專(zhuān)利名稱(chēng)：番茄花粉管導(dǎo)入技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種番茄花粉管導(dǎo)入技術(shù)，用于番茄、茄子、辣椒等茄果類(lèi)新品種培育，屬于農(nóng)作物育種技術(shù)領(lǐng)域。
外源DNA導(dǎo)入方法首先用刀片平行截取2/3花柱，然后用100μl微量注射器吸取10μl(濃度為0.615～0.799μg/μl)供體DNA，沿花柱慢慢插入子房，深及子房的1/2處，輕輕將注射器往上提一提，接著小心注入供體DNA。并以TE緩沖液作對(duì)照。
本發(fā)明利用總DNA和帶有耐鹽目的基因的質(zhì)粒作為供體，通過(guò)巧妙的設(shè)計(jì)使既能用傳統(tǒng)的葉色遺傳規(guī)律，又能用現(xiàn)代的PCR及PCR-southern技術(shù)證實(shí)花粉管通道技術(shù)在番茄育種上的有效性。
本發(fā)明的受體材料為擬改良品種“鮮豐”以及帶有特殊葉色基因(雙陰性黃化基因)的品種“矮黃”。選用的供體材料為野生耐鹽的秘魯番茄Lycopersicon peruvianum、奇士曼尼番茄L.cheesmanii LA166、潘那利番茄L.pennellii LA716、醋栗番茄L.pimpinellifolium LA2184及帶有耐鹽目的基因HVA1的pBY520質(zhì)粒。
研究表明，在常溫下番茄授粉后24～48小時(shí)內(nèi)開(kāi)始受精，形成的花粉管一珠心組織通道，是導(dǎo)入外源DNA的現(xiàn)成途徑。導(dǎo)入時(shí)間過(guò)晚，胚胎已形成，珠心組織呈封閉狀，外源DNA就很難滲入。因此，本發(fā)明在導(dǎo)入時(shí)間上選擇24～48小時(shí)。
本發(fā)明采用的供體材料4份野生種葉色均為綠色，2份受體材料中鮮豐的葉色為綠色，而矮黃的葉色則為黃色。在番茄的葉色遺傳上，綠色對(duì)黃色為顯性，且為單基因遺傳，在實(shí)際生產(chǎn)上正是利用這一特性，以矮黃為母本進(jìn)行不去雄授粉，在F1代的苗期就把假雜種拔除。故可以用傳統(tǒng)的葉色遺傳規(guī)律來(lái)檢測(cè)花粉管技術(shù)在番茄上的可行性和有效性。通過(guò)對(duì)導(dǎo)入HVA1目的基因的植株進(jìn)行現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)PCR及PCR-southern檢測(cè)，同樣證明花粉管導(dǎo)入技術(shù)在番茄上的可行性。
本發(fā)明的花粉管導(dǎo)入技術(shù)與其它幾類(lèi)基因?qū)爰夹g(shù)相比，有一定優(yōu)勢(shì)利用整體植株的卵細(xì)胞、受精卵或早期胚細(xì)胞轉(zhuǎn)化DNA，無(wú)需組織培養(yǎng)和誘導(dǎo)再生植株等一整套人工培養(yǎng)過(guò)程；方法簡(jiǎn)便，一般常規(guī)育種工作者易于掌握；只有部分外源DNA片段進(jìn)入受體基因組，避免了供體基因與受體基因組全面重組，因而易于穩(wěn)定，大大縮短了育種時(shí)間；可以任意選擇生產(chǎn)上的當(dāng)家品種進(jìn)行外源DNA的導(dǎo)入，達(dá)到目的基因的轉(zhuǎn)移?？杀Ａ羰荏w的優(yōu)良性狀?？梢灾苯荧@得種子，對(duì)其后代的生產(chǎn)價(jià)值進(jìn)行考察，可避免一般生物技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室研究與大田要求脫節(jié)的問(wèn)題。
