專利名稱：一種應(yīng)用同源重組法獲得轉(zhuǎn)基因柞蠶生產(chǎn)目的蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域。涉及一種利用同源重組序列組建轉(zhuǎn)基因柞蠶表達載體生產(chǎn)外源基因產(chǎn)物的方法，主要包括通過轉(zhuǎn)基因昆蟲技術(shù)對柞蠶進行改造，由此獲得能夠在體內(nèi)生產(chǎn)外源基因產(chǎn)物的柞蠶。
背景技術(shù)：
自1974年美國學(xué)者Jaenisch首次應(yīng)用顯微注射法獲得轉(zhuǎn)基因小鼠以來，轉(zhuǎn)基因動物已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、疾病動物模型的建立、藥用蛋白質(zhì)的生產(chǎn)、農(nóng)業(yè)等各個領(lǐng)域。
轉(zhuǎn)基因動物的研究建立在經(jīng)典遺傳學(xué)、分子遺傳學(xué)、結(jié)構(gòu)遺傳學(xué)和DNA重組技術(shù)的基礎(chǔ)之上。作為生物科學(xué)領(lǐng)域的高新技術(shù)，轉(zhuǎn)基因動物的研究既具有深遠(yuǎn)的理論價值，又有重大的應(yīng)用價值，因而近年來成為生物工程領(lǐng)域的研究熱點之一。
轉(zhuǎn)基因動物是指用實驗導(dǎo)入的方法使外源基因在染色體基因組內(nèi)穩(wěn)定整合，并能遺傳給后代的一類動物。
從1985年有人提出利用轉(zhuǎn)基因動物乳腺生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)至今的數(shù)年間，這一近乎天方夜譚的神話已逐漸變成了現(xiàn)實。通過動物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)人類藥用蛋白的研究已取得了初步成功。利用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)人類藥用蛋白等非常規(guī)畜牧產(chǎn)品，是目前世界上轉(zhuǎn)基因研究的熱點之一。
1991年，英國科學(xué)家將人的α1-抗胰蛋白酶基因轉(zhuǎn)入綿羊受精卵，成功地獲得了5只轉(zhuǎn)基因綿羊，其中4只母綿羊乳中都表達了人的α-1抗胰蛋白酶，而且從綿羊乳中純化的α1-抗胰蛋白酶與人血漿中的α1-抗胰蛋白酶具有相同的生物學(xué)活性。我國科學(xué)家也成功培育了乳汁中含有活性人凝血因子IX的轉(zhuǎn)基因綿羊。利用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)人類藥用蛋白的生物反應(yīng)器研究還相繼在豬、山羊等其它家畜上取得了成功，表明利用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)人類藥用蛋白等生物活性物質(zhì)是可能和可行的。
現(xiàn)在，有些生物技術(shù)公司已經(jīng)瞄準(zhǔn)了轉(zhuǎn)基因昆蟲，利用昆蟲作為一種生物反應(yīng)器。研究認(rèn)為，利用轉(zhuǎn)基因昆蟲生產(chǎn)藥物，與轉(zhuǎn)基因哺乳動物相比，具有不少特點和優(yōu)點如(1)轉(zhuǎn)基因昆蟲所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的糖部分(糖蛋白)也能夠被糖基化；(2)有些藥物，如抗血栓形成藥物和血液稀釋劑用轉(zhuǎn)基因昆蟲來生產(chǎn)可能更好，因為沒有生物交叉反應(yīng)；(3)昆蟲的世代時間短，約8-13周；(4)生產(chǎn)成本低，據(jù)分析，一個細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)每年可生產(chǎn)100公斤未純化的單克隆抗體，其生產(chǎn)成本預(yù)計每克100美元，而用轉(zhuǎn)基因昆蟲生產(chǎn)每克需0.1-0.3美元。
