專利名稱:誘導(dǎo)植物病害抗性的組合物及其產(chǎn)生方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及誘導(dǎo)植物病害抗性的組合物及產(chǎn)生該組合物的方法,其中所述組合物是以絲狀真菌菌絲或子實(shí)體作為原料,也是環(huán)保的并且對(duì)使用者和消費(fèi)者是安全的。
背景技術(shù):
農(nóng)作物病害防除的主要常規(guī)方法包括使用化學(xué)農(nóng)藥的方法和使用微生物農(nóng)藥或生物的方法,其中所述化學(xué)農(nóng)藥如殺真菌劑或侵染抑制劑,微生物農(nóng)藥如拮抗微生物,生物方法如使用天敵生物。
在大部分化學(xué)農(nóng)藥中,通過(guò)直接作用于植物致病真菌而防除病害。除了化學(xué)農(nóng)藥外,還使用抗性誘導(dǎo)型農(nóng)藥,其中通過(guò)增強(qiáng)植物本身所擁有的病害抗性來(lái)防除農(nóng)作物的病害。
多數(shù)情況下,農(nóng)藥對(duì)植物致病真菌表現(xiàn)出明顯的作用。但持續(xù)使用這些農(nóng)藥在許多情況下會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生抗這些農(nóng)藥的突變體。另一方面,抗性誘導(dǎo)型農(nóng)藥通過(guò)誘導(dǎo)植物的抗性而不是通過(guò)直接作用于植物致病真菌來(lái)防除病害感染的。由于這種機(jī)制,到目前為止對(duì)于抗性誘導(dǎo)型農(nóng)藥還沒(méi)有出現(xiàn)抗性突變體的報(bào)導(dǎo)。因此,可以認(rèn)為抗性誘導(dǎo)型農(nóng)藥對(duì)包括其他生物在內(nèi)的環(huán)境的影響相對(duì)較小。
在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,要求建立可持續(xù)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術(shù)。為了滿足這種要求,開(kāi)發(fā)具有環(huán)境意識(shí)的農(nóng)業(yè)材料是一項(xiàng)重要的任務(wù)。
此外,近幾年來(lái)消費(fèi)者對(duì)安全食品需求的不斷增加導(dǎo)致了對(duì)有機(jī)農(nóng)產(chǎn)品的日益增長(zhǎng)的需求,這些有機(jī)農(nóng)產(chǎn)品是通過(guò)利用農(nóng)業(yè)的自然循環(huán)機(jī)能培育出來(lái)的。根據(jù)日本農(nóng)林漁業(yè)部頒布的指導(dǎo)方針,在生產(chǎn)有機(jī)農(nóng)產(chǎn)品中使用的材料限于天然存在的有用的礦物質(zhì)、植物、動(dòng)物和從上述物質(zhì)中取出、提取或制備的天然物質(zhì)。當(dāng)期望將這些物質(zhì)作為農(nóng)藥時(shí),例如用于防除病害和害蟲(chóng)時(shí),只有根據(jù)農(nóng)用化學(xué)品管理法注冊(cè)的農(nóng)藥能夠被使用,并且抗生素是不能被使用的。
因此,用于有機(jī)農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)的防除物質(zhì)是有限的。于是人們期待著來(lái)源于天然存在物質(zhì)的高效病害防除劑作為常規(guī)化學(xué)農(nóng)藥的替代品。具有上述的抗性誘導(dǎo)型病害防除效果、也就是說(shuō)能預(yù)防性地防除病害且來(lái)源于天然存在材料的農(nóng)業(yè)材料的供給,能夠使其實(shí)現(xiàn)成為對(duì)作為使用者的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者和消費(fèi)者是安全的、同時(shí)也能夠降低環(huán)境負(fù)擔(dān)的農(nóng)藥。
到目前為止,用于植物病害抗性誘導(dǎo)的農(nóng)藥局限于“Oryzemate”(通用名烯丙異噻唑,明治制果株式會(huì)社生產(chǎn))和“Bion”(通用名苯并噻二唑(acibenzolar-S-methyl),Novartis生產(chǎn)),它們注冊(cè)為稻瘟病防除劑。
已經(jīng)報(bào)道的其它誘導(dǎo)病害抗性的物質(zhì)是植物抗毒素誘導(dǎo)劑,如多糖分解產(chǎn)物(特開(kāi)平5-331016號(hào))和uasmonic acid(ジヤスモン酸)衍生物(特開(kāi)平11-29412號(hào))。
在上面以誘導(dǎo)病害抗性為目的農(nóng)藥中,針對(duì)多種作物病害的防除作用是通過(guò)誘導(dǎo)植物抗性實(shí)現(xiàn)的,而不是直接作用于植物致病真菌。因此,到目前為止,沒(méi)有關(guān)于對(duì)這些農(nóng)藥出現(xiàn)抗性突變株的報(bào)道。然而,所有這些都是化學(xué)合成的農(nóng)藥,不符合指導(dǎo)方針。此外也應(yīng)該注意到,盡管作為植物的一種病害抗性反應(yīng),上述的植物抗毒素誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)產(chǎn)生植物抗毒素,但在上述公開(kāi)中關(guān)于實(shí)際的病害防除效果沒(méi)有清楚的描述。
同樣地,已經(jīng)作為植物抗毒素誘導(dǎo)劑被報(bào)道的腦苷脂在實(shí)際應(yīng)用水平對(duì)水稻病害(イネ病)有防除效果(特許第2846610號(hào)和WO98/47364)。腦苷脂是一種鞘糖脂,并且是其中己糖通過(guò)糖苷鍵連到腦胺伯醇上的糖脂。鞘糖脂作為膜組分在各種生物體中廣泛存在并且已經(jīng)用來(lái)作為高度安全的化妝品成分。具有病害抗性誘導(dǎo)活性的鞘糖脂被認(rèn)為是屬于腦苷脂(KogaJ.等人(1998)生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.),48(27),31985-31991)。已經(jīng)知道腦苷脂B分布于繩狀青霉(Penicillium funiculosum)(KawaiG.,Ikeda Y.,Tubaki K.(1985)農(nóng)業(yè)生物化學(xué)(Agric.Biol.Chem.)49(7),2137-2146)、香菇(Lentinus edodes)(Kawai G.(1989)生物化學(xué)和生物物理學(xué)報(bào)(Biochim.Biophys.Acta)1001(2)185-190)、pachybasium sp.(Sitrin R.等人(1988)抗生素雜志(J.Antibiot.)41(4),469-480)和絲核菌屬(Rhizoctonia sp.)(Umemura K.等人,植物細(xì)胞生理學(xué)(Plant CellPhysiology)41(6),676-683)。腦苷脂B含有由式(I)代表的結(jié)構(gòu) 在WO98/47364中,公開(kāi)了腦苷脂B是一種水稻病害防除劑。在該專利中公開(kāi)的防除劑是從植物致病真菌提取得到的。此外,還應(yīng)該注意到,到目前為止,還沒(méi)有關(guān)于腦苷脂B和其它腦苷脂針對(duì)除水稻外的農(nóng)產(chǎn)品具有病害防除效果的報(bào)道。