將導(dǎo)入外緣DNA的果實(shí)，單果留種。次年分別播種，對(duì)具有四片葉子的幼苗(用TG1表示)，用150mM NaCl進(jìn)行灌溉，灌溉的頻率為每周3次，連續(xù)4周。將耐鹽性強(qiáng)的植株定植于大田，得到3株正常結(jié)實(shí)的植株。接著進(jìn)行PCR檢測(cè)，證明3株植株中均存在HVA1基因的515bp的特征條帶，證明外緣DNA確實(shí)存在于受體中。
對(duì)TG1代種子發(fā)芽的鹽脅研究表明在NaCl 60mmol/L和80mmol/L脅迫下，TG1代種子的相對(duì)發(fā)芽勢(shì)均高于受體品種“鮮豐”(對(duì)照)的相對(duì)發(fā)芽勢(shì)。NaCl 60mmol/L時(shí)，TG1代種子的發(fā)芽勢(shì)可達(dá)對(duì)照的4.16倍；80mmol/L時(shí)，TG1代種子的發(fā)芽勢(shì)可達(dá)對(duì)照的7.10倍。
對(duì)上述3植株所結(jié)種子以及受體品種“鮮豐”的種子同時(shí)播種，并在定植以后的整個(gè)生長(zhǎng)期，對(duì)植株(用TG2表示)進(jìn)行海水灌溉(海水∶淡水＝1∶1)，結(jié)果表明TG2的成活率可達(dá)63％，并能正常結(jié)果，產(chǎn)量可達(dá)淡水灌溉下的67％-85％。而對(duì)照“鮮豐”在上述海水灌溉下則全部死亡。對(duì)成活植株進(jìn)行PCR-southem檢測(cè)，同樣證實(shí)HVA1基因的存在，這充分證明花粉管導(dǎo)入技術(shù)在番茄上的可行性。
實(shí)施例2受體為栽培種“矮黃”，供體為潘那利番茄L.pennellii LA716。選取處于喇叭口期的花蕾，隔離套袋，次日進(jìn)行人工授粉。授粉后24小時(shí)，用刀片平行截取2/3花柱，然后用100μl微量注射器吸取10μl濃度為0.667/μl的供體DNA，沿花柱慢慢插入子房，深及子房的1/2處，輕輕將注射器往上提一提，接著小心注入供體DNA。
在編號(hào)為324的群體中，發(fā)現(xiàn)了一株葉色為綠色，生長(zhǎng)緩慢的植株。這說(shuō)明傳統(tǒng)的葉色遺傳規(guī)律也證明了花粉管技術(shù)在番茄上的可行性和有效性。
實(shí)施例3栽培種為“鮮豐”，供體為潘那利番茄L.pennelliiLA716。選取處于喇叭口期的花蕾，隔離套袋，次日進(jìn)行人工授粉。授粉后48小時(shí)，用刀片平行截取2/3花柱，然后用100μl微量注射器吸取10μl濃度為0.715/μl的供體DNA，沿花柱慢慢插入子房，深及子房的1/2處，輕輕將注射器往上提一提，接著小心注入供體DNA。
由于導(dǎo)入的為總DNA，導(dǎo)入的群體較大，后代選擇群體也大，故我們利用TG1代植株的一級(jí)側(cè)枝進(jìn)行鹽池(基質(zhì)栽培條件下，用150mMNaCl脅迫)扦插，選留耐鹽性強(qiáng)的側(cè)枝對(duì)應(yīng)的植株。
對(duì)TG2代植株以及受體品種“鮮豐”，在定植以后的整個(gè)生長(zhǎng)期進(jìn)行海水灌溉(海水∶淡水＝1∶1)，結(jié)果表明TG2的成活率可達(dá)71％，并能正常結(jié)果，而對(duì)照“鮮豐”則全部死亡。
實(shí)施例4受體為栽培種“鮮豐”，供體為秘魯番茄Lycopersicon peruvianum。選取處于喇叭口期的花蕾，隔離套袋，次日進(jìn)行人工授粉。授粉后24小時(shí)，用刀片平行截取2/3花柱，然后用100μl微量注射器吸取10μl濃度為0.779/μl的供體DNA，沿花柱慢慢插入子房，深及子房的1/2處，輕輕將注射器往上提一提，接著小心注入供體DNA。
