專利名稱：一種防止植物組織培養(yǎng)中褐化現(xiàn)象產(chǎn)生的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物組織培養(yǎng)方法，特別是涉及一種防止植物組織培養(yǎng)中褐化現(xiàn)象產(chǎn)生的方法。
在植物組織培養(yǎng)快速繁殖中經(jīng)常會(huì)產(chǎn)生褐化現(xiàn)象。這是由于外植體或培養(yǎng)物切口表面滲出的酚類物質(zhì)氧化后使培養(yǎng)基變成暗褐色所致。褐化現(xiàn)象對(duì)不同物種外植體組織或培養(yǎng)物會(huì)產(chǎn)生不同程度的毒害，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)物死亡。目前，減輕褐化的措施有(1)對(duì)母株和外植體進(jìn)行預(yù)處理，如對(duì)外植體進(jìn)行高溫或低溫處理，外植體先在液體培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)幾天，然后再在半固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)(2)選擇適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，在適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下外植體生長(zhǎng)旺盛，有較強(qiáng)的分生能力，可以減輕褐化，如調(diào)整培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)元素的組成和濃度，改變培養(yǎng)溫度、光照和PH值等；(3)在培養(yǎng)基中加入防褐劑，如抗氧化的抗壞血酸，鹽酸半胱氨酸和檸檬酸以及具吸附作用的活性炭和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；(4)縮短繼代時(shí)間，連續(xù)轉(zhuǎn)移外植體，這樣可以減輕褐化的毒害。但現(xiàn)有技術(shù)只能相對(duì)地減輕某些植物組織培養(yǎng)中的褐化程度，并不能有效地解決褐化問(wèn)題。絕大多數(shù)組織培養(yǎng)易褐化的植物還沒(méi)有一種有效的抗褐化技術(shù)，更沒(méi)有一種能完全消除褐化現(xiàn)象的方法。而且現(xiàn)有技術(shù)中有些措施會(huì)對(duì)組織培養(yǎng)物產(chǎn)生不良的副作用，如對(duì)外植體進(jìn)行高溫預(yù)處理會(huì)對(duì)外植體產(chǎn)生傷害，在培養(yǎng)基加入活性炭會(huì)降低培養(yǎng)基中激素的活性。由于現(xiàn)有的抗褐化技術(shù)效果差，不能有效地解決褐化問(wèn)題，到目前為止，有些易褐化且褐化對(duì)組織培養(yǎng)物毒害很大的作物的組織培養(yǎng)程序化途徑尚未建立，致使這些作物的組織培養(yǎng)與快速繁殖的成功率很低。而組織培養(yǎng)與快速繁殖又是這些植物唯一有效的迅速增殖途徑。這就嚴(yán)重影響了這些作物新品種的推廣應(yīng)用速度。蘭科觀賞植物的快速繁殖有兩種途徑，一是用種子無(wú)菌播種，生產(chǎn)實(shí)生苗，二是通過(guò)組織培養(yǎng)生產(chǎn)分生苗。由于實(shí)生苗存在變異，難以保持優(yōu)良品種的種性，所以名貴優(yōu)良品種一般通過(guò)組織培養(yǎng)生產(chǎn)分生苗(克隆苗)。但蘭花組織培養(yǎng)中普遍存在褐化現(xiàn)象，尤其以卡特蘭組織培養(yǎng)最為嚴(yán)重?？ㄌ靥m組織培養(yǎng)中的褐化現(xiàn)象對(duì)外植體的毒害較大，致使其不能正常生長(zhǎng)發(fā)育，甚至外植體死亡。對(duì)此，現(xiàn)有的抗褐化技術(shù)尚不能有效地克服，致使卡特蘭新品種不能迅速推廣。
本發(fā)明提供了一種防止植物組織培養(yǎng)中褐化現(xiàn)象產(chǎn)生的方法，該方法能有效地解決植物組織培養(yǎng)中的褐化問(wèn)題，達(dá)到使易褐化植物組織培養(yǎng)與快速繁殖成功率提高的目的。
