專利名稱：苯丙咪唑抗性基因在木霉菌中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種苯丙咪唑抗性基因在木霉菌中的應用技術。
背景技術：
在植物病害生物防治領域中微生物所發(fā)揮的作用越來越大了。在國外，美國成功的將Bt毒素基因轉移到假單胞細菌(Pf)中，構件出轉基因工程細菌；澳大利亞科學家用生物技術手段，將放線土壤桿菌(K84)改良成具有持久效力的K1026菌株。在國內，利用現代基因工程技術建立了蘇云金芽胞桿菌(Bt)、熒光假單胞菌(Pf)、枯草芽孢桿菌(Bs)等細菌的遺傳轉化體系，創(chuàng)造出一套適合我國國情的菌株分離篩選、基因鑒定、克隆等研究方法，并在真菌的生物改良上取得了重大突破。微生物農藥的研究與生產逐漸成為生物防治的支柱產業(yè)。而在微生物農藥的研發(fā)過程中，其技術軌跡由最早的大規(guī)模的野生菌株的篩選，發(fā)展到采用物理及化學方法定向誘變技術，進而利用選擇壓力的調節(jié)來達到篩選理想菌株方法的使用。但由于生物防治菌對化學殺菌劑普遍敏感，嚴重地限制了它們廣泛應用。為了克服殺菌劑與生物防治菌使用之間的矛盾，人們試圖采用基因工程手段改造微生物菌株，使其既具有防病害能力，又能夠提高對化學殺菌劑的抗性，使生物防治與化學防治的綜合體系得以建立。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種苯丙咪唑抗性基因在木霉菌中的應用，采用原生質體轉化技術，利用酵母的微管蛋白的突變基因，成功的建立起多菌靈抗性基因在木霉、毛殼菌中的轉化體系，攻克了木霉和毛殼菌對化學農藥非常敏感這一重大難題，使綜合防治思想的真正實現成為可能。進行這種應用的主要內容包括1.木霉菌菌株(Trichoderma harzianum)由泰國農業(yè)大學提供。質粒pBR129含有多菌靈抗性基因(Ben)，來自美國斯坦福大學，與E.coli DH5a(大腸桿菌)木霉中擴增和保存。
2.菌體的培養(yǎng)PDA固體培養(yǎng)基和PD液體培養(yǎng)基分別用于木霉的孢子培養(yǎng)和菌絲培養(yǎng)。
PDA固體培養(yǎng)基組成馬鈴薯 200g蔗糖或葡萄糖20g瓊脂15-20g水 1000mlPh 自然PD液體培養(yǎng)基組成PDA中去除瓊脂把馬鈴薯去皮，切成塊煮沸半小時，然后用紗布過濾，再加糖瓊脂，融化后加水至1000ml。1.05千克/平方厘米，121.3℃滅菌20分鐘。
培養(yǎng)條件37℃溫浴3天3.木霉菌轉化前對多菌靈敏感性測定將木霉分別培養(yǎng)在含多菌靈濃度為0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8μg/ml的培養(yǎng)基中，測定對其菌絲生長的抑制(處理菌落半徑/對照菌落半徑)，結果表明，這些木霉菌在1.0μg/ml多菌靈的濃度下均不能生長。
4.感受態(tài)原生質體的制備經DM(1.2mol/L山梨醇，10mol/L Tris緩沖液，Ph＝7)清洗，將在PD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的木霉菌絲經5,000r/min離心5min，棄上清收集沉淀。將沉淀懸浮于含0.8％Novozym酶234的DM中，室溫震蕩作用3h，經紗布過濾除去細胞碎片，在經5,000r/min離心5min，沉淀用DM液和TM液(1.0mol/L山梨醇，10mmol/LTris，pH＝7.5，20mmol/L CaCl2)轉化液各洗滌一次，然后將沉淀懸浮于TM轉化液中。
5.轉化在200μlTM原生質體(2×106)液中加入100ul含50μg的pBR129質粒的TE(Tris EDTA乙二胺四乙酸)，置冰浴中作用10min，再加入1mlPEG(聚乙二醇4000)TM液，在室溫作用10min，然后再加入4ml RM(1.2mol/L山梨醇，10mmol/L Tris，pH＝7.5，0.1％K2HPO4，0.05％MgSO4，0,3％NaNO3)液進行稀釋，按每分2×105原生質體的數量，混合于10ml溶化的RA(1.2mol/L山梨醇，10mmol/L Tris，pH7.5，0.1％K2HPO4，0.3％NaNO3，0.7％瓊脂)中，在平皿中27℃下分別培養(yǎng)16，18，24h。
