專利名稱：一種篩選轉(zhuǎn)基因植物的方法及其所用的雙價(jià)植物表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以草甘膦抗性基因作為標(biāo)記基因篩選轉(zhuǎn)基因植物的方法，及其所用的雙價(jià)植物表達(dá)載體。
背景技術(shù)：
如何篩選植物轉(zhuǎn)化體是成功獲得轉(zhuǎn)基因植物的一個(gè)關(guān)鍵技術(shù)。選擇標(biāo)記按照其基因產(chǎn)物的性質(zhì)主要有幾大類型抗生素類、生化類、熒光素類及抗除草劑類。目前，大多采用抗生素抗性基因作為篩選植物轉(zhuǎn)化的標(biāo)記基因，最常用的有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(Npt II)和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(HPT)。前者基因編碼酶對(duì)卡那霉素(km)和新霉素(neo)具有抗性，后者基因編碼酶對(duì)潮霉素(hyg)產(chǎn)生抗性。雖然這些抗生素抗性基因作為標(biāo)記基因具有轉(zhuǎn)化率較高且方便篩選的優(yōu)點(diǎn)，但人們擔(dān)心這些抗性基因一旦由轉(zhuǎn)基因植株轉(zhuǎn)移到病原菌中，將會(huì)使病原菌對(duì)抗生素產(chǎn)生抗性。用熒光素類基因僅作為報(bào)告基因，無選擇(篩選)作用。生化類基因標(biāo)記，如二氫葉酸還原酶基因標(biāo)記，由于價(jià)格昂貴，不宜推廣。上述三大類型選擇標(biāo)記僅僅作為篩選標(biāo)記，不能夠作為目的性狀基因。目前常用的抗除草劑基因有抗草丁膦的bar(Basta乙酰CoA轉(zhuǎn)移酶)基因和抗溴苯氰的bxn(腈水解酶)基因，但這兩種篩選劑都逐漸被淘汰，因?yàn)椴荻§r(jià)格太昂貴而溴苯氰能被皮膚吸收影響嚙齒動(dòng)物的發(fā)育。
草甘膦對(duì)動(dòng)物毒性低(大白鼠LD 50，口服11343mg/kg，皮下注射7500mg/kg)，在環(huán)境中可被多種微生物分解，也可通過理化途徑降解，所以基本上沒有對(duì)環(huán)境污染的問題。利用莽草酸羥基乙烯轉(zhuǎn)移酶基因(aroA)作為標(biāo)記基因?qū)θ说氖澄镦湼鼮榘踩?，因此是一種理想的植物標(biāo)記基因。
草甘膦是一種內(nèi)吸光譜性除草劑，它可無選擇地抑制所有植物的莽草酸羥基乙烯轉(zhuǎn)移酶(EPSPS)的活性，阻斷芳香族氨基酸的合成，從而阻斷植物的生長。EPSPS在芳香族氨基酸合成途徑中催化莽草酸-3-磷酸(S3P)與磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)合成，形成5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSP)。國外應(yīng)用基因工程培育耐除草劑作物的研究已有15年以上，已開發(fā)出多種抗除草劑的轉(zhuǎn)基因作物，因此，抗草甘膦基因本身又是目的性狀基因。過去，抗草甘膦基因工程的主要策略是利用定點(diǎn)突變來改良草甘膦作用的靶蛋白EPSPS，但由于酶的三維結(jié)構(gòu)和氨基酸作用部位并不完全清楚，所以定點(diǎn)突變的效果十分有限。遇到的問題是，突變后酶雖然降低了對(duì)草甘膦的親和力，但同時(shí)對(duì)酶原低物的親和力也下降，因而影響了酶的催化活性。CN1358858專利申請(qǐng)公開了一種采用基因優(yōu)化技術(shù)所獲得的抗草甘膦抗性基因aroAM12其特征是在EPSPS氨基酸位置由脯氨酸35→丙氨酸；丙氨酸40→纈氨酸；蘇氨酸42→蛋氨酸；精氨酸83→組氨酸；賴氨酸185→谷氨酸；異亮氨酸201→絲氨酸；精氨酸330→蘇氨酸。研究表明，由于EPSP合成酶中多個(gè)氨基酸位點(diǎn)的改變，使該酶對(duì)底物PEP親和性增加，而同草甘膦親和性下降，從而提高對(duì)草甘膦的抗性。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有的篩選轉(zhuǎn)基因植物的方法中篩選標(biāo)記的單一作用或者安全性的不足，本發(fā)明提供一種新型篩選方法及其所用的植物雙價(jià)表達(dá)載體。該方法不僅能夠高效篩選植物轉(zhuǎn)化體，而且方法中的篩選標(biāo)記基因本身又是很好的目的性狀基因。
