專利名稱：基于酵母的生物肥的制作方法
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及包含酵母的生物肥，所述酵母用以固定大氣氮?dú)庖约胺纸夂?、鉀?或碳的不溶性化合物。本發(fā)明亦涉及生物肥的制法以及生物肥用以提高作物產(chǎn)量的方法。
2.發(fā)明背景肥料系支持高產(chǎn)量作物生長(zhǎng)所必需。在植物健康生長(zhǎng)所需的基本營(yíng)養(yǎng)素中，大量氮(以NO3-或NH4+攝取)、磷(以H2PO4-攝取)及鉀(以K+攝取)營(yíng)養(yǎng)素為大多數(shù)生長(zhǎng)于大多數(shù)土壤上作物所需(Wichmann.W.等，IFA世界肥料使用手冊(cè)(IFA World Fevtilizer Use Manual))。如此大量氮、磷及鉀營(yíng)養(yǎng)素主要以無(wú)機(jī)肥形式提供，可呈處理后的天然無(wú)機(jī)物或制造所得化學(xué)品(K.F.Isherwood，1998，無(wú)機(jī)肥使用與環(huán)境(MineralFertilizer Use and the Environment)，美國(guó)環(huán)保計(jì)劃技術(shù)報(bào)告第26號(hào)(United Nations Environmental Programme Technical Report No.26))。無(wú)機(jī)肥的發(fā)展及使用始于1940年代，已經(jīng)使同樣至稍少量農(nóng)田上的作物產(chǎn)量顯著增高因而供應(yīng)今日眾多人口食用。若無(wú)此項(xiàng)農(nóng)業(yè)的發(fā)展則必須將大量牧場(chǎng)及森林轉(zhuǎn)成耕地(K.F.Isherwood，1998，無(wú)機(jī)肥使用與環(huán)境(Mineral Fertilizer Use and the Environment)，美國(guó)環(huán)保計(jì)劃技術(shù)報(bào)告第26號(hào)(United Nations Environmental Programme Technical ReportNo.26))。
盡管無(wú)機(jī)肥在給人類提供大量農(nóng)產(chǎn)品中的重要性，但近年來(lái)已經(jīng)了解其對(duì)環(huán)保造成傷害。無(wú)機(jī)肥招致土壤損傷。例如大多數(shù)氮肥可酸化土壤，因此對(duì)植物及其它土壤生物的生長(zhǎng)造成不良影響。廣泛使用化學(xué)氮肥也會(huì)抑制天然固氮微生物的活性，因而降低土壤的天然肥沃度。無(wú)機(jī)肥還將有毒物質(zhì)引入土壤及產(chǎn)物內(nèi)。例如從磷酸巖處理所得的磷酸鹽肥料常含有小量有毒元素例如鎘，鎘可能累積于土壤內(nèi)而被植物攝取。長(zhǎng)期使用無(wú)機(jī)肥也造成嚴(yán)重環(huán)境污染。例如由于滲濾作用及土壤的侵蝕導(dǎo)致氮及磷酸鹽肥料流失，結(jié)果導(dǎo)致土壤及地下水的污染，以及導(dǎo)致地表水的富營(yíng)養(yǎng)化。污染土壤及水的徹底清理復(fù)雜且困難度高。此種工作的成本也龐大。
在對(duì)此項(xiàng)問(wèn)題尋找解決的道時(shí)，有些人回頭使用有機(jī)肥。如眾所周知，有機(jī)肥來(lái)自許多不同來(lái)源。有機(jī)肥的類型包括農(nóng)場(chǎng)廢物例如農(nóng)作物殘余物以及動(dòng)物糞便；植物及動(dòng)物產(chǎn)品殘余物例如木材；以及城鎮(zhèn)廢物例如廢水(Wichmann.W.等，IFA世界肥料使用手冊(cè)(IFA WorldFertilizer Use Manual))。有機(jī)肥的營(yíng)養(yǎng)素含量通常低，對(duì)支持植物生長(zhǎng)上較為無(wú)效。例如牛糞中的總營(yíng)養(yǎng)素低于2％，其中所含的氮營(yíng)養(yǎng)素由于喪失至環(huán)境中故較難以有效利用(K.F.Isherwood，1998，無(wú)機(jī)肥使用與環(huán)境(Mineral Fertilizer Use and the Environment)，美國(guó)環(huán)保計(jì)劃技術(shù)報(bào)告第26號(hào)(United Nations Environmental Programme TechnicalReport No.26))。通常需要極大量的有機(jī)肥施用至土壤。為了獲得作物高產(chǎn)，有機(jī)肥僅用來(lái)補(bǔ)充無(wú)機(jī)肥。因此使用有機(jī)肥來(lái)取代無(wú)機(jī)肥仍然無(wú)法令人滿意地解決無(wú)機(jī)肥的問(wèn)題。此外有機(jī)肥也造成環(huán)保問(wèn)題。例如某些有機(jī)肥若未經(jīng)處理含有病原微生物例如大腸桿菌(E.coli)，沙門氏菌(Salmonella)及介殼蟲科(Coccidae)。有機(jī)肥也含有有毒化學(xué)品而可能產(chǎn)生討厭的氣味。使用有機(jī)肥也造成天然水系的污染和富營(yíng)養(yǎng)化。因此在世界許多地方包括美國(guó)皆立法對(duì)有機(jī)肥的組成及使用施加顯著限制。
曾經(jīng)提議利用微生物的生物肥作為無(wú)機(jī)肥的替代品。天然固氮微生物包括細(xì)菌例如根瘤菌(Rhizobium)、固氮菌(Azotobacter)以及固氮螺菌(Azospirillum)(參見例如美國(guó)專利第5,071,462號(hào))以及真菌例如黃米曲霉(Aspergillus flavus-oryzae)(參見例如美國(guó)專利第4,670,037號(hào))已經(jīng)用于生物肥中。天然微生物可溶解磷酸巖礦或其它不溶性磷酸鹽成為可溶性磷酸鹽，這些微生物已經(jīng)單獨(dú)(例如美國(guó)專利第5,912,398號(hào))或與固氮微生物組合(例如美國(guó)專利第5,484,464號(hào))用于生物肥中。已經(jīng)開發(fā)出遺傳修飾的細(xì)菌菌株用于生物肥中。已經(jīng)開發(fā)基于重組DNA技術(shù)的辦法來(lái)創(chuàng)建更有效的固氮、磷分解及鉀分解性細(xì)菌菌株用于生物肥中，參見例如美國(guó)專利第5,578,486號(hào)；PCT公報(bào)WO 95/09814；中國(guó)專利公報(bào)CN 1081662A；CN 1082016A；CN 1082017A；CN1103060A；以及CN 1109595A。
但基于天然微生物的生物肥通常不夠有效來(lái)替代無(wú)機(jī)肥。因此重要地是開發(fā)生物肥，其可替代無(wú)機(jī)肥用于給農(nóng)作物補(bǔ)充氮、磷及鉀，從而產(chǎn)生高品質(zhì)農(nóng)作物同時(shí)避免與無(wú)機(jī)肥相關(guān)的問(wèn)題。本發(fā)明提供可替代無(wú)機(jī)肥的基于酵母的生物肥。
此處引述的文獻(xiàn)并非旨在承認(rèn)任一在此引用的文獻(xiàn)為相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)，或承認(rèn)引述的文獻(xiàn)被視為本申請(qǐng)權(quán)利要求的可專利性材料。有關(guān)這些文獻(xiàn)的日期和內(nèi)容的陳述系基于申請(qǐng)人可取得的信息而絕非視為這些文獻(xiàn)的日期或內(nèi)容的正確性。
3.發(fā)明概述本發(fā)明涉及生物肥。本發(fā)明的生物肥組合物包含多達(dá)6種不同酵母細(xì)胞成分、有機(jī)基質(zhì)成分和/或無(wú)機(jī)基質(zhì)成分。具體而言，組合物的酵母細(xì)胞成分可固定大氣氮?dú)?、分解不溶性無(wú)機(jī)物或化合物、分解復(fù)雜的碳材料或化合物、過(guò)度生產(chǎn)生長(zhǎng)因子或過(guò)度生產(chǎn)ATP。
本發(fā)明使用市面上出售和/或可由公眾取得的酵母菌，例如但非限于啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。本發(fā)明的酵母細(xì)胞成分系通過(guò)在活化條件下培養(yǎng)酵母細(xì)胞產(chǎn)生，因此細(xì)胞固定大氣氮?dú)狻⒎纸獠蝗苄粤谉o(wú)機(jī)物或化合物、分解不溶性鉀無(wú)機(jī)物或化合物以及分解復(fù)雜的碳材料或化合物的能力得到活化或提升。酵母細(xì)胞亦在產(chǎn)生過(guò)量生長(zhǎng)因子或ATP的能力得到活化或提升的條件下培養(yǎng)。具有這些活性的酵母細(xì)胞用于將來(lái)自大氣的氮?dú)廪D(zhuǎn)成可由植物用作營(yíng)養(yǎng)素的含氮化合物，用于從無(wú)機(jī)物及復(fù)雜的分子中釋放出不溶性磷、鉀及碳，因此這些元素變成可由植物用于生長(zhǎng)的形式取得。肥料中的一些酵母細(xì)胞通過(guò)供給生長(zhǎng)因子及ATP而用于支持其它提供植物營(yíng)養(yǎng)素的酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)。
本發(fā)明亦涉及在肥料中使用多種多樣的有機(jī)及無(wú)機(jī)材料來(lái)支持本發(fā)明的酵母菌株的生長(zhǎng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，肥料系通過(guò)混合煤礦廢物及磷酸巖與酵母菌株產(chǎn)生。在另一實(shí)施方案中，肥料系通過(guò)混合動(dòng)物糞便及任選的生物消毒劑與酵母菌株產(chǎn)生。在另一實(shí)施方案中，肥料系通過(guò)混合來(lái)自污水處理廠的污泥及生物消毒劑與酵母菌株產(chǎn)生。
本發(fā)明亦涉及肥料的制法，其包含混合、干燥及包裝本發(fā)明的酵母菌株及有機(jī)和/或無(wú)機(jī)材料。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及本發(fā)明的肥料的用法。本發(fā)明的生物肥可用于支持及提升多種多樣植物的生長(zhǎng)及成熟。
4.附圖簡(jiǎn)述


圖1.酵母細(xì)胞的活化。1酵母培養(yǎng)物；2容器；3電磁場(chǎng)源。
圖2.酵母菌株間形成仿共生關(guān)系。4固氮酵母的電磁場(chǎng)源；5磷-分解酵母的電磁場(chǎng)源；6鉀-分解酵母的電磁場(chǎng)源；7碳-分解酵母的電磁場(chǎng)源；8酵母培養(yǎng)物；9容器。
圖3.酵母細(xì)胞適應(yīng)于土壤類型。10電極；11容器；12電極；13酵母培養(yǎng)物；14電磁場(chǎng)源；15溫度控制器。
圖4.有機(jī)材料研磨過(guò)程。16有機(jī)原料；17破碎機(jī)；18研磨機(jī)；19粉狀有機(jī)材料。
圖5.無(wú)機(jī)材料研磨過(guò)程。20無(wú)機(jī)原料；21破碎機(jī)；22研磨機(jī)；23粉狀無(wú)機(jī)材料。
圖6.酵母發(fā)酵過(guò)程。24活化酵母細(xì)胞；25酵母細(xì)胞培養(yǎng)槽，淀粉∶水(35℃)＝1∶2.5，于28-30℃半有氧發(fā)酵48至72小時(shí)；26收獲的培養(yǎng)物。
圖7.混合有機(jī)及無(wú)機(jī)原料。27無(wú)機(jī)材料；28淀粉；29有機(jī)材料；30混合器；31混合物；32待轉(zhuǎn)運(yùn)至肥料生產(chǎn)階段的混合物。
圖8.混合酵母細(xì)胞。33固氮、磷-分解、鉀-分解及碳-分解酵母的入口；34混合槽；35ATP-產(chǎn)生的酵母；36GP-產(chǎn)生的酵母；37酵母混合物；38待轉(zhuǎn)運(yùn)至肥料制造階段的混合物。
圖9.肥料制造過(guò)程。39酵母混合物；40有機(jī)與無(wú)機(jī)材料混合物；41造粒機(jī)(granulizer)；42肥料顆粒。
圖10.干燥過(guò)程。43肥料顆粒；44第一干燥機(jī)；45第二干燥機(jī)；46干燥后的肥料。
圖11.冷卻及包裝過(guò)程。47干燥后的肥料；48冷卻器；49分離器；50散裝裝袋機(jī)；51終產(chǎn)品。
5.發(fā)明詳述在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含酵母細(xì)胞的生物肥組合物。本發(fā)明也在各種實(shí)施方案中提供生物肥組合物的制法及生物肥組合物的用法。
本發(fā)明的生物肥組合物可替代化學(xué)/無(wú)機(jī)肥給植物特別農(nóng)作物供應(yīng)氮(N)、磷(P)及鉀(K)。本發(fā)明的生物肥組合物可提高作物產(chǎn)量達(dá)10-60％。由于本發(fā)明的生物肥利用活酵母的代謝活性來(lái)轉(zhuǎn)換如大氣氮及磷及鉀無(wú)機(jī)物的原料成為植物營(yíng)養(yǎng)素，故酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)換和釋放這些營(yíng)養(yǎng)素部分受到土壤中的養(yǎng)分含量調(diào)節(jié)。土壤的養(yǎng)分含量反過(guò)來(lái)又部分仰賴環(huán)境及植物變化需求。因此由生物肥組合物釋放植物營(yíng)養(yǎng)素可適應(yīng)于土壤條件且可維持一段時(shí)間。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的生物肥組合物包含一種或多種酵母細(xì)胞成分。生物肥組合物的酵母細(xì)胞成分包含多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞，其可執(zhí)行下列功能之一，各功能導(dǎo)致給植物提供其中一類營(yíng)養(yǎng)素(1)固定大氣氮?dú)猓?2)分解磷無(wú)機(jī)物或化合物；(3)分解鉀無(wú)機(jī)物或化合物；(4)分解復(fù)雜或高分子碳材料或化合物?？砂~外酵母細(xì)胞成分來(lái)產(chǎn)生生長(zhǎng)因子及ATP以支持肥料組合物中的其它酵母菌。
本發(fā)明的生物肥組合物進(jìn)一步包含有機(jī)基質(zhì)成分和/或無(wú)機(jī)基質(zhì)成分。肥料組合物的有機(jī)基質(zhì)成分為肥料中的酵母細(xì)胞的主要碳源。無(wú)機(jī)基質(zhì)成分給肥料組合物中的酵母細(xì)胞提供含磷和/或鉀的無(wú)機(jī)物、材料及化合物。有機(jī)及無(wú)機(jī)基質(zhì)成分也可給植物提供其它無(wú)機(jī)物如但非限于鈣、鎂及硫；以及微量營(yíng)養(yǎng)素如但非限于硼、銅、鐵、錳、鉬及鋅。
用于此處的術(shù)語(yǔ)“氮固定”或“固定大氣氮?dú)狻焙ㄉ镞^(guò)程，其中分子氮或大氣氮?dú)獗晦D(zhuǎn)成一種或多種含氮(N)化合物，包括但非限于氨、銨鹽、尿素及硝酸鹽。
用于此處的短語(yǔ)“分解磷無(wú)機(jī)物或化合物”表示生物過(guò)程，其將磷(P)化合物例如但非限于那些存在于磷酸巖中的水不溶性磷化合物轉(zhuǎn)成一種或多種不同的磷化合物，它(們)較為容易由植物及其它酵母菌用于存活和/或生長(zhǎng)。例如所得磷化合物更可溶于水，并因此可由植物根部攝取。
用于此處的短語(yǔ)“分解鉀無(wú)機(jī)物或化合物”表示生物過(guò)程，其將鉀(K)化合物例如但非限于那些鉀云母中存在的水不溶性鉀化合物轉(zhuǎn)成一種或多種不同的鉀化合物，它(們)較為容易由植物及其它酵母菌用于存活和/或生長(zhǎng)。例如所得鉀化合物更可溶于水，并因此可由植物根部攝取。
用于此處的短語(yǔ)“分解復(fù)雜或高分子量碳無(wú)機(jī)物、材料或化合物”表示將復(fù)雜有機(jī)或無(wú)機(jī)碳分子以生物轉(zhuǎn)換成為一個(gè)或多個(gè)碳分子，其通常具有較低分子量，且較為容易由植物及其它生物包括其它酵母菌用于存活和/或生長(zhǎng)。例如這包含將風(fēng)化煤中的高分子量碳化合物轉(zhuǎn)成簡(jiǎn)單的碳水化合物如戊糖及己糖。此過(guò)程包括聚合物碳化合物中的長(zhǎng)鏈碳原子被切割。
用于此處的術(shù)語(yǔ)“生長(zhǎng)因子”表示酵母生長(zhǎng)通常需要的分子，包括但非限于維生素，特別是維生素B復(fù)合體例如維生素B-1、核黃素(維生素B-2)、維生素B-12、煙酸(B-3)、吡哆醇(B-6)、泛酸(B-5)；葉酸；生物素；對(duì)氨基苯甲酸；膽堿；及肌醇。
多種多樣的有機(jī)及無(wú)機(jī)材料可用以供給磷、鉀及復(fù)雜的高分子碳無(wú)機(jī)物、材料及化合物，這些物質(zhì)欲由酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)成由酵母及植物使用的營(yíng)養(yǎng)素?？山Y(jié)合本發(fā)明使用的有機(jī)及無(wú)機(jī)材料包括但非限于礦物例如但非限于磷酸巖或巖石磷酸鹽、磷灰石、磷鈣石、鉀石鹽、石鹽、光鹵石、鉀云母、褐煤；工業(yè)用材料或廢物例如但非限于煤礦廢料、風(fēng)化煤、煤粉及碳?xì)浠衔飶U物；環(huán)保材料及廢物例如但非限于污水處理廠及填土的污泥、泥漿，例如草炭泥漿、河床及湖床泥漿；有機(jī)廢物例如但非限于都市區(qū)的廢物及糞便以及動(dòng)物糞便例如家禽糞便、牛糞、豬糞、羊糞及鳥糞，來(lái)自植物的廢料，來(lái)自動(dòng)物的廢料包括魚粉、骨粉、人類廢物、干燥血等，以及來(lái)自含纖維素、淀粉和/或其它碳水化合物的植物性材料的發(fā)酵產(chǎn)物或副產(chǎn)物。
此外視需求而定，消毒劑可包括于生物肥組合物中。以環(huán)保安全的消毒劑為較佳。例如生物消毒劑超-CM61可與環(huán)保及有機(jī)廢物例如都市區(qū)的廢物及糞便以及動(dòng)物糞便一起使用。