6.篩選分別培養(yǎng)16，18，24h后，在平皿中加入10ml含多菌靈(江陰農藥廠生產的可濕性粉劑)(10μg/ml)的RA，在27℃下繼續(xù)培養(yǎng)，轉化時不加質粒的對照組處理無菌落出現，加入質粒的處理出現了抗多菌靈的球毛殼菌株，繼代培養(yǎng)發(fā)現，這些菌株可在高于1.0μg/ml的多菌靈處理下正常生長，挑選出成活的菌株打孔取樣作進一步生物測定。
7.轉化子生物測定將轉化子在含0，0.5，5，50，100，500，1000μg/ml多菌靈處理條件下培養(yǎng)，測定轉化子對多菌靈的抗性水平，結果顯示，將多菌靈抗性基因轉化到木霉中，使之能夠在1000μg/ml多菌靈處理條件下正常生長，而原菌株在1.0μg/ml多菌靈濃度下即不能生長，抗藥性比原來增加1000倍。同時，將轉化子在不含多菌靈的培養(yǎng)基上培養(yǎng)十代(培養(yǎng)條件同步驟2)，然后分別再在含有0，0.5，5，50，100，500，1000μg/ml多菌靈處理條件下培養(yǎng)，檢驗轉化子的抗藥穩(wěn)定性，結果顯示，抗藥性穩(wěn)定不變。本發(fā)明的優(yōu)點在于微生物菌株在植物病害的生物防治中具有防治效果好、無污染、對人畜安全、無殘留、特異性強以及保持生態(tài)平衡等優(yōu)點，除此之外，本菌株還具有如下優(yōu)良性狀1.菌株整合了來自釀酒酵母(Saccharomyces cervisiae)β-微觀蛋白的突變基因，突變位點為241位的精氨酸變成組氨酸，這一變異使其具有更強的抗藥性；2.對多菌靈敏感性降低實驗證明，轉化前菌株在1.0μg/mg的多菌靈液體處理下抑制率為100％，轉化后可以在1000μg/mg的多菌靈處理條件下正常生長，抗藥性增加1000倍；這種抗藥性的增強效果是十分顯著的，其機理是改變了多菌靈對真菌的作用位點，使多菌靈不能作用于真菌，從而克服了真菌對多菌靈藥物的敏感性，使化學防治與生物防治綜合防治體系的建立成為可能，從而達到更理想的防治病害的效果；3.實驗證明，該基因工程菌株在非選擇壓力下連續(xù)培養(yǎng)十代，抗藥穩(wěn)定性不變，轉化率為6-7個轉化子/μgDNA；該性狀說明其目的基因表達非常穩(wěn)定，不需要反復進行基因轉化，有利于應用這一菌株于植物病害的綜合防治的實踐中；4.與原菌在培養(yǎng)條件相同的情況下，該菌株生長速度快，菌絲粗大，子囊殼黑色，與原菌株呈現出不同的生長狀況。這一特性縮短了育菌周期，使其產業(yè)化更加方便、容易。
實施例苯丙咪唑抗性基因在木霉菌中的應用，其培養(yǎng)過程、轉化、篩選及其應用后的產物的性能監(jiān)測、已及帶來的特點等等已經在內容部分敘述，不再復述。
權利要求
1.一種苯丙咪唑抗性基因在木霉菌中的應用。
全文摘要
苯丙咪唑抗性基因在木霉菌中的應用，一種苯丙咪唑抗性基因在木霉菌中的應用技術。在微生物農藥的研發(fā)過程中，其技術軌跡由最早的大規(guī)模的野生菌株的篩選，發(fā)展到采用物理及化學方法定向誘變技術，進而利用選擇壓力的調節(jié)來達到篩選理想菌株方法的使用。但由于生物防治菌對化學殺菌劑普遍敏感，嚴重地限制了它們廣泛應用。本發(fā)明提供了一種苯丙咪唑抗性基因在木霉菌中的應用技術。通過采用基因工程手段改造微生物菌株，使其既具有防病害能力，又能夠提高對化學殺菌劑的抗性，使生物防治與化學防治的綜合體系得以建立。
文檔編號A01N63/00GK1418947SQ0214480
公開日2003年5月21日 申請日期2002年11月10日 優(yōu)先權日2002年11月10日
發(fā)明者楊謙 申請人:楊謙