日本科學(xué)家Masafumi Yamao等曾于1999年利用同源重組技術(shù)成功地在家蠶絲腺中表達出綠色熒光蛋白，獲得了轉(zhuǎn)基因家蠶。我國學(xué)者也先后將抗NPV-核酶和新霉素抗性基因轉(zhuǎn)移到家蠶的染色體上。但是，家蠶的絲素基因是由兩條多肽鏈，一條重鏈-H和一條輕鏈-L所組成。在進行轉(zhuǎn)基因研究中，由于兩條鏈的原因要想在絲腺中表達純合的外源基因產(chǎn)物，純化非常困難。
柞蠶是我國特產(chǎn)的一種經(jīng)濟飼養(yǎng)昆蟲，它有一系列完整的生產(chǎn)體系。每年有成千上萬噸的柞蠶可被利用，資源豐富、穩(wěn)定。但是，目前傳統(tǒng)蠶繭制品越來越不適應(yīng)市場的需要，產(chǎn)品單一的問題越來越突出。柞蠶資源的利用還僅僅停留在農(nóng)業(yè)的副業(yè)領(lǐng)域上。而對蠶蛹、蠶蛾、絲等進行的開發(fā)和利用，還僅僅停留在以柞蠶資源為原材料的產(chǎn)品深加工上，其產(chǎn)品附加值的含量不高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用柞蠶體為活體宿主來大量表達外源基因產(chǎn)物的方法，提高柞蠶的經(jīng)濟價值。
為了充分利用我國豐富的柞蠶資源，提高柞蠶的經(jīng)濟價值，本發(fā)明首次采用基因工程技術(shù)，以柞蠶染色體上的線性DNA片段(包括各種基因的5’端與3’端調(diào)控及部分結(jié)構(gòu)基因)為同源序列構(gòu)建轉(zhuǎn)移表達載體，經(jīng)線性化及脂質(zhì)體包埋后直接注射到柞蠶雌蛾的交配囊或雄蠶蛹的睪丸內(nèi)，后代經(jīng)過同源重組后繁育成轉(zhuǎn)基因柞蠶，以此柞蠶幼蟲活體或蛹體為宿主，建立柞蠶個體生物反應(yīng)器，實現(xiàn)在柞蠶體內(nèi)來表達生產(chǎn)外源基因產(chǎn)物的目的。
本發(fā)明的技術(shù)方案是克隆柞蠶染色體上的線性DNA片段(包括各種基因的5’端與3’端調(diào)控及部分結(jié)構(gòu)基因)，以此線性DNA片段為同源序列，組建轉(zhuǎn)基因柞蠶基因轉(zhuǎn)移表達載體。將目的基因例如一些能夠改變柞蠶絲性質(zhì)的基因(如綠色熒光蛋白基因、蛛絲牽引絲蛋白基因)，或另有其它目的及用途的基因插入到組建好的轉(zhuǎn)移表達載體上。組建好的轉(zhuǎn)移表達載體經(jīng)線性化及脂質(zhì)體包埋后直接注射到柞蠶雌蛾的交配囊或雄蠶蛹的睪丸內(nèi)，交配產(chǎn)卵后外源基因經(jīng)過同源重組被轉(zhuǎn)移到柞蠶染色體上。篩選含有外源基因的轉(zhuǎn)基因柞蠶，再經(jīng)過近一步的繁育就可以柞蠶幼蟲活體或蛹體為宿主，在個體內(nèi)大量生產(chǎn)外源基因產(chǎn)物。
柞蠶屬于一種變態(tài)昆蟲，在不同的變態(tài)過程中體內(nèi)的物質(zhì)發(fā)生巨大的變化，其中包括蛋白質(zhì)的降解與重新合成，如當(dāng)由幼蟲變?yōu)橛嫉倪^程中，五齡幼蟲在很短的時間內(nèi)(5天左右)合成大量的絲素和絲膠蛋白(約為1-1.5克左右)。我們可以利用柞蠶的這種特性，以柞蠶染色體上的線性DNA片段為同源重組序列組建柞蠶基因轉(zhuǎn)移表達載體，將外源基因克隆到該轉(zhuǎn)移表達載體上培育出轉(zhuǎn)基因柞蠶。利用柞蠶幼蟲活體或蛹為宿主在體內(nèi)大量生產(chǎn)外源基因產(chǎn)物。
本發(fā)明的優(yōu)點和效果是1、柞蠶的世代周期時間短，約15-20周。
2、產(chǎn)物易于純化，由于外源基因產(chǎn)物被直接分泌到絲腺或個體內(nèi)，而柞蠶的體內(nèi)尤其是絲腺內(nèi)含有的蛋白種類比較少，所以當(dāng)進行外源基因表達產(chǎn)物的純化時，工藝簡單。
3、與原核表達系統(tǒng)相比較，轉(zhuǎn)基因昆蟲所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的糖部分(糖蛋白)也能夠被糖基化；與轉(zhuǎn)基因哺乳動物相比，由于與人類的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，所以沒有生物交叉反應(yīng)，非常安全。
4、有些柞蠶基因的啟動子功能非常強大，所以表達的外源基因產(chǎn)物成本比較低廉。以每頭柞蠶幼蟲分泌500mg外源基因產(chǎn)物來計算，約合人民幣0.05-0.2元左右。
