專利名稱：殼內(nèi)鳥卵的卵內(nèi)活化的制作方法
背景技術(shù)：
大小與繁殖能力地面繁殖方法對(duì)繁殖火雞根本行不通，因?yàn)樯逃玫幕痣u品種要經(jīng)過嚴(yán)格挑選，而不能自然交配，以便增加肌肉產(chǎn)量。同樣，對(duì)肉仔雞的繁殖也有同樣的趨勢(shì)。經(jīng)過挑選以增加肉仔雞大小，就會(huì)損害交配和受精能力。預(yù)計(jì)隨著體重的增加，受精能力將逐漸下降。這就意味著給家禽生產(chǎn)商帶來進(jìn)退兩難的境地，因?yàn)槭芫芰Φ慕档椭苯訒?huì)給他們的盈虧結(jié)算線帶來負(fù)面影響。
無效廢物的除去自然交配必須在固體的地板上進(jìn)行，以避免使鳥受傷。這種設(shè)計(jì)要求不能使用自動(dòng)廢物清除系統(tǒng)，而要求在連續(xù)的鳥群間使用手工清除。這就會(huì)增加勞動(dòng)量和提高成本，而降低了對(duì)設(shè)施的生產(chǎn)性使用。
卵的生產(chǎn)和質(zhì)量因?yàn)槁言谑占芭c鳥群一起留在室內(nèi)，所以卵經(jīng)常污染有污物及排泄物等，降低了其孵化率。此外，一般有3-5％的卵直接產(chǎn)在室內(nèi)的地板上，而不是在提供的產(chǎn)卵箱里，這些卵必須被丟棄。
無效空間和設(shè)備利用將雄鳥和雌鳥放在同一室內(nèi)，要求安裝獨(dú)立的喂養(yǎng)和供水系統(tǒng)，因?yàn)槊糠N性別有不同的營養(yǎng)和生產(chǎn)需求。同時(shí)，也要求安裝產(chǎn)卵箱和自動(dòng)卵收集系統(tǒng)。所有這些設(shè)備占用了室內(nèi)有限的地板空間?；谶@些原因，地板飼養(yǎng)較堆積籠系統(tǒng)(stacked cagesystem)而言，不能有效的利用室內(nèi)空間和設(shè)備。
死亡率和繁殖力好斗的雄鳥愛相互打斗，導(dǎo)致較高的雄性死亡率。在室內(nèi)地板飼養(yǎng)時(shí)，雄鳥的平均死亡率在13％，而在籠養(yǎng)時(shí)僅為2％。在交配期間，雄鳥對(duì)雌鳥的挑逗性攻擊行為也會(huì)逐漸增加雌鳥的死亡率，降低繁殖力，以及縮短鳥的產(chǎn)卵周期。隨著雄鳥逐漸變老，繁殖力開始下降。標(biāo)準(zhǔn)的解決辦法就是用年輕的雄鳥充實(shí)鳥群，以增強(qiáng)受精能力。然而，這又開始了新一輪的攻擊行為，引起繁殖力下降和死亡率增加。在室內(nèi)地板養(yǎng)殖更容易引起鳥類疾病，因?yàn)榻?jīng)常接觸帶病原體的草墊和廢棄物。
降低飼料轉(zhuǎn)化率運(yùn)轉(zhuǎn)一個(gè)有競(jìng)爭(zhēng)力的家禽場(chǎng)的關(guān)鍵是控制飼料成本，比如飼料成本占肉仔雞(broiler chick) 飼養(yǎng)成本的60％。在一項(xiàng)研究中，對(duì)于同樣的產(chǎn)量而言，地板飼養(yǎng)的鳥比籠養(yǎng)的鳥要多消耗20％的飼料。產(chǎn)生這個(gè)差別的原因除了地板飼養(yǎng)的鳥具有較高水平的活動(dòng)量外，還有較高水平群居相互作用。雄性比雌性要消耗更多的飼料，從飼料的消耗而言，因?yàn)榈匕屣曫B(yǎng)要保持更多的雄鳥，故地板飼養(yǎng)變得相對(duì)的低效率。
在繁殖方法上有限的靈活性由于地板飼養(yǎng)方案中雄鳥和雌鳥處于一個(gè)大群體中，飼養(yǎng)者很難對(duì)種群進(jìn)行先進(jìn)的雜交和選擇。因此，室內(nèi)地板主要用作預(yù)選遺傳種群以產(chǎn)生商用雜交品種的工具。
人工受精繁殖方案另一種產(chǎn)生孵化卵的方法叫作人工受精(AI)。AI被“繁殖金字塔(breeding pyramid)”頂部的“初級(jí)飼養(yǎng)者”廣泛運(yùn)用，但通常不會(huì)被處于金字塔底部的商業(yè)生產(chǎn)商所采用。初級(jí)飼養(yǎng)者是指此類公司，他們擁有并用雜交等方式改進(jìn)優(yōu)良純種遺傳品系，以產(chǎn)生最終商用產(chǎn)品——肉仔雞、產(chǎn)卵雞及火雞。鳥的數(shù)量按指數(shù)式增加，就像你沿繁殖金字塔向下移動(dòng)，從祖父種群、父輩種群到實(shí)際的商用鳥為止。在繁殖金字塔頂部的具有優(yōu)良遺傳組成的鳥類相當(dāng)昂貴，然而在繁殖金字塔底部的鳥卻不昂貴。因此，在不同的水平采用不同的運(yùn)行模式進(jìn)行繁殖。
在AI系統(tǒng)中，雄性和雌性處于同一房間里，但在不同的籠子里。雌鳥的籠子里通常裝2-5只雌鳥，而雄性籠子里只裝一只雄鳥。AI方案針對(duì)以上指出的地面繁殖房間的許多局限性。例如采用有籠子的房間，廢物的除去可進(jìn)行自動(dòng)化。所以房間要干凈得多，很少有發(fā)生疾病的問題。產(chǎn)卵的方式也得到了改進(jìn)，因?yàn)槁褧?huì)滾出籠子而不會(huì)產(chǎn)在骯臟的地板上。設(shè)備和飼養(yǎng)空間可得到更有效的利用。死亡率因?yàn)槿壕庸粜袨楹图膊〉臏p少而被降到最低。受精水平也因?yàn)榉敝尺^程中群居和身體相互作用的消除而保持更一致，飼料轉(zhuǎn)化率增加了。最后，生產(chǎn)體系為先進(jìn)的雜交和篩選增加了靈活性，這對(duì)于初級(jí)飼養(yǎng)者而言，是改進(jìn)遺傳種群的性能，以保持市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)能力必須的。以上所列舉的大多數(shù)優(yōu)點(diǎn)，對(duì)進(jìn)行商業(yè)水平繁殖的飼養(yǎng)者而言也是很重要的，但這些優(yōu)點(diǎn)被致命的缺點(diǎn)所抵消，即用AI方法繁殖要求較高的勞動(dòng)力成本。
AI方案使用人工勞動(dòng)取代家禽天生的性驅(qū)動(dòng)力。工作人員必須從籠養(yǎng)的雄鳥手工收集精液，并以7天輪回對(duì)籠養(yǎng)的雌鳥進(jìn)行受精。這些方法中所進(jìn)行的操作要求較熟練的勞動(dòng)力。因此，盡管AI方案在操作上是先進(jìn)的，但對(duì)商業(yè)水平繁殖方案來說沒有經(jīng)濟(jì)實(shí)用性。即使使用矮小的雌鳥(一種具有相同的卵生產(chǎn)量而可減少30％的飼料消耗量的創(chuàng)新)，對(duì)于商業(yè)水平繁殖的飼養(yǎng)者來說，也不能補(bǔ)償用AI方案增加的勞動(dòng)力成本。
繁殖過程在排卵期，鳥類卵母細(xì)胞含有一個(gè)胚盤，其含有雌性原核和黃色的卵黃物質(zhì)。胚盤和卵黃由卵母細(xì)胞膜所包圍，叫做卵膜。圍繞卵膜為卵周層(PL)，也被稱為內(nèi)卵周層(IPL)。卵膜和IPL之間的空間被叫作卵周隙，有顆粒細(xì)胞橫貫。一旦卵母細(xì)胞從鳥類的濾泡釋放出來，就被稱為卵子。卵子移動(dòng)進(jìn)入輸卵管，而后被吞入漏斗，如果在此遇到精子，便完成受精作用。
隨著卵子進(jìn)入后漏斗，外卵周層(OPL)就會(huì)包圍卵子。這層膜可防止多精受精作用(多精受精是一種致命的情況，是指在胚盤處多個(gè)精子結(jié)合并穿過卵子)。然后鳥卵被額外的多層卵帶及厚和薄的卵清層所包圍。當(dāng)卵子移動(dòng)到峽部時(shí)，兩層殼膜沉積下來，小的碳酸鈣晶體便沉積在上面，因此開始形成卵殼。
以上事件在受精后的前幾個(gè)小時(shí)內(nèi)發(fā)生。爾后卵子移動(dòng)到子宮，在接下來的18-20小時(shí)中，鈣殼便徹底形成了。然后卵進(jìn)入陰道，保留幾分鐘后從陰道排除或被產(chǎn)出。此時(shí)，如果卵已受精，包含的胚胎有大約40,000-70,000個(gè)細(xì)胞。(Johnston，“In Vitro SpermBinding，Penetration，and Fertilization of Recently OvipositedChicken Eggs，”December 1988，Clemson University)；Olsen，M.W.，J.Morph.70413-5331942)；Etches et al.，in Methods in MolecularBiology，vol.62 Recombinant Gene Expression Protocols，Ed.R.Tuan，Humana Press，Inc.Totowa，NJ，pp.433-4501997)；Petitteet al.，in Manipulation of the Avian Genome，Ed.Etches et al.，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L，pp.81-1011993)。
基因轉(zhuǎn)移長期以來，將目標(biāo)基因直接插入鳥類的生殖系以補(bǔ)充傳統(tǒng)的選擇程序一直是鳥類遺傳學(xué)家們的一個(gè)目標(biāo)。這條路線在哺乳動(dòng)物已經(jīng)取得了巨大進(jìn)步，其早期胚胎可獲得，原核可見，可插入外源DNA。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因鼠、牛、綿羊及山羊已成為大規(guī)模商業(yè)操作的常規(guī)程序。相反，在鳥類，早期胚胎不易獲得，原核也不明顯，使得對(duì)卵內(nèi)早期胚胎中的基因組進(jìn)行操作幾乎是一個(gè)不可逾越的目標(biāo)。
經(jīng)過遺傳修飾的鳥的開發(fā)很大程度要求獲得早期的多能性胚胎細(xì)胞。因?yàn)榕咛サ淖钤缙诎l(fā)育在雌性的輸卵管，只有將雌性體內(nèi)的胚胎取出，才可能將外源DNA引入胚胎，這要求殺死雌性鳥類。而且，將早期胚胎培養(yǎng)以使其完成孵化是一個(gè)相當(dāng)繁瑣的方法，孵化后的成活率僅10％左右。Sang et al.，in Manipulation of the Avian Genome，Ed.Etches et al.，CRC Press，Boca Raton FL，pp.121-133(1993)。
本發(fā)明提供了一種在殼內(nèi)活化產(chǎn)出卵的方法，并從殼內(nèi)孵化出存活雛鳥，因此叫做卵內(nèi)活化，從而從根本上改進(jìn)了鳥類的生物學(xué)。這些方法給地面繁殖和人工受精提供了一種可選擇的方法，從而可大大提高家禽生產(chǎn)的效率。這些方法也便于得到早期鳥類胚胎，使得更容易開發(fā)轉(zhuǎn)基因的鳥類。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及鳥類繁殖領(lǐng)域。尤其是本發(fā)明提供了在殼內(nèi)活化鳥卵的方法。本發(fā)明也提供了孵化出存活雛鳥的殼內(nèi)活化鳥卵的方法。
本發(fā)明也提了在發(fā)育早期所產(chǎn)出的鳥卵。發(fā)明詳述本發(fā)明所使用的詞，“一個(gè)(a，an)或此(the)”指的是“一個(gè)或多個(gè)”。比如“一個(gè)”卵意思可以是“一個(gè)或一個(gè)以上卵”?！按恕币惨馕吨耙粋€(gè)或一個(gè)以上卵”。
