專利名稱：蘇云金芽孢桿菌以色列亞種和球形芽孢桿菌的混合物用于控制對殺幼蚊劑的抗性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于控制雙翅目昆蟲幼蟲的方法或者一種用于抑制雙翅目昆蟲中的殺幼蟲劑抗性的方法，其通過引入一種殺幼蟲有效量的蘇云金芽孢桿菌以色列亞種菌株和球形芽孢桿菌菌株的混合物到包含雙翅目昆蟲幼蟲的環(huán)境里；以及該混合物的組合物。優(yōu)選地，兩種菌株都是未遺傳修飾的。
背景技術(shù)：
蚊子和墨蚊是雙翅目昆蟲的代表，是危害人類和動物生存的害蟲。蚊子是許多人類和動物疾病的主要攜帶者，包括瘧疾、黃熱病、病毒性腦炎、登革熱和絲蟲病。
已經(jīng)開發(fā)了以控制雙翅目昆蟲為目標(biāo)的各種化學(xué)殺蟲劑。例如，用水溶性乙醇以水混合形式用于滅蚊的水源處理披露于美國專利6,077,521。然而，更為最近的重點已經(jīng)放在了生物殺蟲劑的使用上。例如，至少一種生物殺蟲劑成分的釋放控制配方披露于美國專利4,865,842；用形成芽孢的桿菌ONR-60A控制幼蚊披露于美國專利4,166,112；具有抗雙翅目昆蟲害蟲活性的新的蘇云金芽孢桿菌分離物披露于美國專利5,275,815和5,847,079；具有抗雙翅目昆蟲害蟲活性的蘇云金芽孢桿菌菌株的生物純化培養(yǎng)物披露于美國專利5,912,162，以及具有抗雙翅目昆蟲活性的重組衍生的生物殺蟲劑披露于美國專利5,518,897，包括用含有蘇云金芽孢桿菌以色列亞種的殺雙翅目昆蟲蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的藻藍菌，該蛋白可翻譯地融合到強的、高活性天然藻藍菌調(diào)控基因序列中。
然而這些生物殺蟲劑具有缺陷；因此要繼續(xù)尋找新的生物殺蟲劑。某些生物殺蟲劑的一個缺陷是可能發(fā)展形成殺蟲劑抗性。
抗性定義為連續(xù)暴露于殺蟲劑一段時間后，在同一種屬的種群之間產(chǎn)生的敏感性差別。這些差別通過觀測殺死50％或者95％種群的致死劑量(LD)(分別為LD50或LD95)的統(tǒng)計變化。易感性的個體差別存在于每個種群中，實際上不太敏感的害蟲可能通常以低的發(fā)生率存在于至少一些野生型種群中。存在殺蟲劑時，這些實際上不太敏感的害蟲存活并繁殖。由于它們的存活能力是它們遺傳組成的結(jié)果，因此它們的抗性遺傳組成隨后被傳遞給它們的后代，導(dǎo)致了由殺蟲劑誘導(dǎo)選擇的種群敏感性的變化。殺幼蟲劑抗性已經(jīng)在一些雙翅目昆蟲種屬中發(fā)現(xiàn)。
特別地，五帶淡色庫蚊對球形芽孢桿菌(B.s.)的抗性發(fā)展由Rodcharoen等人發(fā)現(xiàn)了Journal of Economic Entomology，Vol.87，No.5，1994，pp.11331140。為克制該抗性，一種通過將B.s.與分離自蘇云金芽孢桿菌以色列亞種的純化CytlA晶狀物混合，或者通過將重組B.t.i.與B.s.混合的方法由wirth等人披露了Journal of Medical Entomologv，Vol.37，No.3，2000，pp.401-407。然而，除了天然衍生的或產(chǎn)生的之外，克制庫蚊對B.s.抗性的改進的生物殺蟲劑和組合物應(yīng)用將是值得期待的。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種組合物，包含蘇云金芽孢桿菌以色列亞種菌株和球形芽孢桿菌菌株的混合物。蘇云金芽孢桿菌以色列亞種菌株可以是未遺傳修飾的，或者球形芽孢桿菌菌株可以是未遺傳修飾的，盡管必然地優(yōu)選的組合物包括未遺傳修飾的蘇云金芽孢桿菌以色列亞種菌株和未遺傳修飾的球形芽孢桿菌菌株。
混合物可以具有約1∶10到約10∶1的蘇云金芽孢桿菌以色列亞種對球形芽孢桿菌的重量比；優(yōu)選約1∶3到約3∶1的蘇云金芽孢桿菌以色列亞種對球形芽孢桿菌的重量比；更優(yōu)選約1∶2到約2∶1的蘇云金芽孢桿菌以色列亞種對球形芽孢桿菌的重量比；以及最優(yōu)選1∶1的蘇云金芽孢桿菌以色列亞種對球形芽孢桿菌的重量比。
額外的成分，例如表面活性劑、惰性載體、防腐劑、保濕劑、食物興奮劑、引誘劑、封裝劑、粘合劑、乳化劑、染料、紫外線防護劑、緩沖液、漂移控制劑、噴霧沉積助劑、自由流動劑或者它們的組合也可用來與殺幼蟲組合物混合。
本發(fā)明也涉及一種控制雙翅目昆蟲幼蟲的方法，包括步驟將殺幼蟲有效量的蘇云金芽孢桿菌以色列亞種菌株和球形芽孢桿菌菌株的混合物引入到含有雙翅目昆蟲幼蟲的環(huán)境中。在該方法中，雙翅目昆蟲可以是蚊子例如尖音庫蚊、五帶淡色庫蚊、埃及伊蚊、環(huán)喙庫蚊、脈毛蚊、按蚊或者它們的組合。
本發(fā)明還涉及一種抑制雙翅目昆蟲中殺幼蟲劑抗性的方法，包括步驟將殺幼蟲有效量的蘇云金芽孢桿菌以色列亞種菌株和球形芽孢桿菌菌株的混合物引入到含有雙翅目昆蟲幼蟲的環(huán)境中。優(yōu)選地，雙翅目昆蟲是庫蚊以及殺幼蟲劑抗性是抗球形芽孢桿菌而發(fā)展形成的。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種用于控制雙翅目昆蟲幼蟲的方法或者一種用于抑制雙翅目昆蟲中的殺幼蟲劑抗性的方法，其通過引入一種殺幼蟲有效量的蘇云金芽孢桿菌以色列亞種菌株和球形芽孢桿菌菌株的混合物到包含雙翅目昆蟲幼蟲的環(huán)境里；以及該混合物的組合物。優(yōu)選地，兩種菌株都是未遺傳修飾的。下面詳細論述該組合物以及利用組合物的方法。
殺幼蟲劑組合物生物殺蟲劑是一類天然產(chǎn)生的殺蟲劑，通常衍生自已經(jīng)發(fā)展出對抗其它生物體的天然防御的單細胞或者多細胞生物。對昆蟲致病的微生物組是各種各樣的和變化多端的。革蘭氏陽性土壤菌蘇云金芽孢桿菌以色列亞種是許多能夠產(chǎn)生殺昆蟲蛋白的蘇云金芽孢桿菌菌株的一種。在細菌芽孢形成過程的循環(huán)中表達的這些蛋白聚集成芽孢樣晶狀包涵體。當(dāng)被包括蚊子和墨蚊的雙翅目幼蟲吞食時，由蘇云金芽孢桿菌以色列亞種產(chǎn)生的芽孢樣晶狀物是有毒的。一旦吞食，晶狀蛋白就溶于幼蟲的中腸并破壞幼蟲中腸區(qū)的上皮細胞。上皮細胞的膨脹和/或溶解伴隨著其后幼蟲的餓死。
