專利名稱：體細(xì)胞雜交創(chuàng)造水稻新種質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新品種選育的技術(shù)領(lǐng)域，特別是關(guān)于體細(xì)胞融合選育水稻新品種的方法。
背景技術(shù)：
野生稻具有極強(qiáng)的抗病蟲害特性，是栽培稻的重要品種資源。疣粒野生稻是我國現(xiàn)存的三種野生稻之一，它對白葉枯病均表現(xiàn)高抗(HR)到免疫，是現(xiàn)今對白葉枯病抗性最強(qiáng)的抗原，但疣粒野生稻與栽培稻的染色體組型不同，使用常規(guī)的有性雜交難以打破生殖隔離，是利用其優(yōu)異性狀的障礙，隨著生物工程中細(xì)胞融合技術(shù)的發(fā)展，為利用野生稻的有用基因提供了新途徑。CN1326672A公開了一種抗水稻白葉枯病育種材料的選育方法，它將栽培稻和疣粒野生稻的原生質(zhì)體通過不對稱細(xì)胞融合得到再生植株，并與栽培稻進(jìn)行回交，獲得抗白葉枯病水稻育種材料。此種方法初步打破栽培稻與野生稻間的生殖隔離，邁出了水稻基因重組制作新品種的第一步，但要得到穩(wěn)固的核質(zhì)雜種，尚存在許多技術(shù)上的問題，例如要得到高質(zhì)量的適合細(xì)胞融合的原生質(zhì)體，就牽涉到如何進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和非胚性愈傷組織向胚性組織轉(zhuǎn)化，以及建立大容量胚性懸浮細(xì)胞系，適應(yīng)大批量制作原生質(zhì)融合體，培育出較多的再生植株。由于疣粒野生稻種子資源珍貴，禾本科作物原生質(zhì)體培養(yǎng)再生頻率低，僅為0.05～0.1％，疣粒野生稻誘導(dǎo)出愈傷組織愈出率僅為20％，且需一個月左右時間，遠(yuǎn)低于栽培稻，疣粒野生稻初次誘導(dǎo)的愈傷組織有胚性、非胚性和中間體三種狀態(tài)，因此提高愈傷組織胚性細(xì)胞的含量和懸浮細(xì)胞質(zhì)的質(zhì)量是有待解決的關(guān)鍵，再是原生質(zhì)體融合法，現(xiàn)有電場融合法和聚合物融合法，電場融合法的融合電壓高，細(xì)胞損傷大，對染色體、DNA結(jié)構(gòu)影響大，不利于遺傳基因傳遞，融合參數(shù)多不易控制，容易產(chǎn)生多細(xì)胞融合，再生植株成活率低；聚合物融合法不會損傷細(xì)胞，能保持細(xì)胞膜完整，融合率高，易操作，再生植株成活率高，選擇方便。因此在具體進(jìn)行原生質(zhì)體融合時應(yīng)選擇對細(xì)胞損傷小，對染色體和細(xì)胞膜性能影響小的聚合物融合法，以盡量保持雙親遺傳基因的傳遞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的是通過選擇雙親具有優(yōu)異特性的體細(xì)胞進(jìn)行原生質(zhì)體融合創(chuàng)造高產(chǎn)抗病的水稻新種質(zhì)，為達(dá)到這一目的，還需對愈傷組織誘導(dǎo)特別是非胚性愈傷組織向胚性方向轉(zhuǎn)化的措施與方法，與其相關(guān)的目的還有針對不同基因型的愈傷組織對培養(yǎng)基適應(yīng)性不同，培養(yǎng)出適應(yīng)原生質(zhì)體融合理想的懸浮細(xì)胞系的措施和方法。
本發(fā)明采用以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)體細(xì)胞雜交創(chuàng)造水稻新種質(zhì)的方法，其特征在于包含以下連續(xù)的工藝步驟A.將栽培稻和疣粒野生稻的成熟胚作外植體，接種于含生長素2，4-D的固體MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織，隔3-4周繼代一次，并調(diào)整培養(yǎng)基的成分，用以改造非胚性愈傷組織向胚性方向轉(zhuǎn)變，長出含量高的小顆粒狀胚性愈傷組織；B.將上述的胚性愈傷組織接種于含生長素2，4-D的AA液體培養(yǎng)基中，在黑暗條件下、在80-100rpm轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)，隔3-4天繼代一次，一個月后轉(zhuǎn)入擴(kuò)大2-3倍體積的AA培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，胚性下降時懸浮細(xì)胞置于固體MS培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，再接回AA液體培養(yǎng)基中，以干濕交替方式培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞系呈淡黃色，其胚性細(xì)胞含量高、細(xì)胞質(zhì)濃、質(zhì)膜光滑，分散度好。
