專利名稱：植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因的克隆及其應(yīng)用，特別是涉及克隆獲得的水稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的DNA序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列。本發(fā)明進(jìn)一步涉及恢復(fù)基因在植物育種中的應(yīng)用。
多種農(nóng)作物如水稻、小麥、玉米、油菜等關(guān)于雄性不育性及其育性恢復(fù)性的研究已有許多報(bào)道，在生產(chǎn)上已大規(guī)模用于雜交種生產(chǎn)。在中國(guó)，雜交水稻自1970年代以來(lái)已大面積種植，其中大部分是利用“三系法”配制雜交種子。“三系法”中的“三系”是指不育系、恢復(fù)系、和保持系。其中不育系具有由細(xì)胞質(zhì)不育基因控制的細(xì)胞質(zhì)雄性不育(cytoplasmic male sterility，簡(jiǎn)稱為CMS)特性。恢復(fù)系具有正常的細(xì)胞質(zhì)或不育細(xì)胞質(zhì)，花粉正常可育，可自交結(jié)實(shí)，其特點(diǎn)是核基因組中攜帶有細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因(fertility restorer gene for CMS)，簡(jiǎn)稱為恢復(fù)基因或Rf基因。保持系具有正常的細(xì)胞質(zhì)，花粉正常可育，可自交結(jié)實(shí)，但其核基因組不攜帶有功能的恢復(fù)基因。生產(chǎn)上應(yīng)用的配套“三系”中，保持系和不育系具有相同的核基因組，其差別是細(xì)胞質(zhì)不同。
水稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育被分為多種類型，其中主要有(1)包臺(tái)(BT)型，其雄性不育細(xì)胞質(zhì)來(lái)源于印度秈稻Chisurah Boro II(Shinjyo，1975)，屬于配子體不育；(2)野敗型(wild abortive，簡(jiǎn)稱WA型)，其雄性不育細(xì)胞質(zhì)來(lái)源于中國(guó)海南省的野生稻，屬于孢子體不育。(3)紅蓮(HL)型，其雄性不育細(xì)胞質(zhì)來(lái)源于中國(guó)海南省的紅芒野生稻，屬于配子體不育。對(duì)不同類型的水稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育，已發(fā)現(xiàn)有相應(yīng)的恢復(fù)基因。對(duì)于包臺(tái)型雄性不育，其恢復(fù)基因Rf1來(lái)源于印度秈稻Chisurah Boro II和其它秈稻。對(duì)于野敗型雄性不育，發(fā)現(xiàn)有2對(duì)主效恢復(fù)基因Rf3和Rf4，主要來(lái)源于低緯度地區(qū)的晚秈稻。對(duì)于紅蓮型雄性不育，其恢復(fù)基因Rf5主要來(lái)源于紅芒野生稻和熱帶秈稻。
現(xiàn)有的水稻恢復(fù)系育種方法主要有2種(1)用現(xiàn)有品種與不育系測(cè)交，選出有恢復(fù)育性能力的品種直接作為恢復(fù)系使用；(2)以攜帶有恢復(fù)基因的品種或品系為基因供體親本與不攜帶恢復(fù)基因的優(yōu)良親本雜交和多代回交選育而成。由于水稻的恢復(fù)基因主要存在于少數(shù)品種，大部分的水稻品種不攜帶有功能的恢復(fù)基因，尤其是粳稻品種基本上不攜帶有功能的恢復(fù)基因，因此水稻恢復(fù)系的育種主要用第(2)種方法，需要多年的時(shí)間才能完成。
對(duì)恢復(fù)基因的研究發(fā)現(xiàn)，包臺(tái)型恢復(fù)系有1對(duì)恢復(fù)基因Rf1，位于第10染色體(Shinjyo，1975)。Ichikawa等(1997)進(jìn)一步用分子標(biāo)記定位了Rf1在第10染色體的大致位置。而對(duì)野敗型恢復(fù)系，多數(shù)研究認(rèn)為有2對(duì)主效恢復(fù)基因，被分別定位在第1和第10染色體(Zhang et al.，1997；張群宇等2002)。紅蓮型恢復(fù)系有1對(duì)恢復(fù)基因，被定位在第10染色體。
關(guān)于植物雄性不育恢復(fù)基因的克隆，目前已報(bào)道的只有玉米(Maize)的T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因Rf2和矮牽牛(Petunia)的細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因Rf-PPR592(Cui et al.，1996；Bentolila et al.，2002)。本發(fā)明申請(qǐng)?zhí)岢鲋斑€沒有水稻的雄性不育恢復(fù)基因克隆的報(bào)道。
本發(fā)明目的是從水稻克隆一種新的細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因，為植物特別是水稻選育新恢復(fù)系以及雜交育種提供有用的基因和分子標(biāo)記。