蘇云金芽孢桿菌以色列亞種(B.t.i.)已經(jīng)被成功地用于蚊子和墨蚊控制項目多年了。蘇云金芽孢桿菌以色列亞種可干凈地用來溫和地清潔有機飼養(yǎng)場所，并且對伊蚊最有效。蘇云金芽孢桿菌以色列亞種的商業(yè)配方因商標(biāo)VECTOBAC而知名，可從Valent BioSciences Corp.獲得。從同一供應(yīng)商獲得的特殊商業(yè)配方是VECTOBAC G，VECTOBAC CG，VECTOBAC12AS和VECTOBAC WDG。蘇云金芽孢桿菌以色列亞種可有效抵抗廣范圍的蚊子種屬，產(chǎn)生低哺乳動物毒性并且容易應(yīng)用。蘇云金芽孢桿菌以色列亞種也極不容易產(chǎn)生抗性，因為它的殺幼蟲活性是基于多重毒性的。在受處理種群中的個體蚊子不對所有毒素敏感的機會將是極小的。
球形芽孢桿菌(B.s.)是在土壤和其它底物中普遍發(fā)現(xiàn)的一種桿狀的、好氧的、形成芽孢的細菌。到目前為止，至少16種菌株已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)出不同程度的滅蚊特性。幾種菌株例如1593M，2362和2297顯示了對幼蚊的高毒性。球形芽孢桿菌菌株2362，(VECTOLEX，來自ValentBioSciences Corp)已經(jīng)在許多國家成功利用。來自同一來源的球形芽孢桿菌特殊的商業(yè)配方是VECTOLEX WDG，SPHERIMOS AS和VECTOLEX CG。而且，發(fā)現(xiàn)該菌株在控制不同棲息地繁殖的蚊子尤其是污水繁殖的蚊子方面表現(xiàn)很好。
球形芽孢桿菌對庫蚊最有效。球形芽孢桿菌的活性歸因于雙毒素，重復(fù)使用可能導(dǎo)致抗性的發(fā)展形成。
然而，幼蚊對球形芽孢桿菌的不同水平的抗性已經(jīng)在尖音庫蚊和五帶淡色庫蚊中觀察到。
我們現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)B.t.i.和B.s.的混合物是有效的殺幼蟲劑配方。利用的是未遺傳修飾的成分，如果殺幼蟲劑要在與食物源例如農(nóng)作物、牛或豬的生產(chǎn)或收獲相關(guān)的環(huán)境中利用的話，這一點是期望的。未遺傳修飾的B.t.i.或B.s.可定義為天然產(chǎn)生的菌株，而不是來自重組DNA技術(shù)的菌株。
B.t.i.和B.s.可以通過混合每種單獨菌株的粉末形式或者混合每種菌株的發(fā)酵肉湯漿，按照如后面實施例1-6列舉的期望的比例而混合。B.t.i.對B.s.的比例可以從約10∶1到約1∶10；優(yōu)選從約3∶1到約1∶3；更優(yōu)選從約2∶1到約1∶2以及最優(yōu)選約1∶1。
上述組合物也可包括額外的成分，例如表面活性劑、惰性載體、防腐劑、保濕劑、食物興奮劑、引誘劑、漂移控制劑、噴霧沉積助劑、封裝劑、粘合劑、乳化劑、染料、紫外線防護劑、緩沖液、自由流動劑，或者穩(wěn)定活性成分、有助于產(chǎn)品處理和應(yīng)用于特定目標(biāo)害蟲雙翅目昆蟲的任何其它成分。
合適的表面活性劑包括陰離子化合物例如羧酸鹽，例如，長鏈脂肪酸的金屬羧酸鹽；N-酰基肌氨酸鹽；磷酸與脂肪醇乙氧基化合物的單或雙酯或者這些酯的鹽；脂肪醇的硫酸鹽例如十二烷基硫酸鈉、十八烷基硫酸鈉或乙酰硫酸鈉；乙氧基脂肪醇的硫酸鹽；乙氧基烷基苯酚的硫酸鹽；木質(zhì)素磺酸鹽；石油磺酸鹽；烷芳基磺酸鹽例如烷基苯磺酸鹽或者低級烷基萘磺酸鹽，例如丁基-萘磺酸鹽；萘甲醛縮合物的磺酸鹽；苯酚-甲醛縮合物的磺酸鹽；或者更復(fù)雜的磺酸鹽例如酰氨基磺酸鹽，如油酸和N-甲基?；撬峄蚨榛虼晁岬幕撬峥s合產(chǎn)物，如磺酸鈉或琥珀酸二辛酯。
非離子表面活性劑包括脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪酸酰胺或者脂肪烷基或鏈烯基取代的苯酚與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物，多羥基醇醚的脂肪酸酯例如脫水山梨醇脂肪酸酯，該酯與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物例如聚氧乙烯脫水山梨醇脂肪酸酯，環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷的嵌段共聚物，乙炔二醇例如2，4，7，9-四乙基-5-癸炔-4，7-二醇或者乙氧基乙炔二醇。
陽離子表面活性劑的例子包括，例如，脂肪族單-、二-或者聚酰胺的醋酸鹽、萘酸鹽或油酸鹽；含氧胺例如聚氧乙烯烷基胺的氧化胺；由羧酸與單-或多胺縮合制備的酰胺連接的胺；或者季銨鹽。
惰性材料的例子包括無機礦物如高嶺石、云母、石膏、肥料、沙、頁硅酸鹽、碳酸鹽、硫酸鹽或者磷酸鹽；有機材料如糖、淀粉或者環(huán)糊精；或者植物材料如木材制品、軟木、玉米棒子粉、稻殼、花生殼以及胡桃殼。
配方中也可含有添加的控制液滴大小和有助于空中施用的漂移控制劑或者噴霧沉積助劑。適用于這些目的的化合物的例子包括聚乙烯醇聚合物溶液、聚酰胺共聚物溶液、聚丙烯酸衍生物及其混合物、植物油及其混合物、石油及其混合物、以及天然和合成的聚合物。
在配方中，超過一種的上述額外的成分可以便利地使用。
本發(fā)明的組合物可以作為液體、水懸液、乳狀懸液或者固體用各自常規(guī)的應(yīng)用技術(shù)加以應(yīng)用。固體配方是必然優(yōu)選的。通常，本發(fā)明的殺幼蟲有效量混合物的應(yīng)用率是提供足以控制目標(biāo)害蟲種群的殺蟲劑的量。
固體組合物的加工可以通過分別噴霧干燥B.t.i.和B.S.菌漿并混合粉末或者通過混合菌漿并噴霧干燥混合的菌漿形成粉劑。
本發(fā)明的組合物可以以合適的形式用于直接應(yīng)用，或者作為濃縮的或原組合物，需要在應(yīng)用前用適量的水或其它稀釋劑進行稀釋。殺蟲劑濃度將隨特定配方的性質(zhì)而變化，特別是，它是濃縮的還是直接使用的。組合物可以包含約1到98％重量的固體或液體惰性載體，以及0.1到50％重量的表面活性劑。這些組合物將以每公頃約50mg(液態(tài)的或干燥的)到20kg或更多量的標(biāo)準(zhǔn)施用。
