專利名稱：色赤楊聯(lián)合共生體的構(gòu)建方法
技術領域：
本發(fā)明涉及非豆科固氮樹木聯(lián)合共生體，具體地說是色赤楊聯(lián)合共生體的構(gòu)建方法。
背景技術：
氮素是組成蛋白質(zhì)的主要元素，是植物生長所必需的大量營養(yǎng)元素?？諝庵须m含有近80％的氮氣，但并不能被高等植物直接吸收利用，人工合成氮素化肥的能源耗費巨大，不合理的過量施用帶來的環(huán)境污染問題也日趨嚴重，人們逐漸認識到農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)完全依賴化肥終非良策，因此生物固氮的研究倍受關注。在貧瘠的土壤中生物固氮的最經(jīng)常的限制因素是磷元素，這是因為磷元素在參與生物界的物質(zhì)循環(huán)中，只有在無機磷和有機磷之間的轉(zhuǎn)化，而不發(fā)生氧化還原反應，而且磷元素在無人為活動參與的情況下總是單向流動的，生物體中的有機磷經(jīng)分解后形成不溶性無機磷酸鹽在土壤中沉積，在被河流帶入海洋，不參與陸地上的磷循環(huán)。而與植物共生的菌根真菌可以通過根外菌絲的形成，增加植物與土壤的接觸點，擴大吸收面積，縮短磷的擴散距離(文獻1Hattingh，M.J.，Gray，L.E.，Gerdemsnn，J.W.1973.Uptakeand translocation of 32 P-labelled phosphate to onion roots by endomycorrhizal fungi，Soil Sci.5456～63；文獻2Nye P.H，Tinker，P.B.1977.Solute movement in thesoil-root system，OxfordBlackwell Scientific Publications.；文獻3Rhode，L.H andJ.W.Gerdemann.1978.Translocation of calcium and phosphate by external hyphae ofVesicular-arbuscular mycorrhizae，Soil Sci.126125～126)，從而提高宿主對磷素的吸收，改善植物營養(yǎng)狀況，促進植物生長(文獻4Raju，P.S.，Clark，R.B.，Ellis，J.R..et al，1990.Effects of species of VAM fungi on growth and mineraluptake of sorghum at different temperatures，Plant Soil.121165～170；文獻5Sieverding，E.T，1983.Influence of Soil moistre regime on VA-mycorrhiza.H.H.Effects of soil temperature and water regime on growth，nutrient uptake and waterutilization of Eupatorium odoratum L.Z.Acker and Pflanzenbau.15256～57)。菌根真菌與植物形成的共生體菌根還可分泌生長素、抗生素及一些酶提高植物的抗逆性，使菌根植物在貧瘠土壤中生存。
由于Frankia具有對宿主的侵染范圍寬，固氮活性比較強和對氧氣不敏感等特性，在生物固氮研究中對Frankia菌的研究將更為重要；而且非豆科固氮植物幾乎全部為木本，這些樹種有很強的抗逆性，分布廣、適應性強，因而在森林經(jīng)營中應用這類植物的生物潛力是相當大的，非豆科樹木共生固氮體系抗逆性強，具有耐干旱、耐鹽堿、耐低PH、耐水濕等特點，且分布廣，資源豐富，因此開展Frankia-非豆科樹木聯(lián)合共生體系的理論與應用研究，不僅對豐富和發(fā)展聯(lián)合共生理論具有重要意義，而且在加速樹木生長，解決農(nóng)村資源短缺，減少水土流失，改良土壤和改善生態(tài)環(huán)境等方面將產(chǎn)生重大的經(jīng)濟和生態(tài)環(huán)境效益。
非豆科固氮樹種-色赤楊，是榿木屬的一個種，又稱遼東榿木，它廣泛分布于東北三省及山東等省份，可生長于海拔200-1500米的山坡林中，它具有生長快、耐瘠薄、萌蘗性強、更新快等特點，是三北地區(qū)重要墾荒先鋒樹種；而且它耐火性較強，是優(yōu)良的防火樹種，具有較高的應用價值。
