溶解，平板冷凍再解凍三次，遵循β半乳糖甙酶供應(yīng)商(Promega，Madison，WI)提供的試驗方法，并作某些改變后實施此項β-半乳糖甙酶測定法。5微升細胞提取物轉(zhuǎn)移至96-孔平底平板中，與45μl 1x Reporter Lysis緩沖劑(1∶10)相混合。隨后加入50μl 2x測試緩沖劑(120mM Na2HPO4、80mM NaH2PO4、2mM MgCl2、100mM(3-巰基乙醇、1.33mg/ml ONPG(Sigma，St.Louis，MO))并與細胞混合。平板在室溫下培養(yǎng)至產(chǎn)生淡黃色。此時加入100μl1M碳酸氫納以終止反應(yīng)。平板用ELISA微量讀取器在420nm波長下讀取結(jié)果。一種標準的，含(u/μl β-半乳糖甙酶(Sigma，St.Louis，MO)、以50mM N-二甘氨酸緩沖劑(Sigma，St.Louis，MO)為補充的、pH為7.5且以100(g/ml BSA)稀釋于1x Reporter Lysis緩沖劑中的β-半乳糖甙酶存在于測試的全過程中。每一細胞提取物中的β-半乳糖甙酶單位使用以標準水平為參考的回歸分析計算，并用細胞提取物樣本中蛋白的毫克數(shù)來表達。
細胞毒性及脂質(zhì)制劑病毒處置法在病毒敏感性測試之前，SLPs對MDCK和293細胞的細胞毒性用顯微鏡檢測和MTT測定法來測定。制備的病毒與用于敏感性測試的SLPs混合物的稀釋液濃度應(yīng)遠高于SLP被測試的安全濃度。如搖擺器結(jié)果所示，大約1×108pfu A型流感病毒或腺病毒與最終濃度為1∶10、1∶100和1∶1000的脂質(zhì)制劑一起培養(yǎng)不同的時間。培養(yǎng)之后，在適當?shù)膫魅窘橘|(zhì)中制備SLP/病毒混合物的血清稀釋液，并覆蓋MDCK(A型流感病毒)或293(腺病毒)細胞以進行上述PRA，細胞內(nèi)ELISA或β-半乳糖甙酶 測定。
電子顯微鏡A型流感病毒從尿囊液中通過一個30％的蔗糖墊進行半純化，該蔗糖墊用GTNE(甘氨酸200mM、Tris-HCl 10mM(pH8.8)、NaCl 100mM和EDTA 1mM)在高速離心(Beckman rotor SW 28 Ti，以20,000rpm旋轉(zhuǎn)16小時)下制成。顆粒沉淀的病毒在GTNE重新組成。10微升獨立樣本(腺病毒，流感病毒，腺病毒+BCTP，流感病毒+BCTP)培養(yǎng)15和60分鐘后，置于用火棉膠片包裹的200目銅柵欄上2分鐘。然后加入5μl 2％鹽二甲胂酸化-緩沖戊二醛。用濾紙過濾3分鐘濾去液體。向柵欄加入10微升7％乙酸雙氧鈾，30秒后用濾紙濾去。柵欄干燥10分鐘后在Philips EM400T透射電子顯微鏡檢測。顯微圖片以200,000x放大率紀律在Fuji FG膠片上。
A型流感病毒對SLPS的敏感性測試我們研究了四種表面活性劑脂質(zhì)制劑(BCTP，NN，W808P，和SS)對抗A型流感病毒MDCK細胞感染的效果。所有被測試的制劑都能不同程度的抑制A型流感病毒的傳染，如圖22所示。BCTP和SS在1∶10稀釋液中對A型流感病毒傳染有超過95％抑制。NN和W808P對A型流感病毒只有一半的效果，它們降低了大約40％的傳染。即使將BCTP稀釋到1∶100，其殺病毒效果也未降低。SS在1∶100稀釋度時，其抑制A型流感病毒傳染的效果降低到55％。這兩種脂性制劑在1∶1000稀釋時對病毒傳染僅有微弱的抑制能力，范圍是22-29％(圖22B)。
由于BCTP和SS都對病毒傳染有強的抑制效果，因此用PRA檢驗從細胞ELISA測定獲得的數(shù)據(jù)。PRA測試證實了BCTP和SS的效果。BCTP在1∶10稀釋時使斑點數(shù)從平均50.88降低到0(表21)。在1∶100稀釋時，BCTP仍然有殺病毒效果。SS在以1∶100稀釋時，與未處置病毒相比，其僅減少了大約7％斑點數(shù)。
表21

a病毒與SLPs培養(yǎng)30分鐘。b斑點數(shù)。