本發(fā)明的篩選轉(zhuǎn)基因植物的方法是用草甘膦抗性基因取代以往所用的抗生素抗性基因，作為篩選轉(zhuǎn)基因植物品系的標(biāo)記基因。
本發(fā)明方法的具體步驟可以是首先在植物表達(dá)載體中插入草甘膦抗性基因(最好是通過基因優(yōu)化技術(shù)獲得的草甘膦抗性基因，例如aroAM12)以及所要篩選的植物性狀基因，構(gòu)成植物雙價(jià)表達(dá)載體；用該植物雙價(jià)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，獲得含有該表達(dá)載體的工程菌；再用此工程菌感染植物外植體；由于草甘膦對(duì)植物有毒性，所以感染后的外植體在分化培養(yǎng)基中分化一周后，待草甘膦抗性基因充分表達(dá)后再加入選擇劑(草甘膦)進(jìn)行篩選。
用于上述本發(fā)明方法的植物雙價(jià)表達(dá)載體，其結(jié)構(gòu)特征是該載體含有草甘膦抗性基因和所要篩選的植物性狀基因。
該植物雙價(jià)表達(dá)載體可以采用植物表達(dá)載體pCAMBIA1300為基本載體，在pCAMBIA1300的多克隆位點(diǎn)MCS處插入草甘膦抗性基因和所要篩選的植物性狀基因而構(gòu)成。植物表達(dá)載體pCAMBIA1300中含有Ti質(zhì)粒中T-DNA的左右邊界序列(LB和RB)，在該段DNA中含有多克隆位點(diǎn)(MCS)，在兩邊界序列之外含有卡那霉素抗性基因km(r)。
上述植物雙價(jià)表達(dá)載體所用的草甘膦抗性基因最好是通過基因優(yōu)化技術(shù)獲得的，例如aroAM12。
本發(fā)明利用草甘膦抗性基因的雙重功效，即一方面作為抗除草劑基因，另一方面作為一種植物篩選標(biāo)記基因，并與其它的重要目的性狀基因連鎖起來轉(zhuǎn)化植物，將大大方便轉(zhuǎn)化植物的篩選以及純系育種品種的篩選。
試驗(yàn)證明，用本發(fā)明方法篩選的轉(zhuǎn)基因植物，不僅具有良好的目的轉(zhuǎn)化基因的性狀，而且具有良好的抗草甘瞵性狀。
以下通過附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。


圖1是含有BtS1m基因的pBtPCR2.1質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖。
圖2是pGAT1300質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖。
圖3是含有aroAM12基因和BtS1m基因的pCM12-BtS1m植物雙價(jià)基因表達(dá)載體示意圖。
圖4是aroAM122和BtS1m基因的特異性檢測(cè)引物進(jìn)行PCR檢測(cè)擴(kuò)增的結(jié)果示意圖。
圖5是煙草葉片對(duì)草甘膦的抗性實(shí)驗(yàn)示意圖。
圖6是煙草生根抗性實(shí)驗(yàn)示意圖。
圖7是煙草植株對(duì)草甘膦的抗性示意圖。
圖8是雙價(jià)轉(zhuǎn)基因煙草表現(xiàn)出的抗蟲效果示意圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1.抗蟲、抗草甘膦植物雙價(jià)表達(dá)載體的構(gòu)建按照表1.1所示的Hind III+Sal I雙酶切反應(yīng)及電泳體系，用Hind III+Sal I切割含有BtS1m基因片段的質(zhì)粒pBtS1m(01129519.8號(hào)專利申請(qǐng)公開)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，利用E.Z.N.AGelExtraction kit(Omega，下同)回收2.7kb左右大小處的條帶，得到2E-35sp+BtS1m片段。