專利名稱：金龜子綠僵菌無紡布菌條生產(chǎn)工藝方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種殺蟲真菌的新劑型生產(chǎn)方法，具體地說是用一種分離自天牛的金龜子綠僵菌[Metarhizium anisopliae(Metsch.)]RCEF0770菌株的無紡布菌條生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
20世紀(jì)50年代以來，化學(xué)農(nóng)藥雖在控制害蟲方面起了巨大的作用，但是隨之而來的是嚴(yán)重的生態(tài)后果如導(dǎo)致某些害蟲種群對(duì)常用殺蟲劑抗性的增強(qiáng)，防治效果下降，用藥量增加；大量殺傷害蟲天敵，引起目標(biāo)害蟲再度猖獗和次要害蟲上升為主要害蟲；某些殺蟲劑的殘留對(duì)環(huán)境和食物的污染，影響了人類的生存環(huán)境。由于大量及不合理的使用化學(xué)農(nóng)藥，造成農(nóng)藥的殘留累積，使環(huán)境受到污染，生態(tài)平衡遭到破壞。主要表現(xiàn)在有益生物被殺傷，害蟲的抗藥性日起嚴(yán)重，農(nóng)副產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量增加等。
為了克服以上弊端，生物防治產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展。特別是蟲生真菌由于有獨(dú)特的擴(kuò)散能力和在自然界的強(qiáng)大宿存力而得到人們的青睞。目前世界上已有20多種真菌殺蟲劑產(chǎn)品登記注冊(cè)，主要的產(chǎn)品多為球孢白僵菌和金龜子綠僵菌粉劑，防治的對(duì)象主要為森林昆蟲、溫室及蔬菜害蟲。我國(guó)主要由一些半工業(yè)化的白僵菌生產(chǎn)廠，生產(chǎn)白僵菌菌粉和高孢粉，用于馬尾松毛蟲和玉米螟的防治。由于蟲生真菌主要依靠昆蟲表皮入侵，所以對(duì)于刺吸式口器害蟲和鉆蛀性害蟲卻無良好的劑型和使用方法。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，實(shí)施農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略，生物防治的實(shí)行則是必須的，真菌殺蟲劑的生產(chǎn)也是一個(gè)很有發(fā)展前景的產(chǎn)業(yè)。本發(fā)明提供一種對(duì)于刺吸式口器害蟲和鉆蛀性害蟲有良好殺滅效果的金龜子綠僵菌無紡布菌條生產(chǎn)工藝方法。
實(shí)現(xiàn)上述目的具體技術(shù)解決方案如下金龜子綠僵菌無紡布菌條生產(chǎn)工藝方法，其特征在于A、菌種RCEF0770菌株，分離自陜西楊陵的青楊天牛的金龜子綠僵菌；B、一級(jí)斜面菌種培養(yǎng)將分離純化的菌種接種于PPDA培養(yǎng)基斜面，放入25℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)9～14天，待菌絲長(zhǎng)滿斜面并產(chǎn)孢時(shí)，轉(zhuǎn)入搖瓶培養(yǎng)；
C、液體種子培養(yǎng)在500ml三角瓶中，裝入200ml的液體種子培養(yǎng)基，1.5pa/kg高壓滅菌30min，待冷卻至40℃左右，接入斜面菌種，接種量為500ml三角瓶接2支培養(yǎng)好的一級(jí)斜面菌種(試管規(guī)格150mm×15mm)。