(2)編碼序列表中序列2所示的氨基酸多肽序列，該序列由506個(gè)氨基酸殘基組成，具有7個(gè)PPR重復(fù)單位(pentatricopeptide repeat)組成的功能結(jié)構(gòu)域(圖4)，其生物學(xué)功能為恢復(fù)植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育的育性。
PPR是由35個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的重復(fù)單位，在不同的含PPR基因中以2個(gè)以上的同向重復(fù)單位形成功能結(jié)構(gòu)域，不同重復(fù)單位的氨基酸序列存在不同程度的變異。因此，構(gòu)成PPR重復(fù)的功能結(jié)構(gòu)域所對(duì)應(yīng)的DNA序列的最小長(zhǎng)度為210堿基，即對(duì)應(yīng)于2個(gè)PPR重復(fù)單位的序列。
根據(jù)本發(fā)明提供的OsRf1基因序列信息(序列1，序列2)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過(guò)以下方法容易地獲得與OsRf1等同的基因(1)通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得；(2)用OsRf1基因片段為探針篩選水稻或其它植物的基因組文庫(kù)獲得；(3)根據(jù)OsRf1基因序列信息設(shè)計(jì)寡核苷酸引物(含簡(jiǎn)并性引物)，用PCR擴(kuò)增方法從水稻或其它植物的基因組獲??；(4)在OsRf1基因序列的基礎(chǔ)上用基因工程方法改造獲得；(5)用化學(xué)合成的方法獲得。
本發(fā)明所述的術(shù)語(yǔ)OsRf1等同基因，是定義為與OsRf1基因的核苷酸序列或氨基酸殘基序列相比有一個(gè)或若干個(gè)核苷酸或氨基酸殘基的差別，包括堿基或氨基酸殘基的改變、缺失、或插入，或與OsRf1基因序列中的連續(xù)210堿基以上的區(qū)段有85％以上的同源性，且其表達(dá)產(chǎn)物的功能與OsRf1表達(dá)產(chǎn)物的功能相同的基因。
因此，本發(fā)明提供的恢復(fù)基因還包括OsRf1等同基因，它們?yōu)橄铝泻塑账嵝蛄兄?，或編碼下列氨基酸多肽序列之一的核苷酸序列(1)將序列1的核苷酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代、缺失或添加，且編碼與序列2同等功能蛋白質(zhì)的衍生核苷酸序列；(2)與序列1的第1460-2980位堿基序列中連續(xù)210堿基以上的區(qū)段具有85％以上的同源性，且編碼與序列2同等功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
(2)將序列2的氨基酸多肽序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且具有與序列2同等功能的衍生氨基酸多肽序列，或其保守性變異多肽，或其活性片段。
本發(fā)明所述的OsRf1基因或其等同基因，還包括含有這些基因全部序或部分序列的載體。
本發(fā)明提供的恢復(fù)基因具有重要的應(yīng)用價(jià)值。應(yīng)用之一是將所述的恢復(fù)基因序列連接到任何一種植物轉(zhuǎn)化載體，用任何一種轉(zhuǎn)化方法將恢復(fù)基因?qū)胨净蚱渌参锛?xì)胞，可獲得能表達(dá)所述基因的轉(zhuǎn)基因恢復(fù)系。用轉(zhuǎn)基因恢復(fù)系與細(xì)胞質(zhì)雄性不育系雜交，可產(chǎn)生雜交種子用于生產(chǎn)。用本發(fā)明所述的基因構(gòu)建到植物轉(zhuǎn)化載體中時(shí)，可以對(duì)所述的基因或其調(diào)控序列作適當(dāng)修飾，也可以在其轉(zhuǎn)錄起始密碼子前用其它啟動(dòng)子取代所述基因原有的啟動(dòng)子。
本發(fā)明提供的恢復(fù)基因的另一個(gè)應(yīng)用是根據(jù)所述基因序列信息產(chǎn)生特異性的分子標(biāo)記，包括但不限于SNP(單核苷酸多態(tài))、SSR(簡(jiǎn)單序列重復(fù)多態(tài))、RFLP(限制性內(nèi)切酶長(zhǎng)度多態(tài))、CAP(切割擴(kuò)增片段多態(tài))。用此標(biāo)記可鑒定水稻或其它植物的雄性不育恢復(fù)系或恢復(fù)植株和非恢復(fù)系或非恢復(fù)植株的基因型，用于分子標(biāo)記輔助選擇育種。所述的非恢復(fù)系為不攜帶有功能的恢復(fù)基因基因的品種和品系，可以是不育系或保持系。
本發(fā)明具有明顯得優(yōu)點(diǎn)和效果。利用本發(fā)明克隆的基因可進(jìn)行分子水平的育種。與常規(guī)的雜交和回交育種方法相比，用轉(zhuǎn)基因方法培育恢復(fù)系可縮短育種時(shí)間，還可以同時(shí)導(dǎo)入其它有用基因，如抗病抗蟲基因，培育出抗病蟲的恢復(fù)系。另外，與常規(guī)的育種選擇方法相比，分子標(biāo)記輔助選擇育種可提高育種選擇效率。
以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的雄性不育恢復(fù)基因的克隆過(guò)程、基因功能分析、以及用途作具體說(shuō)明。