方法本發(fā)明的混合物可以在配制前進行處理，以便在施用到目標(biāo)害蟲的環(huán)境時延長殺蟲活性，只要預(yù)處理對混合物是無害的。這樣的處理可以用化學(xué)和/或物理方法，只要處理不會有害地影響組合物的性質(zhì)?；瘜W(xué)試劑的例子包括但不限于鹵化劑；醛，如甲醛和戊二醛；抗感染劑，如氯化芐基·二甲基·烷基銨；醇，如異丙醇和乙醇；以及組織固定劑，如布安氏固定劑(Bouin′s fixative)和海利氏固定劑(Helly′s fixative)。
本發(fā)明的組合物可以直接應(yīng)用到欲處理的環(huán)境。池塘、湖泊、溪流、河流、靜水以及其它易遭受雙翅目蟲害的地區(qū)是需要這種處理的環(huán)境的例子。除此之外，組合物可以通過噴霧、撒粉、噴灑以及廣播進行施用。
本發(fā)明的組合物可以有效對抗雙翅目昆蟲害蟲，例如伊蚊屬，海濱伊蚊，墨西哥按實蠅，中美按實蠅，按蚊屬，騷擾阿蚊，反吐麗蠅，紅頭麗蠅，地中海臘實蠅，伸展搖蚊，大頭金蠅，次生旋麗蠅，庫蚊屬，脈毛蚊屬，Coquillettidia屬，蟹洞蚊，橄欖實蠅，蔥地種蠅，灰地種蠅，毛尾地種蠅，黑尾果蠅，直突搖蚊，刺舌蠅，須舌蠅，絲舌蠅，Haemagogusequines，刺擾血蠅，牛皮蠅，紋皮蠅，斑腹蠅，銅綠蠅，絲光綠蠅，Lutzomyialonglpaipis，Lutzomyia shannoni，尖眼覃蚊，曼蚊屬，麥蠅蚊，秋家蠅，家蠅，石蠅屬，Ochlerotatus屬，擬桿蠅，直腳蚊屬，絲光綠蠅，白蛉蚊屬，伏蠅，鱗蚊屬，蝗麻蠅，糞麻蠅，黃糞蠅，廄螯蠅，巨蚊，Tripteroides bambusa，蘭帶蚊屬以及長足蚊屬。然而，本發(fā)明的組合物也可有效對抗鱗翅目昆蟲害蟲，例如小臘螟，西部黑頭長翅卷蛾，東部黑頭長翅卷蛾，棉褐帶卷蛾，小地老虎，棉葉夜蛾，秋尺蠖，扁毛蛾，地中海粉斑螟，桃麥條蛾，爍黃條大蠶蛾，梨豆夜蛾，黃卷蛾屬，帶卷蛾屬，棒須委夜蛾，家蠶，棉潛蛾，葡萄干果斑螟，色卷蛾屬，細卷蛾屬，美洲苜蓿粉蝶，米螟，茶小卷蛾，蘋果小卷蛾，核桃舟蛾，天目松毛蟲，葡萄卷葉螟，甜瓜絹野螟，黃瓜絹野螟，西南玉米桿草螟，小蔗桿草螟，榆角尺蠖蛾，赤楊尺蠖，煙草粉斑螟，菩提尺蛾，茶斑蛾，棕卷蛾，Eupoecilia ambiguella，黃毒蛾，暗緣地老虎，大臘螟，梨小食心蟲，葡萄葉煙翅斑蛾，織葉蛾，谷實夜蛾，煙芽夜蛾，行列大蠶蛾，向日葵同斑螟，美國白蛾，茄莖麥蛾，東方鐵杉尺蠖，西方鐵杉尺蠖，雪毒蛾，花翅小卷蛾，甜菜網(wǎng)野螟，舞毒蛾，銀錠夜蛾，天幕毛蟲屬，甘藍夜蛾，蓓帶夜蛾，Manduca quinquemaculata，Manduca sexta，豆莢螟，白腎灰夜蛾，冬尺蠖蛾，古毒蛾屬，玉米螟，春尺蠖，波紋夜蛾，紅鈴麥蛾，加州槲蛾，橘潛蛾，綠脈菜粉蝶，小菜粉蝶，苜蓿綠夜蛾，石竹小卷蛾，荷蘭石竹小卷蛾，洋蔥羽蛾，印度谷螟，菜蛾，花粉蝶，黏蟲，大豆尺夜蛾，雜食尺蠖，紅山背舟蛾，麥蛾，蘋白小卷蛾，灰翅夜蛾屬，異舟蛾，幕谷蛾，粉夜蛾，溫室結(jié)網(wǎng)野螟，亞熱帶夜蛾，蘋果巢蛾；鞘翅目，例如馬鈴薯葉甲屬，菜豆象，綠豆象，墨西哥大豆瓢蟲，榆黃螢葉甲，甘薯象，胡蘿卜象，谷象屬，北方圓頭犀金龜，南方圓頭犀金龜，薔薇刺鰓角金龜，日本孤麗茇，切根鰓金龜，黑菌蟲，小眼谷盜，黃粉蟲，黑粉蟲，黑粉谷盜，雜擬谷盜，褐擬谷盜，螨，例如草地小爪螨，蘋果紅蜘蛛，棉葉螨；膜翅目，例如阿根廷螞蟻，紅外來火蟻；等翅目，例如美國散白蟻，黃枝散白蟻，家白蟻，細腰濕木白蟻，茶新白蟻，西美木白蟻；蚤目，例如禽角葉蚤，飛蚤，病蚤，細蚤，犬櫛首蚤，貓櫛首蚤，禽角頭蚤，人蚤，印鼠客蚤，短頭客蚤，穿皮潛蚤；以及Tylenchida，例如Melodidogyne incognita，Pratylenchus penetrans。
在一個特別的實施例中，本發(fā)明組合物的活性是對抗雙翅目的直裂亞目昆蟲害蟲。直裂亞目包括蚊科，蚋科，搖蚊科，毛蠓科，尖眼覃蚊科，蚤蠅科和覃蚊科。
本發(fā)明混合物抑制殺幼蟲劑抗性的能力在下文實施例中詳細描述。這些實施例是用來描述本發(fā)明優(yōu)選的實施例和效用而不是打算限制發(fā)明，除非在所附的相關(guān)權(quán)利要求中有不同的陳述。
實施例1本發(fā)明的組合殺幼蟲劑配方為兩種可商業(yè)獲得的菌株的混合物VECTOBAC CG，一種商品化的B.t.i.粒狀配方，標(biāo)記效力200ITU/mg，以及VECTOLEX CG，一種商品化的B.s.粒狀配方，標(biāo)記效力50B.s.ITU/mg。典型地，每種菌株的噴霧干燥工業(yè)濃縮物首先摻入到已知量的植物油粘合劑中。配方中植物油粘合劑的量將依賴于配方中B.t.i.或B.s.噴霧工業(yè)濃縮物的量。該典型的范圍可以依賴于B.t.i.或B.s.噴霧干燥工業(yè)濃縮物的量，以及配方中使用的粒狀載體的類型、大小和吸收性質(zhì)而在1％到15％wt/wt之間變化。在該實施例中，使用大小分類10/14目的玉米棒子粉。不過，其它大小范圍例如5/8目、10/20目、10/40目也是合適的。菌漿混合物噴到粒狀載體上，同時在合適的攪拌機中混合并進一步攪拌，直到獲得均一的產(chǎn)品。
實施例2制備用于增強的和廣譜活性的B.t.i.和B.s.粒狀配方。B.t.i.和B.s.(VECTOBAC CG和VECTOLEX CG)的預(yù)配制粒狀產(chǎn)品用于開發(fā)混合配方。所得的混合粒狀產(chǎn)品設(shè)計為包含B.t.i.100ITU/mg和B.s.25B.s.ITU/mg。使用的載體是10/14目的玉米棒子粉。
為制備配方，VECTOLEX CG和VECTOBAC CG各5kg裝料到攪拌機中并攪拌。然后回收產(chǎn)品混合物。
代表性的樣本用于生物分析。表1顯示了用于形成產(chǎn)品混合物的原材料的量。
表1
*商品化B.t.i.粒狀配方，標(biāo)記效力200ITU/mg*商品化B.s.粒狀配方，標(biāo)記效力50B.s.ITU/mg用B.t.i.和B.s.混合樣品測試對抗第四齡埃及伊蚊和第三齡五帶淡色庫蚊的生物分析的結(jié)果顯示于下面的表2。ITU代表國際毒性單位，其基于已知的特定B.t.i.效力的參考材料。
在優(yōu)選的配方中，一比一的B.t.i.對B.s.重量比具有B.t.i.效力100ITU/mg以及B.s.效力B.s.25ITU/mg，其等價于效力基礎(chǔ)上的4∶1的比例。
表2
實施例3