本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是本發(fā)明主要是利用組織培養(yǎng)中不褐化植物的培養(yǎng)物的代謝過(guò)程抑制易褐化植物的組織培養(yǎng)物的褐化。首先取組織培養(yǎng)中不產(chǎn)生褐化現(xiàn)象的植物，經(jīng)組織培養(yǎng)形成快速繁殖的中間繁殖體(以下簡(jiǎn)稱中間繁殖體)。紅掌是一種天南星科花燭屬觀賞植物，在整個(gè)組織培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)褐化現(xiàn)象產(chǎn)生。其組織培養(yǎng)外植體可以用頂芽、腋芽和幼嫩葉片。但由于頂芽和腋芽難以徹底滅菌，所以通常采用幼嫩葉片作外植體。幼嫩葉片經(jīng)0.1％氯化汞水溶液滅菌10分鐘左右，無(wú)菌水洗5～8次后，分切成1cm2左右的小塊，接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(1/2MS+BA4mg/L+2，4-Dlmg/L+3％蔗糖，PH5.8，瓊脂0.7％固化)，50天左右誘導(dǎo)出愈傷組織。愈傷組織在分化培養(yǎng)基(MS+BA8mg/L+3％蔗糖，PH5.8，瓊脂0.7％固化)上培養(yǎng)30天左右形成再分化的組織，再分化的組織在繼代增殖培養(yǎng)基(MS+BA3mg/L+NAA0.2mg/L+3％蔗糖，PH5.8，瓊脂0.7％固化)上繼代培養(yǎng)2～3次(每代30天)后形成可快速增殖的叢芽塊(一種具叢生芽的塊狀組織，即快速繁殖的中間繁殖體)。其次取組織培養(yǎng)中易產(chǎn)生褐化現(xiàn)象的植物的外植體或培養(yǎng)物(以下簡(jiǎn)稱培養(yǎng)對(duì)象)，用下面的方法之一進(jìn)行培養(yǎng)(1)將培養(yǎng)對(duì)象和中間繁殖體共同接種于培養(yǎng)對(duì)象的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；(2)將中間繁殖體在培養(yǎng)對(duì)象的培養(yǎng)基中先培養(yǎng)20～40天，然后去掉中間繁殖體，再在該培養(yǎng)基中接種培養(yǎng)對(duì)象；(3)用培養(yǎng)過(guò)中間繁殖體的液體培養(yǎng)基再配制培養(yǎng)對(duì)象的培養(yǎng)基，然后接種培養(yǎng)對(duì)象。例如，用不附加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和瓊脂的MS基本培養(yǎng)基培養(yǎng)紅掌，10天左右去除紅掌，然后在該液體培養(yǎng)基中加入培養(yǎng)對(duì)象組織培養(yǎng)與快速繁殖所需的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和瓊脂固化劑，以及再補(bǔ)充一些營(yíng)養(yǎng)物配制新培養(yǎng)基，再在這種培養(yǎng)基上接種培養(yǎng)對(duì)象。蝴蝶蘭是一種蘭科觀賞植物，其組織培養(yǎng)的外植體有花梗芽、莖芽和幼嫩葉片等，但經(jīng)常是使用花梗芽。蝴蝶蘭組織培養(yǎng)中外植體百分之百地存在嚴(yán)重褐化現(xiàn)象。這嚴(yán)重地影響了花梗芽的生長(zhǎng)發(fā)育。將蝴蝶蘭花梗帶芽切段或者已誘導(dǎo)出的花梗芽和紅掌叢芽快一起接種于蝴蝶蘭花梗芽培養(yǎng)基(MS+BA3mg/L+3％蔗糖，PH5.8，瓊脂0.7％固化)，每培養(yǎng)瓶裝培養(yǎng)基25ml，接種一個(gè)花梗帶芽切段或者已誘導(dǎo)出的花梗芽和3～4塊直徑1cm左右的紅掌叢芽塊。這樣可以基本消除蝴蝶蘭花梗芽組織培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生的褐化現(xiàn)象，而對(duì)照(蝴蝶蘭花梗芽單獨(dú)培養(yǎng))百分之百產(chǎn)生嚴(yán)重褐化現(xiàn)象。
本發(fā)明的有益效果是利用不褐化植物組織培養(yǎng)快速繁殖的中間繁殖體產(chǎn)生的天然抗褐化物質(zhì)，能有效地解決易褐化植物組織培養(yǎng)中的褐化問(wèn)題。
