專利名稱：表達(dá)Harpin蛋白的大腸桿菌基因工程菌株構(gòu)建及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在原核生物中表達(dá)Harpin蛋白，含有Harpin蛋白基因的載體，用這種載體轉(zhuǎn)化的原核生物(優(yōu)選大腸桿菌)，在大腸桿菌中產(chǎn)生Harpin蛋白的方法，以及這種蛋白質(zhì)作為植物抗菌抑菌劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。
Harpin蛋白是引起蘋果、梨子等玫瑰香植物火燒病的病原菌Erwiniaamylovora hrp基因簇編碼的一種蛋白。它是細(xì)菌對寄主植物致病性必須的一種蛋白，但對非寄主植物，它可引起植物的超敏感反應(yīng)(Hypersensitive response)，其表現(xiàn)為受侵染組織的快速、局部的萎縮和死亡，這就限制病原菌進(jìn)一步擴(kuò)散的可能性。超敏感反應(yīng)是植物自身具有的一種保護(hù)反應(yīng)，類似與高等植物所具有的廣譜抗病菌蟲害的免疫反應(yīng)。Harpin蛋白本身對細(xì)菌、病毒、真菌、線蟲、昆蟲無殺滅或抑制作用，而是通過與植物受體結(jié)合后產(chǎn)生某種信號，刺激或誘導(dǎo)植物自身的免疫機(jī)制來保護(hù)植物。因此用Harpin蛋白作為抗菌抑菌劑具有不污染環(huán)境、不產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)，具有很大的市場潛力。Harpin蛋白可以增強(qiáng)植物的光合作用，利于營養(yǎng)物質(zhì)的攝取，因此可以促進(jìn)種子萌發(fā)和植株發(fā)育，提高作物的產(chǎn)量和質(zhì)量，增大植株個體，利于植物的早熟和結(jié)實(shí)。
本發(fā)明涉及的Harpin蛋白可用兩種方式獲得；(1)從病原菌Erwiniaamylovora中分離；(2)基因工程方法生產(chǎn)。從病原菌中分離Harpin蛋白，成本高、產(chǎn)量小、不能大面積推廣使用。本發(fā)明采用基因工程方法生產(chǎn)Harpin蛋白，如在大腸桿菌中可以高效表達(dá)Harpin蛋白。大腸桿菌發(fā)酵液經(jīng)過超聲波破碎后，可以得到具有生物活性的基因工程Harpin蛋白，作為有效成分可廣泛的應(yīng)用于病蟲害防治和植物保護(hù)。
本發(fā)明的目的是提供一種新型的含有Harpin蛋白基因的工程菌株，該菌株的構(gòu)建方法，該菌株生產(chǎn)Harpin蛋白的方法，以及該蛋白在植物保護(hù)中的應(yīng)用。
本發(fā)明所涉及的Harpin蛋白氨基酸序列如圖一所示，其編碼的核苷酸序列如圖二所示。蛋白質(zhì)全長403個核苷酸，富含甘氨酸和絲氨酸，對熱穩(wěn)定。此基因片段的獲取可以有以下兩種方式(1)PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增設(shè)計(jì)引物用PCR的方法從病原菌Erwiniaamylovora的基因組中或者含有Harpin蛋白的cDNA基因組文庫中擴(kuò)增目的基因。(2)人工合成根據(jù)Harpin蛋白的氨基酸序列或核苷酸序列人工合成核苷酸片段，然后經(jīng)過分離純化得到含有Harpin基因的DNA片段。
本發(fā)明所涉及的Harpin基因的核苷酸或氨基酸序列可以進(jìn)行人為的突變或修飾。如缺失或增加某些氨基酸殘基，但這些改變并不影響蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，不影響蛋白質(zhì)的功能。比如可以在Harpin蛋白的N端加入一端信號肽，以利于蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化。
本發(fā)明設(shè)計(jì)一種在原核生物中表達(dá)Harpin蛋白的方法。大腸桿菌(E.coli)因其安全、表達(dá)量高、表達(dá)產(chǎn)物易于分離純化等優(yōu)點(diǎn)為首選的原核表達(dá)系統(tǒng)。