本發(fā)明中，“活化”意思是產(chǎn)出的未受精卵或卵母細(xì)胞胚胎發(fā)育的啟動(dòng)。下文提出了許多形式的活化。產(chǎn)出卵的殼內(nèi)活化過程此處稱作“卵內(nèi)活化”(IOA)。
本發(fā)明提供了活化殼內(nèi)鳥卵(其中，鳥卵包含由膜包被的卵黃和卵子)的方法，也包括使卵子活化。本發(fā)明也涉及意料之外而驚人的發(fā)現(xiàn)，即未經(jīng)受精的產(chǎn)出鳥卵經(jīng)過殼內(nèi)活化后可孵出存活雛鳥。本發(fā)明中，殼內(nèi)鳥卵被叫做產(chǎn)出卵，也即是從鳥的陰道里排出的帶有碳酸鈣外殼的卵。鳥卵的排出叫做“產(chǎn)卵”。因此，在這里所提及的“殼內(nèi)卵”或“產(chǎn)出卵”是同一個(gè)意思。
當(dāng)鳥卵產(chǎn)出時(shí)，含有一個(gè)硬的、鈣化的外殼。殼內(nèi)含有卵黃，含有支持胚胎生長發(fā)育的營養(yǎng)。這里的“胚胎”指的是在卵受精過程中，由雄性原核和雌性原核融合產(chǎn)生的一種正在發(fā)育的有機(jī)體。盡管一個(gè)受精的(單細(xì)胞)卵子可被叫做胚胎，單細(xì)胞胚胎在此也被特稱為受精卵。
盡管卵內(nèi)活化可在產(chǎn)出卵在室溫維持兩周后進(jìn)行，但活化剛產(chǎn)出的卵會(huì)得到最好的結(jié)果。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在卵產(chǎn)出后的0-96小時(shí)內(nèi)進(jìn)行活化。在更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，在卵產(chǎn)出后的0-72小時(shí)內(nèi)進(jìn)行活化。甚至還要更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，在卵產(chǎn)出后0-48小時(shí)內(nèi)活化。在高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，在卵產(chǎn)出后0-24小時(shí)內(nèi)活化。因此，最好對(duì)產(chǎn)出的卵盡快進(jìn)行活化。然而準(zhǔn)確的時(shí)間限制取決于所產(chǎn)卵是在什么樣條件下保存的，如什么樣的溫度和濕度等。如果讓未受精而產(chǎn)出的卵冷卻前進(jìn)行活化，將會(huì)提高活化效果。
在本發(fā)明的方法中，殼內(nèi)鳥卵活化的方法是通過機(jī)械破壞卵或遞送一個(gè)生物樣品、如含有一個(gè)或多個(gè)精子、細(xì)胞或核的樣品到產(chǎn)出的卵中?？捎靡韵乱恍┓椒▽⒙哑茐幕蜻f送生物樣品。這些方法允許將樣品遞送至殼內(nèi)，包括(但不局限于)用酸溶液等或電穿孔的方法溶解卵殼的一個(gè)區(qū)域，以及諸如用針或解剖刀等工具穿透卵殼或使其產(chǎn)生縫隙，從而使卵殼有一開口。
在將樣品遞送到殼內(nèi)之前，為了防止對(duì)鳥卵的污染，遞送樣品或破壞卵子所要穿透的卵殼某一區(qū)域的表面應(yīng)該進(jìn)行消毒。任何和遞送生物樣品的方法相適應(yīng)的方法都可用來對(duì)卵殼進(jìn)行消毒處理，包括(但不局限于)消毒劑IOFEC-20和3％的過氧化氫。可將卵殼上將要被穿透的位點(diǎn)用消毒劑擦洗或噴灑，或者將鳥卵浸泡在含有消毒劑的容器中進(jìn)行處理。
如上所述，可用小刀或針等工具在卵殼上作一個(gè)開口，所用的工具最好是無菌的。例如，在一個(gè)兩步法中，首先用小刀或其它的銳器在卵殼上開一個(gè)小孔。第二步，用注射器的針頭將樣品通過小孔注入到卵內(nèi)。將樣品引入到卵殼內(nèi)也可用其它的方式，包括(但不局限于)使用移液管，例如微移液管等。在一步法中，用注射器的針頭直接刺破卵殼，將所吸取的樣品注入到卵內(nèi)。因此，“開口”可包括由針形成的小孔。當(dāng)然，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能選擇適用的針頭，其規(guī)格大小足以使所有的樣品都能通過針頭。在一種實(shí)施方案中，所用的針頭要是最小規(guī)格的，從而將樣品完整的遞送到卵殼內(nèi)，而且，針頭要足夠的堅(jiān)韌，以便足以穿過鈣質(zhì)的卵殼。另外，可用一個(gè)單獨(dú)的針頭在卵殼上作一個(gè)開口。在典型情況下，可使用30號(hào)(gauge)到16號(hào)的針頭。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，使用22號(hào)的針頭。
可在卵殼上能使卵活化的任何區(qū)域開口，但通常在胚盤附近卵殼的某一區(qū)域開口。盡管可將鳥卵進(jìn)行處理，以便將胚盤置于卵的不同位置，但剛產(chǎn)出卵的胚盤一般位于覆蓋卵黃附近的氣室的卵殼的大末端。一旦卵殼上已作了開口，優(yōu)選用針頭或移液管等通過氣室將樣品注入到位于氣室下面的膜(內(nèi)層殼膜)下。
為了防止卵的污染和胚胎的死亡，最好將殼上的開口密封?？捎梅嵌拘缘恼澈蟿┲苯訉⒙褮さ拈_口密封。或者，將卵殼的碎片作為補(bǔ)丁將開口關(guān)閉，也可用非毒性粘合劑將碎片粘到卵殼上。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所用非毒性粘合劑為Elmer’s膠水。在另一實(shí)施方案中，粘合劑為一種聚硅酮密封劑。進(jìn)一步，也可用任何“組織膠水”密封卵殼?！敖M織膠水”是外科手術(shù)過程中用來將組織結(jié)合起來的無菌、非毒性粘合劑。
用本發(fā)明所述方法來活化的鳥卵由選自以下一組的鳥類產(chǎn)出雞、鶴鶉、火雞、雉、鴕鳥、鴯鹋、鵝、孔雀、松雞、美洲鴕、鸚鵡、雞尾鸚鵡、美冠鸚鵡、長尾小鸚鵡、以及其它的具有商業(yè)價(jià)值的鳥類。
本發(fā)明提供了殼內(nèi)活化鳥卵的方法，其中，卵包含由膜包圍的卵黃。本發(fā)明也提供了孵化存活雛鳥的方法。
按照本發(fā)明所述方法將鳥卵活化后，將卵進(jìn)行孵化處理，直到孵出存活雛鳥。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該知道孵化特定種受精鳥卵的時(shí)間和優(yōu)選條件。以下為許多種鳥的孵化周期雞-21天，鵪鶉-23天，Corunix鵪鶉-17-18天，雉-23天，火雞-28天，鴨-28-33天，鵝-28-30天，長尾小鸚鵡-18天，鸚鵡-28天，鴿-14天，八哥-14天，雀-14天，紐扣鵪鶉(Button Quail)-16天，峽谷鵪鶉(Valley Quail)-21-22天，天鵝-30-37天。和天然受精卵的孵化相比，用本發(fā)明所述方法對(duì)受精卵進(jìn)行孵化時(shí)，其區(qū)別僅在于孵化時(shí)間可以延長，以便包括受精卵產(chǎn)出前在雌鳥體內(nèi)所保留的時(shí)間。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，雞卵的孵化周期可持續(xù)21-23天。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將容易確定孵化某一特定種鳥卵的最佳溫度，典型的溫度為95°F-100°F。雞卵在約99.5°F進(jìn)行孵化。在一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)接近孵出點(diǎn)時(shí)，雞卵的孵化溫度應(yīng)降低。因此，在當(dāng)前的優(yōu)選實(shí)施方案中，在孵化雞卵的1-18天，在99.5°F進(jìn)行孵化，從19天開始在98.5°F下進(jìn)行孵化至孵出雛雞。
本領(lǐng)域所熟知，要使鳥卵孵出雛鳥，其孵化的濕度水平是很重要的。因此，卵孵化時(shí)典型的濕度為75％-90％。優(yōu)選孵化濕度為約80％。更優(yōu)選地，在接近孵出點(diǎn)時(shí)，孵化卵的濕度水平將升高。因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，雞卵孵化時(shí)，從1-18天，在80％的濕度下孵化，19天以后在85％的濕度孵化至孵出雛雞。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，在孵化的1-18天，在99.5°F和80％的濕度下孵化卵，從第19天開始，在98.5°F和85％的濕度下孵化至孵出雛雞。正如在本領(lǐng)域所熟知的，在孵化期間，翻動(dòng)鳥卵有利于促進(jìn)胚胎的生長。
進(jìn)一步優(yōu)選在商用的孵卵箱里孵化鳥卵。商用孵化器(hatcher)調(diào)節(jié)器(setters)由許多公司生產(chǎn)，包括PAS Reform，Jamesway，Chickmaster，Buckeye，Cumberland，Petersime，Humidaire IncubatorCo.等等。優(yōu)選在孵出之前約三天，將卵從調(diào)節(jié)器孵卵箱(setterincubtor)移到孵化器孵卵箱(hatcher incubator)中。孵化籃(hatcherbasket)可使卵置于雛鳥更易破殼出來的位置。該籃也允許雛鳥在孵出后立即走動(dòng)，這對(duì)于雛鳥的發(fā)育和成活是必要的。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)出的鳥卵，其中含有天然胚胎，此胚胎含有的細(xì)胞少于40,000個(gè)，能發(fā)育成為存活雛鳥?！疤烊弧币馑际钦谏L的，活著以及產(chǎn)生于它來源的地方。因此，天然胚胎指的是其發(fā)育和孵出時(shí)同雌鳥的原核形成所處卵殼相同的胚胎。因此，胚胎是從天然的卵子遺傳下來的。當(dāng)天然受精卵產(chǎn)出時(shí)，典型的正在發(fā)育的胚胎含有40,000-70,000個(gè)細(xì)胞。然而，本發(fā)明所指的卵在產(chǎn)出后，在殼內(nèi)完成受精。因此，本發(fā)明中，卵中正在發(fā)育的胚胎，其孵化期間的細(xì)胞數(shù)有時(shí)不足40,000個(gè)。實(shí)際上，當(dāng)活化鳥卵時(shí)，本發(fā)明的卵中的胚胎僅有一個(gè)細(xì)胞，即受精卵。隨著鳥卵中胚胎的生長，正常的細(xì)胞分裂發(fā)生了，細(xì)胞數(shù)量也增加。因此，本發(fā)明所提供的活化的、產(chǎn)出的鳥卵，在孵化的某一時(shí)間將有以下細(xì)胞數(shù)的胚胎例如1,100，1,000，10,000，20,000 30,000，或40,000，以及細(xì)胞數(shù)位于這些之間的胚胎。兩種商業(yè)上優(yōu)選的鳥卵是雞和火雞的卵。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種殼內(nèi)鳥卵，其含有一個(gè)細(xì)胞數(shù)少于40,000(例如30,000，20,000，10,000，1,000，100和1(受精卵))的胚胎，其中，胚胎能夠發(fā)育成存活雛鳥，卵殼上有一個(gè)小于4厘米的開口。在另一個(gè)實(shí)施方案中，卵殼上的開口小于2厘米。在另一個(gè)實(shí)施方案中，卵殼上的開口小于1厘米或0.5厘米。在另一個(gè)實(shí)施方案中，卵殼上的開口小到僅能容納一個(gè)22號(hào)針頭。因此，開口可能是以下大小之間的任何大小，最小的開口僅允許注入樣品或破壞卵子的工具，最大到小于將體外(在殼外)受精的卵放回殼內(nèi)所要求的孔?！伴_口”意味著鳥卵產(chǎn)出后的某個(gè)時(shí)間，在殼上開的一個(gè)孔。對(duì)開口鳥卵的理解也包括隨后又被密封的鳥卵。例如，用針頭刺一個(gè)孔，并將樣品注入，而后又將開口密封的鳥卵，甚至密封以后，都是在有開口鳥卵的定義范圍之內(nèi)。對(duì)鳥卵而言，胚胎可能是天然的或非天然的?！胺翘烊弧卑切哪骋宦炎影l(fā)育，但對(duì)產(chǎn)出此卵的殼不是天然的那些胚胎。兩種商業(yè)上優(yōu)選的鳥卵來自雞和火雞。另外，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)出的鳥卵，其含有一個(gè)胚胎和一個(gè)天然的卵黃，其中，胚胎的細(xì)胞數(shù)少于40,000，30,000，20,000，10,000，5,000，1,000或100，以及介于1-40,000之間。從這些卵孵出的雛鳥都有正常的核型和正常的發(fā)育。
