專利名稱：醋酸鋰介導(dǎo)的香菇基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食用菌基因工程技術(shù)。
近幾年來，食用菌基因工程研究取得了長足的進(jìn)展，一批目的基因已被克隆出來，但在食用菌遺傳轉(zhuǎn)化方面有關(guān)的報(bào)道較少，在國內(nèi)，有人利用電擊法將糙皮側(cè)耳的總DNA導(dǎo)入紫孢側(cè)耳，獲得了轉(zhuǎn)化菌株；在國外，有將潮霉素抗性基因轉(zhuǎn)入糙皮側(cè)耳和雙孢蘑菇，URAI基因轉(zhuǎn)入柳松菇和結(jié)實(shí)基因(Frt1)轉(zhuǎn)入裂褶菌等。上述轉(zhuǎn)化利用的主要是氯化鈣/聚乙二醇(CaCl2/PEG)介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和電擊法。在香菇基因轉(zhuǎn)移方面，僅有日本巖手大學(xué)建立的限制酶/聚乙二醇介導(dǎo)的一種轉(zhuǎn)化技術(shù)，但該技術(shù)中使用的限制性內(nèi)切酶價(jià)格昂貴，轉(zhuǎn)化成本較高。
本發(fā)明的目的在于提供一種簡便、經(jīng)濟(jì)、有效的醋酸鋰介導(dǎo)的香菇基因轉(zhuǎn)移技術(shù)。
本發(fā)明包括外源目的基因的提取和純化、受體原生體質(zhì)的制備、外源目的基因的導(dǎo)入和轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體的篩選和鑒定四個(gè)部分；各過程內(nèi)容如下1、外源目的基因的提取和純化過程采用常規(guī)的“堿裂解法”來提取質(zhì)粒DNA，提取后的質(zhì)粒DNA采用聚乙二醇分級(jí)沉淀法純化，用紫外吸收法檢測質(zhì)粒DNA濃度和純度，濃度要求達(dá)到1毫克/毫升，純度要求達(dá)到OD260/OD280≥1.8，OD260/OD230≥2.0，并在1％水平瓊脂糖凝膠上電泳，檢測質(zhì)粒大小，然后放入-20℃冰箱內(nèi)待用；2、受體原生質(zhì)體的制備為防止原生質(zhì)體破裂，在原生質(zhì)體的酶解液中加入一定的壓力，以濃度為0.4～0.8摩爾的甘露醇或蔗糖或氯化鉀作為滲透穩(wěn)定劑，在滲透穩(wěn)定劑中加入溶壁酶，配制濃度1.5～3％的溶壁酶酶解液，取培養(yǎng)3～10天的香菇菌絲球，放入酶解液中，在20～35℃條件下進(jìn)行酶解，制備受體原生質(zhì)體，經(jīng)過濾純化，得到原生質(zhì)體純液，純液中受體原生質(zhì)體濃度在106個(gè)/毫升以上；3、外源目的基因的導(dǎo)入按以下步驟進(jìn)行(1)取制備好的受體原生質(zhì)體純液，進(jìn)行離心，棄上清液，再用濃度0.6摩爾甘露醇洗滌一離心2次以上，洗去培養(yǎng)基的成份；(2)加入起介導(dǎo)作用的濃度為0.1～0.5摩爾的醋酸鋰(LiAc)與受體原生質(zhì)體混合，進(jìn)行高速離心，吸除醋酸鋰，再用0.1～0.5摩爾的醋酸鋰與受體原生質(zhì)體混合，調(diào)整受體原生質(zhì)體濃度，要求受體原生質(zhì)體數(shù)在106～109個(gè)/毫升之間；(3)制備外源運(yùn)載DNA，用于提高轉(zhuǎn)化效率將單鏈運(yùn)載DNA加入DNA緩沖液中，濃度為2微克/毫升，煮沸，然后迅速在冰水中冷卻，待用；(4)取第(2)步得到的原生質(zhì)體進(jìn)行離心，去掉醋酸鋰，得到前處理的純?cè)|(zhì)體；(5)在純?cè)|(zhì)體中依次加入濃度50～60％的聚乙二醇、濃度為1.0～1.2摩爾的醋酸鋰、外源運(yùn)載DNA、外源質(zhì)粒DNA和無菌水，構(gòu)成反應(yīng)液，體積比為聚乙二醇占50～60％，醋酸鋰10～15％，外源運(yùn)載DNA12～15％，其余為無菌水，使反應(yīng)液中受體原生質(zhì)體數(shù)在106～109個(gè)/毫升之間；質(zhì)粒DNA含量1.0～20微克/毫升；(6)用力充分混勻反應(yīng)液，然后在25～35℃下培養(yǎng)；(7)在35～45℃水浴中搖動(dòng)培養(yǎng)20～40分鐘；(8)將反應(yīng)液離心，然后將轉(zhuǎn)化混合物吸除，得到轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體；(9)在MYG(麥芽糖0.5％、酵母粉0.5％、葡萄糖1％、其余為水)培養(yǎng)基中加入蔗糖，使培養(yǎng)基的蔗糖濃度為0.4～0.6摩爾，將轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體與培養(yǎng)基混合，搖動(dòng)培養(yǎng)20小時(shí)以上，然后移入固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