本發(fā)明涉及一種構(gòu)建原核表達(dá)載體在大腸桿菌中表達(dá)Harpin蛋白的方法。將本發(fā)明涉及的Harpin基因連接到表達(dá)載體中即可在大腸桿菌中表達(dá)Harpin蛋白?？晒┻x擇的表達(dá)載體系統(tǒng)有很多種，如pUC系列載體、pET系列載體、噬菌體系列載體等。這些載體共有的特征是(1)原核表達(dá)啟動子這是一段特殊的DNA序列，是RNA聚合酶與DNA的結(jié)合位點(diǎn)，只有當(dāng)RNA聚合酶與DNA結(jié)合以后，mRNA的合成才能開始。原核、真核表達(dá)載體具有不同的啟動子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。根據(jù)表達(dá)量的多少原核表達(dá)啟動子有強(qiáng)弱之分，常用的強(qiáng)啟動子有T7啟動子，Lac啟動子、trp啟動子、recA啟動子等；(2)SD序列原核表達(dá)載體可以有或無蛋白質(zhì)翻譯起始位點(diǎn)ATG，在起始位點(diǎn)上游7-9個堿基處有一段Shine-Dalgamo(SD)序列，它是核糖體的結(jié)合位點(diǎn)，核糖體與mRNA結(jié)合后啟動蛋白質(zhì)的翻譯；(3)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)不同的宿主-載體系統(tǒng)可以選擇不同的調(diào)控方法來控制外源基因的表達(dá)。如在Lac啟動子表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)中，只有當(dāng)誘導(dǎo)劑IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)存在時，Lac啟動子的阻遏才能被解除，才能啟動外源基因的表達(dá)；
(4)選擇性標(biāo)記基因不同的載體可以選擇不同的基因作為篩選標(biāo)記。常用抗生素抗性基因作為篩選標(biāo)記，如氨芐青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因等。除作為篩選標(biāo)記外，這些基因還可以保證在選擇壓力(抗生素存在)條件下表達(dá)載體質(zhì)粒在宿主傳代過程中不會丟失。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下一種工程菌株E.Coli BL21(pETHa)，它含有合成的Harpin蛋白基因，并能在原核生物中高效表達(dá)，該菌種命名為E.Coli BL21(pET-23(+)/Harpin)，已于2002年6月28日保藏于湖北省武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，登記入冊號為CCTCC M202026。該重組載體主要由下列DNA元件組成(1)合成的Harpin蛋白基因；(2)大腸桿菌質(zhì)粒復(fù)制起始點(diǎn)；(3)氨芐青霉素抗性基因；(4)六個連續(xù)組氨酸編碼區(qū)。
構(gòu)建本發(fā)明的工程菌株主要所用的原始材料有如下幾種(1)Harpin基因由本實(shí)驗(yàn)室合成；(2)受體大腸桿菌E.coli BL21菌株，購自NOVAGEN公司；(3)pUC19載體，購自Promega公司；(4)pET-23(+)，購自Promega公司。
用來表達(dá)Harpin蛋白的載體通過基因工程方法獲得，其構(gòu)建方法是用BamHI/XhoI雙酶切質(zhì)粒pET-23(+)和重組質(zhì)粒Puc19/Harpin，并經(jīng)0.7％低熔點(diǎn)瓊脂凝膠電泳純化回收1.2kb目的基因片段，用T4 DNA連接酶于16℃水浴連接過夜；轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.Coli BL21，經(jīng)Amp(氨芐青霉素)抗性平板篩選得到E.Coli BL21(pETHa)。該工程菌株于2002年6月28日保藏于中國武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，登記號為CCTCC M202026。該工程菌株攜帶Harpin蛋白基因的表達(dá)載體。
