專利名稱：一種腎臟病及糖尿病人專用稻米品種的選育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為一種腎臟病及糖尿病人專用稻米品種的選育方法，屬于低水溶性蛋白水稻新品種的育種方法，專用于適合腎臟病及糖尿病人食用稻米品種的選育。
二、技術(shù)背景近年來由于我國城鄉(xiāng)居民生活習(xí)慣和生態(tài)環(huán)境等的改變，我國腎臟病和糖尿病患者的人數(shù)在不斷增加，據(jù)統(tǒng)計(jì)，近年來全國糖尿病患者總?cè)藬?shù)超過1億人，其中有近600萬人因糖尿病并發(fā)腎臟病而接受住院治療。腎臟病及糖尿病(并發(fā)腎臟病)患者的蛋白質(zhì)代謝機(jī)能障礙，在治療期間不能食用可吸收蛋白含量超過4％的大米，因此采用低蛋白的飲食配合治療是一種有效的措施，而目前我國尚無專用的低蛋白質(zhì)大米品種，而以代用品進(jìn)行飲食配合治療，這無疑增加了患者的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)，降低了醫(yī)療效果。
眾所周知，通常稻米中的主要蛋白質(zhì)可以分為清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白四大類，其中谷蛋白占整個(gè)蛋白質(zhì)含量的60％，是稻米中可為人體吸收蛋白的主要成分；醇溶蛋白則不能被人體所吸收。因此，對于腎臟病和糖尿病患者來講，所需要的是低水溶性蛋白(低可吸收蛋白)含量的大米。目前我國各稻區(qū)尚無低水溶性蛋白水稻品種在生產(chǎn)上大面積推廣種植。
有益效果 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所提供的一種腎臟病及糖尿病人專用稻米品種的選育方法，具有如下優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明提供的方法選育了產(chǎn)量略高于越光，品質(zhì)優(yōu)良，特別是水溶性蛋白含量低于4％的低水溶性蛋白水稻新品種W3660。與傳統(tǒng)育種方法相比，利用本方法培育低水溶性蛋白水稻品種的年限縮短，從而提高了育種效率。
2、選育的新品種W3360與日本低水溶性蛋白品種LGC-1相比，農(nóng)藝性狀有較大的改善。(見表1)表1. W3360與LGC-1農(nóng)藝性狀比較(2000-2001年平均)

3、育成品種W3660的主要優(yōu)點(diǎn)生育期短、早熟W3660屬中熟中粳，在南京地區(qū)于5月15日左右播種，6月15日左右移栽，8月19日左右齊穗，9月下旬成熟。
綜合性狀好株高90.2cm，主莖總?cè)~片16張，地上伸長5節(jié)。株型稍松散，葉略長，葉色稍淡，轉(zhuǎn)色快，熟相好，穗頸節(jié)稍長，每畝成穗約21萬左右，每穗總粒數(shù)63，實(shí)粒數(shù)59，千粒重28g，畝產(chǎn)400kg左右?？闪舴N繁殖?？沟疚敛。辜y枯病，較抗倒伏。
水溶性蛋白含量低該品系稻米的水溶性蛋白低于4％，適合腎臟病病人食用(表3)。
2、進(jìn)行與低水溶性蛋白緊密連鎖的分子標(biāo)記的篩選，獲得與低水溶性蛋白共分離的簡單重復(fù)序列(SSR)標(biāo)記RM424，SSR標(biāo)記RM424的低水溶性蛋白特征譜帶詳見


圖1。
3、以LGC-1為母本、日本主栽優(yōu)良品種越光為父本進(jìn)行雜交，從雜種F2代開始，根據(jù)各植株主穗12粒稻米中貯藏蛋白的含量、組分，對雜交后代群體進(jìn)行系統(tǒng)選育，結(jié)合緊密連鎖的分子標(biāo)記RM424的輔助選擇，獲得水溶性蛋白含量介于3.1％～4％的適合腎臟病、糖尿病患者食用的水稻新品種W3660，其選育過程詳見圖5。其中蛋白含量及組分的測定方法①單粒糙米總蛋白的提取每粒米(糙米)加0.5ml溶劑A，研磨勻漿，在冰浴上，超聲波處理數(shù)分鐘，離心，15000rpm(或7000g)，5min，上清10ul用于SDS-PAGE，膠濃度為15％。然后用光密度儀檢測各色帶的密度(Beckman DU-8 Spectrimetre)。算出稻米中總蛋白質(zhì)含量。
②各蛋白組分的分離100mg精米粉，加1.0ml試劑B離心管，超聲波處理數(shù)分鐘(冰浴)，微型勻漿機(jī)勻漿1min，離心(10000g，15min，4℃)重復(fù)三次，每次隔6h，上清置一試管中(清-球蛋白組分)，沉淀加1.0ml試劑C，超聲波處理數(shù)分鐘(冰浴)，離心(10000g，15min，4℃)重復(fù)三次，每次隔6h，上清置一試管中(醇溶蛋白組分)，沉淀加1.0ml試劑D，超聲波處理數(shù)分鐘(冰浴)，離心(10000g，15min，4℃)重復(fù)三次，每次隔6h，上清置一試管中(谷蛋白組分)，棄沉淀。