關(guān)于擔(dān)子菌中腦苷脂的分布,已經(jīng)得知腦苷脂包含于生Shiitake香菇(香菇)子實(shí)體的乙醇提取液中(Kawai G(1989)化學(xué)和生物物理學(xué)報(bào)1001(2)185-190),并且能夠用丙酮從培養(yǎng)的裂褶菌(Schizophyllum commune)Fr.(スエヒロタケ)菌絲中提取到腦苷脂(特公昭63-52878號(hào))。然而,上述公開(kāi)中所描述物質(zhì)的活性是子實(shí)體誘導(dǎo)活性,并且其中沒(méi)有提到植物病害抗性的防除效果。
關(guān)于作物栽培中的擔(dān)子菌提取液的利用,例如,特公昭56-44040號(hào)中描述的利用提取液來(lái)達(dá)到增加農(nóng)作物的產(chǎn)量或促進(jìn)生長(zhǎng)的目的,以及特公昭57-48087號(hào)中描述的利用提取液來(lái)促進(jìn)柑桔屬植物色素形成和增加糖含量。然而,所有這些作用均為含水提取液顯示的。
通常,已知病害抗性誘導(dǎo)物質(zhì)的活性依不同的植物物種而不同。葡聚糖,是葡萄糖聚合物,是到目前為止報(bào)導(dǎo)的作為微生物來(lái)源的抗性誘導(dǎo)物質(zhì)的代表實(shí)例。誘導(dǎo)大豆病害抗性的葡聚糖在水稻中不誘導(dǎo)任何抗性反應(yīng)。另一方面,誘導(dǎo)水稻植物病害抗性的葡聚糖對(duì)大豆也沒(méi)有任何抗性誘導(dǎo)能力(Sharp K.(1984)生物化學(xué)雜志259,11321-11336,和Yamaguchi T.(2000)植物細(xì)胞(Plant Cell),12,817-826),表明盡管這些物質(zhì)都?xì)w類(lèi)于葡聚糖但對(duì)作物不同的反應(yīng)依賴于聚合的方法。此外,有報(bào)道稱花生四烯酸可誘導(dǎo)馬鈴薯的抗性(Bostock M.(1981)科學(xué)(Science)212,349-360)。然而,沒(méi)有關(guān)于在除馬鈴薯外的其它作物中誘導(dǎo)抗性的報(bào)道。因此,認(rèn)為抗性誘導(dǎo)物質(zhì)具有作物物種依賴的特異性活性。
發(fā)明概述在這些情況下,本專利的發(fā)明者已經(jīng)研究了誘導(dǎo)植物病害抗性組合物,所述組合物使用各種各樣的絲狀真菌包括食用真菌作為原材料,并且組合物包含絲狀真菌中含有的鞘糖脂作為活性成分。結(jié)果,他們已經(jīng)驚奇地發(fā)現(xiàn)絲狀真菌來(lái)源的鞘糖脂具有針對(duì)水稻植物病害和多種除水稻外的作物的病害防除效果。
此外,本專利的發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)與鞘糖脂一起從絲狀真菌中提取到的脂溶性物質(zhì)可有效地起到鋪展劑的作用。當(dāng)從絲狀真菌中提取鞘糖脂并用作活性成分時(shí),無(wú)需重新加入鋪展劑,因?yàn)橹苄晕镔|(zhì)也與鞘糖脂一起被提取。從提高工作效率和降低成本的觀點(diǎn)看這是非常有利的。本專利的發(fā)明者還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)含有從絲狀真菌中提取到的脂溶性物質(zhì)的組合物可高水平地使活性成分滲透轉(zhuǎn)移進(jìn)植物體。
而且,本專利的發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用有機(jī)溶劑從含有鞘糖脂的絲狀真菌提取得到的粗提物具有植物生長(zhǎng)抑制活性。本專利的發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用有機(jī)溶劑提取的絲狀真菌粗提物中含有作為誘導(dǎo)抗性物質(zhì)的雜質(zhì)而存在的對(duì)植物具有生理性抑制活性的物質(zhì)。本專利的發(fā)明者已經(jīng)成功地在濃縮/分離步驟中有效地去除了這種生理性抑制物質(zhì)。
因此,本發(fā)明的一個(gè)目的就是提供一種抗性誘導(dǎo)型病害防除組合物,這種組合物使用的原材料是經(jīng)攝食或類(lèi)似試驗(yàn)證明是安全的絲狀真菌,對(duì)植物沒(méi)有任何生理學(xué)上的抑制活性,對(duì)于多種作物物種具有廣泛的防除譜,并且是環(huán)保的。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面,提供了誘導(dǎo)植物病害抗性的組合物,所述組合物含有來(lái)源于絲狀真菌的鞘糖脂。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面,提供了用于產(chǎn)生本發(fā)明組合物的方法,其包括如下步驟攪拌浸于有機(jī)溶劑中的絲狀真菌的菌絲或子實(shí)體以提取鞘糖脂或脂溶性物質(zhì)到有機(jī)溶劑中(有機(jī)溶劑提取步驟);以及對(duì)在提取步驟中由有機(jī)溶劑提取獲得的提取液進(jìn)行濃縮和然后的沉淀并去除提取液中含有的對(duì)植物具有生理性抑制活性的物質(zhì)(濃縮/分離步驟)。
發(fā)明詳述在此處使用的術(shù)語(yǔ)“鞘糖脂”是指如式(I)所示的含有長(zhǎng)鏈堿、脂肪酸和糖的化合物。在上下文中,糖的類(lèi)型和糖的數(shù)量沒(méi)有特殊的限制。
在此處使用的術(shù)語(yǔ)“腦苷脂”是指其中糖類(lèi)部分是己糖的鞘糖脂。
絲狀真菌來(lái)源的鞘糖脂的結(jié)構(gòu)特征為長(zhǎng)鏈堿部分第9位連接有甲基(Kawai G.,Ikeda Y.,Tubaki K.(1985)農(nóng)業(yè)生物化學(xué),49(7),2137-2146和Kawai G(1989)生物化學(xué)和生物物理學(xué)報(bào)1001(2)185-190)。已知該結(jié)構(gòu)參與水稻病害抗性誘導(dǎo)活性(Koga J.等人(1998)生物化學(xué)雜志,48(27),31985-31991和Umemura K.等人(2000)植物細(xì)胞生理學(xué),41(6),676-683)。因此,在本發(fā)明中,術(shù)語(yǔ)“絲狀真菌來(lái)源的鞘糖脂”是指長(zhǎng)鏈堿部分第9位連接有甲基的鞘糖脂。而且,在本發(fā)明中,術(shù)語(yǔ)“絲狀真菌來(lái)源的腦苷脂”是指長(zhǎng)鏈堿部分第9位連接有甲基的腦苷脂。
