專利名稱：鐵皮石斛芽簇及其制備工藝和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及一種鐵皮石斛及其制備工藝和用途。
背景技術(shù)：
石斛是常用名貴中藥，具有養(yǎng)陰清熱、生津止渴、明目強身等多種功效，應(yīng)用歷史非常悠久。作為一種名貴中藥，石斛除配伍入藥外，近年來國內(nèi)外對石斛進行了大量深層次的開發(fā)，對石斛的需求量也越來越大。
但由于石斛屬植物自然繁殖率很低，加上人們長期無節(jié)制的采挖，造成野生資源嚴(yán)重貧乏。因此，石斛的栽培對緩解資源緊張局面、保護生物的多樣性、滿足人民醫(yī)療保健需要及出口創(chuàng)匯等起著責(zé)無旁貸的作用。
目前，對于石斛人工培育技術(shù)的研究主要集中在利用野生石斛種子苗的不同部位組織進行愈傷組織誘導(dǎo)和原球莖的誘導(dǎo)，然后從愈傷組織、原球莖直接分化培養(yǎng)，獲取再生苗。但是，這些技術(shù)還存在許多不足之處1)培育時間較長，獲取能符合移栽要求的種子苗或組織培養(yǎng)苗分別需10個月至12個月左右的時間；2)移栽苗的成活率較低，一般為50％左右；3)生長周期較長，人工栽培的植株需生長3-4年左右，才能采集作為藥材；4)愈傷組織的活性成分及有效含量低。野生石斛均用植株作為藥材來源，其植株屬于分化型產(chǎn)物，愈傷組織則屬于未分化型培養(yǎng)物，而對很多藥用植物的成分測定均證明末分化型愈傷組織的活性成分及有效含量低。
所以，如何開發(fā)一種既能縮短石斛的生長周期，又能保持活性成分相對穩(wěn)定的培養(yǎng)技術(shù)，一直是研究人員所努力的方向。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，在于提供一種鐵皮石斛芽簇，它生長速度快，其有效成分的含量與野生型石斛相似，而且能夠保持有效成分含量相對穩(wěn)定。
本發(fā)明的另一個目的，在于提供一種生長快速的鐵皮石斛芽簇的制備工藝，主要是利用細(xì)胞水平誘變和細(xì)胞全能性的原理，動搖和改變其生長緩慢的特性。
本發(fā)明的另一個目的，在于提供一種鐵皮石斛芽簇用于制造食用無菌干粉的用途。
本發(fā)明提供的制備鐵皮石斛牙簇的方法，是根據(jù)細(xì)胞全能性的原理，植株的每一個離體細(xì)胞可以在適宜的培養(yǎng)條件下生長發(fā)育成與母體完全一樣的植株以及細(xì)胞變異原理，即細(xì)胞愈傷組織在離體培養(yǎng)過程中會發(fā)生無性系變異，對離體培養(yǎng)的細(xì)胞或愈傷組織給予誘變處理，可以增加變異范圍和提高變異頻率。因此，我們首先對石斛細(xì)胞或愈傷組織進行誘變以及引發(fā)無性系變異。
取野生鐵皮石斛或種子苗，用其莖尖，芽尖，根尖作為外植體(這些組織內(nèi)細(xì)胞的全能性強)，經(jīng)表面滅菌(70-80％乙醇或滅菌靈)15-20分鐘，切成薄片，置于無菌誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)(2/3 MS、500mg/L CH、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、激動素(KT)、2-4％蔗糖、0.6％瓊脂)，經(jīng)50天左右的培養(yǎng)，獲得大量愈傷組織。愈傷組織置入液體培養(yǎng)基(2/3 N6、500mg/MlCH、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、NAA、3-5％山梨糖)。在搖床上培養(yǎng)30-40天(120轉(zhuǎn)/分)，形成懸浮細(xì)胞或細(xì)胞團。培養(yǎng)溫度22-25℃。在無菌條件下將經(jīng)滅菌的80mg/L平陽霉素(一種安全低毒誘變劑)與愈傷組織或細(xì)胞團共培養(yǎng)12-24小時左右。
用懸浮細(xì)胞或愈傷組織進行2-3次繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)基為2/3 N6、500mg/L的CH、2，4-D、NAA、KT、3-4％蔗糖、0.6％瓊脂。每代培養(yǎng)35-45天，培養(yǎng)溫度22-25℃。