具體實施例方式
下面詳細(xì)說明本發(fā)明的具體實施方案。
柞蠶絲素基因表達載體的組建和綠色熒光蛋白在絲腺內(nèi)的表達1、柞蠶絲素基因的5’端與3’端及部分結(jié)構(gòu)基因的克隆1)柞蠶絲素基因的5’端及部分結(jié)構(gòu)基因的克隆柞蠶DNA的提取取柞蠶蛹脂肪組織0.5g，加液氮研磨成粉狀，加入提取緩沖液2ml，再加入蛋白酶K 5μg/ml，65℃4h，用同體積酚抽提2次，上清用異丙醇沉淀，干燥后溶于400μl TE中，分別用酚、酚/氯仿、氯仿各抽提一次，乙醇沉淀干燥后溶于200μl TE中加入RNase 5μg/ml 37℃保溫30min備用。
PCR引物的合成 參考天蠶和家蠶部分絲素基因序列，人工合成引物5’端引物(AF1)TCC AGC GTT ACC AAT GAG AGC GCT TCA3’端引物(AF2)ATT GTC TAC GTA TTC GTC GTG GTG A柞蠶絲素基因5’端片段的克隆以柞蠶DNA為模板，以AF1、AF2為引物采用兩步法進行擴增。循環(huán)參數(shù)為94℃預(yù)變性1min后，98℃變性20s，68℃退火延伸3min，共35個循環(huán)，然后72℃延伸10min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)低熔點瓊脂糖凝膠電泳法回收純化后，在T4 DNA連接酶作用下與pDM18-T載體連接得到質(zhì)粒pMDAfib5，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。提取DNA進行酶切鑒定，并分析5’端片段序列如下AAATTCTTTA CAACTTCATT AGAATACGTC GATTTTTCTC TACTTCATAT AAATATTCTA TAGATGTGTT TGCTATATAAATACTTTAAA AAAAATGTCT CAACGGTTGT GAAAACTGTC AAAATCTGTT GCGTAGTTCA GAAAAACTAA GGAAACACACAAACATACAG AAAATTTATT TTACAAAAGT ACGGAGATAT ATAAAAATAT TTCGATTACT TTAGAATTAC AATAAAACTATTTGACAATT TGATTGCAAA TATAGACCAT GACAACACCA CATCTTTGTT ATCTAAAACA CGTAGCGACA ACACTCCTTGAACGTTGTTC GAGGATTACT ACGATAGTTG GCGGTTTTTT TTCCGCACCG CAAGAAAAGA GTAGAAATGT ACCGTATTTAAATCCAGTGC GGAAATTTTC ACGCAGAATT CGTTTCCATA CAATTCTATA GGTTACATAT CTTGCGGAAA TAAATTCGTGCCAAAAAGCC GAAGTGCGGG GACTAATAAA GATTTTATTT GGCATTCCTT CTAACCTTTA GATATAAATT TCTGTACGCGCGTATGTCAC TGAACTCCCC CTAAACGGCT GGACTAATTT TGATGAAATT TTGTTTGTGT GTTCCAGTGG ATCCGAGAATAGTTCAGATT CACAAATGGA GCCGGTAGGT GACGCCGCGG TTGACTTTTA GATTTTTTTA AATTATCAAC AACAACGTCCGCCCGGCCCG CTAGTTATGT ATGTATTTGT AAATGTAATC TCAAACCGTT CCTGTTGGAT CGACATTTAA TATGTTTAAGTGAATTAATT AACGTATAAC AGTCATAAGA AAATATTGCA ATAAAATCCC ATCATTTATT CTTTAGAGAC AATATAACCAAACAACAATA AGAATCAGAA TGTAATTACT GTACATTGTT CATGATAGGG GTTTAACTAT GATATTGTTT TAATTCTATA 注斜體字母ATG柞蠶絲素蛋白基因的起始密碼子根據(jù)與已知的天蠶絲素基因部分序列分析表明上面的柞蠶絲素基因5’端部分片段由CAAT box、TATA盒(Hogness box)、prim transcript、絲素蛋白的起始密碼子ATG和部分結(jié)構(gòu)基因及內(nèi)含子所組成。通過比較發(fā)現(xiàn)，在124-506nt、796-1194nt和1216-1298nt處有高度同源性，同源率分別為91.6％、95％、95％。若轉(zhuǎn)錄起始點第一個核苷酸標(biāo)為+1，則TATA盒位于-25處；CAAT盒位于-70處。