絲狀真菌來(lái)源的腦苷脂包括如下腦苷脂腦苷脂A((4E,8E)-N-D-2’-羥基-(E)-3’-十六烷?;?1-O-β-D-吡喃葡萄糖基-9-甲基-4,8-sphingadienine);腦苷脂B((4E,8E)-N-D-2’-羥基棕櫚?;?1-O-β-D-吡喃葡萄糖基-9-甲基-4,8-sphingadienine);
腦苷脂C((4E,8E)-N-D-2’-羥基-(E)-3’-十八烷酰基-1-O-β-D-吡喃葡萄糖基-9-甲基-4,8-sphingadienine);和腦苷脂D((4E,8E)-N-D-2’-羥基硬脂?;?1-O-β-D-吡喃葡萄糖基-9-甲基-4,8-sphingadienine)。
本發(fā)明的組合物可以包含腦苷脂A、腦苷脂B、腦苷脂C和腦苷脂D中的任一種或兩種以上的組合。
本發(fā)明的組合物中作為活性成分而包含的鞘糖脂可以從絲狀真菌的菌絲或子實(shí)體中制備。
優(yōu)選的絲狀真菌包括屬于擔(dān)子菌的微生物和一些用于發(fā)酵生產(chǎn)如酶生產(chǎn)、抗生素生產(chǎn)和多醣生產(chǎn)的微生物。
擔(dān)子菌包括食用擔(dān)子菌和藥用擔(dān)子菌,食用擔(dān)子菌如屬于側(cè)耳屬(Pleurotus)、香菇屬(Lentinus)、火菇屬(Flammulina)、奇果菌屬(Grifola)、蘑菇屬(Agaricus)、木耳屬(Auriculariales)、銀耳屬(Tremellales)、鱗傘屬(Pholiota)和繡球菌屬(Sparassidaceae)的微生物,藥用擔(dān)子菌如屬于Wolfiporis屬或靈芝屬(Ganoderma)的微生物。用于發(fā)酵生產(chǎn)的微生物包括那些屬于曲霉屬(Aspergiilus)、青霉屬(Penicillium)、木霉屬(Trichoderma)、小枝頂孢屬(Acremonium)、毛霉屬(Mucor)和根霉屬(Rhizopus)的微生物。此處可用的優(yōu)選擔(dān)子菌實(shí)例包括香菇、糙皮側(cè)耳(Pleurotus ostreatus)、Flammulina velutipes、Glifola frondosa、二孢蘑菇(Agaricus bisporus)、蘑菇(Agaricus campestris)和毛木耳(Auricularia polytricha)。用于發(fā)酵生產(chǎn)的優(yōu)選微生物的實(shí)例包括黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)和婁地青霉(Penicilliumroquefortii)。
絲狀真菌的菌絲或子實(shí)體可以是諸如活細(xì)胞、細(xì)胞的培養(yǎng)液、培養(yǎng)液濃縮物、干燥細(xì)胞或它們的包括發(fā)酵殘?jiān)趦?nèi)的加工產(chǎn)物等。優(yōu)選的是子實(shí)體的干燥細(xì)胞。
當(dāng)使用絲狀真菌的干燥細(xì)胞時(shí),用研磨機(jī)器如動(dòng)力研磨機(jī)將干燥細(xì)胞研磨到溶劑能夠輕易地浸透到干燥細(xì)胞內(nèi)的程度時(shí)可以實(shí)現(xiàn)高效地提取。從實(shí)現(xiàn)更高效率提取的觀點(diǎn)來(lái)看,精細(xì)研磨到顆??梢酝ㄟ^(guò)2毫米孔徑的篩子的程度是優(yōu)選的。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中,提供了一種產(chǎn)生誘導(dǎo)植物病害抗性的組合物的方法,包括如下步驟攪拌浸于有機(jī)溶劑中的絲狀真菌的菌絲或子實(shí)體,以將細(xì)胞中含有的成分提取到有機(jī)溶劑中(有機(jī)溶劑提取步驟);以及濃縮提取步驟中通過(guò)有機(jī)溶劑提取得到的提取液和然后沉淀并去除提取液中含有的對(duì)植物具有生理性抑制活性的物質(zhì)(濃縮/分離步驟)。由此得到的組合物包含作為活性成分的鞘糖脂和作為鋪展劑成分的脂溶性物質(zhì)。
在本發(fā)明中,術(shù)語(yǔ)“脂溶性物質(zhì)”是指能溶于脂肪和油中的物質(zhì)。用有機(jī)溶劑可提取到許多此類(lèi)脂溶性物質(zhì)。脂溶性物質(zhì)的定量測(cè)定包括用正己烷進(jìn)行的簡(jiǎn)單提取和測(cè)定法。來(lái)源于絲狀真菌菌絲或子實(shí)體的脂溶性物質(zhì)能與作為活性成分的鞘糖脂提取液一起從絲狀真菌中提取出來(lái)。提取的脂溶性物質(zhì)含有具有鋪展活性的兩親性物質(zhì),在施用組合物后,提取的脂溶性物質(zhì)能提高組合物在葉片上的鋪展。因此,可以增強(qiáng)作為活性成分的鞘糖脂在植物體的鋪展和滲透轉(zhuǎn)移。在誘導(dǎo)植物病害抗性的本發(fā)明組合物中,當(dāng)從絲狀真菌提取活性成分時(shí),提取液中也含有鋪展劑成分。因此,在應(yīng)用時(shí)無(wú)需添加任何額外的鋪展劑。即便需要使用額外的鋪展劑,也是僅添加少量的鋪展劑便足以達(dá)到預(yù)期的結(jié)果。從提高工作效率和降低成本的角度來(lái)看是有利的,同時(shí)還能降低對(duì)環(huán)境的影響。
在提取步驟中,將有機(jī)溶劑加入到絲狀真菌中,攪拌混合物,活性成分提取完成之后,進(jìn)行固-液相分離以分離為有機(jī)溶劑提取液和用于提供有機(jī)溶劑提取液的殘?jiān)?。在提取步驟中使用的有機(jī)溶劑包括乙醇、甲醇、己烷、石油醚、乙醚、乙酸乙酯、氯仿和丙酮。為獲得高效提取,優(yōu)選的溶劑是乙酸乙酯和氯仿。然而,當(dāng)組合物作為病害防除劑用于培育有機(jī)農(nóng)產(chǎn)品時(shí)優(yōu)選使用乙醇。
根據(jù)所使用的有機(jī)溶劑和絲狀真菌的情況選擇適當(dāng)?shù)奶崛l件。提取時(shí)液體的溫度優(yōu)選地為15-80℃。而且,為了提高產(chǎn)量,殘?jiān)梢赃M(jìn)行重提取以進(jìn)一步獲得活性成分。為了達(dá)到這個(gè)目的,可以采用這樣的方法,其中在固—液相分離之后,再次使殘?jiān)胗袡C(jī)溶劑,并且將混合物進(jìn)行固—液相分離以分離有機(jī)溶劑提取液。并將該提取液加到以前得到的有機(jī)溶劑提取液中。