C.將胚性懸浮細(xì)胞系培養(yǎng)經(jīng)繼代后3天的懸浮細(xì)胞置于混合酶液中游離原生質(zhì)體，在27℃黑暗振蕩30～50rpm條件下酶解2-3小時，觀察到懸浮細(xì)胞大多數(shù)為3-5個細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)時，靜置酶解液1-2小時，使大部分原生質(zhì)體游離出來，并將游離出的原生質(zhì)體離心濃縮純化；D.將上述經(jīng)純化的原生質(zhì)體分別進(jìn)行失活處理后，所述雙親原生質(zhì)體按1∶1比例混和，然后用融合F液懸浮，再加入等量的高分子聚合物混和均勻使雙親原生質(zhì)體融合30分鐘左右后，用F液對融合體進(jìn)行清洗稀釋，在25～30分鐘內(nèi)稀釋10～12倍時離心收集融合體；E.將上述融合體用KPR培養(yǎng)基包埋培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)入第一次分裂時，加入適量KR培養(yǎng)液，促進(jìn)細(xì)胞分裂，當(dāng)出現(xiàn)4-5次分裂的小細(xì)胞團(tuán)時加入少量含2，4-D2mg/L的生長素誘導(dǎo)細(xì)胞團(tuán)向胚性發(fā)展，長至肉眼可見的細(xì)胞團(tuán)時，將其轉(zhuǎn)入N6培養(yǎng)基，待分化出小植株后，轉(zhuǎn)入NAA壯苗培養(yǎng)基培養(yǎng)。
經(jīng)過上述過程后，栽培稻與疣粒野生稻種子成熟胚外植體細(xì)胞融合體長出再生植株，對融合體再生植株進(jìn)行形態(tài)觀察，植株形態(tài)明顯偏向栽培稻，也具有野生稻的特性，對第3代雜種進(jìn)行RAPD、PCR分子檢測，結(jié)果表明其子代電泳條帶與親本疣粒野生稻和栽培稻的條帶相符，在12份材料中通過隨機(jī)引物擴(kuò)增后，DNA分子檢測證明有10份材料是疣粒野生稻與栽培稻的融合雜種。
上述體細(xì)胞融合體進(jìn)行6代選育，到第6代種植130份株系，其中有79份材料無分離，占61.2％，尚有50份材料分離較大，含38.7％。在選育過程中，對一些株型好，穗型大，劍葉挺，抗性好的材料及時利用。先后用于常規(guī)晚粳稻及雜交晚粳的選育，至2001年秋為止，作親本20份，用這些親本，育成第1代219份，第2代132份，第3代以上的有95份。2000年曾測產(chǎn)2份，2001年測產(chǎn)2份，其中1份畝產(chǎn)達(dá)601.4公斤，比對照提高3.7％。


圖1為體細(xì)胞雜交各個工序狀態(tài)結(jié)果照片，其中1為栽培稻大粒香原生質(zhì)體，2為疣粒野生稻原生質(zhì)體，3為第二次分裂的融合體，4為培養(yǎng)一個月的融合體小細(xì)胞團(tuán)，5為在預(yù)分化培養(yǎng)基上50天形成的致密細(xì)胞，6為60天后融合體植株苗，7為第一代體細(xì)胞融合體植株，8為融合體再生植株分子檢測的RAPD圖譜。
圖2為第6代體細(xì)胞雜交植株測產(chǎn)田。
實(shí)施例描述本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)材料為疣粒野生稻(o.meyeriana.)栽培稻(oryza Sntnval.)栽培稻選用中國水稻研究所提供的大粒香。大粒香為高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的粳稻優(yōu)良品種，但抗病性差，對白葉枯病敏感。疣粒野生稻是我國現(xiàn)存的三種野生稻之一，種子資源少而珍貴。
大粒香栽培稻與疣粒野生稻體細(xì)胞雜交的實(shí)施過程按以下步驟進(jìn)行。