產(chǎn)出本發(fā)明卵的鳥類可能選自例如雞、鶴鶉、鴨、火雞、雉、鴕鳥、鴯鹋、鵝、孔雀、松雞、美洲鴕、鸚鵡、雞尾鸚鵡、美冠鸚鵡、長尾小鸚鵡、天鵝、鴿、以及其它一些有商用價(jià)值的鳥類。在一個(gè)商業(yè)上優(yōu)選的實(shí)施方案中，鳥卵來自適用于本發(fā)明所提供方法的一些鳥類物種，選自雞、火雞、鵝、鴨子、鵪鶉和雉等。在一個(gè)更優(yōu)選的商業(yè)性實(shí)施方案中，通常采用雞卵。本方法也能有效地用于動(dòng)物園的鳥類物種，如幫助保護(hù)瀕臨滅絕的鳥類。
本發(fā)明所提供的方法也適用于爬行動(dòng)物卵的卵內(nèi)活化。爬行動(dòng)物卵和鳥卵一樣，包含卵黃和雌性原核，產(chǎn)出時(shí)也受到卵殼的保護(hù)。一個(gè)未受精而產(chǎn)出的爬行動(dòng)物卵，也可按照本發(fā)明所提供的方法進(jìn)行殼內(nèi)活化。
在這里所描述的卵內(nèi)活化方法也可以與其它的卵內(nèi)活化方法相結(jié)合使用。例如，胚胎可在活化后進(jìn)行接種(vaccination)。這些接種方法在本領(lǐng)域是熟知的。作為選擇，如果接種不會(huì)妨礙胚胎的發(fā)育，這樣的接種可和卵內(nèi)活化同時(shí)進(jìn)行。
另外，卵內(nèi)活化可自動(dòng)進(jìn)行，以便多個(gè)卵同時(shí)被活化(例如通過注入方式活化)。因此，可將50，100，200，300或更多個(gè)卵同時(shí)活化。
所產(chǎn)出的未受精卵可用下文提出的多種特定的方法進(jìn)行活化。上文所描述的活化方法是通過象受精、單性生殖及核轉(zhuǎn)移的方式完成的。因此，正如下文所述，所轉(zhuǎn)移的、用于活化未受精卵的樣品可能是含有樣品物質(zhì)的精子。
受精本發(fā)明提供了一種使殼內(nèi)鳥卵受精的方法，其中，該卵包含由膜包圍的卵黃，該方法包括獲得含有置于生理上可接受的載體中的鳥精子的精子樣品及遞送精子樣品到卵中使其受精的方法。使所產(chǎn)殼內(nèi)卵受精的過程被稱為“卵內(nèi)受精”(IOF)。
可用本領(lǐng)域工作人員所熟知的方法從鳥類的精子樣品中獲得精子，例如本領(lǐng)域工作者所熟知的腹部按摩法。用這種方法也可以將含有精子、精液或透明流體的射出物(精液)收集起來。透明流體是一種當(dāng)陰莖腫脹時(shí)通過淋巴管遞送到陰莖表面的淋巴樣的流體。鳥類的精于也可以從本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的商業(yè)來源得到。
在一個(gè)實(shí)施方案中，精子樣品中的精子是從某一只鳥取得的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，精子樣品中的精子是一只以上鳥的精子混合物。當(dāng)將一只以上鳥的精子混合物用于本發(fā)明所述的方法時(shí)，使卵受精成功的可能性可以增加，因?yàn)槿绻骋恢圾B的精子是不育的，其它鳥的精子很可能具有使卵受精的能力。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，精子樣品含有從同一種鳥取得的精子，用此精子樣品使與精子供體雄鳥同種的雌鳥的卵受精。本發(fā)明也考慮使一種鳥的精子與另一種鳥的卵受精(如果此精子能使卵受精)。
然而，特別優(yōu)選的是，精子應(yīng)在其收集后的30分鐘內(nèi)使用，另外，如果精子能夠保持使卵受精的能力，較老的，甚至是以前冷凍過的或者凍干的精子都可以按照本發(fā)明的方法使用。如果要使精子在收集30分后使用，優(yōu)選和精子補(bǔ)充劑(extender)結(jié)合使用(見下文所述)。
如上文所述，精子樣品也包含有生理上可接受的載體。此處所述“生理上可接受的載體”是一種讓精子保持運(yùn)動(dòng)能力和存活力的流體。生理上可接受的載體的例子包括(但不局限于)未變化的精液、精液(精子固有的或添加的)、透明流體(精子固有的或加入的)、緩沖鹽溶液、精子補(bǔ)充劑，以及它們的組合。載體優(yōu)選包括精子補(bǔ)充劑，在本領(lǐng)域也被叫做稀釋劑。正如上文所述，當(dāng)精子收集后30分鐘內(nèi)不使用，使用時(shí)最好加入精子補(bǔ)充劑。M.R.Bakst，In Manipulationof the Avian Genome，R.J.Etches and AM.Verrinder Gibbons，eds.，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L，pp.15-281993).此處的精子補(bǔ)充劑是一種生理上可接受的載體，將其用來稀釋精子樣品，使精子樣品的體積增加，以降低精子樣品中精子的濃度。優(yōu)選地，精子補(bǔ)充劑的組合物除了延長精子的保存期限外，還將稀釋精子，以便用使收集的精子量使更多的卵受精。關(guān)于精子補(bǔ)充劑組合物的例子、所建議的稀釋比例、最佳的貯存時(shí)間和條件、以及商用的補(bǔ)充劑來源可從Bakst的報(bào)道中找到(“Preservation of Avian CellInPoultryBreeding and Genetics，R.D.Crawforded.) Elsevier，New York，pp 91-1081990))。其它一些在家禽工業(yè)上常用的稀釋劑為Lago配方鳥類精子補(bǔ)充劑(由Hygeia Biological Laboratories生產(chǎn))、Semaid火雞補(bǔ)充劑由Poultry Health Laboratories in Davis California生產(chǎn))、Beltsville家禽精子補(bǔ)充劑Semen Extender由Tri BioLaboratories，Inc.in State College，Pennsylvania生產(chǎn))。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，精子補(bǔ)充劑為Avidiludent(由IMB，10rueGeorges，Clemenceau，BP 81，613021’Aigle，F(xiàn)rance生產(chǎn))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，精子樣品可以含有精子和精液。另外，精子樣品可能含有精子和用生理上可接受的載體稀釋的精液，所述載體包括(但不局限于)緩沖鹽溶液和精子補(bǔ)充劑。
精子樣品也可由本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法制備，包括用緩沖鹽溶液或精子補(bǔ)充劑等溶液洗滌從一只或多只鳥獲得的精液，離心所得溶液，除去上清，以及用一體積的緩沖鹽溶液或精子補(bǔ)充劑等溶液重懸所洗滌過的精子。本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易理解如何用適當(dāng)體積的溶液重懸精子，以獲得想要的濃度。例如，離心并除去上清后，將沉積精子稱重，精子的數(shù)量可通過已知的鳥精子的重量值進(jìn)行估計(jì)。然后用適量體積的溶液重懸精子，以獲得所需要的濃度。作為選擇，除去上清后的精子可以重懸，然后再離心，以便測(cè)定沉積精子的體積(Johnston，1998)。隨后，可用Maeza和Buss公式計(jì)算精子的濃度。(Poultry Sci.5520591976))。
典型的，雞精液中精子的濃度為3～8×108個(gè)/ml，火雞為8～15×108個(gè)/ml，珍珠雞(guinea fowl)為4～8×108/ml，北京鴨為0.2～6×108/ml。人工受精時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)精子數(shù)量為1×108/50μl精液。在本發(fā)明的方法中，由于將精子直接置于雌性原核旁邊，故用來使卵受精的精子比通常要少得多。因此，本發(fā)明的方法中也可用少到只有一個(gè)精子的情況。實(shí)際上，本發(fā)明能夠使用的精子濃度范圍很大。在一個(gè)實(shí)施方案中，將雞精液用等體積的Avidiluent稀釋，然后將大約0.01ml的這種精子樣品注入卵內(nèi)。因此，大約一百萬個(gè)精子可沉積在雌性原核的旁邊。
在本發(fā)明的一個(gè)方法中，將精子樣品遞送到卵，使殼內(nèi)的鳥卵受精。精子樣品的遞送可用上文描述的方法完成。精子在其最寬點(diǎn)大約0.5μm，長度為100μm。因此，在一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，用一個(gè)內(nèi)徑至少10μm的針頭進(jìn)行注射。在一個(gè)實(shí)施方案中，注射完后，針頭仍可留在卵殼里。許多將疫苗注入卵的針頭和方法都可用于或適合于精子的遞送。
可在能影響有效受精的卵殼的任何位置開口，但是典型的情況下，在胚盤附近的卵殼某一區(qū)域開口。盡管可將卵殼進(jìn)行處理，以便將胚盤置于鳥卵的不同區(qū)域，新產(chǎn)卵的胚盤大多位于覆蓋卵黃的氣室的卵殼的大末端。一旦在卵殼上開了一個(gè)口，優(yōu)選通過引入針頭、移液管等將精子樣品通過氣室遞送到位于氣室下面的膜(內(nèi)殼膜)下。精子的數(shù)量可以增加或減少，這取決于給予精子的地點(diǎn)和形式。在一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，將精子樣品用針頭注入鳥卵內(nèi)。在天然情況下，要使卵的受精取得成功，精細(xì)胞必須穿透內(nèi)層卵周膜并和卵膜融合。如果用IOF，在成功受精之前，精細(xì)胞也必須穿透外層卵周液膜。為了增加受精效率，可以處理OPL或卵黃膜。任何可使OPL或卵黃膜更易被穿透的處理都可以被采用，例如非毒性的酸、蛋白水解酶、或物理的磨損等。