3、轉(zhuǎn)化原生體質(zhì)的篩選和鑒定(1)根據(jù)報(bào)告基因鑒定將前述(9)經(jīng)過搖動(dòng)培養(yǎng)的原生質(zhì)體與培養(yǎng)基的混合液離心，吸除上清液，加入蔗糖濃度為0.4摩爾的MYG培養(yǎng)基和X-Glux檢測液，在30～40℃下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)20小時(shí)以上，再在2～10℃下培養(yǎng)48小時(shí)以上，然后在光學(xué)顯微鏡下檢蘭色原生體質(zhì)，計(jì)算轉(zhuǎn)化率；(2)根據(jù)選擇抗性標(biāo)記基因篩選根據(jù)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒攜帶的卡那霉素抗性標(biāo)記基因，在MYG培養(yǎng)基中加入卡那霉素，形成選擇培養(yǎng)基，將上述(9)培養(yǎng)的原生質(zhì)體平鋪于選擇培養(yǎng)基上，在20～30℃下培養(yǎng)，對(duì)形成的菌落進(jìn)行多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測，對(duì)檢測陽性菌株，進(jìn)行分子雜交(Southern Blot)分析，呈陽性的菌株進(jìn)一步培養(yǎng)利用。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下1、提高了轉(zhuǎn)化效率。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化率約為104轉(zhuǎn)化子/微克質(zhì)粒DNA，而氯化鈣/聚乙二醇(CaCl2/PEG)介導(dǎo)法的轉(zhuǎn)化率為103轉(zhuǎn)化子/微克質(zhì)粒DNA，前者是后者的十倍。
2、轉(zhuǎn)化成本低。本發(fā)明不需要特殊的儀器設(shè)備，電擊法所用的脈沖儀，國產(chǎn)價(jià)格為3萬元左右，進(jìn)口價(jià)格為10萬元左右；與限制酶/聚乙二醇法相比，處理1毫克原生質(zhì)體所需限制酶的成本為5000元人民幣，本發(fā)明處理同量的原生質(zhì)體所需醋酸鋰的成本僅為1元人民幣。
3、本發(fā)明提供的方法所需設(shè)備和條件簡單，操作過程容易掌握，在一般實(shí)驗(yàn)室的條件下均能進(jìn)行，便于普及推廣。
實(shí)施例將外源目的基因質(zhì)粒載體PGBI131SABC轉(zhuǎn)化到香菇L26上，該質(zhì)粒攜帶BT毒蛋白基因和豇豆胰蛋白酶抑制素基因(CPTI)，另外還帶有卡那霉素抗性選擇標(biāo)記基因和β-葡萄糖苷酸酶報(bào)告基因。
1、受體原生質(zhì)體的制備以濃度為0.6摩爾甘露醇作為滲透穩(wěn)定劑，配制2.5％的溶壁酶酶解液，取培養(yǎng)5天的“香L26”香菇菌絲球，加入酶解液中，在30℃條件下進(jìn)行酶解，制備原生質(zhì)體，過濾純化，純化后的原生質(zhì)體濃度為106個(gè)/毫升；2、外源目的基因的導(dǎo)入按以下步驟進(jìn)行(1)取制備好的原生質(zhì)體純液30毫升，在3000轉(zhuǎn)/分條件下離心5分鐘，棄上清液，用濃度0.6摩爾甘露醇洗2遍；
(2)加入20毫升濃度為0.1摩爾的醋酸鋰(LiAc)與原生質(zhì)體混合，在最高速下離心15秒，吸除醋酸鋰，再用0.1摩爾的醋酸鋰混合原生質(zhì)體，調(diào)整原生體質(zhì)濃度，使原生質(zhì)體數(shù)在3×106個(gè)/毫升；(3)制備外源運(yùn)載DNA，將單鏈運(yùn)載DNA小牛胸腺肽或鮭魚精子DNA加入TE緩沖液中，濃度為2微克/毫升，制備15毫升，煮沸5分鐘，然后迅速在冰水中冷卻，待用；(4)取第二步得到的原生質(zhì)體14毫升離心，去掉醋酸鋰；(5)向原生質(zhì)體中依次加入濃度為50％的聚乙二醇60毫升，濃度為1.0摩爾的醋酸鋰10毫升，運(yùn)載DNA14毫升、濃度為1毫克/毫升PGBI131SABC質(zhì)粒DNA1毫升，其余用無菌水，使其終體積為100毫升；(6)用力充分混勻混合液，然后在30℃下培養(yǎng)30分鐘；(7)在42℃水浴中搖動(dòng)培養(yǎng)30分鐘；(8)在8000轉(zhuǎn)/分鐘離心15秒，然后將轉(zhuǎn)化混合物吸除；(9)在MYG培養(yǎng)基中加入蔗糖，使培養(yǎng)基的蔗糖濃度為0.4摩爾，將轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體與培養(yǎng)基混合，搖動(dòng)培養(yǎng)24小時(shí)，然后移入固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。本實(shí)施例可獲得約106個(gè)具有抗蟲基因的轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體。
權(quán)利要求