接種后置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱(24-26℃，180轉(zhuǎn)/分)培養(yǎng)3天～5天即可；D、液體發(fā)酵生產(chǎn)采用三級(jí)發(fā)酵(1)、一級(jí)種子罐生產(chǎn)取70L氣升式發(fā)酵罐，裝入50L液體培養(yǎng)基，溫度大于95℃，并加入消泡劑聚氧丙烯氧化乙烯甘油醚15ml，在14.7×104Pa壓力下，保壓25～40分鐘，消毒冷卻后將4瓶上述培養(yǎng)好的500ml搖瓶種子接入培養(yǎng)(24-26℃)，通氣量1∶0.5，保壓4.903～7.0845×104Pa，經(jīng)60～72小時(shí)通氣培養(yǎng)，達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，接入二級(jí)種子罐；(2)、二級(jí)種子罐生產(chǎn)取700L氣升式發(fā)酵罐，裝入450L液體培養(yǎng)基，溫度大于95℃，并加入消泡劑聚氧丙烯氧化乙烯甘油醚150ml，在14.7×104Pa壓力下，保壓25～40min，消毒冷卻后將一級(jí)種子罐種子50L全部接入二級(jí)種子罐培養(yǎng)，溫度24～26℃，通氣量1∶0.5，保壓4.903～7.0845×104Pa，經(jīng)60～72小時(shí)通氣培養(yǎng)，達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，接入三級(jí)種子罐；(3)、三級(jí)種子罐生產(chǎn)取7T氣升式發(fā)酵罐，裝入4.5T液體培養(yǎng)基液體，pH6.0～7.0，加入的熱水溫度大于95℃，并加入消泡劑聚氧丙烯氧化乙烯甘油醚1500ml，通入蒸汽加熱到121℃，保壓30分鐘，冷卻至24～26℃，將二級(jí)種子罐培養(yǎng)好的液體種子500L全部接入，通氣培養(yǎng)，通氣量1∶0.4～0.5V/V·min，攪拌轉(zhuǎn)速190r/m，罐壓4.903～7.0845×104Pa，培養(yǎng)時(shí)間72～96小時(shí)；當(dāng)發(fā)酵液中出現(xiàn)大量菌絲及液生孢子時(shí)，殘?zhí)窃?％以下，發(fā)酵液較粘稠，另外鏡檢菌絲變細(xì)、菌絲體中無明顯的液泡，發(fā)酵液中無明顯斷裂的菌絲，可放罐；E、將無紡布條在1.5Pa/Kg高壓滅菌30min后，冷卻后按700條無紡布條接入100L發(fā)酵液的比例接(浸)入已培養(yǎng)好的發(fā)酵液，在20～28℃，RH95％的培養(yǎng)室架上平鋪培養(yǎng)5天，待菌條上長(zhǎng)滿菌絲后，移入溫度在20～28℃，RH90％的培養(yǎng)室繼續(xù)培養(yǎng)3～5天，菌條上長(zhǎng)滿大量孢子，風(fēng)干即可。
所述的斜面培養(yǎng)基液包括馬鈴薯200g，蛋白胨10g，葡萄糖60g，瓊脂20g，水1000ml。
所述的液體種子培養(yǎng)基包括在1000ml培養(yǎng)基中含20g葡萄糖、40g黃豆粉、0.5gKH2PO4，各組分混合后加水補(bǔ)至1000ml，并用飽和NaOH調(diào)pH至6.3。
所述的種子罐生產(chǎn)液體培養(yǎng)基包括6％麩皮煮汁、2％白砂糖、2％黃豆粉和005％K2HPO4，pH6.3。即在1000ml培養(yǎng)基中含20g白砂糖糖、20g黃豆粉、0.5gKH2PO4，加麩皮煮汁(在800ml水中加麩皮60g煮30分鐘，一層紗布過濾，去除殘?jiān)?，各組分混合后加水補(bǔ)至1000ml，并用飽和NaOH調(diào)pH至6.3。
所述的消泡劑為聚氧丙烯氧化乙烯甘油醚，用量為發(fā)酵液總量的0.03％(即50L中加量為15ml，500L培養(yǎng)料中加150ml，5T培養(yǎng)料中加1500ml)。
按照權(quán)利要求1、2、3、4和5所述的其中任何一款金龜子綠僵菌無紡布菌條生產(chǎn)工藝方法，其特征是所述的無紡布條為長(zhǎng)60cm，寬5cm，厚04cm。
由于蟲生真菌具有可觀的擴(kuò)散效果，較長(zhǎng)的土壤宿存能力，獨(dú)特的體壁侵染方式，以及害蟲抗性發(fā)展緩慢和容易生產(chǎn)等顯著優(yōu)點(diǎn)，因此以綠僵菌為代表的真菌殺蟲劑被世界糧農(nóng)組織在西非撒哈拉沙漠以南國(guó)家大面積推廣治蝗；另外，它們對(duì)于刺吸式口器害蟲如蚜蟲、飛虱、葉蟬、粉虱、介殼蟲等和鉆蛀性害蟲如玉米螟、各種天牛、吉丁蟲等有著強(qiáng)大的毒力，只要選擇良好的施用方式和正確的劑型，就能取得優(yōu)于其他生物或化學(xué)農(nóng)藥無可比擬的良好效果。