圖1中的Y3-8、01-2.5、01-2、Rf1m、C1361、S10019為DNA分子標(biāo)記，Rf1為恢復(fù)基因位點(diǎn)，A24為可轉(zhuǎn)化人工染色體(Transformation-competent artificial chromosome，TAC)克隆，ORF為預(yù)測(cè)的基因開放讀碼框。
圖2中泳道1為含有Rf1候選基因的載體質(zhì)粒PCR產(chǎn)物，泳道2為恢復(fù)系DNA的PCR產(chǎn)物，泳道3-7為導(dǎo)入Rf1候選基因的不育系轉(zhuǎn)化體DNA的PCR產(chǎn)物，泳道8為無(wú)模板DNA陰性對(duì)照，泳道9為不育系非轉(zhuǎn)化體DNA作為陰性對(duì)照，泳道M為分子量標(biāo)記。
圖3所示的花粉育性檢測(cè)方法是將花粉置于培養(yǎng)基上萌發(fā)，箭頭所指為萌發(fā)的花粉管。其中A圖為恢復(fù)系的花粉，B圖為不育系的花粉，C圖和D圖為轉(zhuǎn)化體的花粉。
圖4中斜體字母部分為定位該蛋白到線粒體的信號(hào)肽，標(biāo)下線部分為7個(gè)PPR重復(fù)單位。
圖5中泳道1-7為第2次PCR反應(yīng)中使用OsRf1特異引物Rf1m-3R和Rf1m-2的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中泳道1是不育系的穗部RNA為模板，泳道2是恢復(fù)系的穗部RNA為模板，泳道3-4是導(dǎo)入OsRf1基因的不育系轉(zhuǎn)化體的穗部RNA為模板，泳道5是恢復(fù)系的葉部RNA為模板，泳道6-7是導(dǎo)入OsRf1基因的不育系的葉部RNA為模板。泳道8-14為第2次PCR反應(yīng)中使用Osrf1特異引物Rf1m-3B和Rf1m-2的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中泳道8是不育系的穗部RNA為模板，泳道9是恢復(fù)系的穗部RNA為模板，泳道10是導(dǎo)入OsRf1基因的不育系轉(zhuǎn)化體的穗部RNA為模板，泳道11是恢復(fù)系的葉部RNA為模板，泳道12是不育系的葉部RNA為模板，泳道13-14是導(dǎo)入OsRf1基因的不育系轉(zhuǎn)化體的葉部RNA為模板。
圖6的花粉育性檢測(cè)方法是用碘化鉀染色后用顯微鏡觀察。其中A圖為轉(zhuǎn)OsRf1基因恢復(fù)系的花粉，B圖為不育系的花粉，C圖為保持系的花粉，D圖為雜種F1代植株的花粉。
圖7中泳道1為不育系親本，基因型為rf1rf1；泳道2為恢復(fù)系親本，基因型為Rf1Rf1；泳道3-9為F2花粉全可育株，基因型為Rf1Rf1；泳道10-16為F2花粉半不育株，基因型為Rf1rf1。
實(shí)施例1.水稻恢復(fù)基因Rf1的精細(xì)定位與克隆本發(fā)明用圖位克隆法克隆Rf1基因。首先用水稻包臺(tái)型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系731A和恢復(fù)系C9083雜交，建立了一個(gè)有600株F2個(gè)體的分離群體。根據(jù)已報(bào)道的水稻第10染色體上所定位的Rf1位點(diǎn)的大致位置(Ichikawa，1997)，選擇了該區(qū)域的分子標(biāo)記進(jìn)行了多態(tài)性檢測(cè)和連鎖分析。這些標(biāo)記包括Y3-8(張群宇等，2002)、C1361、S10019(日本RGP研究所http//rgp.dna.affrc.go.jp)、以及根據(jù)水稻基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)的資料在BAC克隆序列OSJNBa0078O01所在位置設(shè)計(jì)和合成的引物以PCR擴(kuò)增獲得的多態(tài)性探針01-2.5、01-2、和Rf1m。用這些標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析，構(gòu)建了一個(gè)Rf1位點(diǎn)區(qū)域的連鎖圖(
圖1)。圖中有2個(gè)標(biāo)記即01-2.5和C1361與Rf1位點(diǎn)之間分別只有1個(gè)重組事件，相當(dāng)于0.08cM(厘摩爾根)的遺傳距離，而另2個(gè)標(biāo)記01-2和Rf1m與Rf1位點(diǎn)之間是零重組，即完全連鎖。01-2是一個(gè)RFLP標(biāo)記，Rf1m是一個(gè)SNP標(biāo)記，兩者相距約10kb。因此Rf1位點(diǎn)被精細(xì)定位在標(biāo)記01-2和Rf1m附近區(qū)域(
圖1)。以可轉(zhuǎn)化人工染色體載體TAC(Liu et al.，2002)構(gòu)建了一個(gè)恢復(fù)系C9083的基因組文庫(kù)。用01-2和Rf1m為探針篩選這個(gè)基因組文庫(kù)，獲得了1個(gè)TAC克隆，編號(hào)為A24，其插入子大小為36kb(
圖1)。