已有研究表明聯(lián)合共生體中菌根菌與共生固氮菌之間存在著相互促進作用，尤其是菌根菌對固氮菌的固氮作用具有明顯的增效作用，菌根的存在促進了宿主植物的生長，改善了植物根際的微生態(tài)環(huán)境；但是這類研究基本上是限于VA菌之間或外生菌之間，并且多停留在現(xiàn)象的描述上，并未在純培養(yǎng)條件下進行，就將其歸功于雙接種的增效作用，這種盲目性的結(jié)論必然導致不能最好地利用固氮植物資源和菌根技術，發(fā)揮固氮植物與微生物共生的優(yōu)勢作用效果不夠理想，對脆弱地帶的生態(tài)恢復效果欠佳；并且不同的固氮樹種需要適宜的不同的菌根菌、不同的固氮菌，它們不同的組合其增效作用明顯不同，那么選擇出不同宿主樹木適宜的不同菌根菌與共生固氮菌顯得尤為重要；因為共生是一種雙向選擇過程，它們需要彼此相互適應，如果彼此間不能相互協(xié)調(diào)，反而會抑制植物生長。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種相互協(xié)調(diào)的適宜的菌根菌、共生固氮菌與色赤楊聯(lián)合共生體的構(gòu)建方法。
為實現(xiàn)上述目的本發(fā)明所采用的技術方案為聯(lián)合共生體的構(gòu)建方法，將菌根菌、固氮菌與共生固氮植物相結(jié)合，以共生固氮為核心，將純培養(yǎng)條件下的觀察測試與放大規(guī)模的田間模擬相結(jié)合，針對不同的固氮植物選取相應的菌種進行聯(lián)合接種，以增強宿主植物與微生物間的親合力；具體操作過程如下(1)共生菌種的選取a.在選定固氮樹種色赤楊分布的貧瘠山區(qū)，隨機選取至少3處不同地塊的樹齡在5年以上的樹種根系樣品進行外部形態(tài)觀測和形態(tài)解剖學觀察，確定其VA菌根菌和/或外生菌根菌的感染情況；VA菌根菌為Glomus intraradices根內(nèi)球囊霉，Glomus macrocarpum大果球囊霉，Glomus mosseae摩西球囊霉，Glomus tortuosum扭形球囊霉，Gigaspora gigantea大巨孢囊霉，Gigaspora gregaria集生巨囊霉，Acaulosporascrobilata無梗囊霉；
外生菌根菌為Lactaria insulsus劣味乳菇，Hebeloma masophaeum毛邊滑銹傘，Russula adusta黑菇，Hymenogaster alnicola赤楊須腹菌，Lactariusobscultatus暗色乳菇；；b.依據(jù)菌根感染強度和固氮結(jié)瘤量，確定共生菌與色赤楊樹種的親合力，選定該樹種根際中的發(fā)育狀態(tài)較優(yōu)的菌種類型，并在每一不同地塊多點取樣，于其根際中分離出VA菌根菌和/或外生菌根菌，弗蘭克氏放線菌，進行菌種擴繁培養(yǎng)；弗蘭克氏放線菌At4，Ahp1，Ahp3；c.在純培養(yǎng)條件下，將分離培養(yǎng)好的菌種單接和組合搭配接種，確定共生體形成效應的回接試驗，進一步對上述發(fā)育狀態(tài)較優(yōu)的菌種類型進行驗證，確定優(yōu)勢菌種和優(yōu)勢菌種組合；(2)共生體構(gòu)建用上述所選優(yōu)勢菌種組合對相同固氮樹種色赤楊進行聯(lián)合接種，構(gòu)建成聯(lián)合共生體，優(yōu)勢菌種組合為VA菌根菌、外生菌根菌及分離于固氮樹種根際中的固氮菌。
本發(fā)明以分離于色赤楊林下的Glomus屬VA菌根真菌與外生菌根劣味乳菇菌和宿主植物為色赤楊的弗蘭克氏放線菌共同接種于色赤楊形成色赤楊聯(lián)合共生體。
其中所述劣味乳菇可用黑菇代替。
本發(fā)明選取優(yōu)勢菌種中VA菌根菌為Glomus intraradices根內(nèi)球囊霉和/或Glomus mosseae摩西球囊霉；外生菌根菌為Lactaria insulsus劣味乳菇和/或Russula adusta黑菇；固氮菌為弗蘭克氏放線菌At4和/或Ahp1。
本發(fā)明選取優(yōu)勢菌種組合為Glomus intraradices根內(nèi)球囊霉，Lactariainsulsus劣味乳菇，弗蘭克氏放線菌At4。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點1.本發(fā)明接種VA菌根菌、外生菌根菌及分離于色赤楊根際中的固氮菌形成的色赤楊聯(lián)合共生體效果優(yōu)于雙接種和單接種，以此為理論依據(jù)能更好地應用于造林生產(chǎn)實踐，又能發(fā)揮它們之間的促生優(yōu)勢；非豆科固氮樹木色赤楊有很強的抗逆性，而且在其感染VA菌和外生菌菌根后可極大限度地提高宿主的抗貧瘠、抗重金屬毒害、抗極端濕度溫度、抗極端PH值等能力；在森林經(jīng)營中發(fā)揮色赤楊的生物潛力意義巨大。
2.本發(fā)明接種VA菌根菌、外生菌根菌及分離于色赤楊根際中的固氮菌形成的色赤楊聯(lián)合共生體增強宿主植物色赤楊的適應性，能夠較好地應用于今后的造林引種、育種、逆境條件下的造林與復墾；同時在促進植物生長，植物病蟲害的防治等方面都有很好的應用前景；能更好地恢復和重建農(nóng)林生態(tài)系統(tǒng)，發(fā)揮色赤楊的共生優(yōu)勢。