BCTP作用于A型流感病毒的動力學為了研究BCTP作用于A型流感病毒傳染所需的時間，病毒與兩種稀釋度的BCTP(1∶10，1∶100)一起培養(yǎng)4段不同的時間間隔(5、10、15、30分鐘)。隨后，進行斑點數(shù)降低測定法。如表22所示，在與每一種BCTP培養(yǎng)5分鐘后，MDCK細胞種A型流感病毒感染完全停止。盡管濃度或時間不同，BCTP與A型流感病毒的相互作用沒有顯著的差別。
表22

BCTP抗-A型流感病毒效果由于TRITON X-100洗滌劑具有抗病毒活性(Maha和Igarashi，1997；Portocala等，1976)，我們研究了單獨使用TRITON X-100或其與獨立的BCTP組分結(jié)合使用是否具有與BCTP有相同程度的抑制A型流感病毒感染的效果。A型流感病毒用以下試劑處置1)BCTP，2)磷酸正三丁酯、TRITON X-100及大豆油的結(jié)合劑(TTO)，3)TRITON X-100和大豆油(TO)，或4)單獨使用TRITONX-100(T)。與單獨使用或與其他被測試組分結(jié)合使用TRITON X-100相比，BCTP在1∶10和1∶100稀釋時(TRITON X-100以1∶500，及1∶5000稀釋)對A型流感病毒顯然更為有效(圖23)。在以1∶1000稀釋時，BCTP(TRITON X-1001∶50,000稀釋)能降低50％MDCK細胞的A型流感病毒而同濃度TRITON X-100在單獨使用時基本上沒有效果。
BCTP不影響非包膜病毒的傳染性為研究是否BCTP能影響非包膜病毒的傳染性，我們使用了含有LacZ基因的基因工程腺病毒，編碼β-半乳糖甙酶。這種腺病毒結(jié)構(gòu)在基因轉(zhuǎn)換上有缺陷，因此只能復(fù)制和轉(zhuǎn)化含有the腺病毒5轉(zhuǎn)換基因的允許細胞。293細胞，其能特定的表達轉(zhuǎn)換基因，用于促進腺病毒復(fù)制及產(chǎn)生β-半乳糖甙酶酶。如圖24所示，BCTP處置不能影響腺病毒在293細胞種復(fù)制及表達β-半乳糖甙酶的能力。BCTP處置的和未處置的腺病毒都產(chǎn)生了大約0.11單位的β-半乳糖甙酶酶。
BCTP對包膜病毒的作用由于BCTP僅能改變包膜病毒的傳染性，我們使用電子顯微鏡進一步的研究此種納米乳液對包膜病毒整體性的作用。如圖25D所示，在與1∶100稀釋的BCTP培養(yǎng)60分鐘后，腺病毒結(jié)構(gòu)沒有變化。一些可辨認的A型流感病毒在與BCTP培養(yǎng)15分鐘后能被辨認定位(圖25B)，然而，1小時后發(fā)現(xiàn)了不可辨認的A型流感病毒。BCTP對A型流感病毒的效果和其對粘膜的低毒性表明其能作為有效的殺菌試劑，也可預(yù)防鈾包膜病毒感染引起的疾病。
實施例13鼠傷寒桿菌的W205EC處置中溫度和EDTA的影響圖31和32顯示用添加了0.1％EDTA的不同本發(fā)明乳液對沙門氏菌的處置情況。在溫度為40℃(圖32)和50℃(圖33)時，EDTA提高了乳液的殺菌活性。乳液測試濃度為10.0％、1.0％和0.1％稀釋度。
實施例14
X8PC和W205EC的抗菌性質(zhì)如上所述，乳液X8PC由約8％(體積)的TRITON X-100、約8％(體積)的TBP、約1％的CPC、約64％(體積)的大豆油和約19％(體積)的DiH2O組成；乳液W205EC由約5％(體積)TWEEN 20、約8％(體積)的乙醇、約1％(體積)的CPC、約64％(體積)的油類(例如，大豆油)和約22％(體積)的DiH2O組成0測試X8PC和W205EC在不同情況下減少一組微生物生長的能力。圖35顯示在室溫和37℃下用10％、1％和0.1％稀釋的X8PC能引起偶發(fā)分枝桿菌對數(shù)降低。