殺幼蟲劑混合物產(chǎn)品的配方也可通過在同一粘合劑液體中混合所需水平的兩種B.t.i.和B.s.工業(yè)粉劑，然后注入或者噴霧到粒狀載體上，例如玉米棒子粉或任何其它合適的載體上。
為制備配方，兩種噴霧干燥的工業(yè)濃縮物可在植物油粘合劑液體中成漿，在合適的攪拌機中噴霧到粒狀載體上并攪拌直到獲得均一產(chǎn)品。包含B.t.i.(100ITU/mg)和B.s.(25B.s.ITU/mg)的混合配方的理論組分提供在下面的表3中。
表3
實施例4混合配方的加工也可通過以期望的固體或效力水平預(yù)混合Bti和Bs的發(fā)酵料或菌漿濃縮物，噴霧干燥菌漿混合物以產(chǎn)生混合的工業(yè)噴霧干燥的粉劑濃縮物。在這樣的配方中，菌漿濃縮物可包含防腐劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑、分散劑和其它粘合劑。噴霧干燥的工業(yè)濃縮物或粉劑可隨后用于配方如實施例2和3的粒狀產(chǎn)品或者作為可濕性粉劑、可水分散的粒劑、以及水性或非水性濃縮物。這些混合粉劑濃縮物也可用于丸劑和/或塊劑配方。進行噴霧干燥實驗來混合Bti和Bs發(fā)酵菌漿濃縮物，其不同的比例基于每種菌漿濃縮物的％固體水平。Bti菌漿濃縮物首先用0.12％wt/wt的山梨酸鉀和0.06％wt/wt的對羥基苯甲酸甲酯進行防腐。防腐的Bti菌漿濃縮物中的％固體是11.3％wt/wt。類似地，Bs菌漿濃縮物用0.12％wt/wt的山梨酸鉀和0.06％wt/wt的對羥基苯甲酸甲酯進行防腐。防腐的Bs菌漿濃縮物中的固體百分比是10.1％wt/wt。制備的菌漿混合物和它們的以固體計的比例列于表4。
表4估計的Bti和Bs菌漿混合物
表4所示的組合物使用Niro噴霧進行混合和噴霧干燥。進口溫度范圍在180℃到190℃之間以及干燥過程中的出口溫度范圍在68℃到81℃之間。工業(yè)粉劑通過100目標(biāo)準(zhǔn)篩過濾，樣品對第四齡埃及伊蚊和第三齡五帶淡色庫蚊進行生物分析。平均效力數(shù)據(jù)表示在表5中。
表5，Bti+Bs噴霧干燥工業(yè)粉劑由它們以固體計的比例影響的效力數(shù)值。平均的Bti噴霧干燥工業(yè)粉劑的效力＝7474ITU/mg。平均的Bs噴霧干燥工業(yè)粉劑的效力＝3030Bs.ITU/mg(所有分析是初始的和5℃保存2月的樣品的平均值)
表5顯示的生物效力數(shù)據(jù)顯示了Bti和Bs兩者的真實效力對理論效力的有趣的但是協(xié)同的增加，其基于100％的Bti或Bs噴霧干燥工業(yè)粉劑的真實效力。對伊蚊和庫蚊兩者的活性增加的最佳混合似乎是當(dāng)Bti與Bs菌漿濃縮物以固體計的1份Bti與2份Bs混合的時候。為增強Bs效力，最佳的混合是兩份Bti固體與1份Bs固體混合。在該混合物中，Bs效力顯示了相對于理論效力47％的增加。通過在噴霧干燥前混合Bti和Bs菌漿濃縮物，Bti效力平均值顯示了相對于平均理論效力35％的增加而Bs效力顯示了相對于平均理論效力24％的增加?？雌饋碓趪婌F干燥和進一步將這些粉劑配成粒劑、可濕性粉劑、可水分散的粒劑或者丸劑配方之前混合菌漿濃縮物是明顯有好處的。對這些增強的效力值，最可能的解釋看起來是由于每種噴霧干燥顆粒都帶有Bti和Bs毒素以及芽孢的事實。換句話說，這些并不是實施例2或3顯示的物理性混合物。因此，這些新穎的配制方法可能不僅導(dǎo)致了廣譜的活性，也將發(fā)展形成抗性的可能性最小化。換句話說，抗性控制也可通過另一種新穎的配制方法而獲得。
實施例5混合殺幼蟲劑配方也可以液體形式制備，通過加入期望水平的VECTOBAC WDG(3000ITU/mg)和VECTOLEX WDG(650ITU/mg)到噴霧罐的水中并混合直到獲得均一的分散。這樣形成的懸液可通過各種應(yīng)用方法傳遞到目標(biāo)棲息地。液體配方用于噴霧操作是理想的。
實施例6液體配方可從每種單獨菌株的液體配方制備。VECTOBAC 12AS和SPHERIMOS AS(由Valent BioSciences Corp.出售的水懸液產(chǎn)品形式)也可在噴霧罐的水中混合并通過各種噴霧設(shè)備使用。將B.t.i.和B.s.配成與防腐劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑、分散劑、稀釋劑的水性配方仍然是另一種優(yōu)選的用于傳遞兩種毒素到蚊子棲息地的方法。
實施例7已知對B.s.有抗性的五帶淡色庫蚊實驗集落在應(yīng)答B(yǎng).t.i.和B.s.混合物選擇時的敏感性改變在實驗室中以下面的方式確定。選擇是指低于LC100水平的處理。
抗B.s.的五帶淡色庫蚊集落是從采集自西部美國奶牛場的廢水池的敏感性幼蟲開始的。采集幼蟲的場所受到每一代LC90的選擇，進行四十代。在第40代，集落分別顯示出對LC50和LC90水平的54.4倍和14.2倍的抗性。該集落用于后面的試驗。
抗性集落是那種顯示出對特定殺蟲劑敏感性明顯降低的集落，該殺蟲劑對野生型昆蟲具有預(yù)期的敏感性。通常，五倍或更多的敏感性降低表征了抗性。Rodcharoen等，Journal of Economic Entomoloav，Vol.87，No.5，1994，pp.1133-1140，更充分地探索了抗性原理。
敏感性集落是那種可被特定殺蟲劑有效殺死的。例如，在五帶淡色庫蚊中，如果一種特定的殺蟲劑，球形芽孢桿菌，具有小于0.1ppm的測定LC50值，則該集落的特征就是對那種殺蟲劑敏感的。
儲備懸液的制備通過在20ml蒸餾水中混合0.2g B.t.i.或B.s.以得到1％懸液；混合物的制備通過以期望的比例混合儲備懸液。懸液隨后按測試處理所需進行稀釋。
親代集落和第十代的生物測試通過放置20只晚期第三齡或早期第四齡的幼蟲到含有100ml蒸餾水的116ml蠟紙杯中。每杯加入一勺幼蟲食物(在20ml蒸餾水中的2g碾碎的兔肉小球)。杯子用一系列濃度范圍的殺幼蟲劑單獨以及混合物處理。在每次生物測試中使用0.0001-0.1ppm范圍的五到七個不同的濃度來得到死亡率。每次測試中每個濃度重復(fù)四到五次。處理的幼蚊保持在82-85°F。從用測試的殺幼蟲劑處理時開始，定期計算死亡幼蟲的數(shù)量，以確定LC50值。一旦所有的幼蟲死亡，50％死亡的濃度就能確定了。