③用SDS-PAGE法測定各蛋白組分含量(以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn))300ul清-球蛋白組，300ul谷蛋白組，各加1.0ml 10％TCA(三氯乙酸)；300ul醇溶蛋白組，80℃干燥至100ul，加1.0ml 10％TCA，上述成分分別離心，10000g，15min，去上清，沉淀加100ul SDS-尿素，進(jìn)行SDS-PAGE，然后用光密度儀檢測535nm下各色帶的密度(Beckman DU-8Spectrimetre)。算出稻米中清-球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白分別占總蛋白中的百分比。
④用Bradford法測定各蛋白組分含量(以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn))清-球蛋白組分，谷蛋白組分；醇溶蛋白組分(80℃干燥)，上述成分分別加蒸餾水定容至4.0ml，各加33ul 2％脫氧膽酸，作用15min，各加1.3ml 24％TCA，4℃過夜，離心3000rpm，15min，2℃，棄上清，沉淀，1.0ml 1NaOH(溶解各蛋白)，用Bradford法測蛋白含量(以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn))。
⑤各試劑的配方試劑A50mM KH2PO4-NaOH pH 6.8(或50mM Tris-HCl pH 6.8)+gM尿素+4％SDS+20％甘油+5％β-巰基乙醇試劑B50mM KH2PO4-NaOH pH 6.8(或50mM Tris-HCl pH 6.8)+0.SM NaCl試劑C60％正丙醇+1mM EDTA-2Na試劑D1％乳酸+1mM EDTA-2Na低水溶性蛋白指紋圖譜的建立，可作為3660的鑒定標(biāo)準(zhǔn)
水稻基因組DNA的分離采用CTAB法。水稻孕穗期收取6～8克新鮮葉片(-80℃保存的葉片)，在-20℃預(yù)冷研缽中用液氮研磨成粉末；轉(zhuǎn)移到-20℃預(yù)冷的三角瓶中，放入-20℃冰箱保存待用(過夜)；加入20ml 96℃ 1.5％CTAB緩沖液，迅速攪勻后，置于56℃水浴中，50rpm，水浴30min；轉(zhuǎn)入50ml離心管中，加入等體積氯仿-異戊醇(24∶1)，室溫下120rpm，40min充分混勻；室溫下300rpm離心20min，取上清液；加入1/10體積56℃預(yù)熱的10％CTAB緩沖液，混勻；加入等體積的氯仿-異戊醇(24∶1)，慢慢混勻；室溫下3000rpm離心20min，取上清液；加等體積的CTAB沉淀緩沖液，輕輕顛倒數(shù)次直至DNA沉淀形成；室溫下3000rpm離心20min，棄上清液，離心管倒置在吸水紙上干燥數(shù)分鐘；加5ml 1M NaCl和5ul 10mg/ml RNaseA，56℃溶解DNA；加2倍體積的預(yù)冷(-20℃)無水乙醇，沉淀10min；棄上清，沉淀用等體積70％乙醇洗滌10min；棄70％乙醇，加等體積預(yù)冷(-20℃)無水乙醇脫水10min；DNA沉淀風(fēng)干后，溶解于TE中備用。
微衛(wèi)星的PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系10ul(1ul 10ng/ul DNA，0.7ul2pmol/ul引物，1ul 10×Buffer(free MgCl2)，0.2ul 2.5mM dNTP，0.6ul25mMMgCl2，0.1ul 5u/ul Taq，6.4ul ddH2O)，反應(yīng)程序?yàn)?5℃變性5min，95℃變性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，共進(jìn)行35次循環(huán)，72℃延伸7min。PCR反應(yīng)在PE-9600熱循環(huán)儀中進(jìn)行。
擴(kuò)增產(chǎn)物的PAGE和銀染檢測擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠濃度為8％，凝膠大小180×120×2mm，電泳緩沖液為0.5×TBE，以50bp的DNA Ladder為對照比較擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量大小，200V恒壓電泳。電泳結(jié)束后，凝膠用蒸餾水稍微沖洗。銀染方法如下含10％酒精，0.5％冰乙酸固定液固定2次，6分鐘/次，然后0.2％AgNO3溶液滲透10～12分鐘，ddH2O清洗2次，0.002％硫代硫酸鈉溶液置代30s，用含NaOH1.5％、甲醛0.4％的溶液染色，最后用0.75％Na2CO3溶液終止顯色反應(yīng)。