在濃縮/分離步驟中,濃縮有機(jī)溶劑提取液以增加活性成分和鋪展劑成分的含量,同時(shí)去除對(duì)植物具有生理性抑制活性的物質(zhì)。
通過(guò)常規(guī)方法,如冷凍干燥、真空濃縮或加熱蒸餾,可以實(shí)現(xiàn)濃縮。然而,由于在升高的溫度下濃縮是不利的,所以優(yōu)選地采用真空濃縮。在加熱蒸餾時(shí),濃縮可在80℃以下的溫度下進(jìn)行。
可以進(jìn)行濃縮以使?jié)饪s物中腦苷脂B的含量?jī)?yōu)選地為0.4-3.0mg/ml,更優(yōu)選地為0.9-3.0mg/ml,作為正己烷提取物的脂溶性物質(zhì)含量?jī)?yōu)選地為10-200mg/ml,更優(yōu)選地為30-100mg/ml。當(dāng)然,進(jìn)行濃縮時(shí)也可以腦苷脂B以外的其他腦苷脂含量為指標(biāo)。濃縮時(shí),體積優(yōu)選地降低到濃縮之前體積的五分之一到三十分之一,更優(yōu)選地是1/10-1/20。
濃縮物中,作為正己烷提取物的脂溶性物質(zhì)含量小于10mg/ml時(shí),有時(shí)對(duì)植物有生理性抑制作用的成分不能作為沉淀物被去除。另一方面,當(dāng)濃縮過(guò)度使得脂溶性物質(zhì)的含量大于200mg/ml時(shí),再稀釋時(shí)有時(shí)會(huì)引起脂溶性物質(zhì)的分離,這使得不可能得到均一的組分。
本發(fā)明誘導(dǎo)植物病害抗性的組合物制劑可以是在農(nóng)藥中所采用的任何一種制劑,它們的實(shí)例包括液體制劑、粉劑、顆粒劑、乳油、可濕性粉末、油溶液、氣溶膠和飄浮劑(フロアブル)。施用的化學(xué)品形式、使用形式和施用方法都沒(méi)有特別的限制。然而,施用時(shí)組合物的濃度要根據(jù)腦苷脂的含量而定,優(yōu)選地為0.5-100μg/ml,更優(yōu)選地為1-50μg/ml,特別優(yōu)選地為5-20μg/ml。然而,施用濃度要依據(jù)植物種類(lèi)、生長(zhǎng)時(shí)期和施用方法而調(diào)整到適當(dāng)?shù)臐舛取?br>
本發(fā)明的誘導(dǎo)植物病害抗性的組合物可用于保護(hù)所有栽培植物,栽培植物的實(shí)例包括谷物類(lèi)(例如水稻、大麥、小麥和玉米)、茄科植物(例如番茄、茄子和馬鈴薯)、葫蘆科植物(例如黃瓜、甜瓜和南瓜)、豆科植物(例如豌豆和大豆)、十字花科植物(例如日本蘿卜、大白菜和甘藍(lán))、薔薇科植物(例如草莓、蘋(píng)果和梨)、菊科植物(例如萵苣)、旋花科植物(例如甘薯)、傘形科植物(例如胡蘿卜、歐芹和芹菜)和葡萄科植物(例如葡萄藤)。在植物中,一般的病害抗性反應(yīng)被認(rèn)為對(duì)致病真菌是非特異的。因此,所有的由絲狀真菌引起的植物病害作為上述農(nóng)作物的目標(biāo)病害被提及,它們的實(shí)例包括稻瘟病真菌(Magnaporthe grisea)、稻褐斑病(イネごま葉枯病)真菌(宮部旋孢腔菌(Cochliobolus miyabeanus))、甘薯莖腐病(つる割れ病)真菌(尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum))、瓜類(lèi)莖腐病真菌(尖孢鐮刀菌f.sp.melonis)、萵苣根腐病真菌(尖孢鐮刀菌f.sp.萵苣屬)和番茄黃萎病(大麗花輪枝孢(Verticillum dahliae))。
在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中提供了一種包含絲狀真菌來(lái)源的鞘糖脂和脂溶性物質(zhì)的誘導(dǎo)植物病害抗性的組合物,其中鞘糖脂包含腦苷脂B。
此外,在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中還提供了一種包含絲狀真菌來(lái)源的鞘糖脂和脂溶性物質(zhì)的誘導(dǎo)植物病害抗性的組合物,其中鞘糖脂包含腦苷脂B,該腦苷脂B的含量是0.4-3.0mg/ml,作為正己烷提取物的脂溶性物質(zhì)含量是10-200mg/ml。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中提供了一種在目的植物中誘導(dǎo)病害抗性的方法,包括用含有絲狀真菌來(lái)源的鞘糖脂的組合物處理目的植物的步驟。
此外,在本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中提供了一種防除植物病害的方法,包括用含有絲狀真菌來(lái)源的鞘糖脂的組合物處理靶植物的步驟。
實(shí)施例通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明,但實(shí)施例不用于作為本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1誘導(dǎo)植物病害抗性的組合物的產(chǎn)生(1)有機(jī)溶劑提取步驟用動(dòng)力研磨機(jī)(臺(tái)式動(dòng)力研磨機(jī)P-02,SHOWA GIKEN INDUSTRIAL有限公司制造)研磨干燥的shiitake香菇并用1.0mm孔徑的篩子收集研磨物。向1kg干shiitake香菇研磨物中加入5L 99.5%的乙醇。將混合物保持在25℃,持續(xù)攪拌24小時(shí)進(jìn)行提取,然后將固—液相分離成第一次乙醇提取液和殘?jiān)H缓?,將殘?jiān)?L 99.5%的乙醇中30分鐘洗滌殘?jiān)撕蠓蛛x為第二次乙醇提取液和殘?jiān)?。將第一次和第二次乙醇提取液混合在一起得到乙醇提取液?br>
(2)濃縮/分離步驟將在有機(jī)溶劑提取步驟中得到的混合的乙醇提取液在大氣壓下、液體溫度為80℃條件下進(jìn)行濃縮,直到液體的體積變?yōu)槠鹗俭w積的1/20。濃縮后,將濃縮物冷卻至室溫,通過(guò)離心去除液體中的最終沉淀,得到大約80ml乙醇提取濃縮液A。用正己烷法測(cè)定乙醇提取濃縮液A中的脂溶性物質(zhì)的含量,并用HPLC法測(cè)定乙醇提取濃縮液A中腦苷脂B的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),脂溶性物質(zhì)和腦苷脂B的含量分別為100mg/ml和2.2mg/ml。
(3)提取液的分析上面得到的提取液用于如下的分析。
使用TSKgel ODS 120A柱(Tosoh公司制造;4.6mm×300mm)經(jīng)HPLC分析提取液以測(cè)定腦苷脂B和腦苷脂D的含量。分析時(shí),在柱溫度為50℃、80%乙醇溶劑和1毫升/分鐘流速的條件下,215nm紫外檢測(cè)到的滯留時(shí)間為20.8分鐘和24.6分鐘的物質(zhì)的含量分別為定量測(cè)定的腦苷脂B含量和腦苷脂D的含量。