本發(fā)明工藝生產(chǎn)的無紡布菌條劑型具有獨(dú)特的先進(jìn)性一是對(duì)害蟲的防治效果持久。由于無紡布上的真菌孢子生存活性遠(yuǎn)高于孢子粉，而且，真菌還可以利用無紡布上的營(yíng)養(yǎng)不斷生長(zhǎng)產(chǎn)孢，孢子存活力明顯加長(zhǎng)，有利于殺滅羽化周期長(zhǎng)的天牛等害蟲；二是無紡布真菌菌條劑型在田間壽命很長(zhǎng)，受天氣影響相對(duì)較小。無紡布上的孢子主要是靠飄移而接觸蟲體的，與昆蟲接觸的機(jī)會(huì)相對(duì)較多，環(huán)境中有利因子出現(xiàn)的時(shí)間較長(zhǎng)，只要條件具備就會(huì)侵染害蟲，受環(huán)境制約的幅度較小；三是本發(fā)明工藝生產(chǎn)的金龜子綠僵菌菌條對(duì)天牛類蛀干害蟲殺蟲效果明顯且穩(wěn)定；四是本發(fā)明生產(chǎn)工藝不復(fù)雜、工藝穩(wěn)定、易調(diào)控、成功率高。五是投資少，占地小、無三廢問題，尤其適于中小企業(yè)采用。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1該金龜子綠僵菌無紡布菌條生產(chǎn)工藝方法，包括五道生產(chǎn)工序1、菌種RCEF0770菌株，分離自天牛的金龜子綠僵菌[Metarhizium anisopliae(Metsch.)]；2、一級(jí)斜面菌種培養(yǎng)將分離純化的菌種接種于PPDA培養(yǎng)基斜面，每1000ml培養(yǎng)基含馬鈴薯200g，蛋白胨10g，葡萄糖60g，瓊脂20g，水1000ml；放入25℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)10天，待菌絲長(zhǎng)滿斜面并產(chǎn)孢時(shí)，即可轉(zhuǎn)入搖瓶培養(yǎng)；3、液體種子培養(yǎng)在500ml三角瓶中，裝入200ml的液體種子培養(yǎng)基，1.5pa/kg高壓滅菌30min，待冷卻至40℃左右，接入斜面菌種，接種量為500ml三角瓶接2支培養(yǎng)好的一級(jí)斜面菌種，試管規(guī)格150mm×15mm，接種后置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱，24-26℃，180轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)3天～5天即可；4、液體發(fā)酵生產(chǎn)該工序分為三個(gè)步驟即采用三級(jí)發(fā)酵(1)、一級(jí)種子罐生產(chǎn)取70L氣升式發(fā)酵罐，按配方加入原料和水，即50L液體培養(yǎng)基，溫度大于95℃，并加入消泡劑聚氧丙烯氧化乙烯甘油醚15ml，在14.7×104Pa壓力下，保壓25～40分鐘，消毒冷卻后將4瓶上述培養(yǎng)好的500ml搖瓶種子接入培養(yǎng)，24-26℃，通氣量1∶0.5，保壓4.903～7.0845×104Pa，經(jīng)60～72小時(shí)通氣培養(yǎng)，達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，接入二級(jí)種子罐；(2)、二級(jí)種子罐生產(chǎn)取700L氣升式發(fā)酵罐，以培養(yǎng)500L液體菌種計(jì)算，注意扣除消毒過程中的冷凝水200L；按配方加入原料和水，即裝入450L液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基配方及其它控制條件同一級(jí)種子罐生產(chǎn)；達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，接入三級(jí)種子罐。