其中的重組質(zhì)粒pUC19/Harpin由下面方法構(gòu)建第一步，根據(jù)已知的Harpin基因核苷酸列，分四段合成Harpin基因。A片段(起點(diǎn)位置63-終位置376)；B片段(起點(diǎn)位置377-終點(diǎn)位置729)；C片段(起點(diǎn)位置730-終點(diǎn)位置1035)；D片段(起點(diǎn)位置1036-終點(diǎn)位置1288)。在A片段5′端引進(jìn)Bam HI位點(diǎn)，D片段3′端引進(jìn)XhoI位點(diǎn)；第二步，將上述A、B、C、D四個片段分別克隆到pUC19質(zhì)粒的EcoR I-Hind III區(qū)域，克隆方向?yàn)?’端隨著接EcoRI，3’端隨著接Hind III。這四個質(zhì)粒分別命名為PJZ23A，PJZ23B，PJZ23C和PJZ23D。第三步，EcoR I/Mut I酶切PJZ23A，回收A片段，并與經(jīng)過EcoR I/BssH II酶切的質(zhì)粒PJZ23B連接得到含有片段A/B的質(zhì)粒PJZ23AB；PJZ23AB再經(jīng)EcoR I/Sty I酶切回收A/B片段，與經(jīng)過EcoR I/Sty I酶切的質(zhì)粒PJZ23C連接得到含A/B/C片段的質(zhì)粒PJZ23 Alpha；PJZ23 Alpha再用EcoR I/Xma I酶切回收片段A/B/C，連接到經(jīng)過EcoR I/Xma I酶切的質(zhì)粒PJZ23D中，最后得到含有四個片段的質(zhì)粒pUC19/Harpin。
將重組獲得的Harpin蛋白的工程菌株CCTCC M202026單菌落挑到內(nèi)含100μg/ml Amp(氨芐青霉素)的LB培養(yǎng)基中(25ml)，37℃，200rpm過夜培養(yǎng)，以1∶20比例接種到含Amp的500ml LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)其濃度達(dá)到OD600＝0.7-0.9時，加入IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)到終濃度1mM，于37℃，250rpm誘導(dǎo)表達(dá)3hr，收獲菌液，5000rpm離心10min，收集菌體沉淀，再按常規(guī)方法即可獲得Harpin蛋白。
利用攜帶Harpin蛋白基因的大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)的Harpin蛋白可作為一種抗菌抑菌劑的有效成份用于植物保護(hù)。
本發(fā)明提供了一種Harpin蛋白工程菌株E.Coli BL21(pETHa)，該菌株的構(gòu)建方法和用途，以及由此工程株生產(chǎn)Harpin蛋白，該菌株含有合成的Harpin全長基因，能在原核生物中復(fù)制，從而獲得Harpin蛋白，可作為抗菌抑菌劑的有效成份，其作為生物殺蟲劑具有廣譜效力，保護(hù)植物抵抗病毒、細(xì)菌和昆蟲的感染和侵害。
本發(fā)明涉及基因工程Harpin蛋白可以作為抗菌抑菌劑的有效成份廣泛的應(yīng)用于作物保護(hù)，特別是單子葉植物和雙子葉植物。比如苜蓿、大米、小麥、大麥、黑麥、棉花、向日葵、玉米、花生、甘薯、大豆、豌豆、萵苣、大蒜、甘藍(lán)、甜菜、蘿卜、菠菜、洋蔥、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、南瓜、黃瓜、蘋果、梨子、柑橘、草莓、葡萄、菠蘿、煙草、番茄、高粱、甘蔗等。裝飾性植物非洲堇、矮牽?；ā⑻祗每?、猩猩木、菊花、康乃馨、百日菊等。
本發(fā)明涉及基因工程Harpin蛋白可以作為抗菌抑菌劑的有效成份用于防治假單胞菌屬、歐文氏菌屬、黃單胞菌屬等引起的植物細(xì)菌類疾??；鐮孢屬、疫霉屬等引起的植物真菌類疾?。粺煵莼ㄈ~病毒和番茄花葉病毒等植物病毒類疾病。此外，對于農(nóng)作物、蔬菜害蟲如棉鈴蟲、甜菜夜蛾、菜青蟲等也有一定的趨避和控制作用。
以下結(jié)合附圖
和具體的實(shí)施方案對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明，這些實(shí)施方案無意于以任何方式限制本發(fā)明權(quán)利要求所要求的范圍。