在LC80的水平用B.s.(球形芽孢桿菌菌株2362，ABG-6184，VECTOLEX，來自Valent BioSciences Corp.)或者B.t.i.(蘇云金芽孢桿菌以色列亞種(VECTOBAC，來自Valent BioSciences Corp.)單獨處理的集落與用1∶2重量比的B.s.(VECTOLEX)對B.t.i.(VECTOBAC)在LC80水平處理五代，接著用1∶1重量比的B.s.(VECTOLEX)對B.t.i.(VECTOBAC)在LC80水平再處理五代的集落進行比較。
在最初五代的這些處理之后，由1∶2混合物進行選擇的集落比由單獨成分選擇的任一集落獲得了更低的平均B.s.LC50值，這標(biāo)志著增加的敏感性和因此降低的抗性，如表6所示。在隨后五代的過程中，在1∶1混合物的選擇下，平均B.s.LC50值繼續(xù)下降。
表6這個表顯示了來自25代的原始選擇研究的數(shù)據(jù)。在選擇中，一個關(guān)鍵的變化是在10代之后，由B.t.i.選擇的集落轉(zhuǎn)到B.s.選擇，以估測集落中敏感性的穩(wěn)定性。
表6B.s.抗性集落在應(yīng)答B(yǎng).t.i.，B.s.以及混合物的選擇中以ppm表示的B.s.敏感性的變化
*從10到25代轉(zhuǎn)回到B.s.選擇。
實施例8使用實施例7描述的生物分析程序來估測B.s.抗性的和敏感的五帶淡色庫蚊集落。
確定每次處理的平均LC50值。更低的平均LC50值表征著特定的處理可以在更低的濃度有效使用，這表明生物對處理更敏感了。
結(jié)果提供在下面的表7中。正如預(yù)料的，B.s.處理給出了最高的B.s.抗性集落平均LC50。然而，2∶1比例的混合物表現(xiàn)出比B.t.i.和B.s.單獨使用的結(jié)果更好的結(jié)果，在敏感的和抗性的集落中都是，這表明了組分混合時的更高敏感性和可能的協(xié)同性。
表7兩種實驗性五帶淡色庫蚊集落對B.t.i.，B.s.以及B.t.i.與B.s的2∶1混合物的以ppm表示的敏感性
實施例9B.t.i.與B.s.的2∶1混合物對確定為B.s.敏感的五帶淡色庫蚊集落的效力如下進行測試。
五帶淡色庫蚊混合性敏感集落來自于從西部美國地區(qū)采集的卵筏混合物。采集的卵筏各自轉(zhuǎn)移到230ml的蠟紙杯中，每個杯子有200ml自來水以及0.5g兔肉小球作為幼蟲食物。幼蟲被孵化出來。將蟲蛹用水移到杯子中并置于篩籠中形成成蟲。提供給成蟲10％蔗糖溶液，并在成蟲后第五天給雌蚊喂食有限的小雞。在該血液喂食后第5天，產(chǎn)卵的杯子放入籠子中以采集卵。為在實驗室中培養(yǎng)集落，將4-5個卵筏放在含有2升自來水和2g兔肉小球作為食物的搪瓷盤子中。
樣品制備條件、生物分析方法以及LC50的確定與實施例7所述相同。結(jié)果提供在下面的表8中。結(jié)果顯示，隨著時間的過去，B.s.敏感的測試集落到應(yīng)答B(yǎng).s.單獨處理的第五代時，變得不夠敏感了，因為LC50值增加了。相反，2∶1混合物沒有顯示出相同程度的同樣趨勢。該事實是數(shù)據(jù)表明的，其在顯示出比親代菌株增加的LC50的同時，也顯示出比用B.s.單獨處理時更少的增加。因此，2∶1B.t.i.與B.s.混合物的使用減慢了隨時間的抗性。
表8表8也顯示了來自通過20代的原始選擇研究的數(shù)據(jù)。在選擇中，一個關(guān)鍵的變化是在5代之后，混合物選擇的集落由2∶1B.t.i./B.s.混合物(VectoBac WDG/VectoLex WDG)轉(zhuǎn)到1∶1混合物選擇。
表8B.s.敏感集落在應(yīng)答B(yǎng).t.i.和B.s.混合物時敏感性的變化
實施例10進行下面的實驗來證實混合物用于控制不同種屬蚊子的效用。在該實施例中，混合物以及單獨的殺幼蟲劑的效力是在五帶淡色庫蚊和埃及伊蚊的混合種群上確定的。
二十個塑料培養(yǎng)盆放在美國中西部地區(qū)的室外。這些盆充滿了去離子水并添加2.4g碾碎的豚鼠食物為營養(yǎng)物。然后盆中滋生100只第三齡五帶淡色庫蚊和100只第三齡埃及伊蚊。滋生后一小時，就在處理之前，對盆子取樣，計算每個盆子的測試樣品中幼蟲的數(shù)目以獲得對照值。
測試的殺幼蟲劑包括VECTOLEX CG(50 B.s.ITU/mg，在玉米棒子粉上)，VECTOBAC CG(200 ITU/mg，在玉米棒子粉上)以及VECTOLEX CG和VECTOBAC CG的1∶1混合物，如實施例2所述。每個盆子用適量的三種測試殺幼蟲劑中的一種進行處理，相當(dāng)于單獨處理的標(biāo)準(zhǔn)5、10或20磅/英畝。
在處理后第五天和第十二天，100只第三齡五帶淡色庫蚊和100只第三齡埃及伊蚊被加入到每個盆子中。
在處理后第二天、第七天和第十四天從盆中對幼蟲取樣，以確定有多少還活著。得到的數(shù)目與處理前的幼蟲存活數(shù)進行比較。100％的減少就表示所有幼蟲都被殺死了。正數(shù)值的減少百分比就表示殺幼蟲劑確實殺死了幼蟲。結(jié)果提供在下面的表9中，表明B.t.i.與B.s.的1∶1混合物在測試的每個應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)下都能夠控制五帶淡色庫蚊和埃及伊蚊的幼蟲，即使是經(jīng)過了幾天的時期。
表9平均的減少百分比
實施例11進行另一個實驗來證實混合物用于殺滅不同種屬蚊子的效用。在該實施例中，混合物以及每種單獨的殺幼蟲劑的效力是在環(huán)喙庫蚊上確定的。
測試是在西部美國的一個廢水處理廠的廢水池中的蚊子上進行的。這個池子被極度污染，標(biāo)準(zhǔn)測試表明存在環(huán)喙庫蚊。高高的蘆葦覆蓋了80％的水面。池子邊緣劃分為大小在0.1到0.2英畝范圍的六塊地區(qū)，以用于測試。
就在處理前，每個測試地區(qū)取樣，計算每個地區(qū)的測試樣品中幼蟲的數(shù)目以獲得對照值。
測試殺幼蟲劑是實施例10所述的配方，然后每個地區(qū)用適量的三種測試殺幼蟲劑中的一種進行處理，相當(dāng)于單獨處理的標(biāo)準(zhǔn)5、或10磅/英畝。