干細菌或者濕細菌與2％W205EC的乳液(含有或不含有1％、2％和3％Natrosol)在室溫下培養(yǎng)15分鐘后，每組中的大腸桿菌都顯示有大約2對數(shù)減少。干細菌或者濕細菌與2％W205EC的乳液(含有或不含有1％、2％和3％Natrosol)在室溫下培養(yǎng)15分鐘后，每組中金黃色釀膿葡萄球菌顯示了大約4對數(shù)減少。濕細菌與2％W205EC的乳液(含有或不含有1％、2％和3％Natrosol)在室溫下培養(yǎng)15分鐘后，每組淋病奈瑟氏球菌都顯示了大約3對數(shù)減少。
一種橡膠表面用于測試在不同溫度下及用不同類型的水稀釋的1％W205EC的殺菌活性。一英寸的表面用20g皮帶碎屑涂抹。鼠傷寒桿菌人工噴灑到表面上并干燥20分鐘。該處置過程中有3次間隔，間隔為一分鐘，在每一間隔操作暫停1分鐘。隨后在室溫下培養(yǎng)10分鐘。結(jié)果顯示在圖36中。該數(shù)據(jù)表明在每一測試溫度下，在使用diH2O、蒸餾水和自來水時，W205EC都是有效的。
所有上文中體積的出版物和專利在此作為綜合參考引用。在不背離本發(fā)明范圍和主旨的情況下，本發(fā)明所述方法和體系的不同修改形式和變化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來都說是顯而易見的。盡管本發(fā)明用一些特定優(yōu)選的實施方案加以闡述，但是應(yīng)當理解，我們要求保護的發(fā)明不能被限制于這些特定實施方案中。事實上，所述用以實施本發(fā)明的方法的不同修改形式對于相關(guān)技術(shù)人員來說是顯而易見的，這些修改形式也包括在權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種含有水包油乳液的組合物，所述水包油乳液所含的不連續(xù)油相是分散于水相之中的，其中第一組分包含醇類或甘油，第二組分包含表面活性劑或一種含鹵化合物。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述第一組分含有一種醇類。
3.權(quán)利要求1的組合物1，其中所述第一組分含有甘油。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中所述第二組分含有表面活性劑。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中所述第二組分含有一種含鹵化合物。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中所述水相含有水。
7.權(quán)利要求1的組合物，其中所述水相含有；磷酸鹽緩沖鹽水。
8.權(quán)利要求1的組合物，其中所述油相含有一種植物油。
9.權(quán)利要求8的組合物，其中所述植物油選自大豆油、鱷梨油、亞麻油、椰油、棉籽油、角鯊烯油、橄欖油、低芥酸菜籽油、玉米油、菜籽油、紅花油和葵花油。
10.權(quán)利要求1的組合物，其中所述油相含有的油類選自魚油、調(diào)味油、水不溶性維生素和礦物油。
11.權(quán)利要求1的組合物，其中所述油相含機油。
12.權(quán)利要求1的組合物，其中所述油相含有30-90vol％的水包油乳液。
13.權(quán)利要求1的組合物，其中所述油相含有50-80體積％的水包油乳液。
14.權(quán)利要求1的組合物，其中所述醇類種含有乙醇。
15.權(quán)利要求1的組合物，其中所述表面活性劑含有一種聚山梨醇酯表面活性劑。
16.權(quán)利要求15的組合物，其中所述聚山梨醇酯表面活性劑選自TWEEN 20、TWEEN 40、TWEEN 60和TWEEN 80。
17.權(quán)利要求1的組合物，其中所述表面活性劑含有一種苯氧基聚乙氧基乙醇。
18.權(quán)利要求17的組合物，其中所述苯氧基聚乙氧基乙醇選自TRITON X-100、X-301、X-165、X-102和X-200。
19.權(quán)利要求17的組合物，其中所述苯氧基聚乙氧基乙醇含有TYLOXAPOL。
20.權(quán)利要求1的組合物，其中所述表面活性劑含有十二烷基硫酸鈉。