2)柞蠶絲素基因3’端序列的克隆mRNA的分離純化取柞蠶五齡幼蟲第5天的后部絲腺，在液氮中碾成粉末，按照TRIzol提取試劑盒說明書提取總RNA。然后按照QuickPrep mRNAPurification Kit操作手冊進行mRNA的分離純化。產(chǎn)物溶于10μl經(jīng)過DEPC處理的無RNase Free的dH2O中保存?zhèn)溆谩?br> 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 按照寶生物工程(大連)有限公司提供的3’-Full RACE CoreSet試劑盒的說明進行，反應(yīng)物組成如下10xRNA PCR Buffer21MgCl2(25mM) 41dNTP Mixture 21AMV Reverse Transcriptase XL(5U/1) 11RNase Inhibitor(40U/1) 0.51OligodT-3sites Adaptor Primer(2.5M) 11Total RNA11RNase Free dH2O 8.51Total201反應(yīng)條件為30℃10分鐘，50℃30分鐘，然后加熱到95℃5分鐘，最后冷卻到5℃5分鐘。
PCR擴增反應(yīng)在上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中加入10x Ex Taq Buffer(Mg2+Plus)10μl，dNTP Mixture 8μl，TaKaRa Ex Taq酶0.5μl，上游特異引物Ps+(5’-G TCT AGA GGT ACC AGA CGA GCA GGC CAT GAA CGT GCT-3’，引物設(shè)計參考GeneBank公開的柞蠶部分絲素基因序列Acces s ion No.D83241)1μl，3sitesAdaptor Primer 1μl，dH2O 59.5μl，總體積為100μl。94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分鐘，40個循環(huán)后72℃延伸10分鐘。
PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)低熔點瓊脂糖凝膠電泳法回收純化后，在T4 DNA連接酶作用下與pDM18-T載體連接得到質(zhì)粒pMDAfib3，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。提取DNA進行酶切鑒定，并分析3’端序列分析如下 注黑框內(nèi)的TAA柞蠶為絲素的終止密碼子黑體下劃線部分為3’UTR的加尾信號采用3’RACE方法從中國柞蠶品種741五齡幼蟲后部絲腺的mRNA中克隆的柞蠶絲素基因3’端片段長1.4kb。經(jīng)過序列分析及開放讀碼框分析證實，所克隆的基因片段與已知序列的同源性為85％，3’端在1311bp處為終止密碼子，在它的第1372 bp處有一個3’UTR的加尾信號AATAAA，與3’末端的poly(A)尾相距25個核苷酸。
2、組建柞蠶絲素基因轉(zhuǎn)移表達載體采用PCR方法從質(zhì)粒pMDAfib3上克隆到含有3’UTR及加尾信號AATAAA的DNA片段并克隆到pMDAfib3質(zhì)粒上的柞蠶絲素基因3’端片段上游的XbaI位點，構(gòu)成質(zhì)粒pMDAFib33。再利用PCR方法從pMDAfib5上分別克隆到兩個基因片段，其中一個去掉柞蠶絲素蛋白基因起始密碼子ATG及后面的部分；另外一個保留信號肽及內(nèi)含子序列，只去掉成熟絲素蛋白基因序列，克隆到pMDAFib33的XbaI位點，構(gòu)成FG1和FG2兩個轉(zhuǎn)移表達載體。將綠色熒光蛋白基因克隆到兩個載體的SmaI和XbaI位點上，獲得兩個含有綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒FG1/GFP和FG2/GFP。