在處理后第二天、第七天和第十四天從測試地區(qū)對幼蟲取樣，以確定有多少還活著。得到的數(shù)目與處理前的幼蟲存活數(shù)進行比較。100％的減少就表示所有幼蟲都被殺死了。正數(shù)值的減少百分比就表示殺幼蟲劑確實殺死了幼蟲。結(jié)果提供在下面的表10中，表明B.t.i.與B.s.的1∶1混合物能夠控制環(huán)喙庫蚊幼蟲。
表10平均的減少百分比
實施例12進行另一個實驗來證實混合物用于殺滅不同種屬蚊子的效用。在該實施例中，混合物以及每種單獨的殺幼蟲劑的效力是在路邊溝渠的野外尖音庫蚊和脈毛蚊上確定的。
西部美國的一個由公路分隔的路邊溝渠的兩個部分是研究的地點。溝渠生長著草和水生植物，并容納來自腐爛機體和降雨的滲流物。一個具有類似的水文地理和植被的排水洼地選擇為未處理的對照。每個地區(qū)在處理的時候都繁殖了尖音庫蚊以及脈毛蚊。
就在處理前，每個測試地區(qū)取樣，計算每個地區(qū)的測試樣品中幼蟲的數(shù)目以獲得對照值。
測試殺幼蟲劑是實施例10所述的配方，然后測試地點的兩個用適量的兩種測試殺幼蟲劑中的一種進行處理，相當(dāng)于單獨處理的標(biāo)準(zhǔn)20磅/英畝。余下的測試地點不處理以作為對照。
在處理后第四天和第七天從測試地區(qū)對幼蟲取樣。得到的數(shù)目與處理前的幼蟲存活數(shù)進行比較。100％的減少就表示所有幼蟲都被殺死了。正數(shù)值的減少百分比就表示殺幼蟲劑確實殺死了幼蟲。結(jié)果提供在下面的表11中，表明B.t.i.與B.s.的1∶1混合物能夠控制尖音庫蚊和脈毛蚊的幼蟲。
表11平均的減少百分比
實施例13B.s.(VECTOLEX)與B.t.i.(VECTOBAC)的2∶1混合物的效力以下面的方式在田間確定。
測試地區(qū)是西部美國的一塊稻田，測量為156英畝。在測試地區(qū)之間用堤作為緩沖區(qū)。在處理時，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)滴定測試，按蚊幼蟲存在的密度為每勺0.5-3.0只。每種單獨的殺幼蟲劑以及殺幼蟲劑混合物以12磅/英畝的標(biāo)準(zhǔn)由飛機施用，其以每小時85英里的速度和60英尺的掃描寬度施用粒劑。
在處理后第2、6和15天進行幼蟲計數(shù)，并與未處理的對照測試地區(qū)的幼蟲數(shù)比較。結(jié)果顯示在下面的表12中，證實2∶1混合物能夠有效殺滅幼蟲，因為正數(shù)值的幼蟲控制百分比表示殺幼蟲劑確實殺死了幼蟲。
表12平均的減少百分比
實施例14下面的研究證實了不同B.s.敏感的和不敏感的蚊子對混合物的敏感性。它們支持混合物作為一種控制蚊子以及控制B.s.抗性蚊子的方法的權(quán)利要求。三個研究也支持了在粒劑配方之前混合工業(yè)粉劑的方法。
B.t.i.和B.s.的1∶1混合物配方用于控制B.s.抗性五帶淡色庫蚊田間種群的效力與每種配方分別進行比較。
材料與方法一種高抗性的五帶淡色庫蚊種群是在泰國Nonthaburi省Bang Yai區(qū)的Wat Pikul鑒別的。該種群在2001年一月到九月之間用不同劑量的VectoBac WDG(3000Bti ITU)和VectoLex WDG(650Bs ITU)以及兩者的1∶1混合物進行處理。在每次處理后，種群變化通過滴定隨時間進行估測，并計算處理后的晚齡幼蟲和蛹的控制百分比。
結(jié)果VectoLex WDG高達200mg/m2的劑量對該種群產(chǎn)生了很少或者沒有控制。發(fā)現(xiàn)VectoBac WDG提供控制的劑量低至20mg/m2。發(fā)現(xiàn)兩種產(chǎn)品的1∶1混合物在20mg/m2的劑量下比單獨的任一種產(chǎn)品都更有效。
表13B.s.抗性五帶淡色庫蚊田間種群在用B.s.，B.t.i.，以及B.t.i和B.s.的混合物處理后的減少百分比
兩種B.t.i./B.s.混合物配方用于控制尖音庫蚊和脈毛蚊，在人工地區(qū)中與標(biāo)準(zhǔn)B.s.配方進行效力比較材料與方法2001年7月27日，在位于OR.，波特蘭，5235N.Columbia Blvd的Multonomah郡蚊控區(qū)研究室所在地，使用淺水池建立了二十八個人工測試區(qū)。池子布置成四排，每排七個池子。每排指定為一個測試系列。池子用來自該區(qū)水源的自來水注入到大約8英寸的深度。該深度在整個研究過程中維持。每個池子具有大約0.785M3的表面積。每個池子富集稻草和兔肉食物(100gr.)用于提供幼蚊的棲息地和食物。
池子留給干草/兔肉食物混合物進行適應(yīng)，并使本地蚊子的天然種群開始落戶。在本地蚊子種群無法在研究池子中產(chǎn)生足夠的種群后，對試驗池子進行人工繁殖。在該初始繁殖之后，尖音庫蚊和脈毛蚊種群通過天然再繁殖維持自身。
在研究中比較了標(biāo)記為ABG6185、VBC60015和VBC60019的三種配方。ABG-6185包含形成在玉米棒子粉上的B.s.工業(yè)粉劑，具有50B.s.ITU的效力。VBC-60015和VBC-60019是形成在玉米棒子粉上的B.t.i.和B.s.工業(yè)粉劑的混合物，分別具有200B.t.i./50B.s.ITU和100B.t.i./50B.s.ITU的理論效力。配方以2.5kg/公頃和5kg/公頃的施用標(biāo)準(zhǔn)與未處理的對照比較進行測試。每個施用標(biāo)準(zhǔn)和對照組在測試系列中以任意方式進行四次重復(fù)。
使用標(biāo)準(zhǔn)蚊勺在每池取5勺進行取樣，并用精密網(wǎng)孔過濾器濃縮幼蟲捕獲物?；旌蠘悠繁４嬖谝掖贾杏糜谟嫈?shù)和種屬鑒別。幼蟲計數(shù)記錄為第一齡-第二齡，第三齡-第四齡以及蛹。
處理前的計數(shù)和測試產(chǎn)品的應(yīng)用在2001年8月20日進行。初始的處理后幼蟲計數(shù)在處理后大約64小時的2001年8月23日進行。繼續(xù)計數(shù)在8月27日、8月31日進行，最后計數(shù)在2001年9月6日。
控制成功通過計算每次測試的四次重復(fù)的第3和第4階段幼蟲平均數(shù)以及處理前后的蛹計數(shù)來確定?？刂瓢俜直韧ㄟ^并將Mulla′s公式應(yīng)用到每次處理的總體種群平均值來計算。