(3)、三級(jí)種子罐生產(chǎn)取7T氣升式發(fā)酵罐，裝入4.5T液體培養(yǎng)基液體，發(fā)酵用培養(yǎng)基配方同一級(jí)種子罐生產(chǎn)，pH6.0～7.0。將培養(yǎng)料按比例投入發(fā)酵罐中，加入熱水，熱水溫度等于95℃，通入蒸汽加熱到121℃，保壓30分鐘，冷卻至24～26℃，將二級(jí)種子罐培養(yǎng)好的液體種子500L全部接入，注意培養(yǎng)時(shí)體積應(yīng)控制在發(fā)酵罐體積80％，即5000L，通氣培養(yǎng)，通氣量1∶0.4V/V·min，攪拌轉(zhuǎn)速190r/m，罐壓4.903～7.0845×104Pa，培養(yǎng)時(shí)間80小時(shí)；經(jīng)檢驗(yàn)合格，即可放罐。
當(dāng)發(fā)酵液中出現(xiàn)大量菌絲及液生孢子時(shí)，殘?zhí)窃?％以下，發(fā)酵液較粘稠，另外鏡檢菌絲變細(xì)、菌絲體中無明顯的液泡，發(fā)酵液中無明顯斷裂的菌絲，可放罐；5、菌條滅菌及接種培養(yǎng)將無紡布條剪成長(zhǎng)60cm，寬5cm，厚0.5cm的條狀，在1.5Pa/Kg高壓滅菌30min后，冷卻后按700條無紡布條接入100L發(fā)酵液的比例接(浸)入已培養(yǎng)好的發(fā)酵液，在20～28℃，RH95％的培養(yǎng)室架上平鋪培養(yǎng)5天，待菌條上長(zhǎng)滿菌絲后，移入溫度在20～28℃，RH90％的培養(yǎng)室繼續(xù)培養(yǎng)3～5天，菌條上長(zhǎng)滿大量孢子，風(fēng)干即可。
權(quán)利要求
1.金龜子綠僵菌無紡布菌條生產(chǎn)工藝方法，其特征在于A、菌種RCEF0770菌株，分離自天牛的金龜子綠僵菌[Metarhizium anisopliae(Metsch.)]；B、一級(jí)斜面菌種培養(yǎng)將分離純化的菌種接種于PPDA培養(yǎng)基斜面，放入25℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)9～14天，待菌絲長(zhǎng)滿斜面并產(chǎn)孢時(shí)，轉(zhuǎn)入搖瓶培養(yǎng)；C、液體種子培養(yǎng)在500ml三角瓶中，裝入200ml的液體種子培養(yǎng)基，1.5pa/kg高壓滅菌30min，待冷卻至40℃左右，接入斜面菌種，接種量為500ml三角瓶接2支培養(yǎng)好的一級(jí)斜面菌種，試管規(guī)格150mm×15mm)，接種后置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱，24-26℃，180轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)3天～5天即可；D、液體發(fā)酵生產(chǎn)采用三級(jí)發(fā)酵(1)、一級(jí)種子罐生產(chǎn)取70L氣升式發(fā)酵罐，裝入50L液體培養(yǎng)基，溫度大于95℃，并加入消泡劑聚氧丙烯氧化乙烯甘油醚15ml，在14.7×104Pa壓力下，保壓25～40分鐘，消毒冷卻后將4瓶上述培養(yǎng)好的500ml搖瓶種子接入培養(yǎng)，24-26℃，通氣量1∶0.5，保壓4.903～7.0845×104Pa，經(jīng)60～72小時(shí)通氣培養(yǎng)，達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，接入二級(jí)種子罐；(2)、二級(jí)種子罐生產(chǎn)取700L氣升式發(fā)酵罐，裝入450L液體培養(yǎng)基，溫度大于95℃，并加入消泡劑聚氧丙烯氧化乙烯甘油醚150ml，在14.7×104Pa壓力下，保壓25～40min，消毒冷卻后將一級(jí)種子罐種子50L全部接入二級(jí)種子罐培養(yǎng)，溫度24～26℃，通氣量1∶0.5，保壓4.903～7.0845×104Pa，經(jīng)60～72小時(shí)通氣培養(yǎng)，達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，接入三級(jí)種子罐；(3)、三級(jí)種子罐生產(chǎn)取7T氣升式發(fā)酵罐，裝入4.5T液體培養(yǎng)基液體，pH6.0～7.0，加入的熱水溫度大于95℃，并加入消泡劑聚氧丙烯氧化乙烯甘油醚1500ml，通入蒸汽加熱到121℃，保壓30分鐘，冷卻至24～26℃，將二級(jí)種子罐培養(yǎng)好的液體種子500L全部接入，通氣培養(yǎng)，通氣量1∶0.4～0.5V/V·min，攪拌轉(zhuǎn)速190r/m，罐壓4.903～7.0845×104Pa，培養(yǎng)時(shí)間72～96小時(shí)當(dāng)發(fā)酵液中出現(xiàn)大量菌絲及液生孢子時(shí)，殘?zhí)窃?