脂溶性物質(zhì)的含量是作為正己烷提取物來(lái)測(cè)定的(根據(jù)1985年日本環(huán)境機(jī)構(gòu)第28號(hào)通告的附表)。具體而言,在100ml分液漏斗中加入50ml去離子水并向去離子水中加入1ml樣品溶液。接著,加入10ml正己烷和0.5g NaCl,將混合物震蕩,然后豎直放置。分離后,去除下層,再加入50ml水洗滌。用水洗滌重復(fù)兩次,回收己烷層。將適量的無(wú)水硫酸鈉加入到該己烷層中使其脫水。然后用2號(hào)濾紙(商標(biāo)ADVANTEC,Toyo RoshiKaisha有限公司制造)過(guò)濾混合物,濾紙用少量的己烷洗滌。將提取液轉(zhuǎn)移到蒸發(fā)容器中在80℃熱板上蒸發(fā),然后在干燥器中干燥(80℃)。稱重干燥的產(chǎn)物作為正己烷提取物重量。
實(shí)施例2為了比較不同有機(jī)溶劑之間的腦苷脂提取率,測(cè)定了從生shiitake香菇中提取到的腦苷脂B和腦苷脂D的含量。所比較的有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、正己烷和乙酸乙酯。在100g生shiitake香菇中加入其中一種溶劑(150ml)和30ml水,然后將其放在加水混合器(Ace HomogenizerAM-7,Nihon Seiki Seisakusho有限公司制造)中研磨。將研磨液轉(zhuǎn)移到離心沉淀管中并在振蕩器(旋轉(zhuǎn)往復(fù)振動(dòng)器R-30,TIETECH有限公司制造)上振蕩12小時(shí),以便將腦苷脂提取到有機(jī)溶劑層。用上述的HPLC方法測(cè)定溶劑提取的腦苷脂的量,并以每克生shiitake香菇中腦苷脂B和腦苷脂D的含量表示。結(jié)果示于表1。發(fā)現(xiàn)提取液中含有幾種腦苷脂,而不是僅含有腦苷脂B和腦苷脂D(數(shù)據(jù)省略)。這些腦苷脂對(duì)應(yīng)于Kawai等(生物化學(xué)和生物物理學(xué)報(bào),1001,1989,185-190)給出的Len I-X。
表1
實(shí)施例3腦苷脂B含量、脂類(lèi)含量和濃縮率與防除稻瘟病的保護(hù)值之間的關(guān)系對(duì)實(shí)施例1中乙醇提取濃縮液A制備過(guò)程中分別濃縮的濃縮物和進(jìn)一步濃縮提取濃縮液A所得到的溶液進(jìn)行脂溶性物質(zhì)含量、腦苷脂B含量和對(duì)稻瘟病的防除效果的檢測(cè)。對(duì)于每種濃縮液的濃縮,將完成提取步驟后的乙醇提取液作為一倍稀釋液,并且完成提取后的液體量與濃縮/分離步驟中每一次濃縮操作后的液體量的比率作為濃縮率。這樣,可得到1-、2-、5-、10-、20-、30-和50-倍濃縮液用于測(cè)試。以正己烷提取物表示脂溶性物質(zhì)含量。此外,對(duì)于每種液體,還比較了所測(cè)試液體的鋪展性、稀釋后液體的狀態(tài)以及以施用液體后葉片生理性紊亂水平表示的葉表面狀態(tài)。
為了檢測(cè)病害防除效果,用以下方法進(jìn)行了評(píng)估測(cè)試。具體而言,每盆播種8粒強(qiáng)力萌芽稻種(品種Akitakomachi)并在空調(diào)房間內(nèi)進(jìn)行培育,在真葉處于3-4葉齡期時(shí)將樣品噴到植物上。在本例中,每組樣品提供5盆,將具有不同濃縮率的溶液稀釋到含10ppm腦苷脂B而制備的液體來(lái)處理植物。作為比較試驗(yàn),將腦苷脂B的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋到10ppm腦苷脂B而制備的溶液來(lái)處理植物。將測(cè)試液(每盆2ml)施用于葉子上,并且使植物靜置1小時(shí)直到葉子上的測(cè)試液變干,然后將植物重新置于空調(diào)房間內(nèi)進(jìn)行培育。腦苷脂B標(biāo)準(zhǔn)品(2mg/ml腦苷脂B溶液)(植物細(xì)胞生理學(xué)41(6),676-683(2000))是用Umemura等人的方法分離和純化到的標(biāo)準(zhǔn)樣品。
樣品處理3天后,用稻瘟病真菌(Magnaporthe grisea,種007)分生孢子懸浮液噴霧接種來(lái)進(jìn)行感染處理。噴霧接種后,將植物在黑暗和濕潤(rùn)的條件下靜置36小時(shí),使稻瘟病真菌感染植物。此后,將植物轉(zhuǎn)移到空調(diào)房間中培養(yǎng)。接種5天后,計(jì)數(shù)每組樣品中第三真葉上的病斑數(shù)用于計(jì)算保護(hù)值。按如下方程計(jì)算保護(hù)值保護(hù)值=(1-處理組每片葉子上病斑的平均數(shù)/對(duì)照組每片葉子上病斑的平均數(shù))×100。對(duì)照組中,每盆噴霧2ml水。
結(jié)果歸納于表2。當(dāng)使用低濃縮率樣品時(shí),葉子變色表明植物發(fā)病。另一方面,當(dāng)使用高濃縮率樣品時(shí),其稀釋液受到分離而降低保護(hù)值和可操作性。綜合考慮葉子狀態(tài)、鋪展性、稀釋后液體的狀態(tài)和保護(hù)值,認(rèn)為提取液優(yōu)選地濃縮至腦苷脂B的濃度為0.4-3.0mg/ml和作為正己烷提取物的脂溶性物質(zhì)含量為10-200mg/ml。
表2
鋪展性○正常,×排斥水的。
葉表面狀態(tài)○正常,×由于發(fā)病變黃或變色,△部分變色。
稀釋后液體狀態(tài)○正常,×油分離,△部分分離。
實(shí)施例4稻瘟病防除試驗(yàn)(1)方法用與實(shí)施例3中相同的方法評(píng)估防除效果。將實(shí)施例1中制備的乙醇提取濃縮液A用水稀釋成300倍的稀釋液(含10ppm腦苷脂B),并且測(cè)試液處理組(A)的葉片用每盆2ml測(cè)試液進(jìn)行處理。另一方面,在10ppm腦苷脂B溶液中加入0.1%的吐溫20作為鋪展劑得到測(cè)試液。測(cè)試液處理組(B)的葉片是用每盆2ml這種測(cè)試液進(jìn)行處理。
(2)結(jié)果結(jié)果示于表3。對(duì)于對(duì)照組,每片葉子的病斑平均數(shù)為18.6;對(duì)于腦苷脂B處理組(B),每片葉子的病斑平均數(shù)為2.3;和對(duì)于乙醇提取濃縮液A處理組(A),每片葉子的病斑平均數(shù)為1.8,表明在所有的組都觀察到了顯著的病害發(fā)生抑制效果。對(duì)于保護(hù)值,根據(jù)本發(fā)明的乙醇提取濃縮液A處理組(A)高于腦苷脂B(加入吐溫20作為鋪展劑)處理組(B)。
表3
實(shí)施例5稻褐斑病防除試驗(yàn)(1)方法用與實(shí)施例3中稻瘟病防除試驗(yàn)相同的方法(測(cè)試植物培育、樣品處理方法和處理濃度、以及致病真菌感染方法),檢測(cè)了乙醇提取濃縮液A處理組(A)和腦苷脂B處理組(B)中的稻褐斑病防除效果。噴霧接種褐斑病真菌(宮部旋孢腔菌)分生孢子懸浮液2天后計(jì)數(shù)病斑數(shù)。