在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明的生物肥組合物包含至少一種酵母細(xì)胞成分且優(yōu)選6種酵母菌細(xì)胞成分。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在某些培養(yǎng)條件下，多種酵母菌株可被誘發(fā)而具有下列6種活性(1)固定大氣氮?dú)猓?2)分解磷無(wú)機(jī)物或化合物；(3)分解鉀無(wú)機(jī)物或化合物；(4)分解復(fù)雜或高分子量碳材料或化合物；(5)產(chǎn)生過(guò)量的生長(zhǎng)因子，其量足夠支持肥料組合物中的其它酵母菌株的需求；以及(6)產(chǎn)生過(guò)量的ATP，其量足夠支持肥料組合物中其它酵母菌株的需求。培養(yǎng)條件決定培養(yǎng)的酵母活性得到活化或提升。6種活性的各個(gè)特定培養(yǎng)條件分別在5.1-5.6節(jié)中詳細(xì)描述。
根據(jù)本發(fā)明，生物肥的酵母細(xì)胞成分的生產(chǎn)系通過(guò)在適當(dāng)培養(yǎng)基中有電磁場(chǎng)存在下培養(yǎng)多數(shù)酵母細(xì)胞。電磁場(chǎng)可由本領(lǐng)域眾所周知的多種裝置產(chǎn)生。舉例設(shè)置的示意圖顯示于
圖1中。所需頻率及振幅的電磁場(chǎng)由電磁源(3)產(chǎn)生，其包含一個(gè)或多個(gè)信號(hào)產(chǎn)生器，能產(chǎn)生電磁波，優(yōu)選為100MHz至2000MHz頻率范圍的正弦波。若有所需，也可使用信號(hào)放大器來(lái)提高輸出。電磁場(chǎng)可由多種手段施加至培養(yǎng)物上，包括將培養(yǎng)物放置于信號(hào)發(fā)射器附近。在一實(shí)施方案中，電磁場(chǎng)系由浸沒(méi)于培養(yǎng)物(1)中的電極外加。在優(yōu)選實(shí)施方案中，電極之一為金屬板，另一電極包括多數(shù)個(gè)電線配置于容器(2)內(nèi)部，以便電磁場(chǎng)能量可均勻分布于培養(yǎng)物中。使用的電極線數(shù)目依據(jù)于培養(yǎng)物容積及電線直徑。在優(yōu)選實(shí)施方案中，對(duì)于具有多達(dá)5000毫升容積的培養(yǎng)物，每100毫升培養(yǎng)物可使用直徑0.1-1.2毫米的電極線；對(duì)于容積大于1000升的培養(yǎng)物，每1000升培養(yǎng)物可使用直徑3-30毫米的電極線。
預(yù)計(jì)用于本發(fā)明的酵母類別包括但非限于下列種屬的酵母菌糖酵母(Saccharomyces)，裂殖酵母(Schizosaccharomyces)，擲孢酵母(Sporobolomyces)，球擬酵母(Torulopsis)，絲孢酵母(Trichosporon)，威克酵母(Wickerhamia)，阿舒氏囊霉菌(Ashbya)，芽生菌(Blastomyces)，假絲酵母(Candida)，固囊酵母(Citeromyces)，克利伯菌(Crebrothecium)，隱球酵母(Cryptococcus)，德巴利氏酵母(Debaryomyces)，擬內(nèi)孢霉(Endomycopsis)；地霉(Geotrichum)，漢遜氏酵母(Hansenula)，克勒克氏酵母(Kloeckera)，油脂酵母(Lipomyces)，畢赤氏酵母(Pichia)，紅螺菌(Rhodosporidium)，以及紅酵母(Rhodotorula)。酵母菌株的非限制性例子包括啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)Hansen，ACCC2034，ACCC2035，ACCC2036，ACCC2037，ACCC2038，ACCC2039，ACCC2040，ACCC2041，ACCC2042，AS2.1，AS2.4，AS2.11，AS2.14，AS2.16，AS2.56，AS2.69，AS2.70，AS2.93，AS2.98，AS2.101，AS2.109，AS2.110，AS2.112，AS2.139，AS2.173，AS2.174，AS2.182，AS2.196，AS2.242，AS2.336，AS2.346，AS2.369，AS2.374，AS2.375，AS2.379，AS2.380，AS2.382，AS2.390，AS2.393，AS2.395，AS2.396，AS2.397，AS2.398，AS2.399，AS2.400，AS2.406，AS2.408，AS2.409，AS2.413，AS2.414，AS2.415，AS2.416，AS2.422，AS2.423，AS2.430，AS2.431，AS2.432，AS2.451，AS2.452，AS2.453，AS2.458，AS2.460，AS2.463，AS2.467，AS2.486，AS2.501，AS2.502，AS2.503，AS2.504，AS2.516，AS2.535，AS2.536，AS2.558，AS2.560，AS2.561，AS2.562，AS2.576，AS2.593，AS2.594，AS2.614，AS2.620，AS2.628，AS2.631，AS2.666，AS2.982，AS2.1190，AS2.1364，AS2.1396，IFFI 1001，IFFI 1002，IFFI 1005，IFFI 1006，IFFI 1008，IFFI 1009，IFFI 1010，IFFI 1012，IFFI 1021，IFFI 1027，IFFI 1037，IFFI 1042，IFFI 1043，IFFI 10451，IFFI 1048，IFFI 1049，IFFI 1050，IFFI 1052，IFFI 1059，IFFI 1060，IFFI 1063，IFFI 1202，IFFI 1203，IFFI 1206，IFFI 1209，IFFI 1210，IFFI 1211，IFFI 1212，IFFI 1213，IFFI 1215，IFFI 1220，IFFI 1221，IFFI 1224，IFFI 1247，IFFI 1251，IFFI 1270，IFFI 1277，IFFI 1287，IFFI 1289，IFFI 1290，IFFI 1291，IFFI 1291，IFFI 1292，IFFI 1293，IFFI 1297，IFFI 1300，IFFI 1301，IFFI 1302，IFFI 1307，IFFI 1308，IFFI 1309，IFFI 1310，IFFI 1311，IFFI 1331，IFFI 1335，IFFI 1336，IFFI 1337，IFFI 1338，IFFI 1339，IFFI 1340，IFFI 1345，IFFI 1348，IFFI 1396，IFFI 1397，IFFI 1399，IFFI 1411，IFFI 1413，ACCC2043，AS2.2，AS2.3，AS2.8，AS2.53，AS2.163，AS2.168，AS2.483，AS2.541，AS2.559，AS2.606，AS2.607，AS2.611，AS2.612；薛氏糖酵母(Saccharomyceschevalieri) Guillermond，AS2.131，AS2.213；戴耳克氏糖酵母(Saccharomyces delbrueckii)Lindner，AS2.285；戴耳克氏糖酵母(Saccharomyces delbrueckii)Lindner變種蒙古Lodder，AS2.209，AS2.1157；微小糖酵母(Saccharomyces exiguus)Hansen，AS2.349，AS2.1158；發(fā)酵性糖酵母(Saccharomyces fermentati)(Saito)Lodder et vanRij，AS2.286，AS2.343；羅哥糖酵母(Saccharomyces logos)van laer etDenamur ex Jorgensen，AS2.156，AS2.327，AS2.335；蜂蜜糖酵母(Saccharomyces mellis)Lodder et Kreger Van Rij，AS2.195；小橢圓糖酵母(Saccharomyces microellipsoides)Osterwalder，AS2.699；卵形糖酵母(Saccharomyces oviformis)Osterwalder，AS2.100；羅茜糖酵母(Saccharomyces rosei)Lodder et kreger van Rij，AS2.287；魯氏糖酵母(Saccharomyces rouxii)Boutroux，AS2.178，AS2.180，AS2.370，AS2.371；清酒糖酵母(Saccharomyces sake)，ACCC2045；葡萄汁糖酵母(Saccharomyces uvarum Beijer)，IFFI 1023，IFFI 1032，IFFI 1036，IFFI 1044，IFFI 1072，IFFI 1205，IFFI 1207；魏萊氏糖酵母(Saccharomyces willianus)Saccardo，AS2.5，AS2.7，AS2.119，AS2.152，AS2.293，AS2.381，AS2.392，AS2.434，AS2.614，AS2.1189；酵母種，AS2.311；路為氏糖酵母(Saccharomyces ludwigii)Hansen，ACCC2044，AS2.243，AS2.508；中華糖酵母(Saccharomyces sinenses)Yue，AS2.1395；八孢裂殖酵母(Schizosaccharomyces octosporus)Beiierinck，ACCC 2046，AS2.1148；粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)Linder，ACCC2047，ACCC2048，AS2.248，AS2.249，AS2.255，AS2.257，AS2.259，AS2.260，AS2.274，AS2.994，AS2.1043，AS2.1149，AS2.1178，IFFI.1056；紅色擲孢酵母(Sporobolomyces roseus)Kluyver etvan Niel，ACCC 2049，ACCC 2050，AS2.619，AS2.962，AS2.1036；赭色擲孢酵母(Sporobolomyces salmonicolor)(Fischer et Brebeck)Kluyver et van Neil，ACCC2051，AS2.261，AS2.262；白色球擬酵母(Torulopsis candida)(Saito)Lodder，ACCC2052，AS2.270；無(wú)名球擬酵母(Torulopsis famta)(Harrison)Lodder et van Rij，ACCC2053，AS2.685；球狀球擬酵母(Torulopsis globosa)(Olson et Hammer)Lodder etvan Rij，ACCC2054，AS2.202；平常球擬酵母(Torulopsis inconspicua)Lodder et van Rij，AS2.75；貝雷氏絲孢酵母(Trichosporon behrendoo)Lodder et Kreger van Rij，ACCC2055，AS2.1193；頭狀絲孢酵母(Trichosporon capitatum)Diddens et Lodder，ACCC2056，AS2.1385；皮狀絲孢酵母(Trichosporon cutaneum)(de Beurm等)Ota，ACCC2057，AS2.25，AS2.570，AS2.571，AS2.1374；螢光威克酵母(Wickerhamiafluoresens)(Soneda)Soneda，ACCC2058，AS2.1388；棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya gossypii)(Ashby et Nowell)Guillermond，ACCC2001，AS2.475，AS2.1176；皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)Gilehrist et Stikes，ID(D 10)23；白色假絲酵母(Candida albicans)(Robin)Berkhout，ACCC2002，AS2.538，ID 16u(C1)u，ID 61(v(C1)v；樹木假絲酵母(Candida arborea)，AS2.566；季也蒙氏假絲酵母(Candidaguillermondii)(Castellani)Langeron et guerra，AS2.63，ID 21a(C5)a，ID21b(C5)b；克魯斯氏假絲酵母(Candida Krusei)(Castellani)Berkhout，AS2.1045；萊比可假絲酵母(Candida lambica)(Lindner et Genoud)van.Uden et Buckley，AS2.1182；解脂假絲酵母(Candidalipolytica)(Harrison)Diddens et Lodder，AS2.1207，AS2.1216，AS2.1220，AS2.1379，AS2.1398，AS2.1399，AS2.1400；副克柔氏假絲酵母(Candida parakrusei)(Castellani et Chalmer)Langeron et Guerra，ID 19a(C4)a，ID 19b(C4)b，ID 19c(C4)c，ID 19d(C4)d；近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis)(Ashford)Langeron et Talice，AS2.590；近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis)(Ashford)et Talice Var.imtermedia VanRij et Verona，AS2.491；假熱帶假絲酵母(Candidapseudotropicalis)(Castellani)Basgal，AS2.68，ID64(C3)；鐵紅假絲酵母(Candida pulcherrima)(Lindner)Windisch，AS2.492；粗壯假絲酵母(Candida robusta)Diddens et Lodder，AS2.1195；皺摺假絲酵母(Candidarugousa)(Anderson)Diddens et Loddeer，AS2.511，AS2.1367，AS2.1369，AS2.1372，AS2.1373，AS2.1377，AS2.1378，AS2.1384；熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)(Castellani)Berkout，ACCC2004，ACCC2005，ACCC2006，AS2.164，AS2.402，AS2.564，AS2.565，AS2.567，AS2.568，AS2.617，AS2.637，AS2.1387，AS2.1397，ID 17a(C2)a，ID 17b(C2)b，ID 17d(C2)d；產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)Henneberg Lodder et KregerVan Rij，AS2.120，AS2.281，AS2.1180；基質(zhì)固囊酵母(Citeromycesmatritensis)(Santa Maria)Santa Maria，AS2.1401；阿舒克利伯菌(Crebrothecium ashbyii)(Guillermond)Routein，ACCC2013，ACCC2014，AS2.481，AS2.482，AS2.1197；羅倫氏隱球酵母(Cryptococcus laurentii)(Kufferath)Skinner，ACCC2007，AS2.114，ID 95(y2)；新型隱球酵母(Cryptococcus neoformans)(Sanfelice)Vuillemin，ID25u(D2)u，ID 25v(D2)v，ID 25w(D2)w；漢遜氏德巴利氏酵母(Debaryomyces hansenii)(Zopf)Lodder et Kreger-van Rij，ACCC2010，AS2.45；克洛氏德巴利氏酵母(Debaryomyces kloeckeri)Guilliermond etPeju，ACCC2008，ACCC2009，AS2.33，AS2.34，AS2.494；德巴利氏酵母種屬(Debaryomyces sp.)