3、外源基因在昆蟲細(xì)胞-柞蠶細(xì)胞系中的表達在35mm的細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種柞蠶細(xì)胞1×106，加入3ml含10％的FBS的TC-100細(xì)胞培養(yǎng)基后27C培養(yǎng)24小時。取15u1的Cellfectin試劑加入100毫升無血清培養(yǎng)基中，另取2ug重組DNA加入100毫升無血清培養(yǎng)基中。將兩溶液混合后放置30分鐘。同時用無血清培養(yǎng)基清洗細(xì)胞兩次。加入800毫升無血清培養(yǎng)基及上述混合液。27C培養(yǎng)8小時后，移去培養(yǎng)基，換含10％的FBS的TC-100細(xì)胞培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)24小時后開始在熒光顯微鏡下觀察。
結(jié)果在步驟2中構(gòu)建的兩個含有綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒FG1/GFP和FG2/GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染柞蠶細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)有綠色熒光的細(xì)胞從轉(zhuǎn)染后24小時開始出現(xiàn)，48小時細(xì)胞的熒光強度最大。本實驗證明利用柞蠶絲素基因的5’端與3’端及部分結(jié)構(gòu)基因構(gòu)建的基因轉(zhuǎn)移表達載體能夠在昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達外源基因，為下一步的工作提供依據(jù)。
4、外源基因?qū)胱跣Q卵方法一柞蠶滯育蛹經(jīng)過體表消毒后解剖，找到雄蠶睪丸，將經(jīng)過脂質(zhì)體處理的攜帶外源基因綠色熒光蛋白的FG1/GFP和FG2/GFP的質(zhì)粒DNA(1ugDNA+30ul脂質(zhì)體，混勻后室溫放置30分鐘)注射到睪丸內(nèi)，每個睪丸注射2ul。點滴抗生素后用蠟將體表傷口密封，使其正常發(fā)育，采用常規(guī)方法與雌蛾交配制種。產(chǎn)卵后孵化養(yǎng)蠶。檢測其所產(chǎn)卵孵化而成的后代個體是否攜帶外源基因。
方法二將攜帶外源基因綠色熒光蛋白的FG1/GFP和FG2/GFP質(zhì)粒經(jīng)過脂質(zhì)體處理(1ugDNA+30ul脂質(zhì)體，混勻后室溫放置30分鐘)注射到處女蛾交配囊，然后讓其與雄蛾交配，使其產(chǎn)卵孵化。檢測其所產(chǎn)卵孵化而成的后代個體是否攜帶外源基因。
5、攜帶外源基因的后代個體檢測及表達產(chǎn)物的檢測取柞蠶幼蟲血淋巴20ul，加液氮研磨成粉狀，加入提取緩沖液200ul，再加入蛋白酶K 5μg/ml，65℃4h，用同體積酚抽提2次，上清用異丙醇沉淀，干燥后溶于400μl TE中，分別用酚、酚/氯仿、氯仿各抽提一次，乙醇沉淀干燥后溶于20μl TE中加入RNase 5μg/ml 37℃保溫30min備用。
根據(jù)后代個體所攜帶的外源基因序列(綠色熒光蛋白)合成特異性引物，進行PCR特異性擴增檢測，所得結(jié)果通過與對照比較即可確定，同時也可對擴增產(chǎn)物進行序列測定分析進一步對轉(zhuǎn)基因個體進行驗證。
解剖摘取柞蠶五齡幼蟲第5天的后部絲腺，在長波長紫外光下觀察，發(fā)現(xiàn)有綠色熒光產(chǎn)生。將該絲腺在液氮中碾成粉末，按照TRIzol提取試劑盒說明書提取總RNA和蛋白質(zhì)。然后通過Northern blot和Western blot對表達產(chǎn)物進行檢測和確定。
在本發(fā)明的實施例中，柞蠶的絲素蛋白與家蠶不同，它的蛋白分子是由一條單鏈構(gòu)成的。因此，本發(fā)明的實施例采用同源重組的技術(shù)將外源基因GFP導(dǎo)入的同時也就將柞蠶絲素基因敲除掉了。當(dāng)外源基因GFP被表達時表達的是一個純合的基因產(chǎn)物。同時，表達的綠色熒光蛋白經(jīng)過修飾后能夠分泌柞蠶的絲腺中，因此在長波長紫外光下觀察，發(fā)現(xiàn)有綠色熒光產(chǎn)生。柞蠶的個體大，所以它的絲素基因的啟動子非常強大，外源基因產(chǎn)物產(chǎn)量高。由于外源基因產(chǎn)物被直接分泌到柞蠶的絲腺內(nèi)，所以表達產(chǎn)物的純化非常簡單。