在一個(gè)實(shí)施方案中，用針頭、移液管等以約15°的角度推進(jìn)至卵殼內(nèi)，并穿透襯在卵殼內(nèi)的膜。在一個(gè)本發(fā)明所提供的方法中，針頭、移液管等推進(jìn)通過氣室，直到達(dá)到內(nèi)層的殼膜。一個(gè)練習(xí)使用本發(fā)明方法的人應(yīng)知道，當(dāng)針頭或移液管進(jìn)一步推進(jìn)受到輕微阻礙時(shí)，表明針頭或移液管已達(dá)到殼膜。隨著針頭或移液管的尖端輕微推進(jìn)，來自膜的阻力消失，針頭或移液管的尖端剛好穿過膜。然后，精子樣品被遞送到了卵內(nèi)靠近膜的某一區(qū)域，也即是胚盤的附近。因此，精子可以剛好被遞送到膜的下面，這個(gè)方法叫做細(xì)胞質(zhì)內(nèi)精子注射法(ICSI)。常規(guī)的精子樣品的體積可少至0.005ml，或大到0.10ml。一個(gè)典型的精子樣品體積為大約0.01ml。
為了防止卵的污染和胚胎的死亡，卵殼上的開口優(yōu)選用上文所述的方法密封。本發(fā)明的方法可使許多鳥類物種所產(chǎn)的卵受精，所述鳥類物種選自雞、鵪鶉、鴨、火雞、雉、鴕鳥、鴯鹋、鵝、孔雀、松雞、美洲鴕、鸚鵡、雞尾鸚鵡、美冠鸚鵡、以及其它一些具有商業(yè)價(jià)值的鳥類。
本發(fā)明也提供了一種使殼內(nèi)鳥卵受精的方法，其中，所述卵含有一個(gè)由膜包圍的卵黃；也提供了孵化出存活雛鳥的方法，包括獲得含有置于生理上可接受的載體上的鳥精子的精子樣品，并將精子樣品遞送到卵使其受精，并且孵化卵并從卵孵出存活雛鳥。此處“獲得”包括利用預(yù)制備和預(yù)遞送的精子樣品。
按照本發(fā)明上文所述方法將精子樣品遞送到卵內(nèi)以后，按上文所述方法將卵進(jìn)行孵化，直到孵出存活雛鳥。
正如上文所述，本發(fā)明的方法也可用于爬行動(dòng)物卵的卵內(nèi)受精。爬行動(dòng)物卵和鳥卵一樣，也含有卵黃和雌性原核，當(dāng)其產(chǎn)出時(shí)也受到卵殼的保護(hù)。一個(gè)未受精的爬行動(dòng)物卵產(chǎn)出后，也可用本發(fā)明所述方法進(jìn)行殼內(nèi)受精，尤其是將含有一個(gè)或多個(gè)同種爬行動(dòng)物精子的精子樣品，通過卵殼上的開口遞送到未受精的產(chǎn)出卵的殼內(nèi)，并遞送到雌性原核附近的卵黃上，在此處發(fā)生受精作用。
另外，卵內(nèi)受精可自動(dòng)進(jìn)行，以便多個(gè)卵同時(shí)受精，例如采用注射技術(shù)。因此，50，100，200，300或更多的卵可同時(shí)被注射。
單性生殖在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所產(chǎn)未受精卵的活化采用單性生殖誘導(dǎo)。此處的單性生殖是指在沒有雄性配子的情況下，由雌性的配子單獨(dú)產(chǎn)生胚細(xì)胞的過程。
在一個(gè)優(yōu)選方案中，所產(chǎn)未受精卵用單性生殖進(jìn)行的活化可通過穿透包圍卵黃(卵黃膜)和胚盤的膜的方式進(jìn)行誘導(dǎo)，例如直接用25號(hào)針頭刺破卵殼并進(jìn)入卵內(nèi)，穿透包圍卵黃的膜。最好避免使卵黃破裂。因此，對(duì)包圍卵黃的膜的穿透和破壞可啟動(dòng)卵子的活化。需要指出的是，其它一些能破裂包圍卵黃的膜的機(jī)械方式也可以用。例如激光，包括非熱能的YGA(億鋁石餾石)激光，可用來破壞包圍卵黃的膜，而在此方法中并不使用針頭。
有證據(jù)表明，胞質(zhì)中Ca2+濃度短暫的增加啟動(dòng)卵發(fā)育。胞質(zhì)中Ca2+濃度可通過直接注入Ca2+到卵內(nèi)或使用攜帶Ca2+的離子載體如A23187的方式人為地增加。這使得目前所測(cè)試過的所有動(dòng)物的卵都得到了活化Alberts 1983)。通過注入Ca2+螯合劑EGTA防止Ca2+濃度的增加，從而可抑制受精后卵的活化。因?yàn)榘|(zhì)中Ca2+濃度的增加是短暫的，僅在受精后持續(xù)2-3分鐘，很明顯，它不能直接調(diào)節(jié)卵活化后期所觀察到的各種事件，包括DNA和蛋白質(zhì)的合成等。相反，Ca2+濃度的增加只是啟動(dòng)了各種發(fā)育事件的整個(gè)順序；當(dāng)Ca2+濃度處于高水平時(shí)，卵內(nèi)一定會(huì)發(fā)生一些更加持久性的改變。
盡管有關(guān)卵活化的機(jī)理還不完全為人們所理解，很明顯，精子只是啟動(dòng)了卵內(nèi)的一個(gè)預(yù)設(shè)程序。精子本身并不是必須的。卵可以被許多非特異性的物理或化學(xué)處理活化。這些方法通常被認(rèn)為提高了細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度(Rickord and White，1992)。例如用針刺的方式可活化蛙卵(Alberts，1983)。小鼠卵母細(xì)胞可用如下的方式活化暴露于無Ca2+-Mg2+的培養(yǎng)基(Surani and Kaufman，1977)、含透明質(zhì)酸酶的培養(yǎng)基(Graham，1970)、暴露于乙醇(Cuthbertson)、Ca2+載體或螯合劑(Steinhardt et al.，1974；Kline and Klinge，1992)、蛋白質(zhì)合成抑制劑(Siracusa et al.，1978)以及電刺激(Tarkowskiet al.，1970)等。有人報(bào)道用乙醇(Nagai，1978)、電刺激(Ware etal.，1989)、暴露于室溫(Stice and Keefer，1992)、以及將電刺激和環(huán)己酰亞胺相結(jié)合使用(First et al..，1992；Yang et al.，1992)等方式活化牛的卵母細(xì)胞。這些方法可用來活化產(chǎn)下的未受精鳥卵。
用單性生殖進(jìn)行卵內(nèi)活化的一個(gè)應(yīng)用就是快速生產(chǎn)種禽的純的近交系。目前，工業(yè)實(shí)踐包括使用純合母系的不同組合已生產(chǎn)出商業(yè)上獨(dú)特的鳥類。一直有人在努力獲得、提高和維持這些品系。用單性生殖的方式，一個(gè)雌性的配子能經(jīng)過誘導(dǎo)發(fā)育成存活雛鳥，而不需要來自雄性的遺傳貢獻(xiàn)。所產(chǎn)生的雛鳥在每一個(gè)等位基因完全是純合的。因此，純合品系可在一代中產(chǎn)生，而不是今天所要求的多輪近交。而且，不需要用鳥群來產(chǎn)生純合品系，而只需要用某一個(gè)優(yōu)良的個(gè)體。因?yàn)樵谀骋环敝撤N群中，一些個(gè)別鳥的表現(xiàn)比一般的要好，所以，用這種方法可以使商業(yè)上的最佳遺傳性狀進(jìn)入最終的商業(yè)產(chǎn)品。
核轉(zhuǎn)移核轉(zhuǎn)移/細(xì)胞微操作技術(shù)可被用來活化產(chǎn)出的未受精的產(chǎn)出鳥卵。因此，本發(fā)明的一個(gè)單獨(dú)考慮的實(shí)施方案涉及到了將含細(xì)胞核或“核質(zhì)(nucleoplasts)”的流體懸液進(jìn)行遞送的方法。核質(zhì)可用先進(jìn)的離心方法大規(guī)模的產(chǎn)生。據(jù)測(cè)定，在許多物種，如綿羊、奶牛和小鼠，從某一個(gè)細(xì)胞分離的核質(zhì)可以被插入到另一個(gè)去核的細(xì)胞中，以便產(chǎn)生相同的，克隆的個(gè)體。此處所用的“核轉(zhuǎn)移”是指插入一個(gè)核，也即核質(zhì)，(或者處于細(xì)胞中，或者獨(dú)立于細(xì)胞的核)，到一個(gè)天然核無效(例如通過取出或切除)的細(xì)胞中的過程。這里所描述的方法允許生產(chǎn)商有效地將優(yōu)良遺傳品系繁殖成商用的鳥類，并作為發(fā)展自動(dòng)化核轉(zhuǎn)移儀器平臺(tái)的基礎(chǔ)。
實(shí)現(xiàn)這個(gè)方法所要求的主要的步驟如下(1)開發(fā)合適的細(xì)胞系及培養(yǎng)核質(zhì)供體的條件；(2)顯現(xiàn)并取出或切除鳥卵和/或受精卵；(3)供體核的分離；(4)將供體核轉(zhuǎn)移到卵內(nèi)(胞質(zhì))?？梢鹋咛グl(fā)育的重構(gòu)卵的活化也可能受影響。
核質(zhì)供體細(xì)胞。在幼鳥中，胚胎干細(xì)胞和原始生殖細(xì)胞保持著全能性，可用于鳥的NT程序中。用這種方式產(chǎn)生的克隆雞在用于某些家禽繁殖方面是相當(dāng)有價(jià)值的。
作為選擇，體細(xì)胞系對(duì)于其它家禽繁殖方案可能具有某些優(yōu)點(diǎn)。一個(gè)在選擇體細(xì)胞型時(shí)要考慮的因素就是體細(xì)胞進(jìn)行“重新設(shè)計(jì)(reprogramming)”的能力。為了便于核質(zhì)對(duì)所有胚胎細(xì)胞系有所貢獻(xiàn)，從而導(dǎo)致胚胎的正常發(fā)育，可采用重新設(shè)計(jì)。培養(yǎng)的胚胎成纖維細(xì)胞(CEF)已被廣泛用于哺乳動(dòng)物，由于其容易培養(yǎng)和遺傳操作，因而產(chǎn)生了很好的結(jié)果。在鳥類體系中，CEFs可用于體細(xì)胞的核轉(zhuǎn)移。另外，胚胎來源的胚盤細(xì)胞(BCs)已被培養(yǎng)，并可以使用。另一個(gè)可用作鳥類核轉(zhuǎn)移平臺(tái)的細(xì)胞類型為鳥的B細(xì)胞。
用鳥B細(xì)胞的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是其能進(jìn)行高水平的重組。這個(gè)能力相當(dāng)重要，因?yàn)樗苁雇庠吹腄NA摻入鳥基因組的過程變得有效得多。從而將對(duì)任何供體細(xì)胞系進(jìn)行的體外修飾摻入到所得到的鳥的基因組中。進(jìn)行測(cè)試，已鑒定出最優(yōu)的細(xì)胞類型。例如，從這些細(xì)胞類型中產(chǎn)生核質(zhì)并將其轉(zhuǎn)移到鳥的細(xì)胞質(zhì)(受體細(xì)胞)。導(dǎo)致最高水平胚胎存活率的細(xì)胞類型可被引入標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)平臺(tái)。
在哺乳動(dòng)物，盡管主要是卵用于核轉(zhuǎn)移，但用卵和受精卵都已成功地進(jìn)行了核轉(zhuǎn)移。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)的核轉(zhuǎn)移程序，一般在引入供體的核之前，將現(xiàn)存的核取出或切除。鳥卵較大，供體核和受體核之間的距離很大，因此不嚴(yán)格要求取出受體細(xì)胞的核。然而，目前優(yōu)選去核。