(2)結(jié)果結(jié)果示于表4。對(duì)于對(duì)照組,每片葉子的病斑平均數(shù)為10.2;對(duì)于腦苷脂B處理組(B),每片葉子的病斑平均數(shù)為1.3;和對(duì)于乙醇提取濃縮液A處理組(A),每片葉子的病斑平均數(shù)為0.9,表明觀察到了顯著的病害發(fā)生抑制效果。對(duì)于抑制效果,乙醇提取濃縮液A處理組要好于腦苷脂B處理組。
表4
實(shí)施例6稻瘟病防除的田間試驗(yàn)(1)方法將稻瘟病經(jīng)常發(fā)生地區(qū)的水稻種植田隨機(jī)地分為測(cè)試組(每組24平方米)。在移栽水稻(品種Koshihikari)秧苗第44天和第51天后,進(jìn)行測(cè)試液施用處理。以120升/10公畝的量噴霧處理,每組3塊地。各組中樣品如下。用實(shí)施例1中制備的乙醇提取濃縮液A經(jīng)水稀釋150倍得到的液體(濃度含20ppm腦苷脂B)處理試驗(yàn)組(E)。用含20ppm腦苷脂B和約0.02-0.03%作為鋪展劑的Mylinow(Mairinou)(Nihon Nohyaku有限公司制造)的腦苷脂B溶液處理比較組(F)。用加入約0.02-0.03%的作為鋪展劑的Mylinow(Nihon Nohyaku有限公司制造)到RabcideFlowable(Kureha化工有限公司制造)(活性成分500ppm fthalide)1000倍稀釋液中而制備得到的液體處理比較組(G)。
(2)結(jié)果最初施用一個(gè)月后,觀察植物葉瘟病發(fā)生,并且根據(jù)由病害發(fā)生百分?jǐn)?shù)決定的保護(hù)值對(duì)各組進(jìn)行比較。結(jié)果示于表5。對(duì)于乙醇提取濃縮液A處理組(E),保護(hù)值是95、對(duì)腦苷脂B處理組(F)是93、和對(duì)比較組(G)是94,表明這些樣品可有效防除稻瘟病。此外,乙醇提取濃縮液A處理組(E)的保護(hù)值是高于腦苷脂B處理組(F)。因此,證實(shí)在實(shí)際的種植田中,本發(fā)明的用于有機(jī)農(nóng)產(chǎn)品培育的誘導(dǎo)植物病害抗性的組合物所能達(dá)到的效果等于或優(yōu)于農(nóng)用化學(xué)品所能達(dá)到的效果。
表5
實(shí)施例7甘薯莖腐病防除試驗(yàn)(1)方法在植入農(nóng)田之前,將用甘薯莖腐病真菌(尖孢鐮刀菌)感染了的甘薯(品種Benikomachi)幼苗根部浸于各種樣品溶液30分鐘。用下述樣品溶液處理各組。用實(shí)施例1中制備的乙醇提取濃縮液A經(jīng)稀釋150倍得到的液體(濃度含20ppm腦苷脂B)處理試驗(yàn)組(E)。用含20ppm腦苷脂B的液體處理比較組(H)。每組植株數(shù)為20,而每組由4塊地組成,每塊地之間間隔60cm。在這種情況下將植株植入農(nóng)田。
(2)結(jié)果植入26天后觀察根部病害發(fā)生的百分?jǐn)?shù),并從根部病害發(fā)生的平均百分?jǐn)?shù)計(jì)算保護(hù)值。結(jié)果示于表6。對(duì)于乙醇提取濃縮液A處理組(E)保護(hù)值是79,對(duì)腦苷脂B處理組(H)是70。因此,證實(shí)本發(fā)明誘導(dǎo)植物病害抗性的組合物對(duì)實(shí)體病害也有防除效果。由于對(duì)土壤病害有小的或沒(méi)有有效的殺真菌劑,對(duì)土壤病害的防除可以說(shuō)是困難的。由于這種原因,常常使用土壤熏蒸消毒劑。然而,由于它效果有限并從環(huán)境污染的角度來(lái)看,期待研發(fā)一種可替代技術(shù)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn),本發(fā)明誘導(dǎo)植物病害抗性的組合物的使用可能是一種利用作物的抗性誘導(dǎo)作用的實(shí)體病害防除方法。
表6
實(shí)施例8瓜類(lèi)莖腐病防除試驗(yàn)(1)方法將瓜類(lèi)植物(品種Ams)(長(zhǎng)出第三或第四葉(真葉))浸于各種測(cè)試溶液10小時(shí)。此后,培養(yǎng)于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中的瓜類(lèi)莖腐病真菌(尖孢鐮刀菌f.sp.Melonis race 2)分生孢子進(jìn)行浸液接種。用實(shí)施例1中制備的乙醇提取濃縮液A經(jīng)稀釋150倍得到的液體(濃度含20ppm腦苷脂B)處理試驗(yàn)組(E)。用含20ppm腦苷脂B的液體處理比較組(H)。
(2)結(jié)果接種21天后觀察根部病害發(fā)生的百分?jǐn)?shù),并從根部病害發(fā)生的平均百分?jǐn)?shù)計(jì)算保護(hù)值。結(jié)果示于表7。對(duì)于乙醇提取濃縮液A處理組(E)保護(hù)值是63,對(duì)腦苷脂B處理組(H)是52。因此,證實(shí)本發(fā)明誘導(dǎo)植物病害抗性的組合物對(duì)蔬菜病害防除是非常有效的。這種效果被認(rèn)為應(yīng)歸功于這樣一種事實(shí),存在于正在申請(qǐng)的本發(fā)明病害抗性誘導(dǎo)組合物中的脂溶性物質(zhì)的鋪展作用促進(jìn)了作為活性成分的腦苷脂的滲透轉(zhuǎn)移進(jìn)入植物體的過(guò)程。
然而,這里無(wú)意受下述理論的約束,盡管認(rèn)為在水溶液中腦苷脂的結(jié)構(gòu)是不穩(wěn)定的,但是腦苷脂與存在于本發(fā)明的組合物中的脂溶性物質(zhì)一起形成一種穩(wěn)定的較高級(jí)的結(jié)構(gòu),這種結(jié)構(gòu)在植物體內(nèi)也相對(duì)穩(wěn)定并且能逐漸地轉(zhuǎn)移擴(kuò)散進(jìn)植物體。由于不易被雨水沖刷而從葉表面流失、不易被日光照射而光降解并且防除效果和所施用的化學(xué)液體的量之間沒(méi)有明顯的相關(guān)性,這種滲透導(dǎo)致預(yù)期更加穩(wěn)定的防除效果和更長(zhǎng)的殘留效果。
表7
實(shí)施例9用乙酸乙酯作為溶劑提取Shiitake香菇、貝葉多孔菌(Glifolafrondosa)和側(cè)耳(糙皮側(cè)耳)的冷凍干燥子實(shí)體。將分別屬于曲霉屬(黑曲霉)、青霉屬(婁地青霉)、毛霉屬(普雷恩毛霉(Mucor prainii))和根霉屬(Rhizopus delemar)的真菌培養(yǎng)于含有1%玉米淀粉、1%糖漿和1%玉米漿(加入氫氧化鈉水溶液調(diào)至pH5.5)液體培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)物6000×g離心20分鐘,收集菌絲,然后用原料菌絲10倍量(w/v)的乙酸乙酯溶劑提取。將溶劑提取液進(jìn)行如實(shí)施例1中的濃縮/分離步驟使提取液的體積降低至原體積的十分之一。因此,生理性抑制物質(zhì)得到分離,并且誘導(dǎo)植物病害抗性的物質(zhì)得到濃縮從而制備得到誘導(dǎo)植物病害抗性的組合物。