將經(jīng)過繼代培養(yǎng)的細(xì)胞團或愈傷組織和修復(fù)培養(yǎng)基(2/3 MS、15％椰汁、3-5％山梨糖)中淺層培養(yǎng)10天左右的經(jīng)誘變處理的細(xì)胞團或愈傷組織先置于分化培養(yǎng)基(2/3 MS、NAA、KT、6-芐基氨基嘌呤(6-BA)、2-3％蔗糖、0.6％瓊脂)上培養(yǎng)，40天后從各種再生物中選擇芽簇型再生物。芽簇置于增殖培養(yǎng)基(2/3 MS或N6、500mg/L的CH、KT、6-BA、NAA、2-3％蔗糖)上形成芽簇群。通過上述技術(shù)培養(yǎng)可以使變異細(xì)胞分化形成再生物(包括芽簇)，這類再生物中含有生長速率快且有效成分及含量與野生鐵皮石斛相近的變異型芽簇。
選擇增殖速度(鮮重增長量)快且健壯類型的芽簇群，取其一部分芽簇進行多糖和石斛生物堿等含量的測定。多糖含量測定采用苯酚-硫酸法，用80％乙醇提取待測物中所含單糖、低聚糖及甙類等干擾性成份，再用水提取多糖類成份。多糖類在硫酸作用下，先水解成單糖分子并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后和苯酚縮合成有色化合物，以比色法測定多糖含量。因為石斛堿缺乏紫外吸收峰，所以生物堿含量的測定以石斛堿純品為標(biāo)準(zhǔn)，采用溴甲酚綠法測定。經(jīng)含量測定后從中選擇多糖、生物堿、氨基酸和微量元素含量與野生石斛相近的芽簇群。這些有益變異可以通過無性繁殖途徑保留和遺傳下去。
由于變異細(xì)胞或變異體在發(fā)生主要變異時還會發(fā)生相連的或不相連的其他變異，以及分裂旺盛型細(xì)胞易對馴化條件產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)的特性，因此將優(yōu)質(zhì)芽簇群依次置于激素(如2，4-二氯苯氧乙酸)濃度從高到低再到零的馴化培養(yǎng)基上，25℃，每天12小時光照，每次培養(yǎng)40天左右。最后從無激素培養(yǎng)基(2/3 MS、500mg/L CH、3％蔗糖、0.6％瓊脂)上選擇生長速度快、有效成分含量高的芽簇群。
將馴化型(即適應(yīng)無激素培養(yǎng)基)芽簇置于簡單培養(yǎng)基(2/3 MS、2-3％蔗糖、0.6％瓊脂)上，22-25℃培養(yǎng)，每天10-12小時光照(日光燈)，每月鮮重量增加1-2倍。按照上述方法，對每批芽簇均進行多糖含量和石斛生物堿含量測定，監(jiān)測其有效成分及其含量的穩(wěn)定性，保證其多糖含量和石斛生物堿含量與野生鐵皮石斛相近。
經(jīng)規(guī)?；a(chǎn)獲得的芽簇生長速率高，有效成分含量與原始芽簇相近，表明經(jīng)多代(目前已達(dá)9代)培養(yǎng)后，芽簇的原有特性保持不變。
用本發(fā)明制備工藝生產(chǎn)的鐵皮石斛牙簇可以用于制備無菌干粉。收集芽簇，去除培養(yǎng)基，用110℃干燥15分鐘，然后80℃、24小時烘干，經(jīng)測定其多糖和石斛堿含量與用冷凍干燥的方法制備的含量相接近。然后用鈷60照射滅菌，最后獲得鐵皮石斛無菌干粉。
本發(fā)明的技術(shù)方案達(dá)到了如下的效果1、本發(fā)明的制備工藝獲得的芽簇，經(jīng)檢驗，其化學(xué)成分、有效成分含量及基本組織構(gòu)造與野生鐵皮石斛相近，并且保持良好的穩(wěn)定性。
2、本發(fā)明的制備工藝有效地擴大了野生鐵皮石斛替代物的來源；通過標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)工藝，每月鮮重量增加1-2倍，3-4個月可成熟收割，而野生型石斛的生長周期為3-4年。隨著生產(chǎn)規(guī)模擴大，還有望成倍提高。
3、此外，由于采用無激素、無菌培養(yǎng)工藝，生產(chǎn)的芽簇可按國際標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)工藝用于生產(chǎn)食用安全性好的無菌干粉，易于打入國際市場。


圖1為鐵皮石斛牙簇的制備流程圖。
具體實施例方式