由于有濃稠的卵黃顆粒，使得在光學(xué)顯微鏡下鳥卵細(xì)胞核的顯現(xiàn)很大程度上無效。因此，目前選擇的鳥卵去核的方法使用了核的熒光標(biāo)記法?？梢允褂靡阎臒晒夂巳玖先鏗oescht 33342(二-苯甲酰胺)和DAPI(4’6-二脒基-2-苯基吲哚)，因?yàn)樗鼈兛梢允购思捌湎嚓P(guān)DNA顯現(xiàn)。
可除去核的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方法；(1)通過玻璃微移液管取出核或(2)用激光切除核。目前，這兩個(gè)用于核微操作的方法都在使用。激光類型和波長可憑經(jīng)驗(yàn)確定。通過任何一種方法使胞質(zhì)中熒光區(qū)域的消失，表明核已被除去。在這個(gè)時(shí)期不僅要取出核DNA，而且優(yōu)選取出紡錘體形成結(jié)構(gòu)。
有許對(duì)因素影響核轉(zhuǎn)移后的發(fā)育，包括要求重構(gòu)胚胎以維持正常的倍數(shù)性。當(dāng)對(duì)一個(gè)開始分化細(xì)胞的核進(jìn)行轉(zhuǎn)移時(shí)，基因表達(dá)的模式將從分化的細(xì)胞型的模式重新設(shè)計(jì)到早期胚胎細(xì)胞型的模式。細(xì)胞周期改變的實(shí)驗(yàn)表明發(fā)生這個(gè)過程的效率受到供體和受體細(xì)胞周期階段的影響。
從對(duì)哺乳動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)表明，在重構(gòu)的胚胎中，當(dāng)DNA開始復(fù)制時(shí)，會(huì)受到供體細(xì)胞和受體細(xì)胞周期階段的影響。由于細(xì)胞質(zhì)中減數(shù)分裂促進(jìn)因子(MPF)的影響，受體細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生更大的影響(Barnes et al.，1993；Campbell et al.，1993)。在復(fù)制期間紡錘體形成時(shí)，MPF的活性增加，在減數(shù)分裂中期II仍保持在高水平。將核轉(zhuǎn)移到含高水平MPF的細(xì)胞質(zhì)時(shí)，不管供體細(xì)胞核周期階段如何，都會(huì)導(dǎo)致核膜的裂解、染色體濃集、核膜的重新形成和DNA復(fù)制等。相反，當(dāng)核轉(zhuǎn)移到具有低水平MPF活性的卵母細(xì)胞時(shí)，核決定是否進(jìn)行DNA復(fù)制(Campbell et al.，1993，1994)。這項(xiàng)工作使我們相信有兩種作用(1)在細(xì)胞周期的特定階段對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行重新設(shè)計(jì)有更大機(jī)會(huì)；(2)轉(zhuǎn)移到相類似細(xì)胞周期階段，會(huì)產(chǎn)生益處。
據(jù)表明，當(dāng)供體細(xì)胞核處于細(xì)胞周期的G0和G1期時(shí)，胚胎的發(fā)育可得到增強(qiáng)。將去核卵母細(xì)胞和處于G0期的乳腺細(xì)胞融合，經(jīng)過發(fā)育得到綿羊多利(Dolly)。同樣，在小鼠中，用處于G0期和G1期的Cumulus細(xì)胞成功的進(jìn)行了體細(xì)胞的核轉(zhuǎn)移(Wakayama，et al，1998)。然而，用非靜止供體細(xì)胞的核產(chǎn)生了克隆牛(Cibelli et al，1998)。這表明，在家禽中成功進(jìn)行核轉(zhuǎn)移的必需條件要憑經(jīng)驗(yàn)確定。處于細(xì)胞周期不同階段的細(xì)胞都可用于確定最佳的實(shí)驗(yàn)方案。供體核遞送可通過供體細(xì)胞和去核卵/受精卵的電融合及直接將供體核注入到去核卵的方式進(jìn)行。由于鳥卵體積大，注射較容易，故將供體核直接注入鳥卵將是核轉(zhuǎn)移的最佳方法。當(dāng)將核轉(zhuǎn)移到減數(shù)分裂中期II停止的卵子時(shí)，一般要求人工活化卵子?？稍诤宿D(zhuǎn)移后的許多時(shí)間間隔進(jìn)行活化，如從核轉(zhuǎn)移后的同時(shí)到幾個(gè)小時(shí)內(nèi)進(jìn)行活化都可以。可通過測(cè)定這些相同的參數(shù)來確定最佳的活化時(shí)間。
可設(shè)計(jì)一個(gè)自動(dòng)高通量系統(tǒng)來執(zhí)行該過程。這有可能完全消除一個(gè)被稱為倍增繁殖(multiplication breeding)的家禽工業(yè)的一方面。典型地，在倍增繁殖方法中，從純種系通過祖父系、父系到最終商用的鳥類，需要幾個(gè)世代。進(jìn)行此過程需要大量的鳥。用核轉(zhuǎn)移進(jìn)行IOA，可從某一只優(yōu)良的鳥繁殖出最終商用的鳥類。凈效應(yīng)是用一種非常高效的繁殖方式產(chǎn)生大量遺傳上優(yōu)良的鳥類。而且，用于核或細(xì)胞轉(zhuǎn)移的細(xì)胞可以無限期的貯存，直到終端用戶需要某一個(gè)特殊的商業(yè)產(chǎn)品為止。另一個(gè)同樣重要的好處就是，可以產(chǎn)生一群完全單性的鳥類。例如烤子雞生產(chǎn)商可能只需要雄性的鳥類，以加快生長速率，然而蛋生產(chǎn)商更傾向于全部要雌鳥。
基因轉(zhuǎn)移本發(fā)明也提供了一種產(chǎn)生含異源核酸的鳥胚胎的方法，包括用本發(fā)明所公開的方法使鳥卵活化，受精，并引入異源核酸到鳥卵中。此處所述的核酸包括(但不局限于)DNA、cDNA、RNA、mRNA及反義RNA。核酸可能是單鏈、雙鏈或多鏈的。異源核酸可以包括鳥類物種的非天然核酸，以及在鳥細(xì)胞或核中被引入位置不能正常表達(dá)的核酸。
當(dāng)鳥卵用IOA的方式活化后，可在發(fā)育胚胎的任何階段進(jìn)行處理，以控制一些或所有胚胎細(xì)胞的遺傳組成。對(duì)鳥的轉(zhuǎn)基因最有價(jià)值的便是早期胚胎。IOA允許了異源核酸的種系轉(zhuǎn)移，因?yàn)檫@允許盡可能早的將異源核酸引入早期鳥胚胎。例如，這種對(duì)發(fā)育中胚胎的遺傳操作可產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因鳥，其包含的遺傳物質(zhì)能用于調(diào)節(jié)內(nèi)源性DNA及其表達(dá)，并產(chǎn)生可制造具有商業(yè)價(jià)值蛋白的細(xì)胞。
按照幾個(gè)已知的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可將某一核酸轉(zhuǎn)移到鳥類基因組。(Harlow and Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1988；Lennette et al.，Manual of Clinical Microbiology，14thEd.，Amer.Soc.For Microbiology，Washington，D.C.，1985；Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，2ndEd.，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，New York，1989；Antisense RNAand DNA，D.A.Melton，Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY(1988)；Freshney，Culture of Animal Cells，A Manual of Basic Technique，2ndEd.Alan R.Liss，Inc.，New York(1987)；Centers for Disease Control Laboratory Manual，U.S.Department of Health，Education，and Welfare Pun.No.79-8375，p.75，Centers for Disease Control，Atlanta，GA；FundamentalVirology，2ndEd.Bernard N.Fields and David M.Knipe，ChiefEds.，Raven PressNew York，1990)。將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到鳥類基因組的例子包括(但不局限于)鳥白血病組織增生病毒(ALV)轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、胚盤細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、原始生殖細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移及核轉(zhuǎn)移等。將異源核酸引入胚胎可在活化事件發(fā)生的同時(shí)進(jìn)行，例如在精子樣品引入卵的同時(shí)或在胚胎發(fā)育的后期進(jìn)行。
目前用來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因鳥的標(biāo)準(zhǔn)方法就是產(chǎn)生包含異源DNA插入片段的復(fù)制缺陷型ALV病毒來源的轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒。因?yàn)榇祟w粒在鳥體內(nèi)沒有復(fù)制能力，故沒有在鳥或人體引起病毒血癥或疾病的危險(xiǎn)。用此處所描述的方法，可將轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒直接引入含有早期鳥胚的產(chǎn)出卵中。例如，可在胚胎上方開一個(gè)孔，直接將轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒引入胚中的胚下腔。然后將開口密封，把鳥卵放于孵卵器中讓其發(fā)育。
另一個(gè)將異源核酸引入鳥類基因組的方法為轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)座子是指能夠在宿主基因組中轉(zhuǎn)座和移動(dòng)的遺傳元件。在鳥類中沒有已知的轉(zhuǎn)座子。然而，實(shí)驗(yàn)表明，從其它來源的轉(zhuǎn)座子，經(jīng)重新構(gòu)建，也能在鳥的基因組中起作用?？蓪⑦@些轉(zhuǎn)座子工程化，作為有用的核酸載體系統(tǒng)，從而將某些基因插入鳥類基因組。
此外，另一個(gè)將異源核酸引入鳥胚胎的方法為胚盤細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移法?？蓮腦期胚胎(產(chǎn)出受精卵的胚胎階段)取得胚盤或其它早期細(xì)胞，可將這些細(xì)胞注回到其克隆、生長和產(chǎn)生嵌合幼鳥的受體胚胎中?！扒逗稀庇坐B由來自兩個(gè)不同遺傳系的細(xì)胞組成。將分離不久的胚盤細(xì)胞引入受到輻射的宿主胚胎，它們具有形成所得到的鳥的所有組織，包括生殖系(產(chǎn)生精子和卵并因此產(chǎn)生下面所有世代的細(xì)胞)的能力，用本領(lǐng)域技術(shù)人員的所有熟知的各種方法，將胚盤細(xì)胞培養(yǎng)并用DNA轉(zhuǎn)染，以試圖產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因禽類。