用HindIII+Xho I切割aroAM12PCR2.1質(zhì)粒(含aroAM12基因的PCR2.1質(zhì)粒，見圖1)，回收4100bp處的條帶，得到含有Nos終止序列的片段，然后用T4DNA連接酶將回收的2.7kb和4100bp的兩部分DNA片段連接起來(連接反應(yīng)體系見表1.2)，得到含有BtS1m基因的pBtPCR2.1質(zhì)粒(見圖1)。用EcoRI+Xho I切割含aroAM12基因片段的pCAMBIA1300-M12(由aroAM12基因片段插入pCAMBIA1300質(zhì)粒構(gòu)成，見圖2)，回收2300bp處的條帶，得到含有CaMV+TSP+aroAM12的片段；用EcoR I+Xho I切割pCAMBIA1300載體，回收6800bp處的條帶，得到去除抗潮霉素基因的pCAMBIA1300空表達(dá)載體；然后用T4DNA連接酶將2300bp和6800bp兩部分DNA片段連接起來，得到含aroAM12的去除抗潮霉素抗生素基因的pGAT1300質(zhì)粒(見圖2)。用Hind III+Xba I切割pGAT1300質(zhì)粒，得到帶有缺口的pGAT1300質(zhì)粒。用Hind III+Xba I切割pBtPCR2.1質(zhì)粒，回收3.0kb處的條帶，得到2E-35spBt+Nos片段，然后用T4DNA Ligase連接帶有缺口的pGAT1300質(zhì)粒和3.0kb兩部分DNA片段，即得到雙價(jià)質(zhì)粒載體pCM12-s1m(見圖3)。該植物雙價(jià)表達(dá)載體pCM12-s1m上含有抗草甘膦基因(aroAM12)和抗蟲基因(BtS1m)，但不含可在植物中表達(dá)的抗生素抗性基因。其中，抗草甘膦基因(aroAM12)所在表達(dá)框的構(gòu)成是從5′到3′端方向(I)轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的啟動(dòng)子CaMV35s，(II)轉(zhuǎn)導(dǎo)肽序列(TSP)，以便將合成的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到其作用靶位點(diǎn)葉綠體中，(III)抗草甘膦基因M12編碼序列和(IV)3′端的非翻譯區(qū)PolyA片段?？瓜x基因BtS1m所在表達(dá)框的構(gòu)成是從5′到3′端方向(I)轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，包含有2個(gè)增強(qiáng)子的35s啟動(dòng)子，即2E-35sp，(II)TMVRNA的Ω片段(翻譯增強(qiáng)子)，(III)帶分泌信號(hào)肽的嵌合Bt殺蟲蛋白編碼序列BtS1m，(IV)Nos，3′端的轉(zhuǎn)錄終止序列。
表1.1 Hind III+Sal I雙酶切反應(yīng)及電泳體系質(zhì)粒載體DNA 20.0μlHind III(10U/μl) 3.0μlSal I(10U/μl)3.0μl10x反應(yīng)緩沖液 8.0μlddH2O46.0μl在37℃條件下保溫3小時(shí)，然后用1XTAE(0.04mol/L Tris-乙酸，0.001mol/L EDTA)電泳緩沖液配制1.0％的瓊脂糖凝膠，在瓊脂糖凝膠里加入EB(溴化乙錠)至終濃度為0.5μg/ml，在3-5V/cm的電壓降下電泳。
表1.2 連接反應(yīng)體系DNA片段1 5.0μlDNA片段2 5.0μlddH2O8.0μlT4 Ligase(5weiss U/ul)0.5μlT4 Ligase緩沖液(10x) 2.0μl在16℃條件下連接反應(yīng)過夜。實(shí)施例2.大腸桿菌轉(zhuǎn)化子的獲得E.coli XL-1-blue感受態(tài)細(xì)胞的制備①將XL1-blue的單菌落接入5mL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基(見表2.1)中，37℃、震蕩過夜；②按1％(v/v)的量轉(zhuǎn)入新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩至OD600＝0.3；③將50-100mL的LB液體培養(yǎng)基(LB配制見表2.1)加入兩個(gè)無菌離心管中，在冰上放置30分鐘；④在4℃、4000rpm(轉(zhuǎn)/分)離心10分鐘，去上清液，在每個(gè)離心管中加入10mL預(yù)冷的0.1％CaCl2溶液重懸菌體，冰浴30分鐘。⑤在4℃、4000rpm離心10分鐘，去上清液，將菌體懸浮于2mL預(yù)冷的0.1％的CaCl2溶液中，再加入300μL的無菌甘油，混勻，在每個(gè)無菌的離心管中加入100uL XLl-blue感受態(tài)細(xì)胞，于-70℃保存。