以下結(jié)合具體實施例，以進一步說明本發(fā)明的技術(shù)特征。應(yīng)理解，下述實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限定本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明下述實施例中所用的培養(yǎng)基中，
MS為一種培養(yǎng)基，其配方為(單位mg/L)NH4NO31650、 KNO31900、 CaCL2.2H2O 440、MgSO4.7H2O 370、 KH2PO4170、KI 0.83、H3BO36.2、 MnSO4.4H2O 22.3、 ZnSO4.4H2O 8.6、Na2MoO4.2H2O 0.025、CuSO4.5H2O 0.025、 CoCL2.6H2O 0.025、Na2EDTA 37.3、 FeSO4.7H2O 27.8、 pH5.7。
N6為一種培養(yǎng)基，其配方為(單位mg/L)KNO32830、(NH4)2SO4463、 CaCL2.2H2O 166、MgSO4.7H2O 185、 KHPO4400、 FeSO4.7H2O 27.8、Na-EDTA 37.3、 MnSO4.4H2O 4.4、ZnSO4.7H2O 1.5、H3BO31.6、pH5.8實施例1 石斛細(xì)胞或愈傷組織的誘變及無性系變異取野生石斛或種子苗，用其莖尖或根尖，經(jīng)75％乙醇表面滅菌30秒，滅菌靈或漂白粉滅菌15分鐘，無菌水洗凈，置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基(2/3 MS、水解酪蛋白(CH)500mg/L、NAA 1.0mg/L、IAA 0.1mg/L、KT 0.1mg/L、3％蔗糖、0.6％瓊脂)上培養(yǎng)45天以誘導(dǎo)形成愈傷組織。愈傷組織置入液體培養(yǎng)基(2/3 N6、CH 500mg/L、2，4-D 0.5mg/L、NAA 0.1mg/L、0.3％山梨糖)中，搖床(120rpm)培養(yǎng)35天，收集細(xì)胞團/小愈傷組織，加入80mg/L平陽霉素，培養(yǎng)24小時后，無菌水洗凈后取出置入分化培養(yǎng)基(2/3 MS、NAA0.05mg/L、KT 1.0mg/L、6-BA 0.5mg/L、2％蔗糖、0.6％瓊脂)或?qū)⒓?xì)胞團/愈傷組織置于繼代培養(yǎng)基(2/3 N6、500mg/L CH、2，4-D 0.5mg/L、NAA0.1mg/L、3％蔗糖、0.6％瓊脂)上培養(yǎng)2-3代以誘發(fā)無性系變異，每代培養(yǎng)40天，然后取出置入分化培養(yǎng)基。誘導(dǎo)、分化及培養(yǎng)的溫度均為22-25℃。
實施例2 石斛誘變細(xì)胞或愈傷組織的芽簇再生將經(jīng)誘變處理的細(xì)胞團或愈傷組織置于修復(fù)培養(yǎng)基(2/3 MS、15％椰汁、3％山梨糖)中于22-25℃淺層培養(yǎng)10天左右。然后置于分化培養(yǎng)基(2/3 MS、NAA 0.05mg/L、KT 1.0mg/L、6-BA 0.5mg/L、2％蔗糖、0.6％瓊脂)上22-25℃培養(yǎng)，待形成再生芽、再生苗等不同類型再生產(chǎn)物，40天后，從中選擇芽簇。
實施例3 有效成分含量高和增殖速度快石斛芽簇的篩選芽簇在增殖培養(yǎng)基上(2/3 N6、500mg/L CH、NAA 0.5mg/L、KT0.5mg/L、6-BA 0.5mg/L、2％蔗糖、0.6％瓊脂)培養(yǎng)形成芽簇群。選擇生長健壯、增長速度快的芽簇群，取其部分芽簇進行多糖含量測定(測定方法見《中草藥》，1990，21(10)10-12)，從中選擇多糖含量高的芽簇。
選擇多糖含量高的芽簇群再進行石斛生物堿測定(測定方法見《安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報》，1994，21(4)503-506)從中選擇生物堿含量高的芽簇群。
實施例4 石斛芽簇?zé)o激素培養(yǎng)的馴化取優(yōu)質(zhì)石斛芽簇置于激素(2，4-二氯苯氧乙酸)含量較高的馴化培養(yǎng)基(2/3 MS、2，4-D 0.5mg/L、3％蔗糖、CH 500mg/L、0.6％瓊脂)上培養(yǎng)40天，從中選取生長快的芽簇群；再置于激素含量較低的馴化培養(yǎng)基(2/3MS、2，4-D 0.05mg/L、3％蔗糖、CH 500mg/L、0.6％瓊脂)上培養(yǎng)30天，從中選取生長快的芽簇群；最后置于無激素培養(yǎng)基(2/3 MS、3％蔗糖、CH500mg/L、0.6％瓊脂)上培養(yǎng)30天，從中選取生長快且健壯的芽簇。以上培養(yǎng)溫度均為22-25℃。