21.權(quán)利要求1的組合物，其中所述含鹵化合物含有氯化鯨蠟基吡啶鎓。
22.權(quán)利要求1的組合物，其中所述含鹵化合物選自鹵化鯨蠟基吡啶鎓、鯨蠟基三甲基鹵化銨、鹵化鯨蠟基二甲基乙銨、鹵化鯨蠟基二甲基芐銨、鹵化鯨蠟基三丁基磷鎓、月桂基三甲基鹵化銨、肉豆蔻基三甲基鹵化銨、鯨蠟基三甲基氯化銨、鯨蠟基芐基二甲基氯化銨、溴化鯨蠟基吡啶鎓、溴化鯨蠟基三甲銨、溴化鯨蠟基二甲乙銨、溴化鯨蠟基三丁基磷鎓、月桂基三甲基溴化銨和肉豆蔻基三甲基溴化銨。
23.權(quán)利要求1的組合物，其中所述乳液進一步含有一種第三組分，所述第三組分包含表面活性劑。
24.權(quán)利要求1的組合物，其中所述乳液進一步含有一種第三組分，所述第三組分包含一種萌發(fā)增強子。
25.權(quán)利要求1的組合物，其中所述乳液進一步含有一種第三組分，所述第三組分含有一種磷酸酯基的溶劑。
26.權(quán)利要求25的組合物，其中所述磷酸酯基的溶劑含有磷酸三丁酯。
27.權(quán)利要求1的組合物，其中所述乳液進一步含有一種第三組分，所述第三組分選自neutramingen、L丙氨酸、氯化銨、胰胨豆胨培養(yǎng)液、酵母提取物、L-抗壞血酸、卵磷脂、對羥基苯甲酸甲酯、硫代硫酸鈉、檸檬酸鈉、肌苷、氫氧化鈉、右旋糖和聚乙二醇。
28.權(quán)利要求1的組合物，其中所述第一組分含有乙醇，其中所述第二組分含有TRITON X-100。
29.權(quán)利要求23的組合物，其中所述第一組分含有乙醇，所述第二組分含有氯化鯨蠟基吡啶鎓，和所述第三組分含有TWEEN-20。
30.一種制作水包油乳液的方法，包括乳化一種混合物，所述混合物包含一種油類、水性溶液、含醇類或甘油的第一組分及含表面活性劑或含鹵化合物的第二組分。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述第一組分含有一種醇。
32.權(quán)利要求30的方法，其中所述第一組分含有甘油。
33.權(quán)利要求30的方法，其中所述第二組分含有表面活性劑。
34.權(quán)利要求30的方法，其中所述第二組分含有一種含鹵化合物。
35.權(quán)利要求30的方法，其中所述油類選自大豆油、鱷梨油、亞麻油、椰油、棉籽油、角鯊烯油、橄欖油、低芥酸菜籽油、玉米油、菜籽油、紅花油和葵花油。
36.權(quán)利要求30的方法，其中所述油類選自魚油、調(diào)味油、水不溶性維生素和礦物油。
37.權(quán)利要求30的方法，其中所述油相含機油。
38.權(quán)利要求30的方法，其中所述醇類包括乙醇。
39.權(quán)利要求30的方法，其中所述含鹵化合物選自鹵化鯨蠟基吡啶鎓，鯨蠟基三甲基鹵化銨，鹵化鯨蠟基二甲基乙銨，鹵化鯨蠟基二甲基芐銨，鹵化鯨蠟基三丁基磷鎓、月桂基三甲基鹵化銨、肉豆蔻基三甲基鹵化銨、鯨蠟基三甲基氯化銨、氯化鯨蠟基吡啶鎓、鯨蠟基芐基二甲基氯化銨、溴化鯨蠟基吡啶鎓、溴化鯨蠟基三甲銨、溴化鯨蠟基二甲乙銨、溴化鯨蠟基三丁基磷鎓、月桂基三甲基溴化銨和肉豆蔻基三甲基溴化銨。
40.權(quán)利要求30的方法，其中所述混合物進一步含有一種第三組分，所述第三組分含有表面活性劑。
41.權(quán)利要求30的方法，其中所述混合物進一步含有一種第三組分，所述第三組分含有一種萌發(fā)增強子。
42.權(quán)利要求30的方法，其中所述混合物進一步含有一種第三組分，所述第三組分含有一種磷酸酯基溶劑。
43.權(quán)利要求30的方法，其中所述混合物進一步含有一種第三組分，所述第三組分選自neutramingen、L丙氨酸，氯化銨、胰胨豆胨培養(yǎng)液、酵母提取物、L-抗壞血酸，卵磷脂、對苯甲酸甲酯、硫代硫酸鈉、檸檬酸鈉，肌苷、氫氧化鈉、右旋糖和聚乙二醇。
44.權(quán)利要求30的方法，其中所述第一組分含有乙醇，所述第二組分含有TRITON X-100。
45.權(quán)利要求42的方法，其中所述第一組分含有乙醇，所述第二組分含有氯化鯨蠟基吡啶鎓，所述第三組分含有TWEEN-20。