3.本發(fā)明豐富和發(fā)展聯(lián)合共生理論，在森林生態(tài)系統(tǒng)中有較大的應用潛力，在加速樹木生長，解決農(nóng)村資源短缺(即木料、燃料、肥料等)，減少水土流失，改良土壤和改善生態(tài)環(huán)境等方面將產(chǎn)生重大的經(jīng)濟和生態(tài)環(huán)境效益。
4.本發(fā)明為生物適應貧瘠環(huán)境提供有效對策，增加其對不良環(huán)境的適應能力；本發(fā)明通過純培養(yǎng)驗證了色赤楊優(yōu)良性狀的發(fā)揮優(yōu)劣與其同時受菌根侵染和結(jié)瘤有關，以聯(lián)合共生生態(tài)效應為主干，創(chuàng)建出構(gòu)建色赤楊聯(lián)合共生體優(yōu)化組合的應用技術。
具體實施例方式
聯(lián)合共生體的構(gòu)建方法，將菌根菌、固氮菌與共生固氮植物相結(jié)合，以共生固氮為核心，將純培養(yǎng)條件下的觀察測試與放大規(guī)模的田間模擬相結(jié)合，針對不同的固氮植物選取相應的菌種進行混合接種，以增強宿主植物與微生物間的親合力；一.具體操作過程如下共生菌種的選取在選定固氮樹種分布的貧瘠山區(qū)，隨機選取3處不同地塊的樹齡在5年以上的樹種根系樣品進行外部形態(tài)觀測和形態(tài)解剖學觀察，確定其VA菌根菌和/或外生菌根菌的感染情況；依據(jù)菌根感染強度和固氮結(jié)瘤量，確定共生菌與該樹種的親合力，選定該樹種根際中的發(fā)育狀態(tài)較優(yōu)的菌種類型，并在每一不同地塊多點取樣，于其根際中分離出VA菌根菌和/或外生菌根菌，根瘤菌或弗蘭克氏放線固氮菌，進行菌種擴繁培養(yǎng)；在純培養(yǎng)條件下，將分離培養(yǎng)好的菌種單接和組合搭配接種，確定共生體形成效應的回接試驗，進一步對上述發(fā)育狀態(tài)較優(yōu)的菌種類型進行驗證，確定優(yōu)勢菌種和優(yōu)勢菌種組合；(一)材料與方法1.供試菌株(1)VA菌根真菌采用VA菌根真菌的孢子為接種菌劑。內(nèi)生孢子分離于色赤楊林下根際土壤中(土深約10厘米)，主要為Glomus屬，以三葉草為宿主植物進行盆載擴繁備用。
(2)外生菌根真菌選用三種外生菌根真菌91#(E1)、94#(E2)、10#(E3)。
表1.

(3)弗蘭克氏放線菌選用的三種弗蘭克氏放線菌菌株N1(At4)、N2(Ahp1)、N3(Ahp3)。
表2.

(二)試驗方法1.色赤楊種子的處理當年采集的色赤楊種(低溫保存)，在清水中浸泡24小時，濾去漂浮在水面上的不成熟種子，用0.15％HgCl溶液消毒一分鐘，再用無菌水反復沖洗干凈。將種子均勻鋪在濕潤的沙布上，放入培養(yǎng)皿中，蓋嚴。移入恒溫箱(28℃)內(nèi)催芽一周左右，待種子萌芽后進行播種。
2.基質(zhì)配置及用量培養(yǎng)基質(zhì)為珍珠巖、泥碳分別過2mm篩，珍珠巖取篩上大粒，泥碳取下面粒性均一的碎屑，珍珠巖泥碳為按7∶1的質(zhì)量比用M.M.N營養(yǎng)液拌料，基質(zhì)與營養(yǎng)液固液比為1∶2.8，將上述拌好的基質(zhì)用塑料布蒙2小時，待水分充分滲透后，將基質(zhì)裝入500毫升三角瓶，每瓶裝400毫升，高壓滅菌1.5小時。
3.接種過程(1)接入外生菌根真菌采用固體菌劑，培養(yǎng)基質(zhì)為麩皮和木屑(1∶4)；稱取適量外生菌根真菌固體菌劑，均勻地鋪開在基質(zhì)表面，然后在覆蓋2厘米厚的基質(zhì)。
(2)接入VA菌根菌先將濕篩傾析法分離的內(nèi)生孢子在消毒液中消毒，用無菌水清洗干凈后轉(zhuǎn)移到無菌的濾紙片(3厘米*3厘米)將孢子連同濾紙片一同接入基質(zhì)內(nèi)以保證孢子的集中分布，再覆蓋2厘米基質(zhì)。
(3)播種挑選萌芽整齊生長良好的種子播入接菌的基質(zhì)中，然后覆蓋2厘米基質(zhì)，于大三口瓶口蓋上口徑5厘米的塑料小杯，置于培養(yǎng)室中暗光室溫條件培養(yǎng)，三至五天后小苗萌發(fā)，給予人工光照。
(4)接入弗蘭克氏菌弗蘭克氏菌在BAP培養(yǎng)液28℃下?lián)u瓶培養(yǎng)，繁殖足夠的菌體，將菌體用無菌水離心洗滌(1000r/m，5-10min)，無菌勻漿后稀釋制成菌懸液作為接種菌劑，每100株菌苗接種離心后菌體1毫升，小苗長出兩片子葉后接入放線菌；接種時先將離心后菌體勻漿稀釋，在小苗根部鉆孔，將菌液接入小孔中以保證菌液分布在色赤楊小苗的根際，接種后用基質(zhì)覆蓋小孔。
其中以不接任何菌種的植株作為對照組→CK，其它生長條件與接菌組相同。
接菌組合見表3.