結(jié)果在處理后，所有處理過的地區(qū)的平均種群數(shù)相對于未處理的對照地區(qū)減少了，在處理后7天比對照組具有顯著的降低(P＝0.05，Student-Newman-Keuls)。在處理個體之間具有數(shù)字差異，但是沒有統(tǒng)計學(xué)上顯著的差別。最初的減少(處理后第3天)對混合配方整體來說是最高的，類似的控制在整個研究期間都可以在配方中看到。來自2.5kg/公頃處理的減少百分比顯示于表14。
表12修正了在2.5kg/公頃處理應(yīng)用之后，人工地區(qū)的L3-L4庫蚊和脈毛蚊幼蟲的減少百分比。*
表14
*相對于基于5次重復(fù)種群平均值的對照的修正兩種B.t.i./B.s.混合物配方用于控制環(huán)喙庫蚊和尖音庫蚊，在小田地區(qū)中與標(biāo)準(zhǔn)B.s.配方進行效力比較材料與方法測試地點是一個沼澤，小溪流在這里進入華盛頓Yakima附近的Yakima河。存在環(huán)喙庫蚊和尖音庫蚊的天然種群。水流基本上是停滯的。深度是6-12英寸并在試驗期間保持恒定。水溫在試驗期間為72到77°F范圍。植被主要是分散著闊葉草的草，覆蓋80％的表面。植物高度是6-15英寸高。有時候牛在這個地方吃草，但是在試驗期間沒有出現(xiàn)。這個地方有機物質(zhì)含量非常高。這個地區(qū)的食肉種群一般很少。
試驗是一種每次處理用三個1000平方英尺的地區(qū)進行的隨機化完全抑制實驗。這些地區(qū)在2001年7月19日進行施用之前立即取樣，并在施用后48小時、7天和14天再次取樣。在每個地區(qū)用標(biāo)準(zhǔn)蚊勺取二十勺。在每勺中計數(shù)第一齡-第二齡幼蟲，第三齡-第四齡幼蟲以及蛹。
在研究中比較了標(biāo)記為ABG6185、VBC60015和VBC60019的三種配方。ABG-6185包含形成在玉米棒子粉上的B.s.工業(yè)粉劑，具有50B.s.ITU的效力，VBC-60015和VBC-60019是形成在玉米棒子粉上的B.t.i.和B.s.工業(yè)粉劑的混合物，分別具有200B.t.i./50B.s.ITU和100B.t.i./50B.s.ITU的理論效力。配方以5磅/英畝的施用標(biāo)準(zhǔn)與未處理的對照比較進行測試。數(shù)據(jù)通過變量分析進行分析。減少百分比的計算用Mulla′s公式，僅在大幼蟲和蛹的基礎(chǔ)上進行。每次處理的總體種群平均值用于該計算。
結(jié)果在處理后兩天，所有三種配方都提供了明顯的盡管并不突出的控制。5磅/英畝的標(biāo)準(zhǔn)可能對該地區(qū)來說是相當(dāng)?shù)偷?。在?天和14天的控制并不是很顯著，因為對照組中復(fù)制兩代的幼蟲種群只有很低的種群數(shù)。不過，所有的處理過的地區(qū)都比未處理的地區(qū)在第7天和14天具有更高的控制百分比。比較配方，似乎處理組之間在第2天沒有任何差別，但是在第7天兩種VBC配方都比ABG-6185好。使用L3-蛹的總體種群平均值計算的修正減少百分比顯示于表15。
表15修正了以5磅/英畝處理應(yīng)用之后，小田地區(qū)的第三齡-第四齡庫蚊幼蟲和蛹的減少百分比。*表15
四種B.t.i./B.s.混合物配方用于控制Ochlerotatustaeniorhynchus，在人工地區(qū)與標(biāo)準(zhǔn)B.t.i.配方進行效力比較材料與方法在該研究中使用二十四個人工測試地區(qū)，其位于佛羅里達巴拿馬市公共衛(wèi)生昆蟲研究與教育中心的John A.Mulrenan，Sr.。這些地區(qū)用3-5ppt鹽水填充到大約6英寸的深度。該深度在研究期間維持。每個地區(qū)具有大約8英尺的表面面積。浮草和沙土底層存在于這些地區(qū)。在研究期間，水溫平均為75華氏度。
測試地區(qū)的人工繁殖在初始處理之前以及處理后每隔一天進行。在每個繁殖日，大約1000只第三齡Ochlerotatus taeniorhynchus幼蟲被加入到每個地區(qū)。
在研究中比較了標(biāo)記為ABG6138s、VBC60015、VBC60016、VBC60018和VBC60019的五種配方。ABG6138s包含形成在玉米棒子粉上的B.t.i.工業(yè)粉劑，具有200B.t.i.ITU的效力。VBC60015、VBC60016、VBC60018和VBC60019是形成在玉米棒子粉上的B.t.i.和B.s.工業(yè)粉劑的混合物，分別具有200B.t.i./50B.s.ITU、100B.t.i./25B.s.ITU、200B.t.i./25B.s.ITU和100B.t.i./50B.s.ITU的理論效力。配方以2.8kg/公頃的施用標(biāo)準(zhǔn)與未處理的對照比較進行測試。數(shù)據(jù)通過變量分析進行分析。每個施用標(biāo)準(zhǔn)和對照組在測試系列中以任意方式進行四次重復(fù)。
取樣使用標(biāo)準(zhǔn)蚊勺在每個地區(qū)取8勺。記錄每個地區(qū)采集的幼蟲數(shù)。初次取樣在初始繁殖和處理后第1天進行，并在處理后第2、3、5、7、10和13天重復(fù)。
控制成功通過比較在處理過的地區(qū)采集的幼蟲數(shù)與在對照地區(qū)采集的數(shù)目來確定。每次處理的死亡百分比使用下面的公式計算。
％死亡＝(#對照的幼蟲數(shù)-#處理的幼蟲數(shù))/#對照的幼蟲數(shù)結(jié)果在處理后一天，所有處理過的地區(qū)的種群數(shù)比未處理的對照地區(qū)明顯降低。在第一天的平均減少百分數(shù)對于VBC60015為79.7％，對于VBC60018為98.5％。在這天處理組之間沒有顯著的差別。到研究的第7天，這些材料繼續(xù)顯示出效力，在此之后，控制百分比迅速降低。三種混合物處理，VBC60015、VBC60018和VBC60019，在13天的研究過程中提供了明顯更高的總體減少百分比(LSMEANSSS多項比較測試，p＝0.05)。以2.8 kg/公頃處理7天中的減少百分比顯示于表16。
表16.以2.8kg/公頃處理7天中的減少百分比表16
所有引用的參考文獻在此引入作為參考。
本發(fā)明通過前面的說明書和實施例闡明。前面的說明書打算作為非限制性的例證，因為根據(jù)這些，許多改變對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將成為顯而易見的。因此打算將所有這些在所附權(quán)利要求的范圍和精神之內(nèi)的改變包括在內(nèi)。