將克隆A24進(jìn)行了DNA測(cè)序和用基因預(yù)測(cè)軟件Autopredgeneset進(jìn)行基因預(yù)測(cè)分析。在與標(biāo)記Rf1m重疊的位置上預(yù)測(cè)到一個(gè)基因開放讀碼框(ORF)。用計(jì)算機(jī)分析軟件PSORT預(yù)測(cè)的結(jié)果顯示該ORF編碼表達(dá)的蛋白質(zhì)被定位到線粒體。由于植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因存在于線粒體，恢復(fù)基因表達(dá)產(chǎn)物需要進(jìn)入線粒體才能行使恢復(fù)育性的功能，因此將此ORF作為Rf1候選基因，通過(guò)以下的基因功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)其功能。2.水稻候選恢復(fù)基因的轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)化體的育性檢測(cè)將TAC克隆A24的插入子中包含Rf1候選基因的一個(gè)7.3kb片段亞克隆到植物轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1300，導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105。將水稻包臺(tái)型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系WYJ8A成熟種子在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織。把含有目的基因轉(zhuǎn)化載體的EHA105在YM瓊脂培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)1天，收集在含有100μmol/L的乙酰丁香酮的MB液體培養(yǎng)基。將水稻愈傷組織浸入菌液20分鐘，吸干菌液后轉(zhuǎn)移到MB瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)。轉(zhuǎn)移愈傷組織至含有50mg/L潮霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，每14天繼代一次，繼代2次。抗性篩選后，轉(zhuǎn)入再生培養(yǎng)基分化出轉(zhuǎn)化苗，獲得了50多株轉(zhuǎn)化體。
用SNP標(biāo)記Rf1m對(duì)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行了PCR檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)使用3個(gè)引物，其中引物Rf1m-1為GTGGAACCCATCATCTTTAAC-3’，引物Rf1m-2為GCAATAATGGAGCTGTAAA-3’，引物Rf1m-3R為GGAATGACCGAGCTCG-3’。Rf1m-3R為恢復(fù)系等位基因OsRf1特異的巢式引物。PCR步驟為(1)第1次PCR用引物Rf1m-1和引物Rf1m-2擴(kuò)增33個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為94℃30秒，60℃60秒，72℃60秒；(2)取1μl PCR產(chǎn)物為模板，用引物Rf1m-3R和Rf1m-2進(jìn)行第2次PCR反應(yīng)(25μl)，擴(kuò)增10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為94℃30秒，50℃30秒，72℃60秒。
檢測(cè)結(jié)果證明目的基因片段已導(dǎo)入這些轉(zhuǎn)化體(圖2)。轉(zhuǎn)化體抽穗開花時(shí)取花粉用碘化鉀染色鏡檢，發(fā)現(xiàn)可育花粉率達(dá)到約50％-80％，花粉萌發(fā)實(shí)驗(yàn)可觀察到轉(zhuǎn)化體的花粉萌發(fā)出花粉管(圖3)，轉(zhuǎn)化體自交能結(jié)實(shí)。而對(duì)照的不育系的可育花粉率為零，花粉不能萌發(fā)，自交不能結(jié)實(shí)。本實(shí)驗(yàn)即基因功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說(shuō)明，轉(zhuǎn)化到不育系的候選恢復(fù)基因的表達(dá)恢復(fù)了不育系的花粉育性，證明了該基因的生物學(xué)功能為恢復(fù)植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育的育性，確認(rèn)了該基因即為雄性不育恢復(fù)基因。本發(fā)明將這個(gè)從水稻基因組的Rf1位點(diǎn)克隆獲得的細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因命名為OsRf1(Oriza sativa Rf1)，水稻非恢復(fù)系的等位基因?yàn)镺srf1。3.OsRf1基因的序列分析通過(guò)篩選水稻cDNA文庫(kù)和反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)擴(kuò)增，獲得了OsRf1的cDNA克隆并測(cè)序。序列表中序列1所示序列為包含了OsRf1基因的基因組DNA片段，它包括啟動(dòng)子區(qū)、開放讀碼框、以及3’端非翻譯區(qū)的序列。OsRf1的開放讀碼框有1521個(gè)核苷酸，是一個(gè)沒有內(nèi)含子的基因，編碼由506個(gè)氨基酸組成的蛋白多肽(圖4，序列2)。測(cè)序比較分析發(fā)現(xiàn)OsRf1與多個(gè)非恢復(fù)系的Osrf1的核苷酸序列只有3個(gè)堿基的差別，其中2個(gè)堿基的變異導(dǎo)致2個(gè)氨基酸殘基的改變，即在序列2第156位的Gly(G)變?yōu)镾er(S)，第412位的Asn(N)變?yōu)镾er(S)。