表3.

兩個月后將小苗置于自然光下，輔以人工光照，每月澆20-30毫升無菌水每瓶，在小苗長至瓶口時打開杯蓋。
(5)培養(yǎng)6個月后進行數(shù)據(jù)調(diào)查；測試指標包括株高、地徑、生物量、主根長、側(cè)根數(shù)、菌根侵染率和結(jié)瘤量等；其中菌根侵染率采用染色法計數(shù)統(tǒng)計(Philips & Hayman，1970)，根部菌根特征采用壓片法進行顯微觀察。
(三)結(jié)果與分析1.色赤楊聯(lián)合共生的確認(在純培養(yǎng)條件下，較單純的根際環(huán)境，這種確認是確鑿可信的)(1)VA菌根真菌侵染的確認通過染色的方法，植物被侵染后在根表面和根際周圍可觀察到的結(jié)構(gòu)有內(nèi)生菌絲、孢子及孢子果；在根皮層組織中可觀察到的結(jié)構(gòu)有泡囊、叢枝和內(nèi)生菌絲。
本實驗在接菌植株根際培養(yǎng)基質(zhì)中篩出了VA菌根真菌孢子，證實侵染成功；采集色赤楊小根根樣，將其染色后進行壓片，在顯微鏡下進行鏡檢，在根皮細胞中發(fā)現(xiàn)大量著色的泡囊及內(nèi)生菌絲，泡囊在皮層薄壁細胞內(nèi)或在細胞間由菌絲體頂端膨大而形成，其形態(tài)為長橢圓形，觀察結(jié)果確認在純培養(yǎng)條件下色赤楊被VA菌根真菌侵染。
(2)外生菌根真菌侵染的確認本實驗中接種外生菌根真菌的植株根系均表現(xiàn)出根毛的退化，根的分枝明顯多于不接菌植株，菌根外形為短的分枝側(cè)根，呈樹枝狀，末端彎曲膨大，三種外生菌根真菌形成的菌絲在外形上無明顯差異，顏色為褐黃色或深褐色；在顯微鏡下可以觀察到纏繞在根外的無色菌絲，菌絲套較薄，類似絮狀，取新鮮根樣壓片染色后鏡檢可觀察到期根外皮層組織間由于菌絲的侵染而間隙增寬；通過以上形態(tài)學和解剖學觀察可以確認外生菌根真菌在純培養(yǎng)條件下成功侵染了色赤楊幼苗并形成菌根。
(3)弗蘭克氏菌侵染的確認接種弗蘭克氏的色赤楊能夠結(jié)瘤，其根瘤聚集成球狀，觀察結(jié)果證明色赤楊能夠與弗蘭克氏放線菌形成共生體進行結(jié)瘤固氮作用。
2.菌根對宿主植物養(yǎng)分吸收起重要作用，它能夠促進植物對氮、磷、硫、鋅和其它一些元素的攝取，同時消耗過剩糖類，維持健全的生理狀態(tài)，從而促進宿主植物的生長。
表4.