在不違背如下面權(quán)利要求所限定的發(fā)明原理和范圍時，所述的本發(fā)明的方法、組合物、實施和安排可以改變。
權(quán)利要求
1.一種控制雙翅目幼蟲的方法，包括步驟將殺幼蟲有效量的蘇云金芽孢桿菌以色列亞種菌株和球形芽孢桿菌菌株的混合物引入到含有雙翅目昆蟲幼蟲的環(huán)境中。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的蘇云金芽孢桿菌以色列亞種菌株是未遺傳修飾的。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述的球形芽孢桿菌菌株是未遺傳修飾的。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述的蘇云金芽孢桿菌以色列亞種菌株是未遺傳修飾的，以及所述的球形芽孢桿菌菌株是未遺傳修飾的。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述的混合物具有約1∶10到約10∶1的蘇云金芽孢桿菌以色列亞種對球形芽孢桿菌的重量比。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述的混合物具有約1∶3到約3∶1的蘇云金芽孢桿菌以色列亞種對球形芽孢桿菌的重量比。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述的混合物具有約1∶2到約2∶1的蘇云金芽孢桿菌以色列亞種對球形芽孢桿菌的重量比。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述的混合物具有1∶1的蘇云金芽孢桿菌以色列亞種對球形芽孢桿菌的重量比。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述的雙翅目昆蟲是蚊子。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述的蚊子選自由尖音庫蚊、五帶淡色庫蚊、埃及伊蚊、環(huán)喙庫蚊、脈毛蚊、按蚊及其組合組成的組。
11.一種抑制雙翅目昆蟲中的殺幼蟲劑抗性的方法，包括步驟將殺幼蟲有效量的蘇云金芽孢桿菌以色列亞種菌株和球形芽孢桿菌菌株的混合物引入到含有雙翅目昆蟲幼蟲的環(huán)境中。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述的蘇云金芽孢桿菌以色列亞種菌株是未遺傳修飾的。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述的球形芽孢桿菌菌株是未遺傳修飾的。
14.權(quán)利要求11的方法，其中所述的蘇云金芽孢桿菌以色列亞種菌株是未遺傳修飾的，以及所述的球形芽孢桿菌菌株是未遺傳修飾的。
15.權(quán)利要求11的方法，其中所述的混合物具有約1∶10到約10∶1的蘇云金芽孢桿菌以色列亞種對球形芽孢桿菌的重量比。
16.權(quán)利要求11的方法，其中所述的混合物具有約1∶3到約3∶1的蘇云金芽孢桿菌以色列亞種對球形芽孢桿菌的重量比。
17.權(quán)利要求11的方法，其中所述的混合物具有約1∶2到約2∶1的蘇云金芽孢桿菌以色列亞種對球形芽孢桿菌的重量比。
18.權(quán)利要求11的方法，其中所述的混合物具有1∶1的蘇云金芽孢桿菌以色列亞種對球形芽孢桿菌的重量比。
19.權(quán)利要求11的方法，其中所述的雙翅目昆蟲是庫蚊。
20.權(quán)利要求11的方法，其中殺幼蟲劑抗性是產(chǎn)生為抗球形芽孢桿菌的。
21.權(quán)利要求11的方法，其中所述的雙翅目昆蟲是蚊子。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述的蚊子選自由尖音庫蚊、五帶淡色庫蚊、埃及伊蚊、環(huán)喙庫蚊、脈毛蚊、按蚊及其組合組成的組。
23.一種組合物，包含蘇云金芽孢桿菌以色列亞種菌株和球形芽孢桿菌菌株的混合物。
24.權(quán)利要求23的組合物，其中所述的蘇云金芽孢桿菌以色列亞種菌株是未遺傳修飾的。
25.權(quán)利要求23的組合物，其中所述的球形芽孢桿菌菌株是未遺傳修飾的。
26.權(quán)利要求23的組合物，其中所述的蘇云金芽孢桿菌以色列亞種菌株是未遺傳修飾的，以及所述的球形芽孢桿菌菌株是未遺傳修飾的。
27.權(quán)利要求23的組合物，其中所述的混合物具有約1∶10到約10∶1的蘇云金芽孢桿菌以色列亞種對球形芽孢桿菌的重量比。
28.權(quán)利要求23的組合物，其中所述的混合物具有約1∶3到約3∶1的蘇云金芽孢桿菌以色列亞種對球形芽孢桿菌的重量比。
29.權(quán)利要求23的組合物，其中所述的混合物具有約1∶2到約2∶1的蘇云金芽孢桿菌以色列亞種對球形芽孢桿菌的重量比。
30.權(quán)利要求23的組合物，其中所述的混合物具有1∶1的蘇云金芽孢桿菌以色列亞種對球形芽孢桿菌的重量比。
31.權(quán)利要求23的組合物，進一步包含額外的成分，選自表面活性劑、惰性載體、防腐劑、保濕劑、食物興奮劑、引誘劑、封裝劑、粘合劑、乳化劑、染料、紫外線防護劑、緩沖液、漂移控制劑、噴霧沉積助劑、自由流動劑及其組合。
32.權(quán)利要求23的組合物，其中兩種菌株的菌漿是噴霧干燥的。
33.權(quán)利要求32的組合物，其中菌漿是分別噴霧干燥的。
34.權(quán)利要求32的組合物，其中菌漿被混合在一起，并將混合物噴霧干燥。
全文摘要
公開了一種控制雙翅目昆蟲幼蟲的方法或者一種抑制幼蟲抗性發(fā)展、控制雙翅目昆蟲抗性種群并降低抗性水平的方法，其通過將殺幼蟲有效量的蘇云金芽孢桿菌以色列亞種菌株和球形芽孢桿菌菌株的混合物引入到含有雙翅目昆蟲幼蟲的環(huán)境中；以及混合物的組合物。優(yōu)選兩種菌株都是未遺傳修飾的。
文檔編號A01N63/00GK1491080SQ02805109
公開日2004年4月21日 申請日期2002年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月16日
發(fā)明者P·德錢特, B·N·德維賽蒂, P 德錢特, 德維賽蒂 申請人:瓦倫特生物科學(xué)公司