核酸序列表.seq<110>大連理工大學(xué)<120>一種應(yīng)用同源重組法獲得轉(zhuǎn)基因柞蠶生產(chǎn)目的蛋白的方法<140>02144699.7<141>2002-12-03<160>2<210>1<211>1303<212>DNA<213>柞蠶(Antheraea pernyi)<220><223>柞蠶絲素基因5’端片段序列<400>1aaattcttta caacttcatt agaatacgtc gatttttctc tacttcatat aaatattcta 60tagatgtgtt tgctatataa atactttaaa aaaaatgtct caacggttgt gaaaactgtc 120aaaatctgtt gcgtagttca gaaaaactaa ggaaacacac aaacatacag aaaatttatt 180ttacaaaagt acggagatat ataaaaatat ttcgattact ttagaattac aataaaacta 240tttgacaatt tgattgcaaa tatagaccat gacaacacca catctttgtt atctaaaaca 300cgtagcgaca acactccttg aacgttgttc gaggattact acgatagttg gcggtttttt 360ttccgcaccg caagaaaaga gtagaaatgt accgtattta aatccagtgc ggaaattttc 420acgcagaatt cgtttccata caattctata ggttacatat cttgcggaaa taaattcgtg 480ccaaaaagcc gaagtgcggg gactaataaa gattttattt ggcattcctt ctaaccttta 540gatataaatt tctgtacgcg cgtatgtcac tgaactcccc ctaaacggct ggactaattt 600tgatgaaatt ttgtttgtgt gttccagtgg atccgagaat agttcagatt cacaaatgga 660gccggtaggt gacgccgcgg ttgactttta gattttttta aattatcaac aacaacgtcc 720gcccggcccg ctagttatgt atgtatttgt aaatgtaatc tcaaaccgtt cctgttggat 780cgacatttaa tatgtttaag tgaattaatt aacgtataac agtcataaga aaatattgca 840ataaaatccc atcatttatt ctttagagac aatataacca aacaacaata agaatcagaa 900tgtaattact gtacattgtt catgataggg gtttaactat gatattgttt taattctata 960ggattcatta ctttatcatt ttatcaatat ttaaaattgt ttatttgaaa tagttaacga 1020cattacaaag ttttcgtata aaagggcgcc aaagtctggt ctcattatca gttcggttcc 1080agctctcata accatgagag taatagcctt cgtgatcttg tgctgcgctt tgcaggtgag 1140ttccaacatt tatttaaata ttttcataat atgcaaatgt tccacacgct tataatttta 1200aataattatt ttttaatggt gaaaataaag caatatagat ttcaattact tacagtatgc 1260aactgctaaa aatttacgtc accacgacga atacgtagac aat1303<210>2<211>1390<212>DNA<213>柞蠶(Antheraea pernyi)<220><223>柞蠶絲素基因3’端片段序列<400>2gcaggaagtg cagcagcagc cgcagcagct gcagcagcag ccgcttcagg tgctggaaga60tcaggcggta gttacggatg gggtgatggc ggttatggtt