，ACCC2011，ACCC2012；肋狀擬內(nèi)子包霉菌(Endomycopsis fibuligera)(Lindner)Dekker，ACCC2015，AS2.1145；阿舒氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)Guilliermond；白地霉(Geotrichum candidum)Link，ACCC2016，AS2.361，AS2.498，AS2.616，AS2.1035，AS2.1062，AS2.1080，AS2.1132，AS2.1175，AS2.1183；羅威氏地霉(Geotrichum ludwigii)(Hansen)Fanf等，AS2.363；健強(qiáng)地霉(Geotrichum robustum)Fang等，ACCC2017，AS2.621；甜香地霉(Geotrichum suaveolens)(Krzemecki)Fang等，AS2.364；異常漢遜氏酵母(Hansenula anomala)(Hansen)H et P sydow，ACCC2018，AS2.294，AS2.295，AS2.296，AS2.297，AS2.298，AS2.299，AS2.300，AS2.302，AS2.338，AS2.339，AS2.340，AS2.341，AS2.470，AS2.592，AS2.641，AS2.642，AS2.735，AS2.782，AS2.794；產(chǎn)阿拉伯糖醇漢遜氏酵母(Hansenula arabitolgens)Fang，AS2.887；杰丁漢遜氏酵母(Hansenula jadinii)Wickerham，ACCC2019；土星漢遜氏酵母(Hansenulasaturnus)(Klocker)H et P sydow，ACCC2020，AS2.303；施氏漢遜氏酵母(Hansenula schneggii)(Weber)Dekker，AS2.304；亞菌膜漢遜氏酵母(Hansenula subpelliculosa)Bedford，AS2.740，AS2.760，AS2.761，AS2.770，AS2.783，AS2.790，AS2.798，AS2.866；檸檬形克勒克酵母(Kloeckera apiculata)(Reess emend.Klocker)Janke，ACCC2021，ACCC2022，ACCC2023，AS2.197，AS2.496，AS2.711，AS2.714；斯達(dá)氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)Lodder et van Rij，ACCC2024，AS2.1390；粉狀畢赤氏酵母(Pichia farinosa)(Lindner)Hansen，ACCC2025，ACCC2026，AS2.86，AS2.87，AS2.705，AS2.803；膜醭畢赤氏酵母(Pichia membranaefaciens)Hansen，ACCC2027，AS2.89，AS2.661，AS2.1039；類酵母紅冬孢(Rhodosporidium toruloides)Banno，ACCC2028，AS2.1389；橙黃紅酵母(Rhodotorula aurantiaca)(Saito)Lodder，ACCC2029，AS2.280；膠粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)(Fresenius)Harrison，ACCC2030，AS2.102，AS2.107，AS2.278，AS2.499，AS2.694，AS2.703，AS2.704，AS2.1146；微小紅酵母(Rhodotorula minuta)(Saito)Harrison，AS2.277；深紅酵母(Rhodotorularubar)(Demme)Lodder，ACCC2031，AS2.21，AS2.22，AS2.103，AS2.105，AS2.108，AS2.140，AS2.166，AS2.272，AS2.279，AS2.282；中華紅酵母(Rhodotorula sinesis)Lee，AS2.1391；拜烈氏糖酵母(Saccharomyces bailii)Lindner，AS2.312；以及卡爾斯伯糖酵母(Saccharomyces carlsbergensis)Hansen，ACCC2032，ACCC2033，AS2.113，AS2.116，AS2.118，AS2.121，AS2.132，AS2.162，AS2.189，AS2.200，AS2.216，AS2.265，AS2.377，AS2.417，AS2.420，AS2.440，AS2.441，AS2.443，AS2.444，AS2.459，AS2.595，AS2.605，AS2.638，AS2.742，AS2.745，AS2.748，AS2.1042。
某些酵母種可根據(jù)本發(fā)明得到活化且包括于本發(fā)明中，已知對(duì)人類和/或其它活生物具有病原性，例如棉桃阿舒氏囊霉(Ashby et Nowell)Guillermond，ACCC2001，AS2.475，AS2.1176；皮炎芽生菌Gilehrist etStikes，ID(D 10)23；白色假絲酵母(Robin)Berkhout，ACCC2002，AS2.538，ID 16u(C1)u，ID 61v(C1)v；副克柔氏假絲酵母(Castellani etChalmer)Langeron et Guerra，ID 19a(C4)a，ID 19b(C4)b，ID 19c(C4)c，ID 19d(C4)d；熱帶假絲酵母(Castellani)Berkout，ID 17a(C2)a，ID 17b(C2)b，ID 17d(C2)d；基質(zhì)固囊酵母(Santa Maria)Santa Maria，AS2.1401；阿舒克利伯菌(Guillermond)Routein，ACCC2013，ACCC2014；羅倫氏隱球酵母(Kufferath)Skinner，ACCC2007，AS2.114，ID 95(y2)；新型隱球酵母(Sanfelice)Vuillemin，ID 25u(D2)u，ID 25v(D2)v，ID 25w(D2)w；漢遜氏德巴利氏酵母(Zopf)Lodder et Kreger-vanRij，ACCC2010；克洛氏德巴利氏酵母Guilliermond et Peju，ACCC2008，ACCC2009；德巴利氏酵母種，ACCC2011，ACCC2012；肋狀擬內(nèi)孢霉菌(Lindner)Dekker，ACCC2015，AS2.1145。某些情況下若野外開放使用可能危害人體和/或其它生物健康，則在本發(fā)明的生物肥中使用這些病原酵母較不佳。
通常以糖酵母屬的酵母菌為較佳。啤酒糖酵母菌株中以啤酒糖酵母漢遜(Hansen)為較佳菌株。最佳酵母菌株為保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)、保藏號(hào)為AS2.501，AS2.535，AS2.441，AS2.406，AS2.382及AS2.16的啤酒糖酵母漢遜菌株。通常酵母菌株可得自私有或公有實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)物，或得自公開的培養(yǎng)物保藏單位，例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，10801UniversityBoulevard，Manassas，VA 20110-2209及中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，中國(guó)科學(xué)院微生物所，中國(guó)北京海淀區(qū)，郵政信箱2714，郵編100080。
雖然較佳，但本發(fā)明的酵母細(xì)胞成分的制備非僅限于從酵母純菌株開始。各酵母細(xì)胞成分可通過(guò)培養(yǎng)不同種或株的酵母細(xì)胞混合物來(lái)產(chǎn)生。酵母細(xì)胞成分的組成可由本領(lǐng)域眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)酵母鑒別技術(shù)確定。
某些酵母可發(fā)揮一種所需的功能比其它酵母更有效。于本發(fā)明條件下培養(yǎng)之前或之后，任一種或任一株酵母進(jìn)行六種所需功能之一的能力可容易地由本領(lǐng)域已知方法測(cè)試。例如固氮量可由美國(guó)專利第5,578,486號(hào)所述的修飾的乙炔還原方法測(cè)定，在此以其全文引作參考。修飾的乙炔還原法通過(guò)測(cè)量空氣容積內(nèi)分子氮的減少來(lái)測(cè)定氮被固定的量。氮被固定的量也可通過(guò)測(cè)量酵母細(xì)胞產(chǎn)生的氨及硝酸鹽來(lái)確定(參見例如Grewling等，1965年，康乃爾農(nóng)業(yè)實(shí)驗(yàn)狀態(tài)公報(bào)(CornellAgr Exp Sta Bull)96022-25)。對(duì)于其它功能，植物可利用的磷數(shù)量作為從不溶性或生物不可利用的磷化合物轉(zhuǎn)變結(jié)果，可通過(guò)鉬藍(lán)法測(cè)定(參見例如Murphy等，1962年，分析化學(xué)期刊(Analytica Chimica Acta)2731-36)或紫外吸收法；而從不溶性或生物不可利用的鉀化合物轉(zhuǎn)變的可利用的鉀數(shù)量可例如由火焰原子吸收光譜術(shù)測(cè)定(參見例如Puchyr等，1986年，分析化學(xué)協(xié)會(huì)期刊(J.Assoc.Off.Anal.Chem.)69868-870)。在生物肥組合物加至土壤后酵母供給植物可利用的氮、磷及鉀的能力可由本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)測(cè)試。例如酵母細(xì)胞在土壤中所產(chǎn)生的植物可利用的氨、硝酸鹽、磷及鉀通過(guò)Morgan土壤試驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行提取并定量分析(參見例如Lunt等，1950年，康乃爾農(nóng)業(yè)實(shí)驗(yàn)狀態(tài)公報(bào)(Conn Agr Exp Sta Bull)541)。
不欲受任何理論或機(jī)理所限，本發(fā)明人相信培養(yǎng)條件活化和/或提升酵母的基因或一組基因的表達(dá)，由此酵母細(xì)胞變成活性或更有效地執(zhí)行各自功能。
根據(jù)本發(fā)明，生物肥組合物包含至少一種能執(zhí)行下列生物功能之一的酵母細(xì)胞成分(1)固定大氣氮?dú)猓?2)分解肥料組合物或土壤中存在的不溶性或生物不可利用的磷無(wú)機(jī)物或化合物；(3)分解肥料組合物或土壤中存在的不溶性或生物不可利用的鉀無(wú)機(jī)物或化合物；(4)分解肥料組合物或土壤中存在的復(fù)雜或高分子量碳材料或化合物；(5)生產(chǎn)過(guò)量生長(zhǎng)因子，其量足夠支持肥料組合物中的其它酵母菌株所需；以及(6)生產(chǎn)過(guò)量ATP，其量足夠支持肥料組合物中的其它酵母菌株所需。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物肥組合物可包含一種酵母菌株至多達(dá)6種不同酵母種或菌株，各菌株在特定條件下培養(yǎng)而誘發(fā)或使各自功能的能力最大化。須了解也考慮其它配方。如此若有所需，生物肥組合物可刪除一種或多種前述酵母細(xì)胞成分。例如在富含生物可利用的磷的土壤中，肥料組合物可調(diào)配成不含磷化合物分解的酵母所組成的成分。在本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施方案中，預(yù)期生物肥組合物含有全部6種酵母細(xì)胞成分以及有機(jī)和/或無(wú)機(jī)基質(zhì)。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，各種酵母細(xì)胞成分的酵母細(xì)胞存在于混合物中，酵母細(xì)胞可于某些條件下培養(yǎng)，以至具有不同功能的酵母細(xì)胞可彼此供給和/或彼此仰賴營(yíng)養(yǎng)素及生長(zhǎng)因子。結(jié)果在本發(fā)明的肥料組合物的各種酵母細(xì)胞成分間建立起仿共生關(guān)系。此種培養(yǎng)過(guò)程是任選的，但可改良生物肥的穩(wěn)定性及功效，由此肥料更適合在天然土壤環(huán)境中長(zhǎng)期使用。此種任選過(guò)程的培養(yǎng)條件述于第5.7節(jié)。
在本發(fā)明的又另一實(shí)施方案中，酵母細(xì)胞也可于某些條件下培養(yǎng)以便將酵母細(xì)胞調(diào)整適應(yīng)特定類型的土壤。此種培養(yǎng)過(guò)程為任選的，可分開應(yīng)用至各個(gè)酵母細(xì)胞成分或應(yīng)用至酵母細(xì)胞成分的混合物中。結(jié)果為酵母在特殊土壤環(huán)境下生長(zhǎng)及存活更好。此種任選過(guò)程的培養(yǎng)條件述于第5.8節(jié)。
如此處所用，若有生物肥存在于土壤或施用于植物根、莖、葉或其它部位，生物肥組合物可支持或提升植物生長(zhǎng)，該植物或植物部分增加生存力、大小、重量、發(fā)芽速率、生長(zhǎng)速率或成熟速率。因此，生物肥組合物可用于任一種農(nóng)藝、園藝及森林應(yīng)用上。生物肥組合物可用于大規(guī)模的商業(yè)耕作、開放性田地或溫室內(nèi)、或甚至用于裝飾性植物內(nèi)部。優(yōu)選的是生物肥用以提升農(nóng)作物的生長(zhǎng)例如但非限于谷類作物、蔬菜作物、水果作物、花作物及草作物。例如生物肥可用于小麥、大麥、玉米、大豆、稻米、燕麥、馬鈴薯、蘋果、柳橙、西紅柿、香瓜、櫻桃、檸檬、萵苣、胡蘿卜、甘蔗、煙草、棉花等。
生物肥組合物可以常規(guī)肥的相同方式施用。如相關(guān)領(lǐng)域中專業(yè)技術(shù)人員已知，可采用多種方法及設(shè)備。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的酵母菌株的培養(yǎng)醪直接施用至土壤或植物。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的酵母菌株干粉施用至土壤或植物。在又另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的酵母細(xì)胞成分及有機(jī)和無(wú)機(jī)基質(zhì)成分的混合物施用至土壤或植物。生物肥組合物可由噴液器、噴霧器及其它可自動(dòng)化的機(jī)械裝置施用至土壤。生物肥組合物可直接施用至植物例如浸泡植物種子和/或部或噴灑到葉上。這種施用可定期進(jìn)行，例如每年一次或每個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)一次或視需要更為頻繁。本發(fā)明的生物肥組合物也可與其它類型肥料結(jié)合使用或輪替使用。
于第5.1-5.6節(jié)分別說(shuō)明用于固氮、磷化合物分解、鉀化合物分解、復(fù)雜碳化合物分解、生長(zhǎng)因子生產(chǎn)及ATP生產(chǎn)的酵母細(xì)胞成分。描述各種酵母細(xì)胞成分的制法。第5.7節(jié)描述本發(fā)明的肥料組合物中各種酵母菌株間建立仿共生(Symbiosis-like)關(guān)系的方法。第5.8節(jié)描述使本發(fā)明的酵母細(xì)胞適合于特殊類型土壤的方法。第5.9節(jié)描述生物肥組合物的制造。也描述有機(jī)及無(wú)機(jī)原料的制法以及生物肥的制法，包括混合、干燥、冷卻及包裝。在本發(fā)明的各種實(shí)施方案中，使用處理、移轉(zhuǎn)及儲(chǔ)存微生物的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。雖然并非必要，但進(jìn)行本發(fā)明方法時(shí)采用無(wú)菌條件或干凈環(huán)境是理想的。
5.1.固氮酵母細(xì)胞成分氮固定是將大氣氮?dú)廪D(zhuǎn)成氨及硝酸鹽的過(guò)程。天然微生物中已發(fā)現(xiàn)超過(guò)70個(gè)屬的接近800種微生物，大多數(shù)為細(xì)菌及藍(lán)細(xì)菌(cyanobacteria)可固氮。某些固氮微生物例如根瘤菌與植物形成共生關(guān)系，特別在豆科植物根部。其它例如固氮菌可自由存活并可固定土壤中的氮。
本發(fā)明中酵母固氮能力被活化或提升，所得固氮酵母細(xì)胞可用作本發(fā)明的生物肥組合物的成分。
根據(jù)本發(fā)明，具有固氮能力增強(qiáng)的酵母細(xì)胞系通過(guò)在適當(dāng)培養(yǎng)基中有電磁場(chǎng)存在下培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)制備。活化或提升酵母固氮能力的電磁場(chǎng)頻率通常在800MHz至1000MHz的范圍內(nèi)。酵母細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)一段足夠長(zhǎng)的時(shí)間后，可采用本領(lǐng)域眾所周知的方法對(duì)細(xì)胞固氮的能力進(jìn)行測(cè)試。
本發(fā)明制造固氮酵母細(xì)胞的方法在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行。培養(yǎng)基含有可由酵母細(xì)胞同化的營(yíng)養(yǎng)源。通常碳水化合物例如糖類如蔗糖、葡萄糖、果糖、右旋糖、麥芽糖、木糖等以及淀粉可單獨(dú)或組合用于培養(yǎng)基中作為可同化碳源。培養(yǎng)基中所用的碳水化合物來(lái)源的確切數(shù)量部分依賴于培養(yǎng)基的其它成分，但碳水化合物的量通常占培養(yǎng)基重量的約0.1％至5％且優(yōu)選約0.5％至2％及最優(yōu)選約1％。這些碳源可分開使用，或數(shù)種碳源可合并用于培養(yǎng)基。
可摻入培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽類包括可生成鈉、鉀、鈣、磷酸根、硫酸根、碳酸根等離子的常見鹽類。營(yíng)養(yǎng)素?zé)o機(jī)鹽的非限制性例子有CaCO3、KH2PO4、MgSO4、NaCl及CaSO4。
表I固氮酵母的培養(yǎng)基組成
須注意表I提供的培養(yǎng)基組成并非限制性的。本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員鑒于實(shí)用及經(jīng)濟(jì)考慮例如培養(yǎng)規(guī)模以及培養(yǎng)基成分的當(dāng)?shù)毓?yīng)量可對(duì)培養(yǎng)基作出多種修飾。
培養(yǎng)過(guò)程始于對(duì)每100毫升培養(yǎng)基接種1毫升選定酵母菌株的接種物，其細(xì)胞密度為102-105細(xì)胞/毫升，優(yōu)選3×102-104細(xì)胞/毫升。過(guò)程可視需求放大或縮小規(guī)模。酵母培養(yǎng)物在電磁場(chǎng)存在下生長(zhǎng)約12-24小時(shí)，優(yōu)選約24小時(shí)。電磁場(chǎng)可由本領(lǐng)域已知的任一種手段施用，頻率在860至870MHz的范圍，優(yōu)選約865MHz，更優(yōu)選865.522至865.622MHz及最優(yōu)選約865.572MHz。電磁場(chǎng)振幅系在1000-2000mV的范圍，優(yōu)選約1250mV。第一期培養(yǎng)后，酵母細(xì)胞進(jìn)一步在基本相同條件下再培育約24小時(shí)，但振幅提升至4000-5000mV的較高水平，優(yōu)選至約4656mV。培養(yǎng)過(guò)程的舉例設(shè)置描述在