數(shù)據(jù)庫(kù)比較分析沒有發(fā)現(xiàn)OsRf1與已知生物學(xué)功能的基因有明顯的同源性。OsRf1與玉米的T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因Rf2(乙醛脫氫酶基因)在核苷酸序列和氨基酸多肽序列上無(wú)同源性。OsRf1與矮牽牛的育性恢復(fù)基因Rf-PPR592在核苷酸序列上檢測(cè)不到同源性，在氨基酸多肽序列上只在部分區(qū)域有約29％的同源性。因此OsRf1是一個(gè)新的植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因。
以O(shè)sRf1基因?yàn)樘结樅Y選水稻cDNA文庫(kù)和測(cè)序分析，結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)檢索比較分析，發(fā)現(xiàn)水稻基因組中至少有另外7個(gè)基因與OsRf1高度同源。這些同源基因中，只有OsRf1的功能由本發(fā)明所確定，其余同源基因的功能未知。數(shù)據(jù)庫(kù)檢索發(fā)現(xiàn)一種植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)的基因組也有多個(gè)功能未知的氨基酸多肽序列與OsRf1編碼的氨基酸多肽序列有不同程度的同源性。利用NCBI網(wǎng)站進(jìn)行分析顯示，OsRf1編碼的氨基酸序列有7個(gè)PPR重復(fù)(圖4)，因此OsRf1屬于含PPR功能結(jié)構(gòu)域的超級(jí)基因家族的一個(gè)新成員，是該基因家族中已明確功能的少數(shù)幾個(gè)基因之一。4.OsRf1基因的表達(dá)特性分析用RT-PCR對(duì)該基因表達(dá)的組織和時(shí)空特異性進(jìn)行了分析。RT-PCR使用SNP標(biāo)記Rf1m的4個(gè)引物，即除了實(shí)施例2所述的3個(gè)引物外，還有一個(gè)不育系或保持系等位基因Osrf1特異的巢式引物Rf1m-3BGGAATGACCGAGCTCA-3’。PCR步驟為(1)第1次PCR用引物Rf1m-1和引物Rf1m-2擴(kuò)增33個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為94℃30秒，60℃60秒，72℃60秒；(2)取0.3μl PCR產(chǎn)物為模板，配制2個(gè)第2次PCR反應(yīng)(25μl)，即用引物Rf1m-3R和Rf1m-2為1個(gè)反應(yīng)，用Rf1m-3B和Rf1m-2為另1個(gè)反應(yīng)，擴(kuò)增10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為94℃30秒，50℃30秒，72℃60秒。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從恢復(fù)系和不育系及其導(dǎo)入OsRf1基因的不育系轉(zhuǎn)化體的幼穗和葉組織的RNA反轉(zhuǎn)錄模板能夠擴(kuò)增出特異片段，說(shuō)明OsRf1及其等位基因Osrf1在水稻幼穗和葉組織都有表達(dá)，即屬于組成型表達(dá)的基因(圖6)。5.轉(zhuǎn)化OsRf1基因產(chǎn)生新恢復(fù)系及配制雜種的應(yīng)用將OsRf1基因亞克隆到植物轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1300，導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105，用于轉(zhuǎn)化水稻包臺(tái)型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系WYJ8A，獲得了50多株轉(zhuǎn)化體。用轉(zhuǎn)化體的T1代純合植株與另一個(gè)水稻不育系KFA雜交，產(chǎn)生了雜種F1種子。這些F1植株長(zhǎng)勢(shì)良好，且育性正常(圖7)，說(shuō)明可以用轉(zhuǎn)化OsRf1基因產(chǎn)生新的恢復(fù)系，用于雜交種子生產(chǎn)。6.OsRf1基因序列在分子標(biāo)記輔助選擇育種中的應(yīng)用利用本發(fā)明提供恢復(fù)基因序列信息可以產(chǎn)生分子標(biāo)記，用于鑒定Rf1位點(diǎn)上具有各種基因型即Rf1Rf1、Rf1rf1、rf1rf1的植株，可在分子標(biāo)記輔助選擇育種中應(yīng)用。圖8所示為用SNP標(biāo)記Rf1m對(duì)水稻親本和F2代植株的基因型進(jìn)行鑒定，PCR反應(yīng)條件與實(shí)施例4的相同。結(jié)果表明所有植株的標(biāo)記基因型與花粉育性表現(xiàn)型完全一致。