(1)VA菌根真菌對于色赤楊生長的作用，見表4本實驗在無菌條件下對色赤楊接種菌根真菌，無其它菌的干擾，VA菌侵染效果較好，植株表現(xiàn)較好的生長狀況，是因為VA菌促進植株根系的分枝發(fā)育，幫助植物水份的吸收，提高植物在脅迫狀態(tài)下的耐受性以及促進植物激素的產(chǎn)生，并能引起植物細胞尤其是根細胞膜透性根系分泌物和滲透物數(shù)量和質(zhì)量的改變，從而促進宿主植物的生長。
(2)菌根真菌對于色赤楊生長的作用，見表4
本實驗所選取的三種外生菌根真菌具有較廣譜的宿主范圍，但它們對宿主的促進作用效果不同；從各項生長指標綜合分析來看E2劣味乳菇(Lactarius insulsus)對色赤楊作用效果最好，E3黑菇(Russula adusta)次之，E1毛邊華銹傘(Hebeloma mesophaseum)與其它兩者相比作用效果最差。
(3)混合接種內(nèi)、外生菌根菌對色赤楊生長的作用，見表4本實驗結(jié)果證實接種VA菌和外生菌根真菌以及單接菌根真菌的情況，可以看出，不同內(nèi)、外生菌根菌對宿主植物的生長都有促進作用，但促生效果差異較大；三種菌種組合中以劣味乳菇與VA菌促生效果最好，其雙接比單接效果各項指標都有所增長；IE1雖無IE2生長效果好，但比單接菌E1共生優(yōu)勢是比較明顯的，IE3的增生效益不太明顯，但也有一定的促進作用。
3.弗蘭克氏放線菌對色赤楊生長的作用，見表4本實驗所選取三種弗蘭克氏放線菌它們對宿主的促進作用效果不同；從各項生長指標綜合分析來看N1對色赤楊作用效果最好，N2、N3次之；從反應固氮能力的指標結(jié)瘤量看N1效果最好；植物株高、地徑和鮮重的增長與結(jié)瘤量的增加成正比，這充分證明了宿主植物色赤楊良好的生長狀況與弗蘭克氏放線菌的作用是緊密相關的。
4.菌根真菌和弗蘭克氏菌的聯(lián)合增效作用，見表4雙接VA菌根真菌、弗蘭克氏放線菌對色赤楊生長的作用本實驗結(jié)果證實接種VA菌和弗蘭克氏放線菌的情況，可以看出，不同菌種組合對宿主植物的生長都有促進作用，但促生效果差異較大；三種菌種組合中以VA菌與N1促生效果最好，是較好的組合；另兩種組合也有一定的促進作用，但效果稍差一些，但對植物的生長、根系的發(fā)育還是極有幫助的；與單接效果比，體現(xiàn)了較好的聯(lián)合共生效益，各項生長指標都有較好的增長。
(1)雙接外生菌根真菌、弗蘭克氏放線菌對色赤楊生長的作用，見表5表5.


我們的實驗結(jié)果有力地證實了雙接外生菌根真菌和弗蘭克氏菌對宿主植物的生長起到了良好地促進作用，接種植株的生長狀況均好于相對應的單接菌情形；其中同時接種E2和弗蘭克氏菌的植株均表現(xiàn)出較好的長勢，比其它對照組E2、E3都高，其中E2N1比其它雙接菌的組合都好；N1和外生菌根菌也有較好的表現(xiàn)，比其它對照組N2、N3都高。
(2)同時接種VA菌根真菌、外生菌根真菌和弗蘭克氏放線菌的增效作用，見表6表6.

菌根真菌和弗蘭克氏菌都能促進宿主植物的生長，但其作用機理不同，菌根真菌促進宿主植物吸磷，促進宿主植物根系的生長，弗蘭克氏菌能促進宿主植物吸氮，促進宿主植物地上部分的生長。同時接種VA菌根真菌、外生菌根真菌和弗蘭克氏放線菌的色赤楊，生長指標明顯高出對照，且增長率都比單接和雙接都好，這充分證明促進作用是它們綜合作用的結(jié)果；其中IE2N1是最好的組合，共生優(yōu)勢最為顯著，體現(xiàn)出較好的生長結(jié)果。其它菌根真菌和弗蘭克氏菌聯(lián)合接種也都促進了宿主植物的生長。
(3)菌根菌與弗蘭克氏菌的相互作用實驗證明它們間有相互促進作用，混合接菌不但提高了弗蘭克氏菌的結(jié)瘤量，而且也同時促進了菌根菌的發(fā)育狀況。其中尤其是外生菌根真菌對弗蘭克氏菌的作用效果較為明顯，見表7。
表7