取實(shí)施例1中的連接產(chǎn)物(植物雙價(jià)表達(dá)載體pCM12-slm)10μl，加入到剛好融化的大腸桿菌XL-1-blue感受態(tài)細(xì)胞中，輕微混勻，冰浴半小時(shí)；42℃水浴熱激90秒鐘，然后冰浴1-2分鐘。加LB培養(yǎng)基1ml于Eppendorf管中，37℃水浴培養(yǎng)1小時(shí)，13000rpm離心5秒鐘，去上清，加入100μl LB培養(yǎng)基，混勻，涂在LB+Km(kanamycine，卡那霉素)平板上。37℃培養(yǎng)24小時(shí)左右時(shí)，挑取單菌落，搖菌過夜，采用E.Z.N.APlasmid miniprep Kit回收質(zhì)粒，經(jīng)PCR和酶切檢測(cè)后，挑選出陽性質(zhì)粒，保存相應(yīng)的菌落，即轉(zhuǎn)化子。該轉(zhuǎn)化子可用于擴(kuò)增和提取植物雙價(jià)表達(dá)載體pCM12-s1m。
表2.1 LB液體培養(yǎng)基成分細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨10g；細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物5g；NaCl10g；去離子水950mL(若配制固體培養(yǎng)基則再按18-20g/L的量加入瓊脂。)完全溶解后用5mol/LNaOH調(diào)pH7.2，再加入去離子水至總體積為1L，然后高壓滅菌即可。實(shí)施例3.根癌土壤桿菌的轉(zhuǎn)化根癌土壤桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞的制備①從含有鏈霉素(str)和利福平(Rif)的YEB固體培養(yǎng)基(見表3.1)平板上挑取LBA4404菌落，接種到5ml含有相應(yīng)抗生素的YEB液體培養(yǎng)基(按表3.1，不加瓊脂)中，28℃，200rpm震蕩過夜。②用YEB液體培養(yǎng)基稀釋至50ml，然后28℃、200rpm培養(yǎng)6-12小時(shí)，至OD600值為0.6左右。③置于冰上5分鐘，然后于4℃、2000rpm離心7分鐘。④取1ml濃度為20mmol/L冰冷的CaCl2溶液重懸沉淀，混勻。⑤分裝成10份，每份100μl，-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 向-70℃冰箱中保存的桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞100μl中加入實(shí)施例2中所提取的質(zhì)粒5μl，37℃水浴5分鐘，之后加入1ml YEB液體培養(yǎng)基，室溫下放置3小時(shí)。6000rpm離心30秒，倒掉上清，加入100μl YEB，混勻，涂布在YEB+Str+Rif+Km平板上。48小時(shí)左右時(shí)，挑取單菌落(經(jīng)酶切和PCR檢測(cè)，確認(rèn)為含有雙價(jià)基因質(zhì)粒載體)，搖菌過夜，培養(yǎng)至OD600值為0.4-0.6時(shí)用于感染。
表3.1 YEB固體培養(yǎng)基成分細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨5g/L細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物5g/L蔗糖5g/L硫酸鎂 2mmol/L調(diào)pH值至7.2，按18g/L的量加入瓊脂。實(shí)施例4.含有雙價(jià)載體的工程菌對(duì)煙草的轉(zhuǎn)化及抗性植株的獲得將實(shí)施例3得到的工程菌感染煙草外植體(葉片，剪成0.5×0.5cm大小)5分鐘，用經(jīng)過高壓滅菌的濾紙吸干，移入到MS+6-BA(6-benzyladenine，6-芐基嘌呤)1mg/L+NAA(naphthalene acetic acid，萘乙酸)0.1mg/L+3％蔗糖+0.7％瓊脂的培養(yǎng)基中暗處共培養(yǎng)48小時(shí)。