圖1中。本發(fā)明方法在約25℃至30℃下進(jìn)行；但優(yōu)選在28℃下操作此過(guò)程。培育過(guò)程優(yōu)選在溶氧濃度為0.025至0.8mol/立方米，優(yōu)選0.4mol/立方米的條件下進(jìn)行。溶氧水平可由本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的任一種常規(guī)手段控制，包括但非限于攪拌和/或通氣。
培養(yǎng)過(guò)程結(jié)束時(shí)，固氮酵母細(xì)胞可由本領(lǐng)域已知的多種方法從培養(yǎng)物中回收，并儲(chǔ)存在低于約0℃至4℃。固氮酵母細(xì)胞也可干燥且以粉末形式儲(chǔ)存。
本領(lǐng)域已知的任一種方法可用于測(cè)試培養(yǎng)后的酵母細(xì)胞固氮的能力。例如用于測(cè)量微生物固氮的修飾的乙炔還原法可來(lái)評(píng)估制備后酵母的固氮能力。修飾的乙炔還原法描述在美國(guó)專利第5,578,486號(hào)中，在此以其全文引作參考。例如1毫升制備后的酵母培養(yǎng)物接種于密封250毫升燒瓶?jī)?nèi)的30毫升根據(jù)表I的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)物于20-28℃下有含約20％容積比氧氣及80％容積比氮?dú)獾目諝獯嬖谙聹赜?4-56小時(shí)。然后固氮數(shù)量利用本領(lǐng)域已知的任一種手段例如但非限于氣相色譜法，通過(guò)測(cè)量空氣中氮?dú)獾臏p少來(lái)測(cè)定。本發(fā)明的酵母細(xì)胞的固氮量為每克酵母干重至少約10毫克。例如活化后，啤酒糖酵母漢遜菌株AS2.501的固氮量可達(dá)約11200毫克/克。
5.2.磷-分解的酵母細(xì)胞成分本發(fā)明的磷化合物-分解(P-分解)的酵母將不溶性或生物不可利用的含磷物質(zhì)例如磷酸巖轉(zhuǎn)成可溶性磷化合物，故變成植物可利用。
本發(fā)明中，酵母分解不溶性含磷物質(zhì)的能力被活化或提升，結(jié)果所得P-分解酵母細(xì)胞可用作本發(fā)明的生物肥組合物的成分。
根據(jù)本發(fā)明，能分解磷的酵母細(xì)胞可通過(guò)在適當(dāng)培養(yǎng)基中有電磁場(chǎng)存在下培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)制備?；罨蛱嵘湍傅牧追纸獾碾姶艌?chǎng)頻率通常在300MHz至500MHz的范圍。細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)一段足夠長(zhǎng)的時(shí)間后，采用本領(lǐng)域眾所周知的方法可對(duì)細(xì)胞分解含磷物質(zhì)的能力進(jìn)行測(cè)試。
本發(fā)明含磷酵母細(xì)胞的制法可于液體培養(yǎng)基中進(jìn)行。培養(yǎng)基含有可由酵母細(xì)胞同化的營(yíng)養(yǎng)源。通常碳水化合物例如糖類如蔗糖、葡萄糖、果糖、右旋糖、麥芽糖、木糖等及淀粉可單獨(dú)或組合用作為培養(yǎng)基中的可同化碳源。培養(yǎng)基中所用碳源的確切數(shù)量部分依賴于培養(yǎng)基的其它成分，但碳水化合物含量通常占培養(yǎng)基重量的約0.1％至5％及優(yōu)選約0.5％至2％及最優(yōu)選約1.5％。這些碳源可個(gè)別使用或若干碳源可組合用于培養(yǎng)基中。
可摻入培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)鹽為能生成鈉、鉀、鈣、硫酸根、碳酸根等離子的尋常鹽類。營(yíng)養(yǎng)素?zé)o機(jī)鹽的非限制性例子有碳酸鈣、硫酸鎂、氯化鈉及硫酸鈣。適當(dāng)形式的含不溶性磷的物質(zhì)也可包括于培養(yǎng)基中。非限制性例子包括篩目≥200的磷酸巖粉末。其它不溶性含磷物質(zhì)也可分開或合并使用。
表II磷分解酵母的培養(yǎng)基組成
須注意表II提供的培養(yǎng)基組成并非限制性的。本領(lǐng)域那些專業(yè)人員鑒于實(shí)用及經(jīng)濟(jì)考慮例如培養(yǎng)規(guī)模以及培養(yǎng)基成分的當(dāng)?shù)毓?yīng)量可對(duì)培養(yǎng)基作出多種修飾。
培養(yǎng)過(guò)程始于對(duì)每100毫升培養(yǎng)基接種1毫升選定酵母菌株的接種物，其細(xì)胞密度102-105細(xì)胞/毫升，優(yōu)選3×102-104細(xì)胞/毫升。過(guò)程可視需求放大或縮小規(guī)模。酵母培養(yǎng)物在電磁場(chǎng)存在下生長(zhǎng)約12-24小時(shí)，優(yōu)選約24小時(shí)。電磁場(chǎng)可由本領(lǐng)域已知的任一種手段施用，頻率為360至370MHz的范圍，優(yōu)選約366MHz，更優(yōu)選366.199至366.287MHz及最優(yōu)選約366.243MHz。電磁場(chǎng)振幅為1000-2000mV的范圍，優(yōu)選約1230mV。第一期培養(yǎng)后，酵母細(xì)胞進(jìn)一步在基本相同條件下再培育約24小時(shí)，但振幅提升至4000-5000mV的較高水平，優(yōu)選至約4570mV。培養(yǎng)過(guò)程的舉例設(shè)置描述在
圖1中。本發(fā)明方法在約25℃至30℃下進(jìn)行；但優(yōu)選在28℃下操作此過(guò)程。培育過(guò)程優(yōu)選在溶氧濃度為0.025至0.8mol/立方米，優(yōu)選0.4mol/立方米的條件下進(jìn)行。溶氧水平可由本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的任一種常規(guī)手段控制，包括但非限于攪拌和/或通氣。
培養(yǎng)過(guò)程結(jié)束時(shí)，P-分解酵母細(xì)胞可由本領(lǐng)域已知的多種方法從培養(yǎng)物中回收，并儲(chǔ)存在低于約0℃至4℃。P-分解酵母細(xì)胞也可干燥且以粉末形式儲(chǔ)存。
本領(lǐng)域已知的任一種方法皆可用于測(cè)試培養(yǎng)后的酵母細(xì)胞分解含不溶性磷的物質(zhì)的能力。在一實(shí)施方案中，1毫升制備后的酵母培養(yǎng)物接種于30毫升根據(jù)表II的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)物在20-28℃下溫育24-56小時(shí)。然后培養(yǎng)物中PO43-形式的生物可利用的磷含量可由本領(lǐng)域已知的任一種方法測(cè)定，包括但非限于紫外光吸收光譜測(cè)定法。培養(yǎng)物中PO43-含量為每克酵母干重至少提高10毫克。例如活化后，啤酒糖酵母漢遜菌株AS2.535培養(yǎng)物中PO43-含量提高至約4460毫克/克。
5.3.鉀-分解的酵母細(xì)胞成分本發(fā)明的鉀化合物分解(K-分解)的酵母可將含不溶性鉀的物質(zhì)例如鉀云母轉(zhuǎn)成可溶性鉀，故可由植物利用。
本發(fā)明中，多數(shù)個(gè)酵母分解不溶性含鉀物質(zhì)的能力被活化或提升，結(jié)果所得K-分解的酵母細(xì)胞可用作本發(fā)明的生物肥組合物的成分。
根據(jù)本發(fā)明，能分解鉀的酵母細(xì)胞可通過(guò)在適當(dāng)培養(yǎng)基中有電磁場(chǎng)存在下培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)制備?；罨蛱嵘湍傅拟浄纸獾碾姶艌?chǎng)頻率通常為100MHz至300MHz的范圍。細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)一段足夠長(zhǎng)的時(shí)間后，采用本領(lǐng)域眾所周知的方法可對(duì)細(xì)胞分解含鉀物質(zhì)的能力進(jìn)行測(cè)試。
本發(fā)明的K-分解酵母細(xì)胞的制法可于液體培養(yǎng)基進(jìn)行。培養(yǎng)基含有可由酵母細(xì)胞同化的營(yíng)養(yǎng)源。通常碳水化合物例如糖類如蔗糖、葡萄糖、果糖、右旋糖、麥芽糖、木糖等及淀粉可單獨(dú)或組合用作培養(yǎng)基的可同化碳源。培養(yǎng)基中所用碳源的確切數(shù)量部分依賴于培養(yǎng)基的其它成分，但碳水化合物含量通常占培養(yǎng)基重量的約0.1％至5％及優(yōu)選約0.5％至2％及最優(yōu)選約1.5％。這些碳源可個(gè)別使用或若干碳源可組合用于培養(yǎng)基中。
可摻入培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)鹽為能生成鈉、鈣、磷酸根、硫酸根、碳酸根等離子的尋常鹽類。營(yíng)養(yǎng)素?zé)o機(jī)鹽的非限制性例子有(NH4)2HPO4、碳酸鈣、硫酸鎂、氯化鈉及硫酸鈣。適當(dāng)形式的含不溶性鉀的物質(zhì)也可包括于培養(yǎng)基中。非限制性例子包括篩目≥200的鉀云母粉末。其它含不溶性鉀的物質(zhì)也可分開或合并使用。
表III鉀-分解酵母的培養(yǎng)基組成
須注意表III提供的培養(yǎng)基組成并非限制性的。本領(lǐng)域那些專業(yè)人員鑒于實(shí)用及經(jīng)濟(jì)考慮例如培養(yǎng)規(guī)模以及培養(yǎng)基成分的當(dāng)?shù)毓?yīng)量可對(duì)培養(yǎng)基作出多種修飾。
培養(yǎng)過(guò)程始于對(duì)每100毫升培養(yǎng)基接種1毫升選定酵母菌株的接種物，其細(xì)胞密度102-105細(xì)胞/毫升，優(yōu)選3×102-104細(xì)胞/毫升。過(guò)程可視需求放大或縮小規(guī)模。酵母培養(yǎng)物在電磁場(chǎng)存在下生長(zhǎng)約12-24小時(shí)，優(yōu)選約24小時(shí)。電磁場(chǎng)可由本領(lǐng)域已知的任一種手段施用，頻率為250-260MHz的范圍，優(yōu)選約255MHz，更優(yōu)選255.388至255.462MHz及最優(yōu)選255.425MHz。電磁場(chǎng)振幅在1000-2000mV的范圍，優(yōu)選約1340mV。第一期培養(yǎng)后，酵母細(xì)胞進(jìn)一步在基本相同條件下再培育約24小時(shí)，但振幅提升至4000-5000mV的較高水平，優(yōu)選至約4850mV。培養(yǎng)過(guò)程的舉例設(shè)置描述在
圖1中。本發(fā)明方法在約25℃至30℃下進(jìn)行；但優(yōu)選在28℃下操作此過(guò)程。培育過(guò)程優(yōu)選在溶氧濃度為0.025至0.8mol/立方米，優(yōu)選0.4mol/立方米的條件下進(jìn)行。溶氧水平可由本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的任一種常規(guī)手段控制，包括但非限于攪拌和/或通氣。
培養(yǎng)過(guò)程結(jié)束時(shí)，K-分解的酵母細(xì)胞可由本領(lǐng)域已知的多種方法從培養(yǎng)物中回收，并儲(chǔ)存在低于約0℃至4℃。K-分解的酵母細(xì)胞也可干燥且以粉末形式儲(chǔ)存。
本領(lǐng)域已知的任一種方法皆可用于測(cè)試培養(yǎng)后的酵母細(xì)胞分解含不溶性鉀的物質(zhì)的能力。在一實(shí)施方案中，1毫升制備后的酵母培養(yǎng)物接種于30毫升根據(jù)表III的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)物在20-28℃下溫育24-56小時(shí)。然后培養(yǎng)物中K+形式的生物可利用的鉀含量可由本領(lǐng)域已知的任一種方法測(cè)定，包括但非限于原子吸收光譜測(cè)定法。培養(yǎng)物中K+含量為每克酵母干重至少提高10毫克。例如活化后，啤酒糖酵母漢遜菌株AS2.441培養(yǎng)物中K+含量可達(dá)約4050毫克/克。
5.4.復(fù)雜碳-分解的酵母細(xì)胞成分本發(fā)明的碳-分解(C-分解)的酵母可將復(fù)雜、通常高分子量的碳化合物和物質(zhì)如纖維素轉(zhuǎn)成簡(jiǎn)單的碳水化合物，如戊糖和己糖。這些簡(jiǎn)單的碳水化合物被其他酵母細(xì)胞利用以支持它們的生長(zhǎng)和活性。
本發(fā)明中，酵母分解復(fù)雜碳化合物的能力被活化或提升，結(jié)果所得C-分解的酵母細(xì)胞可用作本發(fā)明的生物肥組合物的成分。
根據(jù)本發(fā)明，能分解碳的酵母細(xì)胞可通過(guò)在適當(dāng)培養(yǎng)基中有電磁場(chǎng)存在下培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)制備。用于酵母碳分解的電磁場(chǎng)頻率通常為1000MHz至1200MHz的范圍。細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)一段足夠長(zhǎng)的時(shí)間后，采用本領(lǐng)域眾所周知的方法可對(duì)細(xì)胞分解復(fù)雜碳化合物的能力進(jìn)行測(cè)試。
本發(fā)明的C-分解酵母細(xì)胞的制法可于液體培養(yǎng)基進(jìn)行。培養(yǎng)基含有可由酵母細(xì)胞同化的營(yíng)養(yǎng)源。適當(dāng)形式的含復(fù)雜碳的物質(zhì)如纖維素、煤等可用作培養(yǎng)基中的碳源。培養(yǎng)基中所用碳源的確切數(shù)量部分依賴于培養(yǎng)基的其它成分，但碳水化合物含量通常占培養(yǎng)基重量的約0.1％至5％及優(yōu)選約0.1％至1％及最優(yōu)選約0.5％。這些碳源可個(gè)別使用或若干碳源可組合用于培養(yǎng)基中。
可摻入培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)鹽為能生成鈉、鈣、磷酸根、硫酸根、碳酸根等離子的尋常鹽類。營(yíng)養(yǎng)素?zé)o機(jī)鹽的非限制性例子有(NH4)2HPO4、碳酸鈣、硫酸鎂、氯化鈉及硫酸鈣。
表IVC-分解酵母的培養(yǎng)基組成
須注意表IV提供的培養(yǎng)基組成并非限制性的。本領(lǐng)域那些專業(yè)人員鑒于實(shí)用及經(jīng)濟(jì)考慮例如培養(yǎng)規(guī)模以及培養(yǎng)基成分的當(dāng)?shù)毓?yīng)量可對(duì)培養(yǎng)基作出多種修飾。
培養(yǎng)過(guò)程始于對(duì)每100毫升培養(yǎng)基接種1毫升選定酵母菌株的接種物，其細(xì)胞密度102-105細(xì)胞/毫升，優(yōu)選3×102-104細(xì)胞/毫升。過(guò)程可視需求放大或縮小規(guī)模。酵母培養(yǎng)物在電磁場(chǎng)存在下生長(zhǎng)約12-24小時(shí)，優(yōu)選約24小時(shí)。電磁場(chǎng)可由本領(lǐng)域已知的任一種手段施用，頻率為1087-1097MHz的范圍，優(yōu)選約1092MHz，更優(yōu)選1092.346至1092.428MHz及最優(yōu)選1092.387MHz。電磁場(chǎng)振幅在1000-2000mV的范圍，優(yōu)選約1530mV。第一期培養(yǎng)后，酵母細(xì)胞進(jìn)一步在基本相同條件下再培育約24小時(shí)，但振幅提升至4000-5000mV的較高水平，優(yōu)選至約4720mV。培養(yǎng)過(guò)程的舉例設(shè)置描述在
圖1中。本發(fā)明方法在約25℃至30℃下進(jìn)行；但優(yōu)選在28℃下操作此過(guò)程。培育過(guò)程優(yōu)選在溶氧濃度為0.025至0.8mol/立方米，優(yōu)選0.4mol/立方米的條件下進(jìn)行。溶氧水平可由本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的任一種常規(guī)手段控制，包括但非限于攪拌和/或通氣。
培養(yǎng)過(guò)程結(jié)束時(shí)，C-分解的酵母細(xì)胞可由本領(lǐng)域已知的多種方法從培養(yǎng)物中回收，并儲(chǔ)存在低于約0℃至4℃。C-分解的酵母細(xì)胞也可干燥且以粉末形式儲(chǔ)存。
本領(lǐng)域已知的任一種方法皆可用于測(cè)試培養(yǎng)后的酵母細(xì)胞分解含復(fù)雜碳的物質(zhì)的能力。在一實(shí)施方案中，1毫升制備后的酵母培養(yǎng)物接種于30毫升根據(jù)表IV的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)物在20-28℃下溫育24-56小時(shí)。然后培養(yǎng)物中簡(jiǎn)單碳水化合物的含量可由本領(lǐng)域已知的任一種方法測(cè)定，包括但非限于色譜以及分子熒光光譜測(cè)定法。優(yōu)選地，培養(yǎng)物中簡(jiǎn)單碳水化合物的含量為每克酵母干重至少提高10毫克。例如活化后，啤酒糖酵母漢遜菌株AS2.406培養(yǎng)物中簡(jiǎn)單碳水化合物的含量可達(dá)27200毫克/克。
5.5.生產(chǎn)生長(zhǎng)因子的酵母細(xì)胞成分本發(fā)明的生長(zhǎng)因子生產(chǎn)(GP-生產(chǎn))的酵母可產(chǎn)生維生素及其它營(yíng)養(yǎng)素，例如但非限于維生素B-1、核黃素(維生素B-2)、維生素B-12、煙酸(B-3)、吡哆醇(B-6)、泛酸(B-5)、葉酸、生物素、對(duì)氨基苯甲酸、膽堿、肌醇，其產(chǎn)量可支持其它酵母菌株的生長(zhǎng)。這些生長(zhǎng)因子可由酵母在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生。
本發(fā)明中，酵母過(guò)量生產(chǎn)生長(zhǎng)因子的能力被活化或提升，結(jié)果所得GP-生產(chǎn)的酵母細(xì)胞可用作本發(fā)明的生物肥組合物的成分。