1.醋酸鋰介導(dǎo)的香菇基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，采用常規(guī)的“堿裂解法”來提取外源目的基因的質(zhì)粒DNA，提取后的質(zhì)粒DNA采用PEG分級(jí)沉淀法純化，用紫外吸收法檢測質(zhì)粒DNA濃度和純度，濃度要求達(dá)到1毫克/毫升，純度要求達(dá)到OD260/OD280≥1.8，OD260/OD230≥2.0，并在1％水平瓊脂糖凝膠上電泳，檢測質(zhì)粒大小，然后放入-20℃冰箱內(nèi)待用，其特征在于其方法還包括A、受體原生質(zhì)體的制備；以濃度為0.4～0.8摩爾的甘露醇或蔗糖或氯化鉀作為滲透穩(wěn)定劑，在滲透穩(wěn)定劑加入溶壁酶，配制濃度1.5～3％的溶壁酶酶解液，取培養(yǎng)3～10天的香菇菌絲球，放入酶解液中，在20～35℃條件下進(jìn)行酶解，制備受體原生質(zhì)體，經(jīng)過濾純化，使受體原生質(zhì)體濃度在106個(gè)/毫升以上；B、外源目的基因的導(dǎo)入按以下步驟進(jìn)行(1)取制備好的受體原生質(zhì)體純液，進(jìn)行離心，棄上清液，再用濃度0.6摩爾甘露醇洗滌—離心2次以上，洗去培養(yǎng)基的成份；(2)加入濃度為0.1～0.5摩爾的醋酸鋰與受體原生質(zhì)體混合，進(jìn)行高速離心，吸除醋酸鋰，再用0.1～0.5摩爾的醋酸鋰與受體原生質(zhì)體混合，調(diào)整受體原生質(zhì)體濃度，要求受體原生質(zhì)體數(shù)在106～109個(gè)/毫升之間；(3)制備外源運(yùn)載DNA將單鏈運(yùn)載DNA加入緩沖液中，濃度為2微克/毫升，煮沸，然后迅速在冰水中冷卻，待用；(4)取第(2)步得到的原生質(zhì)體進(jìn)行離心，去掉醋酸鋰，得到前處理的純?cè)|(zhì)體；(5)在純?cè)|(zhì)體中依次加入濃度50～60％的聚乙二醇、濃度為1.0～1.2摩爾的醋酸鋰、外源單鏈運(yùn)載DNA、外源質(zhì)粒DNA和無菌水，構(gòu)成反應(yīng)液，體積比為聚乙二醇占50～60％，醋酸鋰10～15％，外源運(yùn)載DNA12～15％，其余為無菌水，使反應(yīng)液中受體原生質(zhì)體數(shù)在106～109個(gè)/毫升之間；質(zhì)粒DNA含量1.0～20微克/毫升；(6)充分混勻反應(yīng)液，然后在25～35℃下培養(yǎng)；(7)在35～45℃水浴中搖動(dòng)培養(yǎng)20～40分鐘；(8)將反應(yīng)液離心，然后將轉(zhuǎn)化混合物吸除，得到轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體；(9)在MYG培養(yǎng)基中加入蔗糖，使培養(yǎng)基的蔗糖濃度為0.4～0.6摩爾，將轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體與培養(yǎng)基混合，搖動(dòng)培養(yǎng)20小時(shí)以上，然后移入固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所說的醋酸鋰介導(dǎo)的香菇基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，其特征在于滲透穩(wěn)定劑為甘露醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所說的醋酸鋰介導(dǎo)的香菇基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，其特征在于單鏈運(yùn)載DNA為小牛胸腺肽或鮭魚精子DNA。
全文摘要
醋酸鋰介導(dǎo)的香菇基因轉(zhuǎn)移技術(shù)。受體原生質(zhì)體的酶解液中加入滲透穩(wěn)定劑,外源目的基因的前處理以醋酸鋰為介導(dǎo)質(zhì),在原生質(zhì)體中依次加入聚乙二醇、醋酸鋰、單鏈運(yùn)載DNA、外源質(zhì)粒DNA和無菌水,構(gòu)成反應(yīng)液。將反應(yīng)液培養(yǎng)、離心、分離混合物,得到轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體;將轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體與培養(yǎng)基混合,搖動(dòng)培養(yǎng),然后移入固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。本發(fā)明轉(zhuǎn)化效率高,轉(zhuǎn)化成本低,所需設(shè)備和條件簡單,便于普及推廣。
文檔編號(hào)A01H1/00GK1384202SQ0111392
公開日2002年12月11日 申請(qǐng)日期2001年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月29日
發(fā)明者王丕武, 李玉, 于彥春, 武麗敏 申請(qǐng)人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)