用無菌水沖洗3遍，無菌濾紙吸干，然后移入到含有頭孢霉素(400mg/L)的MS+6-BA(1mg/L)+NAA(0.1mg/L)分化培養(yǎng)基中，28±2℃，漫射光條件培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化。培養(yǎng)1周，再轉(zhuǎn)移到含有選擇劑草甘膦的分化培養(yǎng)基上[MS+6-BA(1mg/L)+NAA(0.1mg/L)+草甘膦(30μmol/L)]。繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間(3周)，當(dāng)芽長至2-3cm時(shí)，將產(chǎn)生的抗性芽切下移入到不含草甘膦的MS+NAA(0.1mg/L)生根培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)根的形成。一周后不定根出現(xiàn)。在過兩周后打開瓶蓋煉苗2-3天，將苗取出，用自來水沖去根部培養(yǎng)基，移到盆中，保濕1周后即可成活。實(shí)施例5.轉(zhuǎn)基因植株的分子生物學(xué)鑒定取待測(cè)煙草植株(實(shí)施例4篩選得到的抗性植株)幼嫩葉片，采用CTAB(十六烷基二甲基乙基溴化銨)法微量提取DNA取約1-2cm2的新鮮幼嫩葉片，在一裝有400ul冰冷的CTAB(-)緩沖液(50mmol/L Tris-HCl pH8.0，0.7mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA pH8.0)的管中用玻璃棒磨碎，然后加入500μl于65℃預(yù)熱的CTAB(+)緩沖液{CTAB(-)，2％CTAB.使用前加入1％的2-巰基乙醇}，混勻，65℃保溫90分鐘，期間不時(shí)顛倒混勻，后取出，待冷至室溫后加入450ul氯仿/異戊醇(體積比為24∶1)，顛倒混勻至溶液呈乳濁狀，離心10分鐘。將上層液相轉(zhuǎn)移至一干凈的Eppendorf管中，加入等體積異丙醇，室溫放置20分鐘，然后離心5分鐘，收集沉淀。用70％乙醇洗滌DNA沉淀，于空氣中干燥后，加入20μl雙蒸水溶解。
分別用aroAM12和BtS1m基因的特異性檢測(cè)引物(按照表5.1和表5.2體系)進(jìn)行PCR檢測(cè)。aroAM12引物序列為引物15’-CATGCCATGGAATCCCTGACGTTACAA-3’引物25’-CGCGGATCCTTAGCAGGCTACTCATTC-3’Bts1m引物序列為引物1′5′TATCCCATTGTTCGCAGTCC 3′引物2′5′CATCACGACTCAAGTTGTTA 3′表5.1 PCR反應(yīng)液2×TaqDNA聚合酶緩沖液，4種dNTP各200μM，根據(jù)各模板設(shè)計(jì)的特異引物各3pM(BIOASIA)，各源模板DNA約102-104拷貝，TaqDNA聚合酶(上海生工)約.0.5-5U。具體為dNTPs 2μl模板DNA 1μlTaqDNA聚合酶 0.5μl引物1 0.5μl引物2 0.5μlddH2O16.5μl表5.2 PCR反應(yīng)程序預(yù)變性94℃，5分鐘循環(huán)94℃60秒，58℃60秒，72℃60秒共進(jìn)行30次。
72℃延伸10分鐘。
反應(yīng)結(jié)束后，電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果。電極緩沖液為1xTAB，1.0％的瓊脂糖凝膠，在3-5V/cm的電壓降下電泳1小時(shí)。
檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。其中M為DNA ladder，ck為空白對(duì)照，上圖a，b，c，d為加入BtS1m特異引物后的檢測(cè)結(jié)果，下圖a，b，c，d為加入aroAM12特異引物后的檢測(cè)結(jié)果。從中可以看出，兩組引物分別在1.3kb(aroAM12片段)和0.98kb(BtS1m部分片段)處出現(xiàn)了擴(kuò)增條帶。從圖4中可以看出用草甘膦抗性基因作為標(biāo)記基因篩選出的4株轉(zhuǎn)化苗的DNA擴(kuò)增結(jié)果表明，該雙價(jià)基因已經(jīng)整合到植物基因組DNA中。實(shí)施例6.植株對(duì)草甘膦的抗性檢測(cè)取實(shí)施例4所獲得轉(zhuǎn)化煙草苗幼葉，剪成0.5×0.5cm大小，放在含有10到100μmol/L草甘膦的MS+6-BA(1mg/L)+NAA(0.1mg/L)+3％蔗糖+0.7％瓊脂的分化培養(yǎng)基中，在28℃恒溫，每天16小時(shí)光照條件下培養(yǎng)。以未經(jīng)轉(zhuǎn)化的煙草葉片作為對(duì)照，檢驗(yàn)轉(zhuǎn)化所獲得的煙草對(duì)草甘膦的抗性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示上面一行A為轉(zhuǎn)基因煙草葉片，從左到右培養(yǎng)基中草甘膦的濃度依次為0、0.05、0.4、0.8、1.2mmol/L；下面一行B為野生對(duì)照煙草葉片，從左到右培養(yǎng)基中草甘膦的濃度依次為0、0.05、0.4、0.8、1.2mmol/L。從圖中可以看出轉(zhuǎn)基因植株的葉片在1.2mmol/L草甘膦的培養(yǎng)基上仍能分化出芽，而對(duì)照在0.05mmol/L草甘膦的培養(yǎng)基上時(shí)就沒有芽分化出來，表明所獲得的轉(zhuǎn)化植株具有很好的草甘膦抗性。
將誘導(dǎo)出的抗性芽和空白對(duì)照分化出的芽轉(zhuǎn)移到MS+NAA(0.1mg/L)+3％蔗糖+0.7％瓊脂+30μmol/L草甘膦的生根培養(yǎng)基中，在28℃恒溫，每天16小時(shí)光照條件下培養(yǎng)20天，觀察生根的情況。結(jié)果如圖6所示其中a為雙價(jià)轉(zhuǎn)基因煙草，CK為空白對(duì)照煙草；轉(zhuǎn)基因植株能夠在30μmol/L草甘膦的生根培養(yǎng)基中正常生根，而對(duì)照則不生根或很少生根。
將移栽到大棚的草甘膦抗性煙草苗，直接用孟山都公司的Roundup(活性成分為稀釋至1.55g/L草甘膦)噴灑。結(jié)果如圖7所示其中a1為空白對(duì)照煙草苗噴灑草甘膦(1.55g/L)前的生長狀況，a2為噴灑后15天的生長狀況；b1為雙價(jià)轉(zhuǎn)基因苗噴灑草甘膦(1.55g/L)前的生長狀況，b2為噴灑后15天的生長狀況。噴灑一周后，轉(zhuǎn)基因獲得的煙草，沒有受損的現(xiàn)象；第二次噴藥后，在少數(shù)葉片上出現(xiàn)了一些黃色的斑點(diǎn)，但不影響整棵煙草的生長和長出新葉，而對(duì)照則在10天后死亡。
綜合圖5、圖6、圖7結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出了良好的抗性。實(shí)施例7.轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)棉鈴蟲的殺蟲活性測(cè)定試驗(yàn)設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)基因植株aroAM12，aroAM12+BtS1m和常規(guī)煙草(CK)三個(gè)處理。用于處理1，2齡幼蟲的煙葉放入鋪有浸濕濾紙的培養(yǎng)皿中，葉柄基部用濕潤的脫脂棉球包裹，以防葉片迅速萎焉。試驗(yàn)組和對(duì)照組各接入1齡棉鈴蟲8頭和2齡棉鈴蟲3頭，接蟲前稱重。接蟲后置于28±2℃，光照∶黑暗＝16∶8hrs的溫室中，3天后觀察幼蟲的生存和發(fā)育的情況。結(jié)果如圖8和表7.1所示。從圖和表中可以看出，雙價(jià)轉(zhuǎn)基因煙草表現(xiàn)出良好的抗蟲效果。
表7.1 轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)棉鈴蟲幼蟲生存和發(fā)育的影響材料死亡率(％) 存活幼蟲體重 PCR結(jié)果對(duì)草甘膦代號(hào)3d 6d (mg)3d BtS1m aroAM12的抗性o 12.5 12.55.0±0.3 -+ +a 88.5 100 0.6±0.3 ++ +b 80.0 90 0.7±0.2 ++ +c 85.0 100 0.6±0.35 ++ +d 80.0 100 0.5±0.28 ++ +CK 10.0 10.05.5±0.4 -- -表中，o為含有aroAM12單價(jià)基因植株，a、b、c、d為含有aroAM12+BtS1m雙價(jià)轉(zhuǎn)基因植株，CK為空白對(duì)照。