根據(jù)本發(fā)明，能生產(chǎn)GP的酵母細(xì)胞可通過(guò)在適當(dāng)培養(yǎng)基中有電磁場(chǎng)存在下培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)制備。用于活化或提升酵母GP-生產(chǎn)的電磁場(chǎng)頻率通常為1300MHz至1500MHz的范圍。細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)一段足夠長(zhǎng)的時(shí)間后，采用本領(lǐng)域眾所周知的方法可對(duì)細(xì)胞生產(chǎn)生長(zhǎng)因子的能力進(jìn)行測(cè)試。
本發(fā)明的GP-生產(chǎn)的酵母細(xì)胞的制法可于液體培養(yǎng)基進(jìn)行。培養(yǎng)基含有可由酵母細(xì)胞同化的營(yíng)養(yǎng)源。通常碳水化合物例如糖類如蔗糖、葡萄糖、果糖、右旋糖、麥芽糖、木糖等及淀粉可單獨(dú)或組合用作培養(yǎng)基的可同化碳源。培養(yǎng)基中所用碳源的確切數(shù)量部分依賴于培養(yǎng)基的其它成分，但碳水化合物含量通常占培養(yǎng)基重量的約0.1％至5％及優(yōu)選約0.5％至2％及最優(yōu)選約0.8％。這些碳源可個(gè)別使用或若干碳源可組合用于培養(yǎng)基中。
可摻入培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)鹽為能生成鈉、鈣、磷酸根、硫酸根、碳酸根等離子的尋常鹽類。營(yíng)養(yǎng)素?zé)o機(jī)鹽的非限制性例子有(NH4)2HPO4、碳酸鈣、硫酸鎂、氯化鈉及硫酸鈣。
表VGP-生產(chǎn)的酵母的培養(yǎng)基組成
須注意表V提供的培養(yǎng)基組成并非限制性的。本領(lǐng)域那些專業(yè)人員鑒于實(shí)用及經(jīng)濟(jì)考慮例如培養(yǎng)規(guī)模以及培養(yǎng)基成分的當(dāng)?shù)毓?yīng)量可對(duì)培養(yǎng)基作出多種修飾。
培養(yǎng)過(guò)程始于對(duì)每100毫升培養(yǎng)基接種1毫升選定酵母菌株的接種物，其細(xì)胞密度102-105細(xì)胞/毫升，優(yōu)選3×102-104細(xì)胞/毫升。過(guò)程可視需求放大或縮小規(guī)模。酵母培養(yǎng)物在電磁場(chǎng)存在下生長(zhǎng)約12-24小時(shí)，優(yōu)選約24小時(shí)。電磁場(chǎng)可由本領(lǐng)域已知的任一種手段施用，頻率為1382-1392MHz的范圍，優(yōu)選約1387MHz，更優(yōu)選1387.517至1387.595MHz及最優(yōu)選1387.556MHz。電磁場(chǎng)振幅在1000-2000mV的范圍，優(yōu)選約1620mV。第一期培養(yǎng)后，酵母細(xì)胞進(jìn)一步在基本相同條件下再培育約24小時(shí)，但振幅提升至4000-5000mV的較高水平，優(yōu)選至約4830mV。培養(yǎng)過(guò)程的舉例設(shè)置描述在
圖1中。本發(fā)明方法在約25℃至30℃下進(jìn)行；但優(yōu)選在28℃下操作此過(guò)程。培育過(guò)程優(yōu)選在溶氧濃度為0.025至0.8mol/立方米，優(yōu)選0.4mol/立方米的條件下進(jìn)行。溶氧水平可由本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的任一種常規(guī)手段控制，包括但非限于攪拌和/或通氣。
培養(yǎng)過(guò)程結(jié)束時(shí)，GP-生產(chǎn)的酵母細(xì)胞可由本領(lǐng)域已知的多種方法從培養(yǎng)物中回收，并儲(chǔ)存在低于約0-4℃。GP-生產(chǎn)的酵母細(xì)胞也可干燥且以粉末形式儲(chǔ)存。
本領(lǐng)域已知的任一種方法皆可用于測(cè)試培養(yǎng)后的酵母細(xì)胞過(guò)量生產(chǎn)生長(zhǎng)因子的能力。在一實(shí)施方案中，1毫升制備后的酵母培養(yǎng)物接種于30毫升根據(jù)表V的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)物在20-28℃下溫育32-48小時(shí)。然后培養(yǎng)物中的生長(zhǎng)因子含量以維生素B1、B2、B6及B12總量表示，可由本領(lǐng)域已知的任一種方法測(cè)定，包括但非限于高效液相色譜(HPLC)。培養(yǎng)物中的生長(zhǎng)因子含量為每克酵母干重提高至少10毫克。例如活化后，啤酒糖酵母漢遜AS2.382培養(yǎng)物中維生素B1、B2、B6及B12的含量可達(dá)6120毫克聚集物/克。
5.6. ATP-生產(chǎn)的酵母細(xì)胞成分本發(fā)明的ATP-生產(chǎn)的酵母能過(guò)量生產(chǎn)ATP，其量可支持生物肥組合物中其他酵母菌株的生長(zhǎng)。
本發(fā)明中，酵母過(guò)量生產(chǎn)ATP的能力被活化或提升，結(jié)果所得ATP-生產(chǎn)的酵母細(xì)胞可用作本發(fā)明的生物肥組合物的成分。
根據(jù)本發(fā)明，能提升ATP-生產(chǎn)的酵母細(xì)胞可通過(guò)在適當(dāng)培養(yǎng)基中有電磁場(chǎng)存在下培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)制備。用于酵母活化或提升ATP-生產(chǎn)的電磁場(chǎng)頻率通常為1600MHz至1800MHz的范圍。細(xì)胞經(jīng)生長(zhǎng)一段足夠長(zhǎng)的時(shí)間后，采用本領(lǐng)域眾所周知的方法可對(duì)細(xì)胞生產(chǎn)ATP的能力提升進(jìn)行測(cè)試。
本發(fā)明ATP-生產(chǎn)的酵母細(xì)胞的制法可于液體培養(yǎng)基進(jìn)行。培養(yǎng)基含有可由酵母細(xì)胞同化的營(yíng)養(yǎng)源。通常碳水化合物例如糖類如蔗糖、葡萄糖、果糖、右旋糖、麥芽糖、木糖等及淀粉可單獨(dú)或組合用作培養(yǎng)基的可同化碳源。培養(yǎng)基中所用碳源的確切數(shù)量部分依賴于培養(yǎng)基的其它成分，但碳水化合物含量通常占培養(yǎng)基重量的約0.1％至5％及優(yōu)選約0.5％至2％及最優(yōu)選約0.8％。這些碳源可個(gè)別使用或若干碳源可組合用于培養(yǎng)基中。
可摻入培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)鹽為能生成鈉、鈣、磷酸根、硫酸根、碳酸根等離子的尋常鹽類。營(yíng)養(yǎng)素?zé)o機(jī)鹽的非限制性例子有(NH4)2HPO4、碳酸鈣、硫酸鎂、氯化鈉及硫酸鈣。
表VIATP-生產(chǎn)的酵母的培養(yǎng)基組成
須注意表VI提供的培養(yǎng)基組成并非限制性的。本領(lǐng)域那些專業(yè)人員鑒于實(shí)用及經(jīng)濟(jì)考慮例如培養(yǎng)規(guī)模以及培養(yǎng)基成分的當(dāng)?shù)毓?yīng)量可對(duì)培養(yǎng)基作出多種修飾。
培養(yǎng)過(guò)程始于對(duì)每100毫升培養(yǎng)基接種1毫升選定酵母菌株的接種物，其細(xì)胞密度102-105細(xì)胞/毫升，優(yōu)選3×102-104細(xì)胞/毫升。過(guò)程可視需求放大或縮小規(guī)模。酵母培養(yǎng)物在電磁場(chǎng)存在下生長(zhǎng)約12-24小時(shí)，優(yōu)選約24小時(shí)。電磁場(chǎng)可由本領(lǐng)域已知的任一種手段施用，頻率為1690-1700MHz的范圍，優(yōu)選約1694MHz，更優(yōu)選1694.328至1694.402MHz及最優(yōu)選1694.365MHz。電磁場(chǎng)振幅在1000-2000mV的范圍，優(yōu)選約1470mV。第一期培養(yǎng)后，酵母細(xì)胞進(jìn)一步在基本相同條件下再培育約24小時(shí)，但振幅提升至4000-5000mV的較高水平，優(yōu)選至約4780mV。培養(yǎng)過(guò)程的舉例設(shè)置描述在
圖1中。本發(fā)明方法在約25℃至30℃下進(jìn)行；但優(yōu)選在28℃下操作此過(guò)程。培育過(guò)程優(yōu)選在溶氧濃度為0.025至0.8mol/立方米，優(yōu)選0.4mol/立方米的條件下進(jìn)行。溶氧水平可由本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的任一種常規(guī)手段控制，包括但非限于攪拌和/或通氣。
培養(yǎng)過(guò)程結(jié)束時(shí)，ATP-生產(chǎn)的酵母細(xì)胞可由本領(lǐng)域已知的多種方法從培養(yǎng)物中回收，并儲(chǔ)存在低于約0-4℃。ATP-生產(chǎn)的酵母細(xì)胞也可干燥且以粉末形式儲(chǔ)存。
本領(lǐng)域已知的任一種方法皆可用于測(cè)試培養(yǎng)后的酵母細(xì)胞過(guò)量生產(chǎn)ATP的能力。在一實(shí)施方案中，1毫升制備后的酵母培養(yǎng)物接種于30毫升根據(jù)表VI的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)物在20-28℃下溫育36-56小時(shí)。然后培養(yǎng)物中ATP的含量可由本領(lǐng)域已知的任一種方法測(cè)定，包括但非限于HPLC。ATP的產(chǎn)量為每克酵母干重至少提高約10毫克。例如活化后，啤酒糖酵母漢遜菌株AS2.16培養(yǎng)物中ATP的產(chǎn)量可達(dá)約3320毫克/克。
5.7.仿共生關(guān)系的形成在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，如5.1-5.4節(jié)所述具有最新活化或提升固氮、分解含磷無(wú)機(jī)物或化合物、分解不溶性含鉀無(wú)機(jī)物或化合物以及分解復(fù)雜碳材料的能力的酵母菌株被合并培養(yǎng)，以便它們形成仿共生關(guān)系，由此它們可共同生長(zhǎng)而基本上無(wú)須仰賴外來(lái)供應(yīng)生物可利用的氮、磷、鉀及碳營(yíng)養(yǎng)素。生長(zhǎng)需要的營(yíng)養(yǎng)素系由肥料組合物中的各自營(yíng)養(yǎng)素-生產(chǎn)的酵母菌株通過(guò)將來(lái)自各種來(lái)源的生物不可利用的營(yíng)養(yǎng)素轉(zhuǎn)成可利用的營(yíng)養(yǎng)素來(lái)提供。各種酵母菌株產(chǎn)生各型營(yíng)養(yǎng)素的活性部分與其它酵母細(xì)胞的需求以及植物有關(guān)。結(jié)果當(dāng)需要時(shí)，可溶性生物可利用的營(yíng)養(yǎng)素可被轉(zhuǎn)化，因此避免由于例如滲濾而過(guò)量損失。
可用以改良生物肥性能的任選方法說(shuō)明如下。四株根據(jù)5.1-5.4節(jié)制備的酵母經(jīng)混合后在適當(dāng)液體培養(yǎng)基中有電磁場(chǎng)存在下培養(yǎng)。培養(yǎng)基含有生物不可利用形式的氮、磷、鉀及碳營(yíng)養(yǎng)素。作為非限制性實(shí)例子，大氣氮?dú)庥米鞯獱I(yíng)養(yǎng)源，磷酸鹽巖石粉用作磷營(yíng)養(yǎng)源，鉀云母粉用作鉀營(yíng)養(yǎng)源以及粉狀纖維素用作復(fù)雜的碳營(yíng)養(yǎng)源。其它形式的不溶性含磷及鉀的物質(zhì)及復(fù)雜的碳化合物也可用以替代或組合前述任一種無(wú)機(jī)物質(zhì)作為磷、鉀及碳營(yíng)養(yǎng)源?？蓳饺肱囵B(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽為能生成鈉、鈣、硫酸根、碳酸根等離子的尋常鹽類。營(yíng)養(yǎng)素?zé)o機(jī)鹽的非限制性例子有碳酸鈣、硫酸鎂、氯化鈉及硫酸鈣。
表VII形成仿共生關(guān)系的培養(yǎng)基組成
須注意表VII提供的培養(yǎng)基組成并非限制性的。本領(lǐng)域那些專業(yè)人員鑒于實(shí)際及經(jīng)濟(jì)考慮例如培養(yǎng)規(guī)模以及培養(yǎng)基成分的當(dāng)?shù)毓?yīng)情況可對(duì)培養(yǎng)基作出多種修飾。
培育過(guò)程可優(yōu)選在溶氧濃度為0.025至0.8mol/立方米，優(yōu)選0.4mol/立方米的條件下進(jìn)行。溶氧水平可由本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的任一種常規(guī)手段控制，包括但非限于攪拌和/或通氣。本發(fā)明方法在約25℃至30℃下進(jìn)行；但優(yōu)選在28℃下操作此方法。該方法始于在無(wú)菌培養(yǎng)基中通常接種各約20毫升四種酵母細(xì)胞菌株的接種物，各個(gè)細(xì)胞密度約108細(xì)胞/毫升。任選方法可視需要放大或縮小規(guī)模。
酵母培養(yǎng)物在四種獨(dú)立的電磁場(chǎng)中生長(zhǎng)12-72小時(shí)，優(yōu)選生長(zhǎng)約48小時(shí)。電磁場(chǎng)可由多種手段施用，各具有下列頻率(1)860至870MHz的范圍，優(yōu)選約865MHz，更優(yōu)選865.522至865.622MHz的范圍及最優(yōu)選865.572MHz用于固氮；(2)360至370MHz的范圍，優(yōu)選約366MHz，更優(yōu)選366.199至366.287MHz的范圍及最優(yōu)選366.243MHz用于分解磷；(3)250至260MHz的范圍，優(yōu)選約255MHz，更優(yōu)選255.388至255.462MHz的范圍，及最優(yōu)選255.425MHz用于分解鉀；(4)1087-1097MHz的范圍，優(yōu)選約1092MHz，更優(yōu)選1092.346至1092.428MHz的范圍及最優(yōu)選1092.387MHz用于分解復(fù)雜的碳。各磁場(chǎng)在0-3000mV，優(yōu)選20-1800mV之間以1mV的臺(tái)階及每一完整周期18-23分鐘的速率重復(fù)循環(huán)。培養(yǎng)過(guò)程的舉例設(shè)置示于圖2中。
5.8.土壤調(diào)適本發(fā)明的酵母菌株也必須能夠在各型土壤中生長(zhǎng)及發(fā)揮其各自功能。酵母菌株存活及生長(zhǎng)能力可通過(guò)使本發(fā)明的酵母菌株調(diào)整適應(yīng)特定土壤條件而得到提升。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，根據(jù)5.1-5.6節(jié)任一節(jié)制備的酵母細(xì)胞可單獨(dú)或混合在含有得自一種或多種土壤來(lái)源的土壤的固體或半固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。此種任選方法可用于改良生物肥性能，以下列實(shí)例方式描述。
將含10毫升酵母、密度為106細(xì)胞/毫升的懸浮液與1000立方厘米的土壤培養(yǎng)基混合。方法規(guī)?？梢曅枰糯蠡蚩s小。酵母與土壤的混合物于電磁場(chǎng)存在下培養(yǎng)約48-96小時(shí)，優(yōu)選約48小時(shí)。電磁場(chǎng)可由多種手段施用，依賴于酵母菌株，電磁場(chǎng)具有對(duì)應(yīng)于第5.1-5.6節(jié)所述頻率的一種頻率?？墒褂?00-3000mV，優(yōu)選2100mV的場(chǎng)振幅。培養(yǎng)物在約3℃至約48℃間循環(huán)的溫度下溫育。例如在典型的周期中，培養(yǎng)溫度可始于35-48℃，保持此溫約1-2小時(shí)，然后調(diào)整至42-45℃且于此溫維持1-2小時(shí)，接著調(diào)整至26-30℃且于此溫維持約2-4小時(shí)，然后向下調(diào)整至5-10℃并于此溫維持約1-2小時(shí)及溫度可再升高至35-45℃用于另一周期。周期重復(fù)直至此過(guò)程完成。最后溫度周期完成后，培養(yǎng)溫度降至3-4℃且于此溫維持約5-6小時(shí)。調(diào)整適應(yīng)后，酵母細(xì)胞由常規(guī)方法例如過(guò)濾從培養(yǎng)基中分離及回收。調(diào)適后的酵母細(xì)胞可儲(chǔ)存于4℃以下。培養(yǎng)過(guò)程的舉例設(shè)置示于圖3中。
5.9.酵母細(xì)胞的分離或富集根據(jù)第5.7節(jié)已經(jīng)調(diào)適而形成仿共生關(guān)系的酵母細(xì)胞可以各酵母細(xì)胞菌株保有其獲得或提升的功能的方式而分離或豐富。酵母細(xì)胞的分離根據(jù)在此以其全文引作參考的美國(guó)專利第5,578,486號(hào)及中國(guó)專利公報(bào)CN 1110317A所述方法進(jìn)行。用于活化酵母細(xì)胞的頻率可在分離過(guò)程中使用。然后分離后的酵母細(xì)胞經(jīng)干燥儲(chǔ)存。
5.10.生物肥的制造除了酵母細(xì)胞成分外，多種有機(jī)及無(wú)機(jī)原料也可包括于本發(fā)明的生物肥組合物中。這些材料的制備以及制造生物肥牽涉的步驟系在此描述。
5.10.1.有機(jī)及無(wú)機(jī)基質(zhì)成分的制備大范圍的有機(jī)及無(wú)機(jī)材料可用于本發(fā)明的生物肥組合物中。有機(jī)材料例如但非限于煤礦廢料以及風(fēng)化煤或任何含有20％以上的有機(jī)物質(zhì)的材料可用作碳源以支持植物及酵母的生長(zhǎng)。也可使用這些有機(jī)材料的組合及混合物。存在于這些材料的有機(jī)化合物由酵母分解，該酵母可將復(fù)雜或高分子量碳鏈分子分解成為簡(jiǎn)單碳化合物，因而可被植物以及肥料中的其它酵母細(xì)胞利用。