因此，可將胚盤細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞(ES)注入卵內(nèi)受精的胚胎，以產(chǎn)生嵌合體家禽。然后這些嵌合體家禽經(jīng)過雜交，假定它們具有胚盤或ES細(xì)胞的生殖系轉(zhuǎn)移，可以建立原始的注入細(xì)胞克隆。
此外，原始生殖細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因鳥。隨著發(fā)育胚胎的生長，某些細(xì)胞會(huì)形成生殖系而產(chǎn)生精子和卵。這些原始生殖細(xì)胞(PGCs)遷移到發(fā)育生殖腺的生殖嵴，并處于靜止?fàn)顟B(tài)，直到雛鳥性成熟。一個(gè)進(jìn)行鳥類基因轉(zhuǎn)移的方法就是，分離這些PGCs，對(duì)它們進(jìn)行遺傳操作，并放回正在形成的胚胎，讓其繼續(xù)發(fā)育。這個(gè)技術(shù)性的方法在其發(fā)展程度和潛在應(yīng)用方面可比得上胚盤細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移法。原始生殖細(xì)胞和胚盤細(xì)胞一樣，當(dāng)注入受體胚胎時(shí)，也可促進(jìn)的形成生殖系。
本發(fā)明的另一個(gè)方面包括遞送液體制劑到鳥卵中，以提供關(guān)于個(gè)別雛鳥的基因型狀態(tài)或組成的重要信息。例如，可將DNA和/或RNA探針遞送到鳥胚胎，以便通過性別或其它基因型對(duì)胚胎分類。這些探針特異性結(jié)合其靶序列，以提供關(guān)于鳥類遺傳組成的特異信息。用許多熒光、放射性或化學(xué)發(fā)光分子標(biāo)記探針，可得到用于測(cè)定基因型狀態(tài)的高度可靠的技術(shù)。作為選擇，對(duì)于抗體和其它蛋白質(zhì)，可和報(bào)告分子一樣，以同樣的方式使用。
利用本發(fā)明將核酸摻入單細(xì)胞卵母細(xì)胞和早期胚胎的方法，可將外源DNA摻入所繁殖鳥的所有或大多數(shù)細(xì)胞中。然而，在一個(gè)可選擇的實(shí)施方案中，本發(fā)明也適合將這些核酸和核酸載體遞送到后期的胚胎中。目前，一個(gè)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因家禽的方法包括將病毒顆粒注入到正發(fā)育鳥胚胎的胚下腔中。另一個(gè)應(yīng)用便是鳥胚胎中，某一個(gè)特定基因產(chǎn)物的瞬時(shí)表達(dá)?？梢詫⒑怂嶂苿┻f送到鳥胚以產(chǎn)生基于卵/或動(dòng)物的生物反應(yīng)器系統(tǒng)。蛋白質(zhì)、抗原和抗體也可遞送到胚胎，以影響基因的表達(dá)。
本發(fā)明所描述的卵內(nèi)活化方法也可和其它的卵內(nèi)活化方法結(jié)合使用。例如，可在卵受精后接種胚胎。作為選擇，如果疫苗不會(huì)妨礙胚胎的發(fā)育，可在進(jìn)行卵內(nèi)受精的同時(shí)進(jìn)行接種。
自動(dòng)化IOA可實(shí)行自動(dòng)化，以便使多個(gè)卵同時(shí)受精，如采用注射技術(shù)等。因此，可同時(shí)注射50、100、200、300或更多的卵。本領(lǐng)域技術(shù)人員都清楚，本發(fā)明的方法很容易進(jìn)行大規(guī)模的工業(yè)化操作，以實(shí)現(xiàn)對(duì)新產(chǎn)出鳥卵活化的自動(dòng)化。因此，為了實(shí)現(xiàn)IOA過程的自動(dòng)化，以前用來免疫產(chǎn)出受精卵的方法可進(jìn)行改進(jìn)以引入精子樣品、核，或單性生殖等。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，自動(dòng)化卵處理技術(shù)被世界范圍的許多獨(dú)立發(fā)明者同時(shí)開發(fā)出來?，F(xiàn)今的技術(shù)包括將液體物質(zhì)注入到含胚鳥卵的高通量體系。具體的例子包括注入疫苗以改善所產(chǎn)生鳥的免疫狀態(tài)，注入病毒以制備可用于動(dòng)物和人的疫苗，注入蛋白質(zhì)以影響雛鳥的健康等等。另一個(gè)用于家禽生產(chǎn)的自動(dòng)化體系，可用來對(duì)死亡和存活雛鳥進(jìn)行檢測(cè)，其原理是基于用不同的光源照射，或檢測(cè)卵臺(tái)(eggflat)中兩鄰近鳥卵之間的溫度差別?？偟恼f來，這些技術(shù)代表著當(dāng)今在本領(lǐng)域的發(fā)展?fàn)顟B(tài)。然而，有必要建立一個(gè)更加先進(jìn)的特別適于鳥類繁殖者技術(shù)平臺(tái)，本發(fā)明就是針對(duì)和滿足這一需要。
最近在精子保存方面所取得的技術(shù)進(jìn)展，結(jié)合IOF技術(shù)，使得家禽繁殖工業(yè)朝著更有效的管理模式方面發(fā)展?？蓪⑾挛乃龅膸讉€(gè)重要遺傳技術(shù)結(jié)合起來，創(chuàng)造出真正的多用途平臺(tái)，以實(shí)現(xiàn)家禽繁殖技術(shù)的自動(dòng)化。
為了進(jìn)行IOA操作，例如IOF，如用自動(dòng)化模式，將包括兩個(gè)步驟。第一步，計(jì)算加入機(jī)器的精子樣品中精子細(xì)胞的數(shù)量，或包含供轉(zhuǎn)移物質(zhì)的細(xì)胞或細(xì)胞核的樣品中精子細(xì)胞的數(shù)量。此任務(wù)可用集成的分光光度計(jì)(有時(shí)叫做密度計(jì))完成，類似于市場(chǎng)上ChinoCalifornia公司及其它公司出售的動(dòng)物繁殖系統(tǒng)(AnimalReproduction Systems)。這個(gè)任務(wù)也用流式細(xì)胞儀來完成。從這些儀器分析中所得到的數(shù)據(jù)信息可以傳到中央處理器或其它分析系統(tǒng)，以決定所用精液和精子補(bǔ)充劑(稀釋液)、細(xì)胞或核物質(zhì)的最佳體積。這個(gè)信息被傳送到一個(gè)流體分散裝置，將適量體積的流體分散到卵注射裝置或類似系統(tǒng)的中央流體貯存器中。
第二步，中央處理器激活卵注射裝置，以適當(dāng)?shù)慕嵌?，遞送適量體積的稀釋精子樣品或含某物質(zhì)制劑的細(xì)胞或細(xì)胞核樣品到來受精卵特定的深度，完成IOA過程，如IOF。注射過程包括用管狀打孔器在卵殼上穿孔，插入注射針頭，使其通過卵殼膜及卵黃膜，以遞送樣品制劑。
卵注射裝置設(shè)計(jì)可以類似于工業(yè)上由Embrex，inc.，Merck Inc及其它一些公司制造并生產(chǎn)的設(shè)備。作為例子，在此引用一個(gè)叫做“High Speed Automation Injection System for Avian Embryos”的專利作為參考(U.S.Patent No.4,903,635)。正如專利所揭示的那樣，此設(shè)備為鳥胚胎的高速自動(dòng)化注射系統(tǒng)，可將流體物質(zhì)，尤其是接種用的流體注入鳥卵內(nèi)。此設(shè)備包括吸入裝置，在注射前，可將卵在接觸處的表面支起，而不是向前推。因此，這臺(tái)設(shè)備提供了分離的裝置和設(shè)備用于在卵殼上開口，然后用流體物質(zhì)注射鳥胚胎，或周圍環(huán)境，避免使用針頭或打孔器穿透卵殼并將流體物質(zhì)傳到卵的內(nèi)部。正如本領(lǐng)域所熟知的，本發(fā)明也提出了用一個(gè)針頭穿透卵殼，并遞送流體物質(zhì)。其它一些專利也揭示了將流體物質(zhì)注入卵內(nèi)的方法，包括U.S.Patent Nos.5,900,929，“Method and Apparatus forSelectively Injection of Poultry Eggs”；5,772,342，“OvoAntibiotic and Microbial Treatment to Diminish SalmonellaePopulations in Avians”；5,699,751，entitled“Method and Apparatusfor in Ovo Injection”；5,438,954，entitled“Method and Apparatusfor Early Embryonic in Ovo Injection”；5,339,766，“Method ofIntroducing Material into Eggs During Early EmbryonicDevelopment”；5,176,101，“Modular Injection System for AvianEmbryos”；5,158,038，“Egg Injection Method，Apparatus andCarrier Solution for Improving Hatchability and Disease”；以及5,136,979，“Modular injection system for avian embryos，”所有這些專利僅供參考。在一個(gè)IOF的最簡(jiǎn)單實(shí)施方案中，使用這些設(shè)備時(shí)，用精子代替抗原，將注射的深度調(diào)節(jié)到剛好能完成IOF。
對(duì)于IOA過程，如IOF，可設(shè)計(jì)出能對(duì)送到孵化站后的活化，如受精鳥卵進(jìn)行高通量操作的系統(tǒng)。有利地，本發(fā)明的IOF在直接受精過程中，要求使用比平常少得多的精子，以便在某些繁殖方案中顯著降低所使用的雄鳥的數(shù)量，從而簡(jiǎn)化操作。將現(xiàn)有的雄鳥集中喂養(yǎng)，將產(chǎn)生的足夠新鮮的精液送到孵卵站，使工業(yè)上每年產(chǎn)生的成千上萬的鳥卵受精。所使用的雄鳥越少，繁殖工作者可僅用優(yōu)良的品種進(jìn)行受精，從而在鳥類繁殖上取得更快的遺傳學(xué)進(jìn)步，從而改進(jìn)其品系。另外，通過消除或顯著減少雄鳥的數(shù)量可對(duì)工業(yè)繁殖內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行再合理化。例如，一個(gè)有效得多的商業(yè)孵卵操作方法可直接代替?zhèn)鹘y(tǒng)的孵卵設(shè)施，因?yàn)橹恍枰词芫丫妥銐蛄?。在人工受精方案中，雌性大約要占95-98％，可以不需要手工受精，減少約95％以上和手工受精相關(guān)的勞動(dòng)力。
通過核轉(zhuǎn)移進(jìn)行自動(dòng)活化，人們可進(jìn)一步改進(jìn)鳥卵注射方法使其包含使天然核變得無效的方法。例如用微移液管取出或激光切除天然核或使其變得無效。