(一)Harpin基因的人工合成Harpin基因分四個片段進(jìn)行人工合成，合成由美國MIDLANDCertified Regent公司完成。
(二)Harpin基因DNA片段克隆1、Harpin基因片段的連接，按順序連接Harpin基因四個片段，方法參見分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(Sambrook等，冷泉港，1989)，在滅菌的0.5ml離心管中(1)加入基因片段各1μg，(2)10×緩沖液化4μl，(3)0.1mM的ATP2μl，(4)T4DNA連接酶10μ，(5)補(bǔ)加去離子水至40μl，
37℃水浴30min，加入2μl0.5M EDTA終止反應(yīng)。加40μl苯酚∶氯仿∶異戊醇振蕩1min，8,000rpm離心2min，再用氯仿∶異戊醇抽提1次，轉(zhuǎn)移上清水相至一干凈離心管，加入1/10體積3M乙酸鈉，2倍體積無水乙醇，混勻，置于20℃過夜，12,000rpm離心20min，棄上清，自然干燥，重懸DNA于20μl TE緩沖液。
2、連接Harpin基因pUC19質(zhì)粒按Promega公司的pGEM-T載體操作手冊并參見Sambrook等在“分子克隆“，實(shí)驗(yàn)室手冊，(冷泉港，1989)，在已滅菌干凈的0.5ml離心管中，加入(1)10×T4DNA連接酶緩沖液1μl，(2)20ng/μl的pUC19載體，1μl，(3)約50ng的上述處理樣品DNA，(4)3Weiss units/μl T4 DNA連接酶1μl，(5)補(bǔ)加去離子水至10μl，混勻合置4℃連接過夜。
3、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli TG1，通過BamHI或XhoI單酶切雙酶切鑒定其中的重組質(zhì)粒DNA的正確結(jié)構(gòu)，確定該工程菌株E.coli TG1(pUC19/Harpin)正確建立。
(三)Harpin基因1.2kb片段的克隆使用常規(guī)技術(shù)(參見Sambrook等在分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊，冷泉港，1989)，分離提純質(zhì)粒pET-23(+)、pUC19/Harpin。用XhoI和BamHI雙酶切pUC19/Harpin獲得1.2kb片段，通過低熔點(diǎn)瓊脂糖回收該片段。將該片段連接到XhoI和BamHI雙酶切的表達(dá)載體pET-23(+)中，轉(zhuǎn)化E.coli BL21，方法如下(1)大腸桿菌BL21菌株感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化從37℃培養(yǎng)16-20hr的新鮮LB平板中取E.coli BL21單菌落，置3ml LB液體培養(yǎng)基試管中，37℃，200rpm培養(yǎng)過夜，再將菌液按1∶100比例接種于適量LB培養(yǎng)基中，37℃劇烈振蕩培養(yǎng)約3hr(OD600＝0.3-0.4)，將菌液轉(zhuǎn)入1.5ml無菌離心管，置冰上10min，待培養(yǎng)物預(yù)冷至℃時，4,000rpm離心10min，收集菌體，倒出培養(yǎng)液以0.5ml冰冷的0.1mol/LCaCl2重懸細(xì)胞，置冰上半小時后，4,000rpm離心10min，倒出上清，加入100μl冰冷0.1mol/L CaCl2重懸細(xì)胞。所制感受態(tài)細(xì)胞置4℃，并在12-24hr內(nèi)使用。
在100μl E.coli BL21菌株感受態(tài)細(xì)胞中加入8μl待轉(zhuǎn)化的連接產(chǎn)物DNA(DNA≤50ng)，輕旋以混勻內(nèi)容物，置冰上30min，于42℃冰浴中熱休克90s后，迅速移至冰浴中，待細(xì)胞冷卻1-2min后，每管加入90μl SOC培養(yǎng)液(蛋白胨20g，酵母粉5g，NaCl0.5g，250mMKCl10ml，5M NaOH調(diào)pH值至7.0，15磅20分鐘高壓滅菌。臨用前加5ml已滅菌的2MMgCl2，20ml已滅菌的1M葡萄糖溶液)，置37℃，150rpm培養(yǎng)12-16小時后觀察轉(zhuǎn)化結(jié)果。