無(wú)機(jī)材料例如但非限于磷酸鹽巖石及鉀云母，分別作為磷源及鉀源包括在內(nèi)。也可使用其它含磷或含鉀材料及無(wú)機(jī)物。這些無(wú)機(jī)化合物由K-分解及P-分解的酵母細(xì)胞分解成生物可利用的鉀及生物可利用的磷，它們可被生長(zhǎng)中的植物以及肥料中的酵母細(xì)胞利用。任何有機(jī)或無(wú)機(jī)材料可單獨(dú)或合并使用或用以替代本發(fā)明的任何其它材料。或者，如果特定用途視為需要，則一種或多種有機(jī)或無(wú)機(jī)成分可被刪除或由另一種取代。例如若土壤含有足夠鉀無(wú)機(jī)物則可刪除鉀云母。
本發(fā)明所用的有機(jī)及無(wú)機(jī)材料不應(yīng)含有其含量可抑制酵母細(xì)胞或植物生長(zhǎng)的毒性物質(zhì)或微生物。
本發(fā)明的有機(jī)及無(wú)機(jī)成分在摻入肥料前可研磨成適當(dāng)?shù)男问郊按笮?。通常有機(jī)或無(wú)機(jī)材料可輸送至破碎機(jī)，于該處被分解成為直徑≤5厘米的碎片。任何常規(guī)破碎機(jī)或相等同的機(jī)器皆可用于此目的。然后小片由任何輸送裝置轉(zhuǎn)移至研磨機(jī)并被研磨至篩目≥150的粉末。任何允許細(xì)研的研磨機(jī)皆可用于此目的。然后粉末輸送至適當(dāng)?shù)膬?chǔ)存槽中儲(chǔ)存直至與肥料的其它成分使用為止。研磨過(guò)程示意圖顯示于圖4及5中。
5.10.2.使用產(chǎn)生生長(zhǎng)因子的酵母的發(fā)酵過(guò)程本發(fā)明中，GP-生產(chǎn)的酵母的制備在發(fā)酵過(guò)程中使用第5.5節(jié)所述活化酵母菌株作為種子來(lái)進(jìn)行。發(fā)酵過(guò)程示意顯示于圖6中。
根據(jù)每千克淀粉2.5升水的比例制備發(fā)酵培養(yǎng)基。使用干凈水、優(yōu)選不含任何微生物的水以制備發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵在20-30℃，優(yōu)選25-28℃下于干凈環(huán)境及沒(méi)有強(qiáng)磁場(chǎng)源例如電源線及電源產(chǎn)生器的空間中進(jìn)行。任何接觸發(fā)酵醪的設(shè)備包括反應(yīng)器、管路及攪拌器每次使用前必須徹底清潔。依據(jù)發(fā)酵溫度，發(fā)酵過(guò)程通常持續(xù)約60-72小時(shí)。至少有90％發(fā)酵基質(zhì)被發(fā)酵。發(fā)酵優(yōu)選在半有氧或氧水平為最高可溶性氧濃度的約20-60％的條件下進(jìn)行。氧水平可由本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的任一種常規(guī)手段控制，包括但非限于攪拌和/或通氣。發(fā)酵后，細(xì)胞數(shù)應(yīng)達(dá)約2×1010細(xì)胞/毫升。發(fā)酵醪維持于15-28℃下且須在24小時(shí)以內(nèi)使用?；蛘撸珿P-生產(chǎn)的酵母可經(jīng)排水、干燥及以粉末形式儲(chǔ)存。
5.10.3.使用ATP-生產(chǎn)的酵母的發(fā)酵過(guò)程本發(fā)明中，ATP-生產(chǎn)的酵母的制備在發(fā)酵過(guò)程中使用第5.6節(jié)所述調(diào)適的酵母菌株作為種子進(jìn)行。發(fā)酵過(guò)程示意圖顯示于圖6中。
根據(jù)每千克淀粉2.5升水的比例制備發(fā)酵培養(yǎng)基。使用干凈水、優(yōu)選不含任何微生物的水，最優(yōu)選高壓滅菌水以制備發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵系在20-30℃，優(yōu)選25-28℃下于干凈環(huán)境及沒(méi)有強(qiáng)磁場(chǎng)源例如電源線及電源產(chǎn)生器的空間中進(jìn)行。任何接觸發(fā)酵醪的設(shè)備包括反應(yīng)器、管路及攪拌器每次使用前必須徹底清潔。依據(jù)發(fā)酵溫度，發(fā)酵過(guò)程通常持續(xù)約60-72小時(shí)。至少有90％發(fā)酵基質(zhì)被發(fā)酵。發(fā)酵優(yōu)選在半有氧或氧水平為最高可溶性氧濃度的約20-60％的條件下進(jìn)行。氧水平可由本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的任一種常規(guī)手段控制，包括但非限于攪拌和/或通氣。發(fā)酵后，細(xì)胞數(shù)應(yīng)達(dá)約2×1010細(xì)胞/毫升。發(fā)酵醪維持于15-28℃且須在24小時(shí)以內(nèi)使用?；蛘?，ATP-生產(chǎn)的酵母可經(jīng)排水、干燥及以粉末形式儲(chǔ)存。
5.10.4.原料混合物的制備有機(jī)及無(wú)機(jī)原料以表VIII所示舉例的比例混合。將適量的根據(jù)第5.10.1節(jié)制備的有機(jī)及無(wú)機(jī)材料以及淀粉輸送至混合機(jī)中?？墒褂贸Ｒ?guī)的混合機(jī)例如但非限于轉(zhuǎn)鼓混合機(jī)。混合槽恒定旋轉(zhuǎn)以便均勻混合無(wú)機(jī)材料、有機(jī)材料及淀粉的粉末。然后混合物輸送至儲(chǔ)存槽。有機(jī)及無(wú)機(jī)基質(zhì)材料的混合程序示于圖7中。
表VIII原料比例
5.10.5.酵母混合物的制備酵母混合物以表IX所示的舉例比例制備。將適量的根據(jù)第5.1-5.6節(jié)制備的六種干粉形式的酵母菌株輸送至混合槽。酵母混合約10-20分鐘。然后把混合物送至儲(chǔ)存槽。任何用于混合酵母的設(shè)備包括混合槽及儲(chǔ)存槽每次用前必須經(jīng)徹底清潔，優(yōu)選滅菌。酵母混合物低于20℃以下儲(chǔ)存且須在24小時(shí)以內(nèi)使用。酵母的混合程序示于圖8中?；蛘?，六種酵母混合物可經(jīng)干燥后以粉末形式儲(chǔ)存。
表IX微生物比例
5.10.6.生物肥的制造本發(fā)明生物肥的生產(chǎn)是以根據(jù)表X所示比例通過(guò)混合第5.10.5節(jié)的酵母混合物及第5.10.1節(jié)的有機(jī)及無(wú)機(jī)材料的混合物來(lái)進(jìn)行的。例如酵母及有機(jī)及無(wú)機(jī)材料輸送至造粒機(jī)以形成顆粒。然后肥料顆粒以兩階段式干燥處理干燥。第一干燥階段，肥料在第一干燥機(jī)中不超過(guò)65℃的溫度下干燥不超過(guò)10分鐘時(shí)間，以便酵母細(xì)胞快速變成休眠狀態(tài)。然后把肥料送至第二干燥機(jī)并于不超過(guò)75℃的溫度下干燥不超過(guò)30分鐘時(shí)間以進(jìn)一步去除水。兩階段后，水含量應(yīng)低于5％。優(yōu)選的是溫度及干燥時(shí)間為兩干燥階段所特有，從而酵母細(xì)胞不會(huì)喪失其活力及功能。接著肥料冷卻至室溫。肥料也可在分離器中篩選選擇優(yōu)選尺寸的肥料顆粒。任何分離器例如但非限于可調(diào)整速度及篩目大小的渦輪分離器皆可使用。最后將選定大小的肥料送至散裝袋填裝機(jī)包裝。
生產(chǎn)過(guò)程示于圖9-11中。圖9為從其成分生產(chǎn)肥料程序的示意圖。
圖10為干燥過(guò)程的示意圖。
圖11為冷卻及包過(guò)程的示意圖。
表X生物肥的組成(每一公噸肥料)
6.實(shí)施例下列實(shí)施例表明本發(fā)明的生物肥組合物的制造。本實(shí)施例為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。
保藏編號(hào)為AS2.501、AS2.535、AS2.441、AS2.406、AS2.382及AS2.16的啤酒糖酵母漢遜菌株，各保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，用以制備生物肥的酵母細(xì)胞成分。酵母菌株AS2.501根據(jù)第5.1節(jié)所述方法培養(yǎng)用于固氮。酵母菌株AS2.535根據(jù)第5.2節(jié)所述方法培養(yǎng)用于磷分解。酵母菌株AS2.441根據(jù)第5.3節(jié)所述方法培養(yǎng)用于K-分解。酵母菌株AS2.406根據(jù)第5.4節(jié)所述方法培養(yǎng)用于C-分解。酵母菌株AS2.382根據(jù)第5.5節(jié)所述方法培養(yǎng)用于生長(zhǎng)因子生產(chǎn)。酵母菌株AS2.16根據(jù)第5.6節(jié)所述方法培養(yǎng)用于ATP生產(chǎn)。
煤礦廢料及磷酸鹽巖石分別用作有機(jī)及無(wú)機(jī)材料。本實(shí)施例所用的煤礦廢料含有至少30％有機(jī)物質(zhì)。本實(shí)施例所用的磷酸鹽巖石含有至少25％的五氧化磷。煤礦廢料及磷酸鹽巖石根據(jù)第5.10.1節(jié)制備。
生長(zhǎng)因子-生產(chǎn)的酵母的生產(chǎn)在發(fā)酵過(guò)程中使用第5.5節(jié)所述活化酵母菌株AS2.382作為種子進(jìn)行。發(fā)酵過(guò)程示意圖示于圖6中。發(fā)酵培養(yǎng)基按照每千克淀粉2.5升干凈水的比例制備。發(fā)酵培養(yǎng)基根據(jù)每升培養(yǎng)基10毫升種子溶液的比例接種。在溫度28±1℃及氧濃度0.4mol/立方米時(shí)于干凈環(huán)境中進(jìn)行發(fā)酵約48小時(shí)，所述干凈環(huán)境其中沒(méi)有任何電磁場(chǎng)源。發(fā)酵后，細(xì)胞數(shù)達(dá)約2×1010細(xì)胞/毫升。
ATP-生產(chǎn)的酵母的生產(chǎn)在發(fā)酵過(guò)程中使用第5.6節(jié)所述活化酵母菌株AS2.16作為種子進(jìn)行。發(fā)酵過(guò)程示意圖示于圖6中。發(fā)酵培養(yǎng)基按照每千克淀粉2.5升干凈水的比例制備。發(fā)酵培養(yǎng)基根據(jù)每升培養(yǎng)基10毫升種子溶液的比例接種。在溫度28±1℃及氧濃度0.4mol/立方米時(shí)于干凈環(huán)境中進(jìn)行發(fā)酵約56小時(shí)，所述干凈環(huán)境其中沒(méi)有任何電磁場(chǎng)源。發(fā)酵后，細(xì)胞數(shù)達(dá)約2×1010細(xì)胞/毫升。
原料混合物系根據(jù)表XI及第5.10.4節(jié)的程序制備。
表XI原料比例
酵母混合物系根據(jù)表XII及第5.10.5節(jié)所述程序制備。
表XII酵母比例(每一公噸肥料)
生物肥的生產(chǎn)是以根據(jù)表XIII的比例混合酵母混合物、有機(jī)及無(wú)機(jī)材料來(lái)進(jìn)行的?；旌虾蟮慕湍讣坝袡C(jī)及無(wú)機(jī)材料送至造粒機(jī)以制成顆粒。然后肥料顆粒經(jīng)兩階段式干燥處理干燥。第一干燥階段，肥料在第一干燥機(jī)中不超過(guò)60±2℃的溫度下干燥5分鐘以便酵母細(xì)胞迅速變成休眠狀態(tài)。然后肥料送至第二干燥機(jī)并于不超過(guò)65±2℃的溫度下干燥8分鐘而進(jìn)一步去除水。然后肥料冷卻至室溫。最后送至散裝袋填裝機(jī)包裝。
表XIII肥料組成(每一公噸肥料)
本發(fā)明的范圍非受限于所述的特定實(shí)施方案，其僅供單一舉例說(shuō)明本發(fā)明的個(gè)別方面，并且功能上相等同的方法及成分皆屬于本發(fā)明的范圍。確實(shí)除本文顯示及敘述的以外，本發(fā)明的多種修飾對(duì)本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員來(lái)說(shuō)由前文描述及附圖將顯然自明。這些修飾一定落入隨附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種生物肥組合物，其包含至少一種下列酵母細(xì)胞成分(a)第一酵母細(xì)胞成分，其包含第一多數(shù)個(gè)可固氮的酵母細(xì)胞；(b)第二酵母細(xì)胞成分，其包含第二多數(shù)個(gè)可分解磷化合物的酵母細(xì)胞；或(c)第三酵母細(xì)胞成分，其包含第三多數(shù)個(gè)可分解鉀化合物的酵母細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的生物肥組合物，其進(jìn)一步包含(d)第四酵母細(xì)胞成分，其包含第四多數(shù)個(gè)可將復(fù)雜的碳化合物轉(zhuǎn)成簡(jiǎn)單碳水化合物的酵母細(xì)胞；(e)第五酵母細(xì)胞成分，其包含第五多數(shù)個(gè)可過(guò)量產(chǎn)生生長(zhǎng)因子的酵母細(xì)胞；以及(f)第六酵母細(xì)胞成分，其包含第六多數(shù)個(gè)可過(guò)量產(chǎn)生腺苷三磷酸的酵母細(xì)胞。
3.一種生物肥組合物，其包含至少一種下列酵母細(xì)胞成分(a)第一酵母細(xì)胞成分，其制備系通過(guò)在具有頻率860至870MHz范圍及振幅1000至5000mV范圍的第一電磁場(chǎng)中將第一多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞培養(yǎng)足夠致使所述第一多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞固氮的時(shí)間；(b)第二酵母細(xì)胞成分，其制備系通過(guò)在具有頻率360至370MHz范圍及振幅1000至5000mV范圍的第二電磁場(chǎng)中將第二多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞培養(yǎng)足夠致使所述第二多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞分解磷化合物的時(shí)間；或(c)第三酵母細(xì)胞成分，其制備系通過(guò)在具有頻率250至260MHz范圍及振幅1000至5000mV范圍的第三電磁場(chǎng)中將第三多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞培養(yǎng)足夠致使所述第三多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞分解鉀化合物的時(shí)間。
4.如權(quán)利要求3所述的生物肥組合物，其進(jìn)一步包含(d)第四酵母細(xì)胞成分，其制備系通過(guò)在具有頻率1087至1097MHz范圍及振幅1000至5000mV范圍的第四電磁場(chǎng)中將第四多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞培養(yǎng)足夠致使所述第四多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞將復(fù)雜的碳分子轉(zhuǎn)成簡(jiǎn)單碳水化合物的時(shí)間；(e)第五酵母細(xì)胞成分，其制備系通過(guò)在具有頻率1382至1392MHz范圍及振幅1000至5000mV范圍的第五電磁場(chǎng)中將第五多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞培養(yǎng)足夠致使所述第五多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞過(guò)量產(chǎn)生生長(zhǎng)因子的時(shí)間；以及(f)第六酵母細(xì)胞成分，其制備系通過(guò)在具有頻率1690至1700MHz范圍及振幅1000至5000mV范圍的第六電磁場(chǎng)中將第六多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞培養(yǎng)足夠致使所述第六多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞過(guò)量產(chǎn)生腺苷三磷酸的時(shí)間。
5.如權(quán)利要求2或4所述的生物肥組合物，其進(jìn)一步包含有機(jī)基質(zhì)成分、無(wú)機(jī)基質(zhì)成分或有機(jī)及無(wú)機(jī)基質(zhì)成分二者。
6.如權(quán)利要求2或4所述的生物肥組合物，其中各酵母細(xì)胞成分分別包含屬于選自下列屬的酵母細(xì)胞糖酵母(Saccharomyces)，裂殖酵母(Schizosaccharomyces)，擲孢酵母(Sporobolomyces)，球擬酵母(Torulopsis)，絲孢酵母(Trichosporon)，威克酵母(Wickerhamia)，阿舒氏囊霉菌(Ashbya)，芽生菌(Blastomyces)，假絲酵母(Candida)，固囊酵母(Citeromyces)，克利伯菌(Crebrothecium)，隱球酵母(Cryptococcus)，德巴利氏酵母(Debaryomyces)，擬內(nèi)孢霉(Endomycopsis)；地霉(Geotrichum)，漢遜氏酵母(Hansenula)，克勒克氏酵母(Kloeckera)，油脂酵母(Lipomyces)，畢赤氏酵母(Pichia)，紅螺菌(Rhodosporidium)，以及紅酵母(Rhodotorula)。