ctgactcagc ggcagcagca120gcggcggcag cagcagcagc agccgcttca ggttctggag gatcaggtgg ttatggcggt180tatggcggct acggttcaga ctcagcggca gcagcggcgg cagcagcagc agcagccgct240tcaggtgctg gaggagcagg cggttatggc ggttatggcg gttatggcag ttatggttcg300gactcagcgg cagcggcagc agcagcagca gcggcggcag gctcaggtgc tggaggagta360ggtggtggct atggatgggg cgatggcggt tatggttctg actcagccgc agcagcagca420gcggcggccg cagcagcggc cggctcgggt gctggaggac gacgtggtta tggcgcttac480ggttcagact catcggcagc agctgcagca gcagcagcag ccgcttcagg tgcgggagga540
核酸序列表.seqtcaggcggtg gttacggatg gggcgatggc ggttacggtt cagacccagc ggccgcggca600gcagctgcgg cagcagcagc agcagcagcg ggctcaggtg ctggaggaat aggcggtggt660ttcggacgag gtgacggtgg ttatggttca ggctcatcgg cagcagcagc agcggcggcg720gcggcggcgg ctgcaagacg agcaggtcac ggacgttctg caggaagtgc agcagcagca780gcagctgctg cagctgcagc ggctgcctca ggtgctggtg gatcaggcgg tagttatgga840tgggactatg aaagttacgg ttctggctca gcggcagcag cagctggctc aggtgctgga900ggatcaggcg gtggttatgg atggggtgac ggcggttatg gttcaggttc ttctgcggca960gcagcagcag cagcggcggc ggcggcagga tcaagacgct cagggcatga tcgtgcatat1020ggagcaggaa gtgctgcagc cgcagcagca gcagctgccg ctggcgcagg ggctagtcga1080caagtcggaa tttatggaac agacgatggc ttcgtattag atggaggtta cgattcagag1140ggatcagcgg cggcggcggc agcggcagca gcagctgcgg cgtcatcaag tggtagatct1200actgaaggtc atccacttct ttcgatatgc tgcaggccgt gttctcacag tcatagctat1260gaagcttcca gaatttccgt ccactaatta aatacgaatg tgatttcctc tatatttgac1320cggatacctt ttattttatt tctttatcaa taaataacag catgtgatga gtgcacacaa1380aaaaaaaaa1390
權(quán)利要求
1.一種應(yīng)用同源重組法獲得轉(zhuǎn)基因柞蠶生產(chǎn)目的蛋白的方法，其特征在于以柞蠶染色體上的線性DNA片段，包括各種基因的5’端與3’端調(diào)控及部分結(jié)構(gòu)基因為同源序列，經(jīng)過同源重組后組建轉(zhuǎn)基因柞蠶基因轉(zhuǎn)移表達載體，以柞蠶幼蟲活體或蛹為宿主，在柞蠶體內(nèi)生產(chǎn)外源基因產(chǎn)物；其中所述的線性DNA片段為存在于柞蠶染色體上的核苷酸序列，包括各種已知或未知的基因，如柞蠶絲素蛋白基因、絲膠基因或其它非編碼蛋白的DNA片段；其中所述的外源基因包括一些能夠改變柞蠶絲性質(zhì)的基因，如綠色熒光蛋白基因、蛛絲牽引絲蛋白基因或另有其它目的及用途的基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種應(yīng)用同源重組法獲得轉(zhuǎn)基因柞蠶生產(chǎn)目的蛋白的方法，其特征還在于利用柞蠶染色體上的線性DNA片段為同源重組序列，線性DNA片段包括各種基因的5’端調(diào)控區(qū)域與3’端終止區(qū)域及部分結(jié)構(gòu)基因；其中所述的區(qū)域既包括該基因的啟動子區(qū)域，包括CAAT