用上面的HPLC方法測(cè)定組合物中腦苷脂B的含量,以計(jì)算單位重量的原材料中腦苷脂B的含量。此外,所得到的每種溶劑提取液用水稀釋至濃度為含100ppm腦苷脂B,并且稀釋液施用于稻類(lèi)植物的葉片。根據(jù)WO98/47364中所述的方法測(cè)定稀釋液施用7天后的誘導(dǎo)活性,以葉結(jié)構(gòu)中誘導(dǎo)的植物抗毒素的量作為指標(biāo)。結(jié)果示于表8。植物抗毒素的量表示為phytocassaneA,B,C和D和momilactoneA和B的總量。
從結(jié)果看出,很明顯特別是從擔(dān)子菌中可高效提取腦苷脂B。此外,可以證實(shí)從不同的絲狀真菌中提取制備的組合物具有植物抗毒素誘導(dǎo)能力。
表8
實(shí)施例10萵苣根腐病防除試驗(yàn)(1)方法接種前用化學(xué)法處理萵苣(品種Patriot)植物(長(zhǎng)出第三葉(真葉))12小時(shí),然后將其植入被萵苣根腐病真菌(尖孢鐮刀菌f.sp.Lactucae raceSB1-1)(用稀釋板法測(cè)定細(xì)胞密度3×104CFU/g)污染的土壤進(jìn)行感染接種。實(shí)驗(yàn)組包括用實(shí)施例1中制備的乙醇提取濃縮液A稀釋300倍(濃度含10ppm腦苷脂B)后得到的溶液(E)進(jìn)行浸沒(méi)處理、施用處理和澆水處理的實(shí)驗(yàn)組和用20ppm腦苷脂B溶液(H)進(jìn)行浸沒(méi)處理的實(shí)驗(yàn)組。將通過(guò)這些處理得到的效果進(jìn)行比較。
(2)結(jié)果利用內(nèi)部癥狀觀察植入28天后病害發(fā)生情況。根據(jù)基于病害發(fā)生水平的指標(biāo)判斷病害發(fā)生的程度。根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估病害發(fā)生水平。0無(wú)植物維管束變色;1少于三分之一的植物維管束變色;2三分之一到三分之二的植物維管束變色;和3不少于三分之二的植物維管束變色。按如下方程計(jì)算保護(hù)值保護(hù)值=(對(duì)照組病害發(fā)生的平均程度-實(shí)驗(yàn)組病害發(fā)生的平均程度)/(對(duì)照組病害發(fā)生的平均程度)×100。結(jié)果示于表9。對(duì)作為產(chǎn)品(農(nóng)產(chǎn)品)的地上部分的重量也進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果,在乙醇提取濃縮物處理(E)情況下,對(duì)于浸沒(méi)處理組保護(hù)值是100,對(duì)于施用處理組是72,對(duì)于澆水處理組是86。對(duì)于原材料萵苣的地上部分,當(dāng)將對(duì)照組重量設(shè)定為100時(shí),浸沒(méi)處理組重量是693,對(duì)于施用處理組是266,對(duì)于澆水處理組是559。因此證實(shí)本發(fā)明的病害抗性誘導(dǎo)組合物表現(xiàn)出不受處理方法限制的防除效果,盡管最適的處理?xiàng)l件以作物和目標(biāo)病害的類(lèi)型而不同。
表9
實(shí)施例11蕃茄黃萎病防除試驗(yàn)(1)方法將蕃茄植物(品種Hausumomotaro)(第二葉(真葉)伸展出)浸沒(méi)在實(shí)施例1中制備的乙醇提取濃縮液A經(jīng)稀釋150倍得到的溶液(E)中。浸沒(méi)處理后,將蕃茄植物植入被蕃茄黃萎病真菌(大麗花輪枝孢)(細(xì)胞密度5×104CFU/g)污染的土壤進(jìn)行感染接種。用稀釋150倍的乙醇提取濃縮液A(濃度為含20ppm腦苷脂B)處理實(shí)驗(yàn)組(E)3、6、12和24小時(shí)。用20ppm腦苷脂B溶液處理實(shí)驗(yàn)組(H)12小時(shí)。對(duì)這些處理的防除效果進(jìn)行了測(cè)定和比較。
(2)結(jié)果植入后的第21天,根據(jù)基于外部癥狀的指標(biāo),通過(guò)觀察病害發(fā)生檢測(cè)了防除效果。根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估了基于外部癥狀的病害發(fā)生程度。0健康葉片;1在最低或次最低位置上的葉片上觀察到外部癥狀;2在基本上半數(shù)葉片上觀察到外部癥狀;3在絕大部分葉片上觀察到外部癥狀,并且也觀察到脫落的葉片;和4根部枯萎。按如下方程計(jì)算保護(hù)值保護(hù)值=(對(duì)照組病害發(fā)生的平均程度-實(shí)驗(yàn)組病害發(fā)生的平均程度)/(對(duì)照組病害發(fā)生的平均程度)×100。結(jié)果示于表10。從表10中明顯的看到,在乙醇提取濃縮物處理(E)情況下,當(dāng)處理時(shí)間為3小時(shí)時(shí)保護(hù)值為12,也就是說(shuō)防除效果是不令人滿意的。另一方面,當(dāng)處理時(shí)間為6小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)保護(hù)值大約為60,表明與比較組相比較顯示出不同的病害防除活性。依賴于處理時(shí)間不同而效果不同的原因被認(rèn)為是因?yàn)楸景l(fā)明病害防除組合物的防除效果是一種通過(guò)抗性誘導(dǎo)獲得的效果,為了建立起植物方面的這種抗性,需要一定的時(shí)間階段。此外,已經(jīng)用20ppm腦苷脂B溶液處理12小時(shí)的實(shí)驗(yàn)組(H)保護(hù)值是60,這一事實(shí)表明,本發(fā)明的病害防除組合物中含有的脂溶性物質(zhì)能夠加強(qiáng)腦苷脂的病害防除活性,且不依賴于植物物種。
表10
權(quán)利要求