46.一種預(yù)防或者凈化區(qū)域的方法，包括將所述區(qū)域暴露于一種組合物中，該組合物含有一種水包油乳液，所述水包油乳液所含的不連續(xù)油相均勻分散于水相中；含有醇類或甘油的第一組分；和含有表面活性劑或一種含鹵化合物的第二組分。
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述區(qū)域具有一固體表面。
48.權(quán)利要求46的方法，其中所述固體表面包括一種醫(yī)學裝置。
49.權(quán)利要求46的方法，其中所述區(qū)域包括一種溶液。
50.權(quán)利要求46的方法，其中所述區(qū)域包括生物體的表面。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述生物體包括人類。
52.權(quán)利要求50的方法，其中所述生物體表面包括有機體的內(nèi)表面。
53.權(quán)利要求50的方法，其中所述生物體表面包括生物體的內(nèi)部部分。
54.權(quán)利要求46的方法，其中所述區(qū)域包括食品。
55.修改乳液的方法，包括a)制備一種水包油乳液，所述水包油乳液所含的不連續(xù)的油相均勻分散于水相中，第一項組分含有醇或甘油，第二項組分含有一種表面活性劑或一種含鹵化合物b)向所述乳液加入或從中除去一種組分以制備修改乳液。
56.權(quán)利要求54的方法，其進一步包括有用生物學測試測定所述修改乳液的步驟。
57.權(quán)利要求55的方法，其中所述生物學測定包括一種抗微生物測定。
58.權(quán)利要求54的方法，其進一步包括為所述修改乳液做售賣廣告的步驟。
59.權(quán)利要求54的方法，進一步包括出售所述修改乳液的步驟。
60.一種系統(tǒng)，包括一種含水包油乳液的傳輸系統(tǒng)，所述水包油乳液所含不連續(xù)的油相均勻分布于水相中，其第一組分含有一種醇或甘油，第二組分含有表面活性劑或一種含鹵化合物。
61.一種系統(tǒng)，包括一種與水包油乳液相接觸的材料，所述水包油乳液所含不連續(xù)的油相均勻分布于水相中，其第一組分含有一種醇或甘油，第二組分含有表面活性劑或一種含鹵化合物。
62.權(quán)利要求61的系統(tǒng)，其中所述材料包括一種醫(yī)學裝置。
63.權(quán)利要求61的系統(tǒng)，其中所述材料包括一種溶液。
64.權(quán)利要求63的系統(tǒng)，其中所述溶液包括一種食品。
65.權(quán)利要求63的系統(tǒng)，其中所述溶液包括一種清洗產(chǎn)品。
66.權(quán)利要求63的系統(tǒng)，其中所述溶液包括一種機油。
67.權(quán)利要求61的方法，其中所述材料包括生物材料。
68.權(quán)利要求61的方法，其中所述生物材料包括人類的組織。
69.權(quán)利要求61的方法，其中所述材料包括一種食品。
70.權(quán)利要求61的方法，其中所述材料包括一種霜劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于降低與不同致病生物體及病毒有關(guān)的感染、發(fā)病率和死亡率的一種組合物及方法。本發(fā)明同時還涉及用于凈化被繁殖或被致病生物體或病毒感染的區(qū)域的方法和組合物。而且，本發(fā)明還涉及用于降低致病生物體對食物的感染的方法和組合物。具體的說，通過將致病生物體與一種含有油類、有機溶劑及分散于水相中的表面活性劑的水包油納米乳液相接觸以降低致病生物體引起的感染、發(fā)病率和死亡率。
文檔編號A01N25/30GK1433314SQ00818745
公開日2003年7月30日 申請日期2000年12月29日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月30日
發(fā)明者J·R·小貝克, T·哈姆達, A·史, M·安德爾杰 申請人:密執(zhí)安州立大學董事會