box，TATA box和表達調(diào)控序列和3’末端終止區(qū)域，包括AATAAA和polyA序列，也包括與該基因相鄰的其它基因片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種應(yīng)用同源重組法獲得轉(zhuǎn)基因柞蠶生產(chǎn)目的蛋白的方法，其特征還在于利用柞蠶染色體上的線性DNA片段為同源重組序列，如柞蠶絲素基因的5’端與3’端及部分結(jié)構(gòu)基因為同源序列，組建外源基因轉(zhuǎn)移表達載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種應(yīng)用同源重組法獲得轉(zhuǎn)基因柞蠶生產(chǎn)目的蛋白的方法，其特征還在于利用柞蠶染色體上的線性DNA片段為同源重組序列進行同源重組，將外源基因轉(zhuǎn)移到柞蠶染色體上，如利用柞蠶絲素基因的5’端與3’端的部分序列進行同源重組，將綠色熒光蛋白基因、蛛絲牽引絲蛋白基因轉(zhuǎn)移到柞蠶染色體上等；其中所述的外源基因轉(zhuǎn)移到柞蠶染色體上，既包括將已知基因通過同源重組方法敲除掉，也包括將外源基因插入到已知基因中。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種應(yīng)用同源重組法獲得轉(zhuǎn)基因柞蠶生產(chǎn)目的蛋白的方法，所構(gòu)建的用來在柞蠶體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)表達的各種外源基因表達及轉(zhuǎn)移載體，其特征在于它含有權(quán)利要求1所述的核酸分子，并利用同源重組方法。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種應(yīng)用同源重組法獲得轉(zhuǎn)基因柞蠶生產(chǎn)目的蛋白的方法，其特征在于以下組建步驟a)構(gòu)建含有外源基因的轉(zhuǎn)移表達載體，該載體含有柞蠶基因的5’端與3’端的部分序列；b)將步驟a)中的轉(zhuǎn)移表達載體經(jīng)線性化及脂質(zhì)體包埋后直接注射到柞蠶雌蛾的交配囊或雄蠶幼蟲的睪丸內(nèi)，交配后獲得蠶卵；c)通過正常的發(fā)育，孵化；d)對轉(zhuǎn)基因柞蠶進行鑒別，獲得含有外源基因的轉(zhuǎn)基因柞蠶。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種應(yīng)用同源重組法獲得轉(zhuǎn)基因柞蠶生產(chǎn)目的蛋白的方法，其特征是將外源基因?qū)胱跣Q個體獲得轉(zhuǎn)基因柞蠶品種及后代。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域。涉及一種利用同源重組序列組建轉(zhuǎn)基因柞蠶基因表達載體生產(chǎn)外源基因產(chǎn)物的方法。特征是以柞蠶染色體上的線性DNA片段為同源重組序列組建柞蠶基因轉(zhuǎn)移表達載體，將外源基因克隆到柞蠶基因轉(zhuǎn)移表達載體上，重組質(zhì)粒DNA經(jīng)脂質(zhì)體包埋后直接注射到柞蠶雌蛾的交配囊或雄蠶蛹的睪丸內(nèi)，通過正常的發(fā)育，交配和孵化，獲得含有外源基因的轉(zhuǎn)基因柞蠶。經(jīng)鑒定、品種選育和放養(yǎng)，就可利用柞蠶幼蟲或蛹為宿主在體內(nèi)大量生產(chǎn)外源基因產(chǎn)物。該方法利用柞蠶幼蟲或蛹為活體宿主具有資源豐富穩(wěn)定，外源基因表達量高，表達產(chǎn)物易于純化等特點。
文檔編號A01K67/00GK1438317SQ02144699
公開日2003年8月27日 申請日期2002年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月3日
發(fā)明者安利佳, 李文利, 金禮吉, 張波, 范琦, 王林美, 李樹英 申請人:大連理工大學(xué)