實(shí)施例(1)取天南星科花燭屬觀賞植物紅掌的組織培養(yǎng)快速繁殖的中間繁殖體(叢芽塊)和蝴蝶蘭花梗芽共培養(yǎng)于蝴蝶蘭花梗芽的培養(yǎng)基(MS+BA3mg/L+3％蔗糖，PH5.8，瓊脂0.7％固化)中，每培養(yǎng)瓶裝培養(yǎng)基25ml，接種一個(gè)花梗芽和3～4塊直徑1cm左右的紅掌叢芽塊，能基本消除蝴蝶蘭花梗芽組織培養(yǎng)中的褐化現(xiàn)象。先將紅掌叢芽塊在該培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)3～5天，再接蝴蝶蘭花梗芽，效果更好。
實(shí)施例(2)將紅掌快速繁殖的中間繁殖體先在繼代培養(yǎng)基(MS+BA3mg/L+NAA0.2mg/L+3％蔗糖，PH5.8，瓊脂0.7％固化)上繼代培養(yǎng)30天左右(每培養(yǎng)瓶裝培養(yǎng)基25ml，接種3～4塊直徑1cm左右的紅掌從芽塊)，之后去除培養(yǎng)物，然后將卡特蘭腋芽外植體接種于該培養(yǎng)基上，能基本消除卡特蘭腋芽組織培養(yǎng)中的褐化現(xiàn)象，且腋芽可生根萌發(fā)。而對(duì)照(卡特蘭腋芽外植體接種于新鮮培養(yǎng)基中)全部褐化，生長(zhǎng)發(fā)育受抑制，甚至死亡。
實(shí)施例(3)天南星科花燭屬觀賞植物觀葉花燭在組織培養(yǎng)過(guò)程中也不產(chǎn)生褐化現(xiàn)象，將其快速繁殖的中間繁殖體先在培養(yǎng)基(MS+BA3mg/L+NAA0.2mg/L+3％蔗糖，PH5.8，瓊脂0.7％固化)上繼代培養(yǎng)30天左右，之后去除培養(yǎng)物，然后將美冠蘭芽外植體接種于該繼代培養(yǎng)基上，能基本消除美冠蘭芽組織培養(yǎng)中的褐化現(xiàn)象，培養(yǎng)半個(gè)月左右芽開始萌發(fā)。而對(duì)照(美冠蘭芽外植體接種于新鮮培養(yǎng)基中)全部褐化，生長(zhǎng)發(fā)育受抑制。
權(quán)利要求
1.一種防止植物組織培養(yǎng)中褐化現(xiàn)象產(chǎn)生的方法，其特征是1)取組織培養(yǎng)中不產(chǎn)生褐化現(xiàn)象的植物，經(jīng)組織培養(yǎng)形成快速繁殖的中間繁殖體；2)將易褐化植物的培養(yǎng)物與不褐化植物的中間繁殖體共同接種于易褐化植物的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；3)將不褐化植物的中間繁殖體在易褐化的培養(yǎng)對(duì)象的培養(yǎng)基中先培養(yǎng)20～40天，然后去掉中間繁殖體，再在該培養(yǎng)基中接種培養(yǎng)對(duì)象；4)用培養(yǎng)過(guò)不易褐化植物中間繁殖體的液體培養(yǎng)基再配制成易褐化的培養(yǎng)對(duì)象的培養(yǎng)基，然后接種培養(yǎng)對(duì)象。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種防止植物組織培養(yǎng)中褐化現(xiàn)象產(chǎn)生的方法，其特征是所述的組織培養(yǎng)中不產(chǎn)生褐化現(xiàn)象的植物為天南星科花燭屬觀賞植物紅掌。
全文摘要
一種防止植物組織培養(yǎng)中褐化現(xiàn)象產(chǎn)生的方法。其主要是利用組織培養(yǎng)中不褐化植物的組織培養(yǎng)物的代謝過(guò)程抑制易褐化植物培養(yǎng)中褐化現(xiàn)象的產(chǎn)生。將不褐化植物快速繁殖的中間繁殖體(以下簡(jiǎn)稱中繁體)與易褐化植物外植體或培養(yǎng)物(以下簡(jiǎn)稱培養(yǎng)對(duì)象)共培養(yǎng)，將培養(yǎng)對(duì)象接種于已培養(yǎng)過(guò)中繁體20～40天的培養(yǎng)基中和將培養(yǎng)對(duì)象接種于用培養(yǎng)過(guò)中繁體的液體培養(yǎng)基再配制的培養(yǎng)基中，均能有效地抑制易褐化植物組織培養(yǎng)中褐化現(xiàn)象的產(chǎn)生，甚至消除褐化現(xiàn)象。
文檔編號(hào)A01H4/00GK1468508SQ0213440
公開日2004年1月21日 申請(qǐng)日期2002年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月19日
發(fā)明者呂復(fù)兵 申請(qǐng)人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所