1.胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代以栽培稻大粒香和疣粒野生稻的成熟胚作外植體，將去殼的種子用70％的酒精消毒30秒鐘，然后轉(zhuǎn)入0.1％的升汞中處理10-20分鐘，再用無菌水沖洗2-3次，晾干備用。沿?zé)o菌米盾片方向切下成熟胚，將胚接種于含2，4-D生長素2mg/L固體培養(yǎng)基MS中誘導(dǎo)愈傷組織，每隔3-4周繼代一次。大粒香約6-10天陸續(xù)誘導(dǎo)出愈傷組織，疣粒野生稻40天后才誘導(dǎo)出愈傷組織，愈出率僅20％遠(yuǎn)低于栽培稻，因而為充分利用稀少野生稻資源，重點(diǎn)關(guān)注培育疣粒野生稻。疣粒野生稻胚性組織的轉(zhuǎn)化條件按下述方法創(chuàng)立，在繼代MS培養(yǎng)基中添加Pro500mg/L+Gln500mg/L+CH300mg/L用改造疣粒野生稻的果凍狀非胚性組織，在改造培養(yǎng)基中繼代2-3次，愈傷組織質(zhì)地開始變硬向著胚性方向轉(zhuǎn)變，并長成小顆粒狀的胚性組織。
2.胚性懸浮細(xì)胞系的建立與培養(yǎng)從疣粒野生稻和栽培稻大粒香的胚性愈傷組織中，選擇顏色淡黃、結(jié)構(gòu)松散的小顆粒狀態(tài)愈傷組織，接種于含2，4-D生長素2mg/L的AA液體培養(yǎng)基中，每個100ml的三角瓶內(nèi)裝10-15ml的AA液體培養(yǎng)基，在黑暗條件下振蕩培養(yǎng)，搖床的轉(zhuǎn)速為80-100rpm，開始時每隔3-4天繼代一次，每次吸出1/3的上清液后，加入等量的新鮮培養(yǎng)液，并在倒置顯微鏡下觀察懸浮細(xì)胞的生長情況。1個月后，將懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)入250ml含AA培養(yǎng)液30～40升的三角瓶中懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，每周繼代一次，并根據(jù)愈傷組織的生長狀態(tài)改變培養(yǎng)基的部分成分，促進(jìn)懸浮細(xì)胞加快松散和胚性的保持。為充分利用疣粒野生稻有限資源疣粒野生稻懸浮細(xì)胞培養(yǎng)4-5個月后，懸浮細(xì)胞質(zhì)開始變稀、胚性下降，將懸浮細(xì)胞質(zhì)重新在固體MS培養(yǎng)上繼代一段時間，再接種于AA液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行干濕交替培養(yǎng)以促進(jìn)胚性懸浮細(xì)胞質(zhì)的成長，若將培養(yǎng)液中維生素B1含量提高到10mg/L，繼代2-3次后懸浮細(xì)胞開始變黃，培養(yǎng)液變澄清，呈現(xiàn)生長旺盛狀態(tài)。每周細(xì)胞生長量增加一倍時，細(xì)胞質(zhì)濃、質(zhì)膜光滑、分散度好的細(xì)胞群體，胚性懸浮細(xì)胞系基本建成。
3.原生質(zhì)體的游離及純化在胚性懸浮細(xì)胞系的不同時期，選取繼代天數(shù)不等的懸浮細(xì)胞，通常以繼代后3天的懸浮細(xì)胞為游離最佳時期，此時懸浮細(xì)胞處于對數(shù)生長期，細(xì)胞代謝旺盛，游離出的原生質(zhì)體活性強(qiáng)。將懸浮細(xì)胞置于混合酶液中游離原生質(zhì)體，確定最佳的酶解時期。酶液組成為2％的纖維素酶，1.0％果膠酶，5mmol/LMES，CPW鹽和13％的甘露醇，PH＝5.6。游離原生質(zhì)體時先在27℃，黑暗，30～50rpm的條件下酶解2-3小時，觀察到懸浮細(xì)胞為3-5個細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)時，靜置1-2小時，收集濾液，轉(zhuǎn)速500rpm離心收集原生質(zhì)體。離心沉淀物用CPW鹽+13％甘露醇清洗2-3次，最后用KPR培養(yǎng)液清洗2次。純化后的原生質(zhì)體用FDA處理在熒光顯微鏡下檢測原生質(zhì)體的活力。
4.原生質(zhì)體的細(xì)胞融合選取純化后的疣粒野生稻和栽培稻大粒香原生質(zhì)體分別做失活處理，以2.5mmol/L的碘乙酰胺(IOA)處理大粒香原生質(zhì)體15分鐘，純化其細(xì)胞質(zhì)，然后用CPW鹽+13％甘露醇清洗2次，洗凈殘留的IOA；采用軟X-射線照射疣粒野生稻原生質(zhì)體60分鐘，固定電壓220V，電流3mA處理后包埋培養(yǎng)7天供融合時采用。把處理過的雙親原生質(zhì)體按1∶1比例(野生稻略多于栽培稻)混合，然后用融合F液懸浮，再加入等量的聚乙二醇(PEG)分子量為8000的聚合物混合均勻，促進(jìn)原生質(zhì)體融合。融合30分鐘后用F液對融合體系進(jìn)行清洗稀釋，開始稀釋盡可能慢，稀釋4倍體積后可加快稀釋速度，25～30分鐘稀釋至10-12倍時，離心收集融合體，分別以CPW鹽+13％甘露醇和KPR清洗。融合F液配方組成NaCl 140mmol/L，KCl 5mmol/L，Na2HPO40.75mmol/L，CaCl22H2O125mmol/L，PH＝7.0。