除了通過受精等方式對(duì)鳥卵的活化外，本發(fā)明還包括遺傳分析、遺傳操作和繁殖過程。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，這些手段目前是為實(shí)驗(yàn)室使用而設(shè)計(jì)，要求較高的技術(shù)水平，因此，目前不適于低利潤的家禽養(yǎng)殖工業(yè)的常規(guī)使用。正如本發(fā)明所實(shí)現(xiàn)的那樣，許多技術(shù)很適合摻入生產(chǎn)人員以及遺傳學(xué)家和研究人員使用的完全自動(dòng)化的操作平臺(tái)。
本發(fā)明也設(shè)計(jì)了另外一些方法和步驟來遞送各種液體制劑，以便(a)在卵內(nèi)活化如IOF同時(shí)和/或之后影響鳥胚胎內(nèi)基因的表達(dá)；和/或(b)提供有關(guān)鳥胚胎基因型狀態(tài)的重要信息。遞送裝置可以類似上文所述的遞送精液的卵注射裝置。本發(fā)明可以用裝精子的常規(guī)貯液器或獨(dú)立于精子的貯液器，分別用不同的針頭插入卵內(nèi)注射每種流體，或用一個(gè)針頭先后將流體注入卵內(nèi)。
本發(fā)明也企圖引入一種檢測(cè)裝置來進(jìn)行各種基于基因和蛋白質(zhì)的分析。這種裝置的一個(gè)實(shí)施方案就是，用某一波長的光源，如激光，以及相應(yīng)的在鳥卵中差別表達(dá)的染料作為某一基因型或生理狀態(tài)的指示劑。例如，對(duì)于這個(gè)實(shí)施方案，可用熒光標(biāo)記的性別探針、性別連鎖的啟動(dòng)子和表達(dá)體系以及熒光標(biāo)記的性別抗體等來分類鳥卵。
這個(gè)檢測(cè)裝置可以用一個(gè)CCD相機(jī)或其它合適的熒光信號(hào)檢測(cè)器來激活一個(gè)分類和/或鑒定裝置。在另一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)裝置能用放射性的閃爍計(jì)數(shù)器和/或基于化學(xué)發(fā)光的方法達(dá)到以上同樣的目的。然而，在另一個(gè)實(shí)施方案中，系統(tǒng)可以用“基因芯片”，基因微陣列和/或基因宏觀陣列技術(shù)來達(dá)到檢測(cè)的目的，例如由Affymetrix公司生產(chǎn)的基因芯片等。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，按基因型對(duì)鳥分類可用于生產(chǎn)活動(dòng)中。用性別將鳥分類容許生產(chǎn)能力最佳化。即肉仔雞工業(yè)需要雄性，而產(chǎn)卵雞需要雌性。本發(fā)明也使遺傳學(xué)家能夠基于高速的自動(dòng)化鑒定對(duì)鳥卵進(jìn)行遺傳篩選和基因型分析，產(chǎn)生更快的遺傳學(xué)進(jìn)步并開發(fā)出改進(jìn)的家禽品系。
不管用哪種方法對(duì)基因型進(jìn)行分類，另一種設(shè)計(jì)包括將鳥卵分為“活的”或“死的”。在這個(gè)方法中也考慮引入簡(jiǎn)單的光源和/或溫度裝置，如目前由PAS Reform，Breuil和Embrex公司生產(chǎn)的檢測(cè)系統(tǒng)。關(guān)于本發(fā)明所描述的這一方面，引用Embrex公司的專利作為參考(美國專利No.5,900,929)。
和以下所述的分類設(shè)備相結(jié)合，本發(fā)明注射提供預(yù)定指標(biāo)和其檢測(cè)方法的流體制劑，從而建立一個(gè)用于各種分子檢測(cè)應(yīng)用的多用途平臺(tái)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，引入了液體取樣裝置，以從鳥卵中獲取液體樣品。這個(gè)裝置用一個(gè)真空管和取樣針頭相通，針頭的尖端反復(fù)被各個(gè)鳥卵的液體部分包圍，然后將液體取出。作為選擇，此裝置也可用類似PE Biosystems公司的310基因分析儀中所使用的電滲透梯度將流體樣品吸到取樣毛細(xì)管中。
為了最大程度利用以上所述裝置，有必要在某些時(shí)候用許多技術(shù)來放大信號(hào)。一個(gè)放大檢測(cè)信號(hào)的實(shí)施方案就是，引入一個(gè)集成熱循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)行DNA擴(kuò)增，如由PE Biosystems，Hybaid MJ Research及其它公司生產(chǎn)的熱循環(huán)系統(tǒng)等。這個(gè)裝置對(duì)于用基因芯片、微陣列、宏觀陣列進(jìn)行基因型分析時(shí)非常有用，即使不是必需的。
為了獲得分析樣品更詳細(xì)的數(shù)據(jù)信息，可根據(jù)大小、分子量、電荷或其它的化學(xué)/物理性質(zhì)分離樣品分子。這種分離裝置的一個(gè)實(shí)施方案就是電泳單位。例如可用一個(gè)類似于PE Biosystems公司生產(chǎn)的310基因分析儀中所使用的集成毛細(xì)管電泳單位來分離核酸和蛋白質(zhì)。本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案還可用于對(duì)來自初級(jí)飼養(yǎng)者的家禽品系的鳥卵進(jìn)行高通量基因型分析。
最后，從以上實(shí)施方案獲得的數(shù)據(jù)，可用軟件在中央處理器或其它設(shè)備中進(jìn)行單個(gè)的或集中的處理，以評(píng)價(jià)卵在離開加工線時(shí)的價(jià)值和狀態(tài)。經(jīng)過評(píng)價(jià)后的卵可以標(biāo)記、分類，以便輸送到孵化籃或孵化盤進(jìn)行孵化?？捎妙愃朴贖ewlett Packard和Epson打印機(jī)上的噴墨裝置對(duì)鳥卵進(jìn)行標(biāo)記。鳥卵的分類和輸送可自動(dòng)進(jìn)行，用吸杯(suctioncup)和傳送帶，將大批裝卵的盤子從設(shè)備體輸送到等待的運(yùn)卵車上。該設(shè)備的這部分的裝置可設(shè)計(jì)為類似于Breuil，Kuhl Corporation，Pas Reform和Embrex等公司制造的生產(chǎn)系統(tǒng)。
本發(fā)明所描述的設(shè)備平臺(tái)也得益于某些現(xiàn)有的基因/蛋白質(zhì)分析性能。將這些分析性能直接引入平臺(tái)，可使這些方法以高速度和在工業(yè)規(guī)模上進(jìn)行。本發(fā)明也描述了將這些分析性能直接用于商業(yè)化家禽工業(yè)的例子。
實(shí)施例下面所列的實(shí)施例在于給本領(lǐng)域技術(shù)人員徹底公開和描述本發(fā)明所要求保護(hù)的方法是如何進(jìn)行的，并且只是作為本發(fā)明的舉例，并不限制發(fā)明者所認(rèn)為的本發(fā)明的范圍。本發(fā)明努力確保數(shù)字的準(zhǔn)確性(例如數(shù)量，溫度等)，但也應(yīng)考慮一些錯(cuò)誤和偏差。除非特別指出，份數(shù)是重量份，溫度的單位為°F，壓力為大氣壓或接近大氣壓。
2.在受精前1小時(shí)內(nèi)，在同一個(gè)上午，從4只相隔絕的Rock雄雞獲得精液，裝入Vacutainer小瓶中。
3.將4只雄雞的精液集中起來，和1ml的Avidiluent混合。
4.用1號(hào)，22號(hào)針頭，將精液和Avidiluent混合液吸入1ml的注射器中。
5.用針頭在卵殼大而鈍的末端開一個(gè)口，并將針頭與卵殼表面成15角通過開口。
6.將針頭通過氣室，直到其尖端剛好穿透包圍卵黃和胚盤的膜為止。
7.將一滴0.05ml的精子樣品注射到毗鄰膜的卵黃的表面。
8.將附在注射器上的針頭從卵中取出。
9.用一小片卵殼將注射器開的小口補(bǔ)上，用象Elmer’s glue的膠水將補(bǔ)丁粘到卵殼上。
10.將鳥卵放在商用分度調(diào)節(jié)器中孵化，大約第1-18天時(shí)溫度維持為99.5°F，濕度為80％。按照本領(lǐng)域所熟知及商用調(diào)節(jié)器所用的方法翻動(dòng)卵。
11.到19天時(shí)，將卵轉(zhuǎn)到商用的孵化器中，溫度維持為98.5°F，濕度為80％，直到孵出雛雞。
按照本發(fā)明的方法，對(duì)43個(gè)卵受精，10天后，用常規(guī)的光源照射法檢測(cè)哪些卵已成功受精。43個(gè)中的35個(gè)卵已成功受精，其中32個(gè)被成功孵化成雛雞，除一只外，其余都是健康的。因此，用本發(fā)明的方法，所產(chǎn)的43個(gè)卵中，72％能成功孵出存活雛雞。
2.將從雄性Black Giant收集到的精液，立即用稀釋劑按50∶50進(jìn)行稀釋。
3.在精子收集后的20分鐘內(nèi)，將精子和卵送到實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
4.將卵分成兩組，實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組，每組135個(gè)。
5.按照以前所述方法，用10μl的稀釋精液注射實(shí)驗(yàn)用卵。
6.陰性對(duì)照組不注射。
7.如前所述，注射后的卵用聚硅酮密封劑密封，放入孵卵器孵化。
8. 5天后檢查生育力，并作記錄。
9.在實(shí)驗(yàn)組的135個(gè)卵中，有35個(gè)(24％)具有生育能力。對(duì)照組中沒有卵有發(fā)育的跡象。
1.在早上收集270個(gè)新產(chǎn)的卵。
2.卵被分成兩組，實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組，每組135個(gè)。
3.通過卵殼和殼膜開一個(gè)2-3mm的孔，以便能看見卵黃。
4.輕輕的“刺”和/或穿透包圍卵黃和胚盤的膜，注意不要破壞卵黃。(作為選擇，可通過插入25號(hào)注射器針頭穿透卵殼并進(jìn)入卵黃，從而同時(shí)在卵殼上開口及穿透卵黃膜)。
5.將處理過的卵用密封劑密封，并放入孵卵器孵化。
6.在第5天時(shí)檢查卵的發(fā)育情況，并在放回孵卵器前記錄發(fā)育比例。
7.允許卵繼續(xù)發(fā)育，直到孵出雛鳥，記錄好孵化比例和健康條件。
結(jié)果1.將卵黃破壞的卵丟棄，剩下131個(gè)實(shí)驗(yàn)卵和135個(gè)陰性對(duì)照卵。
2. 5天后檢查發(fā)育情況，131個(gè)卵中，有7個(gè)(5％)被刺穿的卵有明顯胚胎發(fā)育的跡象。
3. 7個(gè)胚胎發(fā)育的鳥卵中，有5個(gè)孵出了正常健康的雛鳥。
4.陰性對(duì)照組中，沒有胚胎發(fā)育的現(xiàn)象。
在整個(gè)應(yīng)用中，參考了各種文獻(xiàn)。這些文獻(xiàn)的公開，以及本發(fā)明所引用的參考文獻(xiàn)，都完整引入這項(xiàng)應(yīng)用中，以便能更全面的描述有關(guān)本發(fā)明領(lǐng)域的現(xiàn)狀。