7.如權(quán)利要求2或4所述的生物肥組合物，其中各酵母細(xì)胞成分包含選自于下列酵母物種的細(xì)胞啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)，薛氏糖酵母(Saccharomyces chevalieri)，戴耳克氏糖酵母(Saccharomyces delbrueckii)，微小糖酵母(Saccharomyces exiguus)，發(fā)酵性糖酵母(Saccharomyces fermentati)，羅哥糖酵母(Saccharomyceslogos)，蜂蜜糖酵母(Saccharomyces mellis)，小橢圓糖酵母(Saccharomyces microellipsoides)，卵形糖酵母(Saccharomycesoviformis)，羅茜糖酵母(Saccharomyces rosei)，魯氏糖酵母(Saccharomyces rouxii)，清酒糖酵母(Saccharomyces sake)，葡萄汁糖酵母(Saccharomyces uvarum Beijer)，魏萊氏糖酵母(Saccharomyceswillianus)，酵母種，路為氏糖酵母(Saccharomyces ludwigii)，中華糖酵母(Saccharomyces sinenses)，拜烈氏糖酵母(Saccharomyces bailii)，卡爾斯伯糖酵母(Saccharomyces carlsbergensis)，八孢裂殖酵母(Schizosaccharomyces octosporus)，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)，紅色擲孢酵母(Sporobolomyces roseus)，赭色擲孢酵母(Sporobolomyces salmonicolor)，白色球擬酵母(Torulopsis candida)，無(wú)名球擬酵母(Torulopsis famta)，球狀球擬酵母(Torulopsis globosa)，平常球擬酵母(Torulopsis inconspicua)，貝雷氏絲孢酵母(Trichosporonbehrendoo)，頭狀絲孢酵母(Trichosporon capitatum)，皮狀絲孢酵母(Trichosporon cutaneum)，螢光威克酵母(Wickerhamia fluoresens)，棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya gossypii)，皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)，白色假絲酵母(Candida albicans)，樹木假絲酵母(Candidaarborea)，季也蒙氏假絲酵母(Candida guillermondii)，克魯斯氏假絲酵母(Candida Krusei)，萊比可假絲酵母(Candida lambica)，解脂假絲酵母(Candida lipolytica)，副克柔氏假絲酵母(Candida parakrusei)，近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis)，近平滑假絲酵母(Candidaparapsilosis)，假熱帶假絲酵母(Candida pseudotropicalis)，鐵紅假絲酵母(Candida pulcherrima)，粗壯假絲酵母(Candida robusta)，皺摺假絲酵母(Candida rugousa)，產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)，基質(zhì)固囊酵母(Citeromyces matritensis)，阿舒克利伯菌(Crebrothecium ashbyii)，羅倫氏隱球酵母(Cryptococcus laurentii)，新型隱球酵母(Cryptococcusneoformans)，漢遜氏德巴利氏酵母(Debaryomyces hansenii)，克洛氏德巴利氏酵母(Debaryomyces kloeckeri)，肋狀擬內(nèi)孢霉菌(Endomycopsisfibuligera)，阿舒氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)，白地霉(Geotrichumcandidum)，羅威氏地霉(Geotrichum ludwigii)，健強(qiáng)地霉(Geotrichumrobustum)，甜香地霉(Geotrichum suaveolens)，異常漢遜氏酵母(Hansenula anomala)，產(chǎn)阿拉伯糖醇漢遜氏酵母(Hansenulaarabitolgens)，杰丁漢遜氏酵母(Hansenula jadinii)，土星漢遜氏酵母(Hansenula saturnus)，施氏漢遜氏酵母(Hansenula schneggii)，亞菌膜漢遜氏酵母(Hansenula subpelliculosa)，檸檬形克勒克酵母(Kloeckeraapiculata)，斯達(dá)氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)，粉狀畢赤氏酵母(Pichiafarinosa)，膜醭畢赤氏酵母(Pichia membranaefaciens)，類酵母紅冬孢(Rhodosporidium toruloides)，橙黃紅酵母(Rhodotorula aurantiaca)，膠粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)，微小紅酵母(Rhodotorula minuta)，深紅酵母(Rhodotorula rubar)及中華紅酵母(Rhodotorula sinensis)。
8.如權(quán)利要求2或4所述的生物肥組合物，其中各酵母細(xì)胞成分包含啤酒糖酵母細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求2或4所述的生物肥組合物，其中各酵母細(xì)胞成分的酵母細(xì)胞分別是保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)、保藏號(hào)選自AS2.501，AS2.535，AS2.441，AS2.406，AS2.382及AS2.16的酵母菌株啤酒糖酵母漢遜的細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求2所述的生物肥組合物，其包含如權(quán)利要求1所述的酵母細(xì)胞成分(a)，(b)及(c)。
11.如權(quán)利要求4所述的生物肥組合物，其包含如權(quán)利要求3所述的酵母細(xì)胞成分(a)，(b)及(c)。
12.如權(quán)利要求10或11所述的生物肥組合物，其進(jìn)一步包含有機(jī)基質(zhì)成分，無(wú)機(jī)基質(zhì)成分或有機(jī)和無(wú)機(jī)基質(zhì)成分二者。
13.如權(quán)利要求12所述的生物肥組合物，其包含按重量計(jì)約0.1至0.2％酵母細(xì)胞成分(a)，約0.1至0.2％酵母細(xì)胞成分(b)，約0.1至0.2％酵母細(xì)胞成分(c)，約0.1至0.2％酵母細(xì)胞成分(d)，約1％酵母細(xì)胞成分(e)，約3％酵母細(xì)胞成分(f)；約65％有機(jī)基質(zhì)成分；約19％無(wú)機(jī)基質(zhì)成分；以及約14％淀粉。
14.一種組合物，其包含多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞，其中所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞已經(jīng)在具有頻率850至860MHz的范圍及振幅1000至5000mV的范圍的電磁場(chǎng)存在下培養(yǎng)一段足夠致使所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞固定氮的時(shí)間。
15.一種組合物，其包含多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞，其中所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞已經(jīng)在具有頻率360至370MHz的范圍及振幅1000至5000mV的范圍的電磁場(chǎng)存在下培養(yǎng)一段足夠致使所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞分解磷化合物的時(shí)間。
16.一種組合物，其包含多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞，其中所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞已經(jīng)在具有頻率250至260MHz的范圍及振幅1000至5000mV的范圍的電磁場(chǎng)存在下培養(yǎng)一段足夠致使所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞分解鉀化合物的時(shí)間。
17.一種組合物，其包含多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞，其中所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞已經(jīng)在具有頻率1087至1097MHz的范圍及振幅1000至5000mV的范圍的電磁場(chǎng)存在下培養(yǎng)一段足夠致使所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞將復(fù)雜的碳分子轉(zhuǎn)成簡(jiǎn)單碳水化合物的時(shí)間。
18.一種組合物，其包含多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞，其中所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞已經(jīng)在具有頻率1382至1392MHz的范圍及振幅1000至2000mV的范圍的電磁場(chǎng)存在下培養(yǎng)一段足夠致使所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞過(guò)量產(chǎn)生生長(zhǎng)因子的時(shí)間。
19.一種組合物，其包含多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞，其中所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞已經(jīng)在具有頻率1690至1700MHz的范圍及振幅1000至5000mV的范圍電磁場(chǎng)存在下培養(yǎng)一段足夠致使所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞過(guò)量產(chǎn)生腺苷三磷酸的時(shí)間。
20.如權(quán)利要求14、15、16、17、18或19所述的組合物，其中所述酵母細(xì)胞為啤酒糖酵母的細(xì)胞。
21.一種生物肥組合物，其包含(i)至少一種下列酵母細(xì)胞成分(a)第一酵母細(xì)胞成分，其制備系通過(guò)在具有頻率約865.522MHz范圍及振幅約1250mV的第一電磁場(chǎng)中將第一多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞培養(yǎng)一段24小時(shí)時(shí)間，以及在具有頻率約865.522MHz及振幅約4656mV的第二電磁場(chǎng)存在下將所述第一多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞培養(yǎng)一段24小時(shí)時(shí)間，以便所述第一多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞可固定氮；(b)第二酵母細(xì)胞成分，其制備系通過(guò)在具有頻率約366.243MHz范圍及振幅約1230mV的第一電磁場(chǎng)中將第二多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞培養(yǎng)一段24小時(shí)時(shí)間，以及在具有頻率約366.243MHz及振幅約4570mV的第二電磁場(chǎng)存在下將所述第二多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞培養(yǎng)一段24小時(shí)時(shí)間，以便所述第二多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞可分解磷化合物；或(c)第三酵母細(xì)胞成分，其制備系通過(guò)在具有頻率約255.425MHz范圍及振幅約1340mV的第一電磁場(chǎng)中將第三多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞培養(yǎng)一段24小時(shí)時(shí)間，以及在具有頻率約255.425MHz及振幅約4850mV的第二電磁場(chǎng)存在下將所述第三多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞培養(yǎng)一段24小時(shí)時(shí)間，以便所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞可分解鉀化合物；(ii)第四酵母細(xì)胞成分，其制備系通過(guò)在具有頻率約1092.387MHz范圍及振幅約1530mV的第一電磁場(chǎng)中將第四多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞培養(yǎng)一段24小時(shí)時(shí)間，以及在具有頻率約1092.387MHz及振幅約4720mV的第二電磁場(chǎng)存在下將所述第四多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞培養(yǎng)一段24小時(shí)時(shí)間，以便所述第四多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞可將復(fù)雜的碳分子轉(zhuǎn)成簡(jiǎn)單碳水化合物；(iii)第五酵母細(xì)胞成分，其制備系通過(guò)在具有頻率約1387.556MHz范圍及振幅約1620mV的第一電磁場(chǎng)中將第五多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞培養(yǎng)一段24小時(shí)時(shí)間，以及在具有頻率約1387.556MHz及振幅約4830mV的第二電磁場(chǎng)存在下將所述第五多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞培養(yǎng)一段24小時(shí)時(shí)間，以便所述第五多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞可過(guò)量產(chǎn)生生長(zhǎng)因子；以及(iv)第六酵母細(xì)胞成分，其制備系通過(guò)在具有頻率約1694.365MHz范圍及振幅約1470mV的第一電磁場(chǎng)中將第六多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞培養(yǎng)一段24小時(shí)時(shí)間，以及在具有頻率約1694.365MHz及振幅約4780mV的第二電磁場(chǎng)存在下將所述第六多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞培養(yǎng)一段24小時(shí)時(shí)間，以便所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞可過(guò)量產(chǎn)生腺苷三磷酸；其中所述酵母細(xì)胞成分包含啤酒糖酵母的細(xì)胞。
22.如權(quán)利要求21所述的生物肥組合物，其中第一酵母細(xì)胞成分包含酵母菌株啤酒糖酵母漢遜AS2.501的細(xì)胞，第二酵母細(xì)胞成分包含酵母菌株啤酒糖酵母漢遜AS2.535的細(xì)胞，第三酵母細(xì)胞成分包含酵母菌株啤酒糖酵母漢遜AS2.441的細(xì)胞，第四酵母細(xì)胞成分包含酵母菌株啤酒糖酵母漢遜AS2.406的細(xì)胞，第五酵母細(xì)胞成分包含酵母菌株啤酒糖酵母漢遜AS2.382的細(xì)胞以及第六酵母細(xì)胞成分包含酵母菌株啤酒糖酵母漢遜AS2.16的細(xì)胞。
23.如權(quán)利要求21所述的生物肥組合物，其中多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞被干燥。
24.一種活化或提升多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞固定大氣氮?dú)饽芰Φ姆椒?，其包含在具有頻率850至860MHz范圍以及振幅1000至5000mV范圍的電磁場(chǎng)存在下將所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞培養(yǎng)一段足夠致使所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞固定氮的時(shí)間。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其包含在具有頻率約865.522MHz及振幅約1250mV的第一電磁場(chǎng)存在下將所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)時(shí)間，以及在具有頻率約865.522MHz及振幅約4656mV的第二電磁場(chǎng)存在下將所述第一多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)時(shí)間，以便所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞可固定氮。