低水溶性蛋白水稻的SSR指紋圖譜W3660及其親本的SSR指紋圖譜見
圖1，SSR標(biāo)記RM242可將水溶性蛋白純合基因型和雜合基因型區(qū)分開，因而可用于低水溶性蛋白純合基因型水稻品種的選育。這是低水溶性蛋白水稻特有的分子檢測特征，可作為W3660的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。W3660的主要特點(diǎn)株高90.2cm，主莖總?cè)~片16張，地上伸長5節(jié)。株型稍松散，葉略長，葉色稍淡，轉(zhuǎn)色快，熟相好，穗頸節(jié)稍長，每畝成穗約21萬左右，每穗總粒數(shù)63，實(shí)粒數(shù)59，干粒重28g，畝產(chǎn)400kg左右?？闪舴N繁殖?？沟疚敛?，抗紋枯病，較抗倒伏。選育的新品種W3360與日本主栽水稻品種越光相比，農(nóng)藝性狀有一定的改善(見表2)。
表2.W3360與越光農(nóng)藝性狀比較(1998-2001年多年多點(diǎn)試驗(yàn)匯總資料)

生育期短、早熟W3660屬中熟中粳，在南京地區(qū)于5月15日左右播種，6月15日左右移栽，8月19日左右齊穗，9月下旬成熟。
水溶性蛋白含量低該品系稻米的水溶性蛋白低于4％，適合腎臟病病人食用(表3)。
表3低水溶性蛋白大米W3660的蛋白質(zhì)測定結(jié)果(2000～2001年)

注總蛋白含量指單粒稻米中蛋白質(zhì)總量占整粒稻米總量的百分比。
以蛋白質(zhì)含量為100％，其中清-球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白分別占總蛋白中的百分比。
權(quán)利要求
1.一種腎臟病及糖尿病人專用稻米品種的選育方法，包括1)以從日本生物資源研究所放射育種場引進(jìn)的低水溶性蛋白的突變品種LGC-1為母本，以驚人糯為父本，雜交，雜種后代自交，從F1開始，后代種子總蛋白進(jìn)行十二烷基磺酸鈉變性-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析顯示，谷蛋白含量為3.1～4％(M/M，下文同)的低谷蛋白性狀和醇溶蛋白含量60-65％的高醇溶蛋白性狀總是相伴出現(xiàn)；F1種子全部呈現(xiàn)低谷蛋白含量和高醇溶蛋白含量特性；F2種子中呈現(xiàn)低谷蛋白和正常蛋白性狀的比例約為3∶1；測定F3種子蛋白，其低谷蛋白純合型，雜合型和正常型的分離比例符合F2植株基因型1∶2∶1，表明低谷蛋白和高醇溶蛋白性狀是由單顯性基因控制，而且能穩(wěn)定地遺傳給后代；2)進(jìn)行與低水溶性蛋白緊密連鎖的分子標(biāo)記的篩選，獲得與低水溶性蛋白共分離的簡單重復(fù)序列(SSR)標(biāo)記RM424，SSR標(biāo)記RM424具有低水溶性蛋白特征譜帶；3)以LGC-1為母本、日本主栽優(yōu)良品種越光為父本進(jìn)行雜交，從雜種F2代開始，根據(jù)各植株主穗稻米中貯藏蛋白的含量、組分，對雜交后代群體進(jìn)行系統(tǒng)選育，結(jié)合緊密連鎖的分子標(biāo)記RM424的輔助選擇，獲得水溶性蛋白含量為3.1％～4％的水稻新品種W3660。
2.據(jù)權(quán)利要求1所述的一種腎臟病及糖尿病人專用稻米品種的選育方法，其特征在于，以上述方法育成的W3660水溶性蛋白含量低于4％，簡單重復(fù)序列(SSR)指紋圖譜具有RM424標(biāo)記的低水溶性蛋白特征譜帶特征譜帶。
全文摘要
本發(fā)明為一種腎臟病及糖尿病人專用稻米品種的選育方法，屬于水稻新品種的選育。對稻米的貯藏蛋白含量、蛋白質(zhì)成分、SDS－PAGE、SSR標(biāo)記等分析，利用分子標(biāo)記輔助選擇結(jié)合SDS－PAGE、蛋白質(zhì)含量測定等方法選育出水溶性蛋白含量低于4％的水稻新品種W3660，產(chǎn)量與越光持平。
圖1為W3660及其親本的簡單重復(fù)序列(SSR)指紋圖譜。
文檔編號A01H1/02GK1421123SQ02157240
公開日2003年6月4日 申請日期2002年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月25日
發(fā)明者萬建民, 江鈴, 王春明, 朱速松, 江紹玫, 蘇昌潮, 王益華, 翟虎渠, 劉世家, 陳亮明, 劉喜, 楊世湖 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)