序列表<110>華南農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因及其應(yīng)用<160>2<210>1<211>3453<212>DNA<213>稻屬水稻(Orisa sativa L.)<220><221>CDS<222>(1460)...(2980)<400>1ggcgagctcg ctggtggccg tgatgatgca ggcgctcgcc caccgcgcca gctacctgtg60ggtgctcgac gaggacgacg actgccgcct cgccgggatc gtcacgttcg ccgacgtgct 120cacggtgttc cgcgagcagc tgcagtgaag gccgctgccg cggcgacgcc aagaaagagt 180tctttttttt ttttctgttg cggcgatcga tcgatggatc gttgtgcatg cctgcatcct 240tgttctgaaa acattttgga gtgtttattt tgaagcgttt tgaactctga actctgaagt 300atttgtctct gccttggcct ggtgttgatg aacaaactga gactttttgg atatgccttc 360caaataaata agcatttgag ttttcatgct gtagtgaaaa attctaaatt gtgattcagt 420ttagaatagt tgaggacatg ttttgtgaga aacaagtgat caaagtggaa tattttaaaa 480agaaactaaa acacgacgga gatgcagtaa tttggattga tgagtaggga taggaagcag 540agagatcgaa gagtgacatt ctcgttggca tcatttttct ctactattat aaaaattgaa 600aatattttta ctaatatttt cgtacgtcat ccgggtacga gacgattttt aaattcgttt 660gcttttagaa atacatatcc gtatttgagt cggtttttaa cattgttcac ttttggcaat 720acagaaagaa tcatataaga aatctgttta aaaaaaactc gcatgctaac ttaaacgatc 780ggacttctaa ctgcagctca tgattttata aaaatatata tatccaagcg aactccatag 840tgaattttat tttaactaaa ccatataata ataacaagat taaaatagac tttacccatt 900gtaatgcacg ggcatttttt ctagtctatg aaaaaattga gaaaattttg caagtgaaat 960attattatgc cacattagca acaaagaaag ttggaaatat ttgcagtata aaaaaaacaa 1020gtaaaaacat gccactcgta gctagaaaaa aaaagtaact taaggaatat aaaaacatgc 1080ttcccatata gaaaaaaaaa gagtaacccc aaatcaagta atactcgttg aagcaagatg 1140tatgtgaaac cgaaaaaaga aaaaaaaaag aacaaataag acgctgatct gattgatctc 1200ttctcgtcgt cttcttcccg cgcctttcgc gaagccaact gctcgaacgg acgcacccgt 1260gcagccgcgc tcgtcggccg tcgccgtcga ggccgcccct ccgccgccgc cagcagctga 1320tccgttcgcc attccttcgc gcgctggtta gttccacctt cctttgcctc tggttcctag 1380tttcctagta aaccacgggg tgatttattc agcgctgccg caggtttcca cctttccttg 1440cccgtccgtc aggccggaca tggcacgccg cgtcgctgcc cgcgcccgcg cccgcgccgg 1500cggcgtcccg cgctcggagg gtacgatcca agaccgagca cgcgttggga gcggtggcgc 1560cgaggacgca ctcgacgtgt tcgacgaatt gctccggcga ggcatcggcg ccccgatccg 1620cagcttgaac ggcgctctcg ccgacgtcgc gcgcgacaac cccgcggccg ctgtgtcccg 1680cttcaaccgc atggcacgag ctggtgccag catggtaact cccaccgtgc acacctatgg 1740catcctcatc ggctgctgct gcagtgcggg ccgcttagac ctcggtttcg cggccttggg 1800ccatgtcgtt aagaagggat tcagagtgga acccatcatc tttaatcctc tgctcaaggg 1860cctctgtgca gacaagagga cggacgacgc aatggacata gtgctccgcg gaatgaccga 1920gctcggctgc gtgccaaatg tcttctccca caccattatt ctcaagggac tctgtcatga 1980gaacagaagc caagaagctc tcgagctgct ccacatgatg gctgatgatg gaggaggctg 2040cttacctaat gttgtgtcat