(2)重組工程菌株E.Coli BL21(pETHa)的酶切鑒定將小量提取的重組質(zhì)粒pETHa用限制性內(nèi)切酶XhoI和BamHI雙酶切和BamHI或XhoI單酶切消化，用0.7％瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)EB染色后觀察，通過與分子量比較DNA片段大小的方法進(jìn)一步鑒定。
(四)SDS-PAGE電泳分析表達(dá)質(zhì)粒中外源基因的表達(dá)1、凝膠的灌制參照參見Sambrook等“分子克隆“(實(shí)驗(yàn)室手冊，冷泉港，1989)的方法，配制8％的分離膠溶液15ml，依次混合各成分后加入催化劑TEMED(N，N，N’，N’四甲基乙二胺)，立即混勻開灌膠，封一層0.1％SDS(二烷基硫酸鈉)覆蓋液面，37℃下聚合30min。聚合完全后排凈凝膠上的液體，以同樣方法灌濃縮膠，插入梳子，避免產(chǎn)生氣泡。
2、蛋白質(zhì)樣品的制備挑含有重組表達(dá)載體的細(xì)菌BL21(pETHa)單菌落在100μg/ml Amp的LB培養(yǎng)基中37℃過夜活化，然后以1∶20稀釋接種到含100μg/mlAmp的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)其濃度達(dá)到OD600＝0.7-0.9時，取出未經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)菌對照。加入IPTG至終濃度1mM，于42℃，200rpm培養(yǎng)30min后，降至37℃繼續(xù)搖床培養(yǎng)5hr后收獲細(xì)菌，4,000rpm離心10min，收集菌體沉淀，加入適量去離子水重懸菌體，置-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 3、上樣及電泳在樣品中加等體積2×SDS凝膠加樣緩沖液，于100℃加熱3-5min變性，按順序加樣，最后在所有不用的加樣孔中加上等體積的加樣緩沖液，以100V電泳至溴酚蘭進(jìn)分離膠，提高電壓至150V，當(dāng)溴酚蘭到達(dá)底部前約1cm處結(jié)束電泳(約需4hr)。
4、固定、染色和脫色剝膠后以5倍體積染液固定并染色過夜(至少4小時以上)，將凝膠浸泡于脫色液中平緩搖動4hr以上，其間更換脫色液3次，脫色完全后即可進(jìn)行觀察和照相。
(五)純化表達(dá)質(zhì)粒中目的基因表達(dá)產(chǎn)物目的基因的表達(dá)挑含待表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)菌BL21(pETHa)單菌落在含100μg/ml的Amp的25ml LB培養(yǎng)基中37℃，200rpm過夜活化，然后以1∶20比例接種到含100μg/ml Amp LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)其濃度達(dá)到OD600＝0.7-0.9時，加入IPTG至終濃度1mM，于42℃，200rpm誘導(dǎo)表達(dá)30min后，降至37℃，繼續(xù)培養(yǎng)5hr，收獲菌液，4,000rpm離心10min，收集菌體沉淀，在細(xì)菌沉淀中加入2-5倍體積的聲波處理液，反復(fù)凍融3次，置于冰中用超聲波破碎細(xì)胞。保存于-20℃?zhèn)溆谩?br> (六)田間應(yīng)用以Harpin蛋白作為活性成分的抗菌抑菌劑中工程蛋白有效含量為3％，將其配置成粉劑或乳劑均勻的噴灑于植物表面即可達(dá)到對細(xì)菌、真菌、病毒性植物病害廣譜的預(yù)防和控制作用。
在一組田間實(shí)驗(yàn)中，以Harpin蛋白作為活性成分的抗菌抑菌劑對真菌引起的茄子棉疫病防治效果達(dá)到72％，而常用的化學(xué)農(nóng)藥只有43％；對黃瓜細(xì)菌性角斑病的防治效果超過90％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過化學(xué)農(nóng)藥的40％；對黃瓜花葉病毒引起的病毒性病害，本發(fā)明的抗菌抑菌劑幾乎可以完全控制病害發(fā)生，而化學(xué)農(nóng)藥只能達(dá)到78.8％的防治效果。
權(quán)利要求