％以下，發(fā)酵液較粘稠，另外鏡檢菌絲變細(xì)、菌絲體中無明顯的液泡，發(fā)酵液中無明顯斷裂的菌絲，可放罐；E、將無紡布條在1.5Pa/Kg高壓滅菌30min后，冷卻后按700條無紡布條接入100L發(fā)酵液的比例接(浸)入已培養(yǎng)好的發(fā)酵液，在20～28℃，RH95％的培養(yǎng)室架上平鋪培養(yǎng)5天，待菌條上長(zhǎng)滿菌絲后，移入溫度在20～28℃，RH90％的培養(yǎng)室繼續(xù)培養(yǎng)3～5天，菌條上長(zhǎng)滿大量孢子，風(fēng)干即可。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金龜子綠僵菌無紡布菌條生產(chǎn)工藝方法，其特征在于所述的斜面培養(yǎng)基液包括馬鈴薯200g，蛋白胨10g，葡萄糖40g，瓊脂20g，水1000ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金龜子綠僵菌無紡布菌條生產(chǎn)工藝方法，其特征在于所述的液體種子培養(yǎng)基包括在1000ml培養(yǎng)基中含20g葡萄糖、40g黃豆粉、0.5gKH2PO4，各組分混合后加水補(bǔ)至1000ml，并用飽和NaOH調(diào)pH至6.3。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金龜子綠僵菌無紡布菌條生產(chǎn)工藝方法，其特征在于所述的種子罐生產(chǎn)液體培養(yǎng)基包括如在1000ml培養(yǎng)基中含20g白砂糖糖、20g黃豆粉、0.5gKH2PO4，加麩皮煮汁，即在800ml水中加麩皮60g煮30分鐘，一層紗布過濾，去除殘?jiān)?，各組分混合后加水補(bǔ)至1000ml，并用飽和NaOH調(diào)pH至6.3。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金龜子綠僵菌無紡布菌條生產(chǎn)工藝方法，其特征在于所述的消泡劑為聚氧丙烯氧化乙烯甘油醚，用量為培養(yǎng)液(發(fā)酵液)總量的0.03％，即50L中加量為15ml，500L培養(yǎng)料中加150ml，5T培養(yǎng)料中加1500ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4和5所述的其中任何一款金龜子綠僵菌無紡布菌條生產(chǎn)工藝方法，其特征在于所述的無紡布條為長(zhǎng)60cm，寬5cm，厚0.4cm。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種真菌殺蟲劑新劑型的生產(chǎn)方法，確切地說是金龜子綠僵菌無紡布菌條生產(chǎn)工藝方法。該方法包括五道生產(chǎn)工序，即菌種的取得、一級(jí)斜面菌種培養(yǎng)、液體種子培養(yǎng)、液體發(fā)酵罐生產(chǎn)和菌條的接種培養(yǎng)。本發(fā)明生產(chǎn)的殺蟲劑，對(duì)害蟲的防治效果持久，對(duì)天牛類蛀干害蟲殺蟲效果明顯且穩(wěn)定，受天氣影響相對(duì)較小，工藝穩(wěn)定，投資少，占地小，生產(chǎn)無三廢問題。
文檔編號(hào)A01N63/00GK1419823SQ0213865
公開日2003年5月28日 申請(qǐng)日期2002年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月20日
發(fā)明者李增智, 樊美珍, 黃勃, 李農(nóng)昌, 王四寶, 李春如 申請(qǐng)人:安徽林苑蟲草研究所