本領(lǐng)域技術(shù)人員都知道，對(duì)本發(fā)明所作的任何修飾和改變都是允許的，只要不偏離本發(fā)明的范圍和精神。本領(lǐng)域技術(shù)人員考慮在此公開的說明書和實(shí)施應(yīng)明白本發(fā)明的其它具體實(shí)施方案。本發(fā)明所提供的說明和實(shí)施例僅是舉例性的，本發(fā)明真正的范圍和精神由權(quán)利要求指出。
權(quán)利要求
1.一種從產(chǎn)出的未受精殼內(nèi)鳥卵中產(chǎn)生存活雛鳥的方法，其中卵包含由膜包圍的卵黃和卵子，該方法包括活化卵子及孵化鳥卵直至孵出雛鳥。
2.權(quán)利要求1的方法，其中，鳥卵來自雞。
3.權(quán)利要求1的方法，其中，鳥卵來自火雞。
4.權(quán)利要求1的方法，其中，多個(gè)卵基本上被同時(shí)活化。
5.權(quán)利要求4的方法，其中，至少20個(gè)卵被活化。
6.權(quán)利要求1的方法，其中，活化是通過誘導(dǎo)鳥卵的單性生殖進(jìn)行的。
7.權(quán)利要求6的方法，其中，單性生殖是通過穿透卵黃膜進(jìn)行誘導(dǎo)的。
8.權(quán)利要求7的方法，其中，穿透使用針頭完成的。
9.權(quán)利要求1的方法，其中，活化是通過遞送含有置于生理上可接受的載體中的鳥類精子的精子樣品而完成的。
10.權(quán)利要求9的方法，其中，卵和精子來自同一物種的成員。
11.權(quán)利要求9的方法，其中，載體為精液。
12.權(quán)利要求9的方法，其中，載體為稀釋的精液。
13.權(quán)利要求12的方法，其中，稀釋的精液含有Avidiluent。
14.權(quán)利要求10的方法，其中，精子樣品被遞送到包圍卵黃的膜附近。
15.權(quán)利要求14的方法，其中，精子樣品被遞送到位于胚盤附近的膜區(qū)域附近。
16.權(quán)利要求10的方法，其中，精子樣品被遞送到膜的下面。
17.權(quán)利要求10的方法，其中，將膜進(jìn)行處理，以便允許精子使卵受精。
18.權(quán)利要求10的方法，其中，鳥類物種選自雞、鵪鶉、鴨、火雞、雉、鴕鳥、鵝及美洲鴕。
19.權(quán)利要求18的方法，其中，鳥類物種為雞。
20.權(quán)利要求10的方法，其中，精子樣品包含從一只以上鳥獲得的精子混合物。
21.權(quán)利要求10的方法，其中，通過穿透卵殼在卵殼上開口，將精子樣品引入卵中，從而完成精子樣品的遞送。
22.權(quán)利要求21的方法，其中，用針頭完成穿透和引入。
23.權(quán)利要求21的方法，其中，開口被密封。
24.權(quán)利要求23的方法，其中，開口用粘合劑密封。
25.權(quán)利要求10的方法，其中，多個(gè)卵基本同時(shí)受精。
26.權(quán)利要求25的方法，其中，至少使20個(gè)卵受精。
27.權(quán)利要求25的方法，其中，至少使50個(gè)卵受精。
28.權(quán)利要求10的方法，其中，卵為雞卵，卵的孵化時(shí)間持續(xù)21-23天。
29.權(quán)利要求10的方法，其中，孵化期的約1-18天的孵化溫度為約99.5°F，從第19天起至孵出雛鳥的孵化溫度為約98.5°F。
30.權(quán)利要求10的方法，其中，從孵化的第一天直到孵出雛鳥，采用80％的濕度。
31.權(quán)利要求10的方法，進(jìn)一步包括在孵化期接種胚胎。
32.使產(chǎn)出的殼內(nèi)鳥卵受精的方法，其中該卵包含由膜所包圍的卵黃，該方法包括a)獲得精子樣品，其中含有置于生理上可接受的載體中的鳥類精子；和b)將精于樣品遞送到卵中，以便使卵受精。
33.權(quán)利要求32的方法，其中，卵和精子來自同一物種的成員。
34.權(quán)利要求32的方法，其中，載體為精液。
35.權(quán)利要求32的方法，其中，載體為稀釋的精液。
36.權(quán)利要求35的方法，其中，稀釋的精液包含Avidiluent。
37.權(quán)利要求32的方法，其中，精子樣品被遞送到包圍卵黃的膜附近。
38.權(quán)利要求37的方法，其中，精子樣品被遞送到位于胚盤附近的膜區(qū)域附近。
39.權(quán)利要求32的方法，其中，精子樣品被遞送到膜的下面。
40.權(quán)利要求32的方法，其中，進(jìn)一步包括處理膜，以便增加受精。
41.權(quán)利要求33的方法，其中，鳥類物種選自雞、鵪鶉、鴨、火雞、雉、鴕鳥、鵝及美洲鴕。
42.權(quán)利要求41的方法，其中，鳥類物種為雞。
43.權(quán)利要求32的方法，其中，精子樣品包含從一只以上鳥獲得的精子混合物。
44.權(quán)利要求32的方法，其中，通過穿透卵殼在卵殼上開口，將精子樣品引入卵中，從而完成精子樣品的遞送。
45.權(quán)利要求44的方法，其中，用針頭完成穿透和引入。
46.權(quán)利要求44的方法，其中，開口被密封。
47.權(quán)利要求46的方法，其中，用粘合劑密封開口。
48.權(quán)利要求32的方法，其中，多個(gè)卵基本同時(shí)受精。
49.權(quán)利要求48的方法，其中，至少使20個(gè)卵受精。
50.權(quán)利要求48的方法，其中，至少使50個(gè)卵受精。
51.一種使殼內(nèi)雞卵受精的方法，其中，該卵包含由膜包圍的卵黃，該方法包括a)獲得置于生理上可接受的載體中的雞精子樣品；和b)將精子樣品遞送到卵內(nèi)，以便使卵受精。
52.一種使殼內(nèi)雞卵受精的方法，其中，該卵包含由膜包圍的卵黃，該方法包括a)獲得稀釋的雞精子；和b)將稀釋的精子遞送到卵內(nèi)，以使卵受精。
53.一種使殼內(nèi)雞卵受精的方法，其中，該卵包含由膜包圍的卵黃，該方法包括a)獲得稀釋的雞精子；和b)通過穿透卵殼，將稀釋的精子引入卵內(nèi)，從而將稀釋精子遞送到卵內(nèi)。
54.一種使殼內(nèi)雞卵受精的方法，其中，該卵包含由膜包圍的卵黃，該方法包括a)獲得稀釋的雞精子；和b)通過穿透卵殼，將稀釋的精子引入卵內(nèi)，從而將稀釋的精子遞送到卵中胚盤附近的膜區(qū)域附近。
55.一種使產(chǎn)出的殼內(nèi)雞卵受精，并孵出存活雛雞的方法，其中卵包含由膜包圍的卵黃，該方法包括將置于生理上可接受的載體中的雞精子樣品遞送到卵內(nèi)，以便使卵受精并孵化卵直到孵出雛雞。
56.一種使產(chǎn)出的殼內(nèi)雞卵受精，并孵出存活雛雞的方法，其中卵包含由膜包圍的卵黃，該方法包括將稀釋雞精子遞送到卵內(nèi)，以便使卵受精并孵化卵直到孵出雛雞。
57.一種使產(chǎn)出的殼內(nèi)雞卵受精，并孵出存活雛雞的方法，其中卵包含由膜包圍的卵黃，該方法包括通過穿透卵殼并將稀釋精子引入卵內(nèi)從而將稀釋的雞精子遞送到卵內(nèi)，以便使卵受精并孵化卵直到孵出雛雞。
58.一種使產(chǎn)出的殼內(nèi)雞卵受精，并孵出存活雛雞的方法，其中卵包含由膜包圍的卵黃，該方法包括通過穿透卵殼并將稀釋精子引入卵內(nèi)從而將稀釋的雞精子遞送到卵中胚盤附近的膜區(qū)域附近，以便使卵受精并孵化卵直到孵出雛雞。
59.一種產(chǎn)出的鳥卵，其中包含細(xì)胞數(shù)少于30,000的天然胚胎，其中胚胎能發(fā)育成存活雛鳥。
60.權(quán)利要求59的卵，其中，胚胎細(xì)胞數(shù)少于20,000。
61.權(quán)利要求59的卵，其中，胚胎細(xì)胞數(shù)少于10,000。
62.權(quán)利要求59的卵，其中，胚胎為受精卵。
63.權(quán)利要求59的卵，其為雞卵。
64.一種產(chǎn)出的雞卵，其中包含細(xì)胞數(shù)少于30,000的天然胚胎，其中胚胎能發(fā)育成存活雛雞。
65.一種被產(chǎn)出的雞卵，包含天然受精卵。
66.一種被產(chǎn)出的鳥卵，包含細(xì)胞數(shù)少于30,000的胚胎，其中，胚胎能發(fā)育成存活雛鳥，并且其中卵殼上有一個(gè)小于4厘米的開口。
67.權(quán)利要求66的卵，其中，胚胎細(xì)胞數(shù)少于20,000。
68.權(quán)利要求66的卵，其中，胚胎細(xì)胞數(shù)少于10,000。
69.權(quán)利要求66的卵，其中，胚胎是一個(gè)受精卵。
70.權(quán)利要求67的卵，其中，開口被密封。
71.權(quán)利要求67的卵，其中，開口小于1厘米。
72.權(quán)利要求67的卵，其中，開口小于5毫米。
73.一種被產(chǎn)出的，包含胚胎的雞卵，胚胎的細(xì)胞數(shù)少于30,000，其中，胚胎能發(fā)育成存活雛雞，并且其中卵殼上有一個(gè)小于4厘米的開口。
74.一種被產(chǎn)出的，包含胚胎的雞卵，胚胎細(xì)胞數(shù)少于20,000，其中，胚胎能發(fā)育成存活雛雞，并且其中卵殼上有一個(gè)小于1厘米的開口。
75.一種被產(chǎn)出的，包含受精卵的雞卵，其中，受精卵能發(fā)育成存活雛雞，并且其中卵殼上有一個(gè)小于4厘米的開口。
76.一種被產(chǎn)出的，包含受精卵的雞卵，其中，受精卵能發(fā)育成存活雛雞，并且其中卵殼上有一個(gè)小于1厘米的開口。
77.一種由權(quán)利要求9的方法產(chǎn)生的卵，其中，該卵含有一個(gè)受精卵。
78.一種被產(chǎn)出的，包含天然卵黃和細(xì)胞數(shù)少于30,000的胚胎的雞卵，其中，胚胎能發(fā)育成存活雛雞。
79.一種被產(chǎn)出的，包含天然卵黃和細(xì)胞數(shù)少于20,000的胚胎的雞卵，其中，胚胎能發(fā)育成存活雛雞。
80.一種被產(chǎn)出的，包含天然卵黃和細(xì)胞數(shù)少于10,000的胚胎的雞卵，其中，胚胎能發(fā)育成存活雛雞。
81.一種產(chǎn)生含異源核酸的鳥胚胎的方法，此方法包括將異源核酸引入由權(quán)利要求1的方法產(chǎn)生的鳥卵中。
82.一種產(chǎn)生含異源核酸的鳥胚胎的方法，此方法包括將異源核酸引入由權(quán)利要求9的方法產(chǎn)生的鳥卵中。
83.權(quán)利要求81的方法，其中，異源核酸編碼藥物蛋白、抗原、激素或抗體。
84.權(quán)利要求82的方法，其中，異源核酸編碼藥物蛋白、抗原、激素或抗體。
85.權(quán)利要求81的方法，其中，異源核酸包含鳥白血病病毒衍生的轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒。
86.權(quán)利要求81的方法，其中，異源核酸編碼一種蛋白質(zhì)。
87.權(quán)利要求81的方法，其中，異源核酸被穩(wěn)定整合到鳥基因組中。
全文摘要
本發(fā)明涉及鳥類繁殖領(lǐng)域。具體地本發(fā)明提供一種在殼內(nèi)活化卵的方法。本發(fā)明也提供孵出了存活雛鳥的殼內(nèi)活化卵的方法。
文檔編號(hào)A01K67/02GK1423521SQ01808067
公開日2003年6月11日 申請(qǐng)日期2001年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月15日
發(fā)明者A·沃藤, T·坎特雷爾 申請(qǐng)人:Ovo生物科學(xué)公司