權(quán)利要求
1.一種用標(biāo)記基因篩選轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征是用草甘膦抗性基因取代抗生素抗性基因，作為篩選轉(zhuǎn)基因植物品系的標(biāo)記基因。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征是首先在植物表達(dá)載體中插入草甘膦抗性基因以及所要篩選的植物性狀基因，構(gòu)成植物雙價(jià)表達(dá)載體；用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，獲得含有該表達(dá)載體的工程菌；再用此工程菌感染植物外植體；感染后的外植體在分化培養(yǎng)基中分化一周至草甘膦抗性基因充分表達(dá)后再加入選擇劑草甘膦進(jìn)行篩選。
3.用于權(quán)利要求1或2所述方法的植物雙價(jià)表達(dá)載體，其特征是該載體含有草甘膦抗性基因和所要篩選的植物性狀基因。
4.按照權(quán)利要求3所述的植物雙價(jià)表達(dá)載體，其特征是，該載體是在基本載體pCAMBIA1300的多克隆位點(diǎn)MCS處插入草甘膦抗性基因和所要篩選的植物性狀基因而構(gòu)成的。
5.按照權(quán)利要求3或4所述的植物雙價(jià)表達(dá)載體，其特征是其所含的草甘膦抗性基因是通過基因優(yōu)化技術(shù)獲得的。
6.按照權(quán)利要求5所述的植物雙價(jià)表達(dá)載體，其特征是其所含的草甘膦抗性基因是aroAM12。
7.按照權(quán)利要求6所述的植物雙價(jià)表達(dá)載體，其特征是其所含的要篩選的植物性狀基因是抗蟲基因BtS1m。
8.按照權(quán)利要求7所述的植物雙價(jià)表達(dá)載體，其特征是該載體是pCM12-s1m，其中，抗草甘膦基因aroAM12所在表達(dá)框的構(gòu)成是從5′到3′端方向(I)轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的啟動(dòng)子CaMV35s，(II)轉(zhuǎn)導(dǎo)肽序列TSP，(III)抗草甘膦基因aroAM12編碼序列和(IV)3′端的非翻譯區(qū)PolyA片段；抗蟲基因BtS1m所在表達(dá)框的構(gòu)成是從5′到3′端方向(I)轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，包含有2個(gè)增強(qiáng)子的35s啟動(dòng)子，即2E-35sp，(II)TMVRNA的Ω片段翻譯增強(qiáng)子，(III)帶分泌信號(hào)肽的嵌合Bt殺蟲蛋白編碼序列BtS1m，(IV)Nos，3′端的轉(zhuǎn)錄終止序列。
全文摘要
本發(fā)明提供一種新型的篩選植物轉(zhuǎn)化體的方法及其所用的植物雙價(jià)表達(dá)載體。該方法用草甘膦抗性基因取代以往所用的抗生素抗性基因，作為篩選轉(zhuǎn)基因植物品系的標(biāo)記基因。方法中所用的植物雙價(jià)表達(dá)載體含有草甘膦抗性基因和所要篩選的植物性狀基因。本發(fā)明不僅能夠高效篩選植物轉(zhuǎn)化體，而且用作篩選標(biāo)記基因的草甘膦抗性基因具有雙重功效，一方面作為抗除草劑基因，另一方面作為一種植物篩選標(biāo)記基因，并與其它的重要目的性狀基因連鎖起來轉(zhuǎn)化植物，將大大方便轉(zhuǎn)化植物的篩選以及純系育種品種的篩選。用本發(fā)明方法篩選的轉(zhuǎn)基因植物，不僅具有良好的目的轉(zhuǎn)化基因的性狀，而且具有良好的抗草甘瞵性狀。
文檔編號(hào)A01H1/00GK1412323SQ0215203
公開日2003年4月23日 申請(qǐng)日期2002年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月25日
發(fā)明者謝龍旭, 徐培林 申請(qǐng)人:中山大學(xué)