5.原生質(zhì)體的植板培養(yǎng)懸浮在KPR培養(yǎng)液中的細(xì)胞融合體經(jīng)45℃的水浴熱擊5分鐘后，迅速放進(jìn)0℃的冰水中冷卻10秒鐘，用含1.2％低熔點(diǎn)瓊脂糖的KPR培養(yǎng)基包埋培養(yǎng)。包埋時以原生質(zhì)體最終密度0.5～1×106個/ml，植板于小培養(yǎng)皿，待瓊脂糖固定后分制成4-6塊，并加入0.3ml左右的液體培養(yǎng)基，最后用P膜封口后暗培養(yǎng)。培養(yǎng)7天后計算原生質(zhì)體植板率。當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)入第一次分裂時，加入適量KP培養(yǎng)基降低培養(yǎng)基的滲透壓，促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞的分裂。當(dāng)出現(xiàn)4-5次分裂的小細(xì)胞團(tuán)時，加入含少量2，4-D生長素的AA培養(yǎng)液以誘導(dǎo)細(xì)胞團(tuán)向胚性發(fā)展，長至肉眼可見的細(xì)胞團(tuán)時，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入N6培養(yǎng)基，在21～26℃溫差交替變化的條件下誘導(dǎo)分化。待分化出小植株后，轉(zhuǎn)入NAA壯苗培養(yǎng)基培養(yǎng)，促進(jìn)幼苗根的發(fā)生。幼苗長到4-5cm時，在室溫下練苗2-3天，然后移栽到溫室中培養(yǎng)。
6.融合體再生植株的分子檢測對第3代疣粒野生稻和大粒香的體細(xì)胞雜交后代植株進(jìn)行RAPD、PCR分子檢測，結(jié)果表明其子代電泳條帶與親本疣粒野生稻和栽培稻的條帶相同，證明有10份材料是疣粒野生稻與大粒香的融合雜種。
7.融合體細(xì)胞雜交后代植株進(jìn)行抗病性檢測驗(yàn)證，第3代獲得7份抗性較好材料，平均在5級以上，到第6代在132份材料中表現(xiàn)高抗的有4份，中抗的有27份。
8.體細(xì)胞雜交材料進(jìn)行了6代的選育在選育過程中，對一些株型好，穗型大，劍葉挺，抗性好的材料及時利用。先后用于常規(guī)粳稻及雜交晚粳的選育，至2001年秋為止，做親本的20份，用這些親本，育成第1代219份，第2代132份，第3代以上的有95份。2000年曾測產(chǎn)2份，2001年測產(chǎn)2份。其中1份畝產(chǎn)達(dá)601.4公斤，比對照提高3.7％。
表1.疣粒野生和大粒香的體細(xì)胞雜交6代群體的主要表現(xiàn)

由表1所列的數(shù)據(jù)和圖2照片反映的植株形狀表明經(jīng)過6代的優(yōu)勢利用表明疣粒野生稻與大粒香栽培稻的體細(xì)胞雜交優(yōu)勢基本穩(wěn)定，在培育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗病的水稻新品種工作中成果顯著。
權(quán)利要求
1.體細(xì)胞雜交創(chuàng)造水稻新種質(zhì)的方法，其特征在于包含以下連續(xù)的工藝步驟A.將栽培稻和疣粒野生稻的成熟胚做外植體，接種于含生長素2，4-D的固體MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織，隔3-4周繼代一次，并調(diào)整培養(yǎng)基的成分，用于改造非胚性愈傷組織向胚性方向轉(zhuǎn)變，長出含量高的小顆粒狀胚性愈傷組織；B.將上述的胚性愈傷組織接種于含生長素2，4-D的AA液體培養(yǎng)基中，在黑暗條件下，在80-100rpm轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)，隔3-4天繼代一次，一個月后轉(zhuǎn)入擴(kuò)大2-3倍體積的AA培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，胚性下降時懸浮細(xì)胞置于固體MS培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，再接回AA液體培養(yǎng)基中，以干濕交替方式培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞系呈淡黃色，其胚性細(xì)胞含量高、細(xì)胞質(zhì)濃、質(zhì)膜光滑、分散度好；C.