由于導(dǎo)入的為總DNA，導(dǎo)入的群體較大，后代選擇群體也大，故我們利用TG1代植株的一級(jí)側(cè)枝進(jìn)行鹽池(基質(zhì)栽培條件下，用150mMNaCl脅迫)扦插，選留耐鹽性強(qiáng)的側(cè)枝對(duì)應(yīng)的植株。
對(duì)TG2代以及對(duì)照品種“鮮豐”，在定植以后的整個(gè)生長(zhǎng)期進(jìn)行海水灌溉(海水∶淡水＝1∶1)，結(jié)果表明TG2的成活率可達(dá)35％，而對(duì)照“鮮豐”則全部死亡。
實(shí)施例5栽培種為“鮮豐”，供體為奇士曼尼番茄L.cheesmanii LA166。選取處于喇叭口期的花蕾，隔離套袋，次日進(jìn)行人工授粉。授粉后48小時(shí)，用刀片平行截取2/3花柱，然后用100μl微量注射器吸取10μl濃度為0.695/μl的供體DNA，沿花柱慢慢插入子房，深及子房的1/2處，輕輕將注射器往上提一提，接著小心注入供體DNA。
由于導(dǎo)入的為總DNA，導(dǎo)入的群體較大，后代選擇群體也大，故我們利用TG1代植株的一級(jí)側(cè)枝進(jìn)行鹽池(基質(zhì)栽培條件下，用150mM NaCl脅迫)扦插，選留耐鹽性強(qiáng)的側(cè)枝對(duì)應(yīng)的植株。
對(duì)TG2代以及對(duì)照品種“鮮豐”，在定植以后的整個(gè)生長(zhǎng)期進(jìn)行海水灌溉(海水∶淡水＝1∶1)，結(jié)果表明TG2的成活率可達(dá)56％，而對(duì)照“鮮豐”則全部死亡。
權(quán)利要求
1.一種番茄花粉管導(dǎo)入技術(shù)，其特征在于選擇處于喇叭口期的花蕾，于前一天隔離套袋，次日進(jìn)行人工授粉，授粉后24～48小時(shí)，利用自然花粉管通道，將外源基因?qū)氲綌M改良受體品種，供體外源DNA導(dǎo)入方法首先用刀片對(duì)受體材料平行截取2/3花柱，然后用100μl微量注射器吸取10μl濃度為0.615～0.799μg/μl的供體DNA，沿花柱慢慢插入子房，深及子房的1/2處后小心注入供體DNA。
2.如權(quán)利要求1所說(shuō)的番茄花粉管導(dǎo)入技術(shù)，其特征在于供體外源基因選用野生耐鹽的秘魯番茄Lycopersicon peruvianum、奇士曼尼番茄L.cheesmanii LA166、潘那利番茄L.pennellii LA716、醋栗番茄L.pimpinellifoliumLA2184或帶有耐鹽目的基因HVA1的Pby520質(zhì)粒。
3.如權(quán)利要求1所說(shuō)的番茄花粉管導(dǎo)入技術(shù)，其特征在于受體材料為擬改良品種“鮮豐”或帶有特殊葉色雙陰性黃化基因的品種“矮黃”。
全文摘要
一種番茄花粉管導(dǎo)入技術(shù),選擇處于喇叭口期的花蕾隔離套袋,人工授粉后24～48小時(shí),利用自然花粉管通道,將外源基因?qū)氲綌M改良受體品種。導(dǎo)入時(shí)先用刀片對(duì)受體材料平行截取2/3花柱,然后用微量注射器吸取10μl濃度為0.615～0.799μg/μl的供體DNA,沿花柱慢慢插入子房,深及子房的1/2處后小心注入供體DNA。本發(fā)明方法簡(jiǎn)便,易于掌握,可以任意選擇生產(chǎn)上的當(dāng)家品種進(jìn)行外源DNA的導(dǎo)入,達(dá)到目的基因的轉(zhuǎn)移,并可保留受體的優(yōu)良性狀。
文檔編號(hào)A01H1/02GK1342400SQ01132000
公開(kāi)日2002年4月3日 申請(qǐng)日期2001年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月25日
發(fā)明者陳火英, 張建華, 陳云鵬, 莊天明 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)