菌根真菌對弗蘭克氏菌的作用菌根真菌對色赤楊結(jié)瘤固氮能力的促進作用，同時接種菌根真菌和弗蘭克氏菌后，植株的結(jié)瘤量比只單接弗蘭克氏菌的植株分別都有所增加，綜上所述數(shù)據(jù)可看出，外生菌根真菌E2與不同弗蘭克氏菌組合后對其結(jié)瘤能力的促進程度比其它真菌都要好，它與VA菌聯(lián)合對N1的作用最好，對E2較優(yōu)良的菌種，能較好促進色赤楊的生長，宿主植物良好的生長狀況為弗蘭克氏菌的生長提供了較好的營生條件，而且菌根菌可以促進分泌磷酸酶等促進植物對磷元素的吸收，充足的磷素供給也是弗蘭克氏菌良好的結(jié)瘤作用的基礎，因此E2對弗蘭克氏菌結(jié)瘤能力的促進作用也是其菌種的優(yōu)良特性的表現(xiàn)。
弗蘭克氏菌對菌根真菌的作用弗蘭克氏菌不僅能通過改善宿主植物的生長狀況來間接影響菌根菌，還可通過根系分泌物來改變根際的微生態(tài)環(huán)境從而影響菌根的發(fā)育；實驗表明弗蘭克氏菌提高了菌根菌的侵染率，隨著菌根菌侵染率的提高，植株根系的發(fā)育也明顯改善，同時接種外生菌與弗蘭克氏菌的植株主根長和側(cè)根數(shù)均比相應的單接種菌根真菌的植株高，但不同的弗蘭克氏對菌根真菌的作用不同。
再將雙接VA菌根真菌和外生菌根真菌的植株與同時接種VA菌根真菌、外生菌根真菌和弗蘭克氏菌的植株相比，三種弗蘭克氏菌中，N1對菌根的促進作用最好，這再一次表明，優(yōu)良菌種在聯(lián)合共生體系中對共生效益的提高具有重要意義。
二.色赤楊聯(lián)合共生的盆栽實驗盆栽是半開放的，相對于純培養(yǎng)條件來說，接近自然條件，因此它是純培養(yǎng)的進一步擴展，能為更大面積的應用聯(lián)合共生技術植樹造林提供基礎，并形成一套可行的人工接種方法。
用上述所選優(yōu)勢菌種組合對相同固氮樹種進行混合接種，構(gòu)建成聯(lián)合共生體，優(yōu)勢菌種組合為VA菌根菌、外生菌根菌及分離于非豆科固氮樹種根際中的固氮菌。
(一)材料與方法1.供試土壤來自樹木園林內(nèi)40厘米以下的生土，過篩，在陽光下曬二天，加干燥滅菌的河沙，沙土比為2∶1，混勻后裝入直徑為15厘米的泥盆中，每盆2公斤；土壤理化性質(zhì)，見表8。
表8.

2.菌劑的制備(1)VA菌根菌菌劑在中國科學院應用生態(tài)所的樹木園的色赤楊樹下采集土樣(土深10厘米)，通過濕篩傾析法獲得內(nèi)生菌根真菌的孢子，主要為Glomus屬；于溫室內(nèi)以三葉草為宿主植物進行盆栽擴繁，基質(zhì)為河沙與土壤2∶1(重量比)混合物，其中河沙160℃干燥2小時，土壤高壓蒸氣滅菌1小時，施入底肥過磷酸鈣0.5％、磷酸二氫鉀0.5％，先向盆中裝好基質(zhì)，澆透水后放入載有孢子的濾紙片，其上覆蓋1～2厘米的土，澆水播種三葉草種子，再覆土1～2厘米；以富含孢子的擴繁土和被侵染的三葉草根段的混合物為菌劑，每盆接種60克。
(2)外生菌根真菌菌劑將三種真菌E1、E2、E3采用斜面培養(yǎng)液體固體培養(yǎng)成三級擴大培養(yǎng)方法制備固體菌劑將菌種接種在斜面培養(yǎng)基(PDMA)上28℃培養(yǎng)10天；取斜面菌切小塊，接種在盛100毫升培養(yǎng)基的500毫升三角瓶中28℃振蕩培養(yǎng)15天；將雜木屑70％，麩皮30％按比例配好拌勻，用M.M.N.營養(yǎng)液拌料，制成固體培養(yǎng)基，裝料到罐頭瓶中，封口，1氣壓下1小時滅菌，每瓶接種15-20毫升種子液，置25～28℃遮光培養(yǎng)30天；以長滿菌絲體的固體培養(yǎng)基為外生菌根真菌菌劑，每盆接種30克；對照接入等量滅菌的基質(zhì)。
(3)弗蘭克氏放線菌選取用三種菌株N1、N2、N3在BAP培養(yǎng)液28℃搖瓶培養(yǎng)，繁殖菌體離心(1000r/m，5-10min)勻漿稀釋制成菌懸液作為菌劑，每100株菌苗接種離心菌體1毫升。