1.誘導(dǎo)植物病害抗性的組合物,其包含來(lái)自絲狀真菌的鞘糖脂。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物,其中所述的鞘糖脂是腦苷脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的組合物,其中所述的腦苷脂是腦苷脂A、腦苷脂B、腦苷脂C和腦苷脂D中的任意一種或它們的混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的組合物,其中所述的鞘糖脂可通過(guò)用有機(jī)溶劑提取絲狀真菌而獲得。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的組合物,其中所述的鞘糖脂可通過(guò)對(duì)經(jīng)有機(jī)溶劑提取絲狀真菌得到的提取液進(jìn)行濃縮和此后沉淀并去除對(duì)植物具有生理抑制活性的物質(zhì)而獲得。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的組合物,其還包含來(lái)自絲狀真菌的脂溶性物質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的組合物,其中所述的脂溶性物質(zhì)可通過(guò)用有機(jī)溶劑提取絲狀真菌而獲得。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的組合物,其中所述的脂溶性物質(zhì)可通過(guò)對(duì)經(jīng)有機(jī)溶劑提取絲狀真菌得到的提取液進(jìn)行濃縮和此后沉淀并去除對(duì)植物具有生理抑制活性的物質(zhì)而獲得。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的組合物,其還包含來(lái)自絲狀真菌的脂溶性物質(zhì)且其中所述的鞘脂包含腦苷脂B。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的組合物,其中所述的脂溶性物質(zhì)可通過(guò)用有機(jī)溶劑提取絲狀真菌而獲得。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的組合物,其中所述的脂溶性物質(zhì)可通過(guò)對(duì)經(jīng)有機(jī)溶劑提取絲狀真菌得到的提取液進(jìn)行濃縮和此后沉淀并去除對(duì)植物具有生理抑制活性的物質(zhì)而獲得。
12.根據(jù)權(quán)利要求9至11中任意一項(xiàng)所述的組合物,其中腦苷脂B的含量是0.4-3.0mg/ml,且作為正己烷提取物的脂溶性物質(zhì)含量是10-200mg/ml。
13.根據(jù)權(quán)利要求9至11中任意一項(xiàng)所述的組合物,其中腦苷脂B的含量是0.9-3.0mg/ml,且作為正己烷提取物的脂溶性物質(zhì)含量是30-100mg/ml。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任意一項(xiàng)所述的組合物,其中所述的絲狀真菌是屬于擔(dān)子菌類(lèi)的微生物或用于發(fā)酵生產(chǎn)的微生物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的組合物,其中所述屬于擔(dān)子菌類(lèi)的微生物是屬于食用擔(dān)子菌類(lèi)的微生物或?qū)儆谒幱脫?dān)子菌類(lèi)的微生物。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的組合物,其中所述用于發(fā)酵生產(chǎn)的微生物是用于酶生產(chǎn)、抗生素生產(chǎn)和糖類(lèi)生產(chǎn)的微生物。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的組合物,其中所述的屬于食用擔(dān)子菌類(lèi)的微生物屬于以下屬,所述屬選自側(cè)耳屬、香菇屬、火菇屬、奇果菌屬、蘑菇屬、木耳屬、銀耳屬、鱗傘屬和繡球菌屬。
18.根據(jù)權(quán)利要求15的組合物,其中所述的屬于藥用擔(dān)子菌類(lèi)的微生物為屬于Wolfiporis屬或靈芝屬的微生物。
19.根據(jù)權(quán)利要求16的組合物,其中所述的用于發(fā)酵生產(chǎn)的微生物屬于以下屬,所述屬選自曲霉屬、青霉屬、木霉屬、小枝頂孢屬、毛霉屬和根霉屬。
20.根據(jù)權(quán)利要求14的組合物,其中所述的屬于擔(dān)子菌類(lèi)的微生物選自香菇、糙皮側(cè)耳、Flammulina velutipes、Glifola frondosa、二孢蘑菇、蘑菇和毛木耳。
21.根據(jù)權(quán)利要求14的組合物,其中所述的用于發(fā)酵生產(chǎn)的微生物選自黑曲霉、米曲霉、婁地青霉、普雷恩毛霉和Rhizopus delemar。
22.根據(jù)權(quán)利要求1至21中任意一項(xiàng)所述的組合物,其用作植物病害防除劑。
23.防除植物病害的方法,其包括用根據(jù)權(quán)利要求1至22中任意一項(xiàng)所述的組合物處理目的植物的步驟。
24.用于產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1至22中任意一項(xiàng)所述的組合物的方法,其包括以下步驟攪拌浸于有機(jī)溶劑中的絲狀真菌的菌絲或子實(shí)體以將鞘糖脂和脂溶性物質(zhì)提取到有機(jī)溶劑中(有機(jī)溶劑提取步驟);以及濃縮在提取步驟中用有機(jī)溶劑提取獲得的提取液,然后沉淀并去除包含于該提取液中的對(duì)植物具有生理抑制活性的物質(zhì)(濃縮/分離步驟)。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法,其中所述的鞘糖脂包含腦苷脂B。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法,其中對(duì)通過(guò)有機(jī)溶劑提取獲得的提取液進(jìn)行濃縮以得到腦苷脂B含量為0.4-3.0mg/ml且作為正己烷提取物的脂溶性物質(zhì)含量為10-200mg/ml的濃縮液。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法,其中對(duì)通過(guò)有機(jī)溶劑提取獲得的提取液進(jìn)行濃縮以得到腦苷脂B含量為0.9-3.0mg/ml的濃縮液。
28.根據(jù)權(quán)利要求26的方法,其中對(duì)通過(guò)有機(jī)溶劑提取獲得的提取液進(jìn)行濃縮以得到作為正己烷提取物的脂溶性物質(zhì)含量為30-100mg/ml的濃縮液。
全文摘要
提供了一種誘導(dǎo)植物病害抗性的組合物,其包含來(lái)自絲狀真菌的鞘糖脂。還提供了一種防除植物病害的方法,其包括用含有來(lái)自絲狀真菌的鞘糖脂的組合物處理目的植物的步驟。
文檔編號(hào)A01N63/04GK1556670SQ0281856
公開(kāi)日2004年12月22日 申請(qǐng)日期2002年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月28日
發(fā)明者梅村賢司, 宇佐美英企, 友田善久, 谷野茂樹(shù), 久, 樹(shù), 英企 申請(qǐng)人:明治制果株式會(huì)社