實施例5 石斛再生芽簇的穩(wěn)定性實驗重復(fù)上述1-4的誘導(dǎo)再生過程，經(jīng)5次重復(fù)，每次均篩選生長速率快且健壯的鐵皮石斛芽簇，將每次篩選得到的芽簇進行有效成分的含量測定，結(jié)果如表1所示

而經(jīng)檢測，野生石斛的多糖含量約為19.15-20.30％，生物堿含量為225.45-230.58ug/g。
可見，本發(fā)明的鐵皮石斛芽簇的誘導(dǎo)再生技術(shù)的重復(fù)性較好。
實施例6 石斛芽簇的工廠化培養(yǎng)對無激素培養(yǎng)基上選擇出的生長快、健壯型芽簇置于簡單培養(yǎng)基(2/3MS、2％蔗糖、0.6％瓊脂)上進行培養(yǎng)，每天用日光燈光照10-12小時，培養(yǎng)溫度為20-25℃。
實施例7 鐵皮石斛芽簇?zé)o菌干粉的制備收集芽簇110℃干燥15分鐘，然后于80℃、24小時的干燥處理或冷凍干燥箱中進行干燥處理。干燥型芽簇進行超細(xì)粉碎，干粉分裝后用鈷60照射滅菌(按照保健食品無菌指標(biāo))，獲得無菌干粉。
權(quán)利要求
1.一種鐵皮石斛芽簇的制備工藝，其特征在于該制備工藝包括下列步驟A.石斛細(xì)胞或愈傷組織的誘變及無性系變異切取野生鐵皮石斛或種子苗的莖尖或根尖，滅菌后置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)形成愈傷組織；愈傷組織置于液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)后收集細(xì)胞團或小愈傷組織，加入平陽霉素培養(yǎng)或置于繼代培養(yǎng)基中誘發(fā)無性系變異，培養(yǎng)物以無菌水洗凈后置入分化培養(yǎng)基進行分化培養(yǎng)；B、石斛誘變細(xì)胞或愈傷組織的芽簇再生經(jīng)誘變處理的細(xì)胞團或愈傷組織置于修復(fù)培養(yǎng)基中淺層培養(yǎng)，然后置于分化培養(yǎng)基上，從形成的再生芽、再生苗等不同類型的再生產(chǎn)物中選擇芽簇；C、有效成分含量高且增殖速度快的石斛芽簇的篩選所選芽簇在增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)形成芽簇群，從中選擇生長健壯、增長快速的芽簇群，取部分芽簇進行多糖含量測定，從中選擇多糖含量高的芽簇；所選多糖含量高的芽簇再進行石斛生物堿測定，從中選擇生物堿含量高的芽簇；D、石斛芽簇的無激素培養(yǎng)馴化所選的有效成分含量高且增殖速度快的石斛芽簇依次置于激素濃度從高到低再到零的馴化培養(yǎng)基上在25℃左右溫度每次培養(yǎng)約40天，每天光照12小時，最后，從無激素培養(yǎng)基上選取生長快且健壯的芽簇。
2.一種以權(quán)利要求1所述的方法制備的鐵皮石斛芽簇，其特征在于，所述鐵皮石斛芽簇每月鮮重增加1-2倍，它的有效成分含量與野生石斛相近且保持穩(wěn)定。
3.一種如權(quán)利要求2所述的鐵皮石斛芽簇的用途，其特征在于，所述鐵皮石斛芽簇可通過下述方法制成食用無菌干粉收集芽簇，去除培養(yǎng)基，110℃干燥15分鐘，然后于80℃、24小時烘干，干燥芽簇進行超細(xì)粉碎，以鈷60照射滅菌制成干粉。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鐵皮石斛芽簇的制備工藝,該制備工藝主要利用無性系變異、誘變、再生和無激素增殖等技術(shù)。用該工藝制備的鐵皮石斛芽簇不僅生長速度比野生鐵皮石斛快,鮮重量每月可增重1－2倍,且有效成分與野生鐵皮石斛相近且能夠保持穩(wěn)定;此外,本發(fā)明還公開了上述鐵皮石斛芽簇用于制造食用無菌干粉的方法。
文檔編號A01H4/00GK1358427SQ0114269
公開日2002年7月17日 申請日期2001年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月18日
發(fā)明者黃劍華 申請人:上海南江衡和生物科技有限公司, 黃劍華