將胚性懸浮細(xì)胞系培養(yǎng)經(jīng)繼代后3天的懸浮細(xì)胞置于混合酶液中游離原生質(zhì)體，在27℃黑暗振蕩30～50rpm條件下酶解2-3小時，觀察到懸浮細(xì)胞大多數(shù)為3-5個細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)時，靜置酶解液1-2小時，使大部分原生質(zhì)體游離出來，并將游離出的原生質(zhì)體離心濃縮純化；D.將上述經(jīng)純化的原生質(zhì)體分別進(jìn)行失活處理后，所述雙親原生質(zhì)按1∶1比例混和，然后用融合F液懸浮，再加入等量的高分子聚合物混和均勻使雙親原生質(zhì)體融合30分鐘左右后，用F液對融合體進(jìn)行清洗稀釋，在25～30分鐘內(nèi)稀釋10～12倍時離心收集融合體；E.將上述融合體用KPR培養(yǎng)基包埋培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)入第一次分裂時，加入適量KR培養(yǎng)液，促進(jìn)細(xì)胞分裂，當(dāng)出現(xiàn)4-5次分裂的小細(xì)胞團(tuán)時加入少量含2，4-D2mg/L的生長素誘導(dǎo)細(xì)胞團(tuán)向胚性發(fā)展，長至肉眼可見的細(xì)胞團(tuán)時，將其轉(zhuǎn)入N6培養(yǎng)基，待分化出小植株后，轉(zhuǎn)入NAA壯苗培養(yǎng)基培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的體細(xì)胞雜交創(chuàng)造水稻新種質(zhì)的方法，其特征是高分子聚合物為分子量大于4000的聚乙二醇(PEG)；融合F液的組成配方為NaCl140mmol/L，KCl 5mmol/L，Na2HPO40.75mmol/L，CaCl22H2O 125mmol/L，PH＝7.0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的體細(xì)胞雜交創(chuàng)造水稻新種質(zhì)的方法，其特征是胚性愈傷組織在繼代MS培養(yǎng)基中添加Pro500mg/L+Gln500mg/L+CH300mg/L用于改造疣粒野生稻的非胚性組織向胚性方向轉(zhuǎn)變。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的體細(xì)胞雜交創(chuàng)造水稻新種質(zhì)的方法，其特征是胚性懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液中維生素B含量提高到10mg/L，繼代2-3次后懸浮細(xì)胞開始變黃，培養(yǎng)液變澄清，呈現(xiàn)生長旺盛狀態(tài)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的體細(xì)胞雜交創(chuàng)造水稻新種質(zhì)的方法，其特征是懸浮在KPR培養(yǎng)液中的細(xì)胞融合體經(jīng)45℃水浴熱擊5分鐘，迅速放進(jìn)0℃的冰水中冷卻10秒鐘，用含1.2％低熔點(diǎn)瓊脂糖KPR培養(yǎng)基包埋培養(yǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的體細(xì)胞雜交創(chuàng)造水稻新種質(zhì)的方法，其特征是原生質(zhì)體植板培養(yǎng)包埋時以原生質(zhì)體最終密度0.5～1×106個/ml植板于小培養(yǎng)皿。
全文摘要
體細(xì)胞雜交制造水稻新種質(zhì)的方法，它通過疣粒野生稻與栽培種大粒香的胚體細(xì)胞愈傷組織和懸浮細(xì)胞體系，采用高分子聚合物PEG和F液進(jìn)行原生質(zhì)體融合，獲得體細(xì)胞種間雜種株，通過白葉枯病的人工剪葉接種和DNA分子鑒定，進(jìn)行了6代選育，獲得高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和抗病的水稻新種質(zhì)。
文檔編號A01H4/00GK1498529SQ02145209
公開日2004年5月26日 申請日期2002年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月11日
發(fā)明者嚴(yán)成其, 顏秋生, 張雪琴, 皇甫偉國, 黃堅, 倪建剛, 沈嵐, 應(yīng)成波, 裘堯軍, 陳國 , 陸永法, 馬榮榮, 肖浩永, 錢凱先, 吳平, 國 申請人:嚴(yán)成其