acagcaccgt catcgatggc ctcttgaaag gaggggatcc 2100ggacaaagcc tacgctacat accgtgaaat gcttgaccgg aggattttgc caaatgttgt 2160gatttacagc tccattattg ctgccctatg caagggtcaa gcaatggaca aggccatgga 2220ggtacacgat aggatggtta agaatggagt tacacccaat tgcttcacgt atactagtct 2280tgtgcatgga ttttgctctt cagggcagtt gacagaggct attaaatttc tagaaaagat 2340gtgcagcaat ggtgttgaac caaatgttgt tacttatagc tcgtttatgg actatctctg 2400caagaacgga agatgcacag aagctagaaa gatttttgat tctatggtca agaggggcct 2460aaagcctgat attactacct acagtagctt acttcatggg tatgctatcg aaggagctct 2520tgttgagatg catggtctct ttgatttgat ggtacaaagt gatatgcaac ccgatcatta 2580tgtcttcaac acactaatat atgcatccgc caagcaagga aaagtagatg aggccatgct 2640tgtatttagc aaaatgaggc agcaaggatt gaaacctaat tgtgttacgt ataacacttt 2700gattaatggc tactgtaaaa ttactaggat ggagaatgct ttagcacttt tccaagagat 2760ggtgagcaat ggtgttagtc ctaattttat cacatataac ataatgctgc aaggtttatt 2820tcgtacagga agaactgcta ctgcaaaaga attctatgta cagattatca aaagtggcaa 2880aaaagatctt atagaacagg ggttgctaga agaattggat gatctatttc tttcaatgga 2940ggacaatgac tgtagtactg tgtcgactcc tgcatgctaa attgcagagt tacaaagtta 3000cttcaaaaag gggaagtagg cactaggcag tgctggggtt tacatgtcca aaattgatca 3060aaataacctc cccgttgaag cttcgactgt tgatttgctg attttgctga tttcaagcag 3120gaaattcaat caaacatacg gaatttctcc ctgaaaagtt ttgctctgaa gtgaaatcca 3180tcctgtttga aatggcctac agttatgcag ttgtaactgg ctattgttgg ccttctcact 3240gaattagtaa tacaaacaag aaattctgga ccactctatg tttggggatc 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Asn Val Phe Ser His Thr155 160 165Ile Ile Leu Lys Gly Leu Cys His Glu Asn Arg Ser Gln Glu Ala170 175 180Leu Glu Leu Leu His Met Met Ala Asp Asp Gly Gly Gly Cys Leu185 190 195Pro Asn Val Val Ser Tyr Ser Thr Val Ile Asp Gly Leu Leu Lys200 205 210Gly Gly Asp Pro Asp Lys Ala Tyr Ala Thr Tyr Arg Glu Met Leu215 220 225Asp Arg Arg Ile Leu Pro Asn Val Val Ile Tyr Ser Ser Ile Ile230 235 240Ala Ala Leu Cys Lys Gly Gln Ala Met Asp Lys Ala Met Glu Val245 250 255His Asp Arg Met Val Lys Asn Gly Val Thr Pro Asn Cys Phe Thr260 265 270Tyr Thr Ser Leu Val His Gly Phe Cys Ser Ser Gly Gln Leu Thr275 280 285Glu Ala Ile Lys Phe Leu Glu Lys Met Cys Ser Asn Gly Val Glu290 295 300Pro Asn Val Val Thr Tyr Ser Ser Phe Met Asp Tyr Leu Cys Lys305 310 315Asn Gly Arg Cys Thr Glu Ala Arg Lys Ile Phe Asp Ser Met Val320 325 330Lys Arg Gly Leu Lys Pro Asp Ile Thr Thr Tyr Ser Ser Leu Leu335 340 345His Gly Tyr Ala Ile Glu Gly Ala Leu Val Glu Met