3.實驗方法(1)色赤楊種子處理播種前先將種子在冰箱中低溫處理，挑選取飽滿種子滅菌恒溫催芽。
(2)接種過程接入外生菌根真菌將固體菌劑均勻鋪在土壤表面，然后再覆2厘米土壤；接入VA菌根菌；播種挑選萌芽整齊生長良好的種子播入接菌土中，覆2厘米土壤，澆足水分，室溫，每盆保5株苗；接入弗蘭克氏菌小苗長出一周后，在小苗根部鉆孔，用吸液管將菌液滴入小孔，接種后用土壤覆蓋小孔；N15示蹤小苗定植后土壤中施入N15標記的硫酸二氨，按2g/m2的量施入。每二個月澆營養(yǎng)液一次，其組成為硝酸鈣10％、磷酸二氫鉀2.5％、7水硫酸鎂2.5％、氯化鉀1.25％和氯化鐵0.125％、余量水。
4.生長指標和生理指標的測定6個月后進行各項指標測試，其中葉綠素含量采用ANON法進行測量；凈光和效率采用CL-301P光合測定儀進行測定；菌根侵染率采用壓片染色法進行計數(shù)統(tǒng)計；含氮量、N15含于中國農(nóng)業(yè)科學院原子能所質(zhì)譜室測定，分析儀器為菲尼根MAT-251超精度氣體同位素質(zhì)譜儀；(二)結(jié)果與分析1.聯(lián)合共生的確認(1)VA菌根真菌的確認在接種VA菌的植株根系剪取幼根，剪成1厘米長的片段在10％氫氧化鉀液中浸泡，90℃水浴1～1.5小時后，放入雙氧水中浸泡20～30分鐘，洗凈1％鹽酸酸化，加入乳酸酚棉蘭染色液90℃水浴30～45分鐘，將已染色的根段用乳酸甘油浸泡脫色，根段中多余的染料清除，而VA菌根菌的各種結(jié)構(gòu)則可保持染色狀態(tài)，將脫色后的根段在載玻片上輕輕壓碎，在顯微鏡下觀察，在根皮層細胞間可以看到被染成蘭色的菌絲體和大量與菌絲相連的泡囊；另外在根際土壤中通過濕篩傾析蔗糖離心法獲得大量孢子和孢子果，可確認侵染成功。
(2)外生菌根真菌的確認與對照相比，接種外生菌根真菌的植株根系發(fā)達，分枝密集，，根毛退化，小根增長受到抑制，側(cè)根末梢末端稍彎曲膨大；菌根為珊瑚狀，偶有二叉分枝，三種外生菌根真菌侵染形成的菌根在外形上無明顯差異，顏色為褐黃色或深褐色；通過切片觀察，可發(fā)現(xiàn)色赤楊根細胞外皮層細胞間隙由于菌絲的生長而加寬，充分證實色赤楊能形成外生菌根。
(3)弗蘭克氏菌侵染的確認接種弗蘭克氏菌的植株根系生長比較粗壯，側(cè)根數(shù)有所增加，并能形成根瘤，根瘤為淡棕色，近球形，證實弗蘭克氏菌侵染了色赤楊根系。
2.單接菌對色赤楊生長的促進作用(1)VA菌根菌對色赤楊生長的促進作用(見表9)侵染后其外生菌絲能刺激土壤細菌的生長繁殖，增加磷酸酶分泌量，同時，VA菌絲也具有堿性和酸性磷酸酶脂并可分泌到根際，可提高根系表面酸性磷酸脂酶的活性，增加了植物對土壤有機磷的利用，從而改善植物的生長狀況，促進生長發(fā)育，其作用大小應看植物對VA菌的依賴性大??；本實驗中對照組自然侵染率為15％，人工接種為70％，其根系發(fā)育比對照組好，各項生理指標也比對照組有明顯提高，證實了其促進作用。
表9.

(2)外生菌根菌對色赤楊生長的促進作用(見表9)其受影響因素較多，從實驗中接外生菌根真菌植株均表現(xiàn)了很好的長勢，植株粗壯，根系發(fā)達，比對照組都有所提高，其中E2的促生效果最好，侵染率也最高，這也說明接菌植株的良好長勢與外生菌根菌的侵染密切相關。菌根真菌與植物之間生長互有選擇性，從為項指標來看三種菌種混合接種也是較好的組合，它們可將不同的根系植物聯(lián)成一體。
(3).接種弗蘭克菌對色赤楊生長的促進作用(見表9)從表中可以看出，弗蘭克氏菌不僅增加植株地上部分的生物量，對植株的根系生長情況也有促進作用。其中N1的促生效果最好。
從上幾種單接菌的促進作用可看出，菌根菌好于弗蘭克氏菌，除實驗條件和實驗時間有一定影響外，可能是色赤楊對菌根菌的依賴性大于弗蘭克氏菌。
3.聯(lián)合接菌對色赤楊生長的增效作用作用(1).雙接VA菌根菌和外生菌根菌對色赤楊生長的促進作用(見表10)表10.