26.一種活化或提升多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞分解含磷無(wú)機(jī)物或化合物能力的方法，其包含在具有頻率360至370MHz范圍以及振幅1000至5000mV范圍的電磁場(chǎng)存在下將所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞培養(yǎng)一段足夠致使所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞分解磷化合物的時(shí)間。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其包含在具有頻率約366.243MHz及振幅約1230mV的第一電磁場(chǎng)存在下將所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)時(shí)間，以及在具有頻率約366.243MHz及振幅約4570mV的第二電磁場(chǎng)存在下將所述第二多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)時(shí)間，以便所述第二多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞可分解磷化合物。
28.一種活化或提升多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞分解含鉀無(wú)機(jī)物或化合物能力的方法，其包含在具有頻率250至260MHz范圍以及振幅1000至5000mV范圍的電磁場(chǎng)存在下將所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞培養(yǎng)一段足夠致使所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞分解鉀化合物的時(shí)間。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其包含在具有頻率約255.425MHz及振幅約1340mV的第一電磁場(chǎng)存在下將所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)時(shí)間，以及在具有頻率約255.425MHz及振幅約4850mV的第二電磁場(chǎng)存在下將所述第三多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)時(shí)間，以便所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞可分解鉀化合物。
30.一種活化或提升多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞分解高分子量碳物質(zhì)能力的方法，其包含在具有頻率1087至1097MHz范圍以及振幅1000至5000mV范圍的電磁場(chǎng)存在下將所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞培養(yǎng)一段足夠致使所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化復(fù)雜的碳分子成為簡(jiǎn)單碳水化合物的時(shí)間。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其包含在具有頻率約1092.387MHz及振幅約1530mV的第一電磁場(chǎng)存在下將所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)時(shí)間，以及在具有頻率約1092.387MHz及振幅約4720mV的第二電磁場(chǎng)存在下將所述第四多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)時(shí)間，以便所述第四多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化復(fù)雜的碳分子成為簡(jiǎn)單碳水化合物。
32.一種活化或提升多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞過(guò)量產(chǎn)生生長(zhǎng)因子能力的方法，其包含在具有頻率1382至1392MHz范圍以及振幅1000至2000mV或1000至5000mV范圍的電磁場(chǎng)存在下將所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞培養(yǎng)一段足夠致使所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞過(guò)量產(chǎn)生生長(zhǎng)因子的時(shí)間。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其包含在具有頻率約1387.556MHz及振幅約1620mV的第一電磁場(chǎng)存在下將所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)時(shí)間，以及在具有頻率約1387.556MHz及振幅約4830mV的第二電磁場(chǎng)存在下將所述第五多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)時(shí)間，以便所述第五多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞過(guò)量產(chǎn)生生長(zhǎng)因子。
34.如權(quán)利要求32或33所述的方法，其進(jìn)一步包含以所述酵母細(xì)胞接種包含濃度約400克/升的淀粉溶液的發(fā)酵培養(yǎng)基以及讓發(fā)酵于20至30℃下進(jìn)行直到至少90％發(fā)酵基質(zhì)已經(jīng)發(fā)酵為止。
35.一種活化或提升多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞過(guò)量產(chǎn)生ATP能力的方法，其包含在具有頻率1690至1700MHz范圍以及振幅1000至5000mV范圍的電磁場(chǎng)存在下將所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞培養(yǎng)一段足夠致使所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞過(guò)量產(chǎn)生腺苷三磷酸的時(shí)間。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其包含在具有頻率約1694.365MHz及振幅約1470mV的第一電磁場(chǎng)存在下將所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)時(shí)間，以及在具有頻率約1694.365MHz及振幅約4780mV的第二電磁場(chǎng)存在下將所述第六多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)時(shí)間，以便所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞過(guò)量產(chǎn)生腺苷三磷酸。
37.如權(quán)利要求35或36所述的方法，其進(jìn)一步包含以所述酵母細(xì)胞接種包含濃度約400克/升的淀粉溶液的發(fā)酵培養(yǎng)基以及讓發(fā)酵于20至30℃下進(jìn)行直到至少90％發(fā)酵基質(zhì)已經(jīng)發(fā)酵為止。
38.一種在生物肥的酵母細(xì)胞成分中形成仿共生關(guān)系的方法，所述方法包含下列步驟制備混合物，其包含(a)第一酵母細(xì)胞成分，其制備系通過(guò)在具有頻率860至870MHz范圍及振幅1000至5000mV范圍的第一電磁場(chǎng)中將第一多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞培養(yǎng)足夠致使所述第一多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞固氮的時(shí)間；(b)第二酵母細(xì)胞成分，其制備系通過(guò)在具有頻率360至370MHz范圍及振幅1000至5000mV范圍的第二電磁場(chǎng)中將第二多數(shù)個(gè)酵母培養(yǎng)足夠致使所述第二多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞分解磷化合物的時(shí)間；(c)第三酵母細(xì)胞成分，其制備系通過(guò)在具有頻率250至260MHz范圍及振幅1000至5000mV范圍的第三電磁場(chǎng)中將第三多數(shù)個(gè)酵母培養(yǎng)足夠致使所述第三多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞分解鉀化合物的時(shí)間；以及(d)第四酵母細(xì)胞成分，其制備系通過(guò)在具有頻率1087至1097MHz范圍及振幅1000至5000mV范圍的第四電磁場(chǎng)中將第四多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞培養(yǎng)足夠致使所述第四多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞將復(fù)雜的碳分子轉(zhuǎn)成簡(jiǎn)單碳水化合物的時(shí)間；以及在具有多數(shù)個(gè)頻率860至870MHz、360至370MHz、250至260MHz以及1087至1097MHz頻率且各頻率具有振幅0至3000mV范圍的電磁場(chǎng)存在下將所述混合物培養(yǎng)一段足夠致使所述酵母細(xì)胞成分形成仿共生關(guān)系的時(shí)間，其中所述磁場(chǎng)中各頻率振幅系于0至3000mV間循環(huán)。
39.如權(quán)利要求24所述的方法，其進(jìn)一步包含制備包含多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞及土壤的混合物；在具有頻率于850至860MHz的范圍以及振幅于1000至5000mV的范圍的電磁場(chǎng)中將所述混合物培養(yǎng)一段足夠致使所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞調(diào)整適應(yīng)于土壤的時(shí)間。
40.如權(quán)利要求26所述的方法，其進(jìn)一步包含制備包含所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞及土壤的混合物；在具有頻率360至370MHz的范圍以及振幅1000至5000mV的范圍的電磁場(chǎng)中將所述混合物培養(yǎng)一段足夠致使所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞調(diào)整適應(yīng)于土壤的時(shí)間。
41.如權(quán)利要求28所述的方法，其進(jìn)一步包含制備包含多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞及土壤的混合物；在具有頻率250至260MHz的范圍以及振幅1000至5000mV的范圍的電磁場(chǎng)中將所述混合物培養(yǎng)一段足夠致使所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞調(diào)整適應(yīng)于土壤的時(shí)間。
42.如權(quán)利要求30所述的方法，其進(jìn)一步包含制備包含多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞及土壤的混合物；在具有頻率1087至1097MHz的范圍以及振幅1000至5000mV的范圍的電磁場(chǎng)中將所述混合物培養(yǎng)一段足夠致使所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞調(diào)整適應(yīng)于土壤的時(shí)間。
43.如權(quán)利要求32所述的方法，其進(jìn)一步包含制備包含多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞及土壤的混合物；在具有頻率1382至1392MHz的范圍以及振幅1000至5000mV的范圍的電磁場(chǎng)中將所述混合物培養(yǎng)一段足夠致使所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞調(diào)整適應(yīng)于土壤的時(shí)間。
44.如權(quán)利要求35所述的方法，其進(jìn)一步包含制備包含多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞及土壤的混合物；在具有頻率1690至1700MHz的范圍以及振幅1000至5000mV的范圍的電磁場(chǎng)中將所述混合物培養(yǎng)一段足夠致使所述多數(shù)個(gè)酵母細(xì)胞調(diào)整適應(yīng)于土壤的時(shí)間。
45.一種生產(chǎn)權(quán)利要求12所述的生物肥組合物的方法，該方法依順序包含下列步驟(i)通過(guò)混合酵母細(xì)胞成分(a)、(b)、(c)、(d)、(e)及(f)制備混合物；以及(ii)將所述有機(jī)基質(zhì)成分及無(wú)機(jī)基質(zhì)成分添加至所述混合物中而形成生物肥。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其進(jìn)一步包含干燥所述生物肥。
47.如權(quán)利要求46所述的方法，其中所述干燥步驟包含下列步驟(iii)在不超過(guò)65℃下干燥所述生物肥組合物一段時(shí)間以使酵母細(xì)胞變成休眠狀態(tài)；(iv)在不超過(guò)70℃下干燥所述生物肥組合物一段時(shí)間以使水含量低于5％；(v)冷卻所述生物肥組合物至環(huán)境溫度；以及(vi)形成具有適當(dāng)大小的所述生物肥組合物的顆粒。
48.如權(quán)利要求45所述的方法，其進(jìn)一步包含在酵母細(xì)胞成分中形成仿共生關(guān)系的步驟，其包含在步驟(i)之后以及步驟(ii)之前，在具有多數(shù)個(gè)頻率860至870MHz、360至370MHz、250至260MHz、1087至1097MHz頻率、1382至1392MHz以及1690至1700MHz且各頻率具有振幅0至3000mV范圍的電磁場(chǎng)存在下將酵母細(xì)胞混合物培養(yǎng)一段足夠致使所述酵母細(xì)胞成分形成仿共生關(guān)系的時(shí)間，其中所述磁場(chǎng)中各頻率振幅系于0至3000mV間循環(huán)。
49.如權(quán)利要求45所述的方法，其進(jìn)一步在步驟(i)之后以及步驟(ii)之前包含下列步驟(iii)添加土壤樣本至步驟(i)的酵母細(xì)胞混合物中，(iv)在具有多數(shù)個(gè)頻率860至870MHz、360至370MHz、250至260MHz以及1087至1097MHz頻率且各頻率具有振幅0至3000mV范圍的電磁場(chǎng)存在下培養(yǎng)一段足夠致使酵母細(xì)胞成分調(diào)整適應(yīng)于土壤的時(shí)間，其中所述磁場(chǎng)中各頻率振幅系于0至3000mV間循環(huán)；以及(v)自土壤分離酵母細(xì)胞。
50.如權(quán)利要求45所述的方法，其在步驟(i)之后以及步驟(ii)之前進(jìn)一步包含下列步驟(iii)在具有多數(shù)個(gè)頻率860至870MHz、360至370MHz、250至260MHz、1087至1097MHz頻率、1382至1392MHz及1690至1700MHz且各頻率具有振幅0至3000mV范圍的電磁場(chǎng)存在下將步驟(i)的酵母細(xì)胞混合物培養(yǎng)一段足夠致使所述酵母細(xì)胞成分形成仿共生關(guān)系的時(shí)間，其中所述磁場(chǎng)中各頻率振幅系于0至3000mV間循環(huán)；(iv)將土壤樣本添加至步驟(iii)的酵母細(xì)胞混合物，(v)在具有多數(shù)個(gè)頻率860至870MHz、360至370MHz、250至260MHz、1087至1097MHz頻率、1382至1392MHz及1690至1700MHz且各頻率具有振幅0至3000mV范圍的電磁場(chǎng)存在下將所述酵母細(xì)胞與土壤的混合物培養(yǎng)一段足夠致使所述酵母細(xì)胞成分適應(yīng)于土壤，其中所述磁場(chǎng)中各頻率振幅系于0至3000mV間循環(huán)；以及(vi)自土壤分離酵母細(xì)胞。
51.一種促進(jìn)植物生長(zhǎng)的方法，其包含在權(quán)利要求1-13及21-23項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的生物肥組合物存在下生長(zhǎng)植物。
全文摘要
本發(fā)明提供包含酵母細(xì)胞的生物肥組合物，所述酵母細(xì)胞具有增強(qiáng)的固定大氣中氮、分解無(wú)機(jī)磷及其化合物、分解無(wú)機(jī)鉀及其化合物、分解復(fù)雜的碳化合物、過(guò)量生產(chǎn)生長(zhǎng)因子以及過(guò)量生產(chǎn)ATP的能力。本發(fā)明的生物肥組合物可代替無(wú)機(jī)肥給農(nóng)作物提供氮、磷和鉀。本發(fā)明還包括生物肥組合物的生產(chǎn)方法以及應(yīng)用方法。
文檔編號(hào)C05F11/00GK1454191SQ0081987
公開日2003年11月5日 申請(qǐng)日期2000年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月5日
發(fā)明者張令玉 申請(qǐng)人:歐亞生物科技有限公司