His Gly Leu350 355 360Phe Asp Leu Met Val Gln Ser Asp Met Gln Pro Asp His Tyr Val365 370 375Phe Asn Thr Leu Ile Tyr Ala Ser Ala Lys Gln Gly Lys Val Asp380 385 390Glu Ala Met Leu Val Phe Ser Lys Met Arg Gln Gln Gly Leu Lys395 400 405Pro Asn Cys Val Thr Tyr Asn Thr Leu Ile Asn Gly Tyr Cys Lys410 415 420Ile Thr Arg Met Glu Asn Ala Leu Ala Leu Phe Gln Glu Met Val425 430 435Ser Asn Gly Val Ser Pro Asn Phe Ile Thr Tyr Asn Ile Met Leu440 445 450Gln Gly Leu Phe Arg Thr Gly Arg Thr Ala Thr Ala Lys Glu Phe455 460 465Tyr Val Gln Ile Ile Lys Ser Gly Lys Lys Asp Leu Ile Glu Gln470 475 480Gly Leu Leu Glu Glu Leu Asp Asp Leu Phe Leu Ser Met Glu Asp485 490 495Asn Asp Cys Ser Thr Val Ser Thr Pro Ala Cys.
500 50權(quán)利要求
1一種分離出的植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因，其特征在于(1)編碼一種具有植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)活性的氨基酸多肽序列，該多肽具有序列表中序列2所示的序列；或編碼具同等功能的由序列2衍生的多肽序列，或其保守性變異多肽，或其活性片段；(2)具有序列表中序列1的核苷酸序列；或與序列1的第1460-2980位堿基序列中連續(xù)210堿基以上的區(qū)段有85％以上的同源性，且編碼與序列2同等功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)的基因，其特征在于所編碼的氨基酸多肽序列含有由35氨基酸殘基重復(fù)單位PPR組成的功能結(jié)構(gòu)域。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)的基因，其特征在于序列1中的第1-1459位堿基為含有啟動(dòng)子調(diào)控元件和5’端非翻譯區(qū)的序列，第1460-2980位堿基為開放讀碼框，第2981-3453位堿基為3’端非翻譯區(qū)的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)的基因，其特征在于序列1為含有來(lái)源于水稻的細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因OsRf1的序列，序列2為序列1中的第1460-2980位堿基序列編碼的氨基酸多肽序列。
5.含有權(quán)利要求1所說(shuō)基因的全部序列或部分序列的載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)基因的應(yīng)用，其特征在于將所說(shuō)的基因或含有所說(shuō)基因的載體轉(zhuǎn)化水稻或其它植物，培育能表達(dá)所說(shuō)基因的轉(zhuǎn)基因恢復(fù)系；用轉(zhuǎn)基因恢復(fù)系與細(xì)胞質(zhì)雄性不育系雜交，產(chǎn)生雜交種子。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)的基因序列的應(yīng)用，其特征在于根據(jù)所說(shuō)的基因序列產(chǎn)生特異性的分子標(biāo)記探針，用此標(biāo)記探針鑒定水稻或其它植物的雄性不育恢復(fù)系或恢復(fù)植株或非恢復(fù)系或非恢復(fù)植株，進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇育種。
全文摘要
本發(fā)明提供了一個(gè)來(lái)源于水稻的細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因OsRfl的核苷酸序列及其編碼的氨基酸多肽序列。該基因?qū)儆赑PR基因家族的成員，為一個(gè)組成型表達(dá)的基因。本發(fā)明還涉及用該基因轉(zhuǎn)化水稻或其它植物選育恢復(fù)系以及根據(jù)該基因序列產(chǎn)生的分子標(biāo)記在育種的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A01H1/00GK1425770SQ02152010
公開日2003年6月25日 申請(qǐng)日期2002年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月20日
發(fā)明者劉耀光, 王中華, 吳豪, 張群宇, 蘇弟華, 陳樂天 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)