1.一種在原核生物中表達(dá)Harpin蛋白的方法，其特征在于獲得的基因工程Harpin蛋白具有引發(fā)植物超敏感反應(yīng)的生物功能。
2.根據(jù)權(quán)利要求1構(gòu)建的一種工程菌株E.Coli BL21(pETHa)，該工程菌株已提交到中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其保藏編號為CCTCC M202026。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的工程菌株，其特征在于這種菌株含Harpin蛋白基因，并能在原核生物中表達(dá)。該基因具有《說明書附圖》圖一所示的氨基酸序列，其編碼的DNA分子具有《說明書附圖》圖二所示的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3或所述的工程菌株，其特征在于所含的重組表達(dá)載體由下列DNA元件構(gòu)成(1)Harpin蛋白基因；(2)大腸桿菌質(zhì)粒復(fù)制起始點(diǎn)；(3)氨芐青霉素抗性基因；(4)六個連續(xù)組氨酸編碼區(qū)。
5.一種構(gòu)建權(quán)利要求2-4任意一項(xiàng)所述的工程菌株的方法，其特征在于用BamH I/Xho I雙酶切質(zhì)粒pET-23(+)和重組質(zhì)粒pUC19/Harpin，并經(jīng)0.7％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳純化回收1.2kb目的基因片段，用T4 DNA連接酶于16℃水浴連接過夜；轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.Coli BL21，經(jīng)氨芐青霉素抗性平板篩選得到E.Coli BL21(pETHa)。
6.一種用權(quán)利要求1-4所述的工程菌株生產(chǎn)Harpin蛋白的方法，其特征在于將重組獲得的攜帶Harpin蛋白的工程菌株CCTCC M202026單菌落挑到內(nèi)含100μg/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃，200rpm過夜培養(yǎng)，以1∶20比例接種到含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)其濃度達(dá)到OD600＝0.7-0.9時，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度1mM，于37℃，200rpm誘導(dǎo)表達(dá)5hr，收獲菌液，4000rpm離心10min，收集菌體沉淀，再按常規(guī)方法即可獲得Harpin蛋白。
7.權(quán)利要求1-4所述的工程菌株或其產(chǎn)生的基因工程Harpin蛋白，作為抗菌抑菌劑的有效成份用于植物保護(hù)，可以抵抗細(xì)菌、真菌、病毒、線蟲等對植物的危害。起特征在于無污染、不產(chǎn)生抗性、廣譜高效，并可促進(jìn)植物的生長發(fā)育。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通過基因工程手段構(gòu)建的工程菌株CCTCC M202026 E.Coli BL21(pETHa)、工程菌株的構(gòu)建方法和用途。該菌株是將人工分段合成連接的Harpin基因與pET表達(dá)載體連接，構(gòu)成含harpin基因的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至E.Coli BL21菌體所得。該菌株可以在IPTG的誘導(dǎo)下表達(dá)Harpin基因工程蛋白，用該蛋白研究研制出安康肽植物抗菌抑菌劑，用于植物細(xì)菌、真菌、病毒、線蟲等病蟲害的防治，并可促進(jìn)植物的生長發(fā)育。
文檔編號A01N63/00GK1468963SQ02134398
公開日2004年1月21日 申請日期2002年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月19日
發(fā)明者張繼, 孟小林, 徐進(jìn)平, 王建, 魯偉, 張 繼 申請人:深圳市武大萬德?；蚬こ逃邢薰?br>