結(jié)果表明共同接種后菌根的侵染能力增強，各項指標的增長率均高于單接菌組，IE2與IE3效果相對較差，共生優(yōu)勢不太明顯。
(2)雙接弗蘭克氏菌和外生菌根菌對色赤楊生長的促進作用它們間效果較明顯，因為它們之間能形成一個良性循環(huán)體，增效顯著。
(3)雙接VA菌根菌和弗蘭克氏菌對色赤楊生長的促進作用其中較好組合為IN1。
菌根真菌與弗蘭克氏菌的相互作用(見表11)表11.


綜上所述，三接菌(即聯(lián)合接種)比單接菌、雙接菌的生長情況都好，是它們聯(lián)合作用的結(jié)果；該結(jié)果與純培養(yǎng)相同。
本實施例所用各類菌株都為非特異性的菌株體，而各菌株體所在的菌種于自然界普遍存在，分布較廣，各菌種在微生物學雜志、生態(tài)學報、土壤學報、林業(yè)科學研究、應用生態(tài)學報上1989～2000年間發(fā)表的論文中均有提及和刊用，依據(jù)N.C.SCHEWCK and YVONNE PEREZ 1988.1Mannual for theidentification of VA mycorrizal fungi(second edition published)進行分類鑒定；色赤楊下的弗蘭克氏放線菌分離于1982年，此后，先后在微生物學報、微生物學雜志、應用生態(tài)學報上1984～1994年間發(fā)表的論文中均有提及和刊用。
權利要求
1.色赤楊聯(lián)合共生體的構(gòu)建方法，其特征在于以分離于色赤楊林下的Glomus屬VA菌根真菌與外生菌根劣味乳菇菌和宿主植物為色赤楊的弗蘭克氏放線菌共同接種于色赤楊形成色赤楊聯(lián)合共生體。
2.根據(jù)權利要求1所述色赤楊聯(lián)合共生體的構(gòu)建方法，其特征在于其中所述劣味乳菇可用黑菇代替。
3.根據(jù)權利要求1所述色赤楊聯(lián)合共生體的構(gòu)建方法，其特征在于其中所述VA菌根真菌、外生菌根及弗蘭克氏放線菌菌株的分離選取過程如下a.在選定色赤楊樹種分布的貧瘠山區(qū)，隨機選取至少3處不同地塊的樹齡在5年以上的樹種根系樣品進行外部形態(tài)觀測和形態(tài)解剖學觀察，確定其VA菌根菌和/或外生菌根菌的感染情況；b.依據(jù)菌根感染強度和固氮結(jié)瘤量，確定共生菌與該樹種的親合力，選定色赤楊樹種根際中的發(fā)育狀態(tài)較優(yōu)的菌種類型，并在每一不同地塊多點取樣，于其根際中分離出VA菌根菌和/或外生菌根菌，弗蘭克氏放線菌，進行菌種擴繁培養(yǎng)；c.在純培養(yǎng)條件下，將分離培養(yǎng)好的菌種單接和組合搭配接種，確定共生體形成效應的回接試驗，進一步對上述發(fā)育狀態(tài)較優(yōu)的菌種類型進行驗證，確定優(yōu)勢菌種和優(yōu)勢菌種組合。
4.按照權利要求3所述固氮植物聯(lián)合共生體的構(gòu)建方法，其特征在于所述優(yōu)勢菌種中VA菌根菌為Glomus intraradices根內(nèi)球囊霉和/或Glomusmosseae摩西球囊霉；外生菌根菌為Lactaria insulsus劣味乳菇和/或Russulaadusta黑菇；固氮菌為弗蘭克氏放線菌At4和/或Ahp1。
5.按照權利要求3所述固氮植物聯(lián)合共生體的構(gòu)建方法，其特征在于優(yōu)勢菌種組合為Glomus intraradices根內(nèi)球囊霉，Lactaria insulsus劣味乳菇，弗蘭克氏放線菌At4。
全文摘要
色赤楊聯(lián)合共生體的構(gòu)建方法，本發(fā)明以分離于色赤楊林下的Glomus屬VA菌根真菌與外生菌根劣味乳菇菌或黑菇和宿主植物為色赤楊的弗蘭克氏放線菌共同接種于色赤楊形成色赤楊聯(lián)合共生體；選用菌種中VA菌根菌為Glomus intraradices根內(nèi)球囊霉和/或Glomus mosseae摩西球囊霉；外生菌根菌為Lactaria insulsus劣味乳菇和/或Russulaadusta黑菇；固氮菌為弗蘭克氏放線菌At
文檔編號A01H1/00GK1465227SQ0213242
公開日2004年1月7日 申請日期2002年6月21日 優(yōu)先權日2002年6月21日
發(fā)明者何興元, 韓桂云, 吳清鳳, 張成剛 申請人:中國科學院沈陽應用生態(tài)研究所