專利名稱：抗微生物劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分離自植物染色質(zhì)的蛋白成分的用途。更精確地說，本發(fā)明涉及分離自植物染色質(zhì)的蛋白成分被解離后作為抗微生物劑的用途以及生產(chǎn)該蛋白成分的方法。
大多數(shù)真核生物產(chǎn)生多種針對感染病原體的保護(hù)機(jī)制。幾種機(jī)制建立在那些基本差異的基礎(chǔ)上，存在于微生物與復(fù)雜多細(xì)胞生物的細(xì)胞之間的膜組分和結(jié)構(gòu)中，即它們針對敏感微生物的外膜。這些膜由脂質(zhì)組成，所述脂質(zhì)具有帶有負(fù)電荷的首基，這些首基面向外，顯然微生物難以抵消通過改變它們的膜組成和結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生的影響。因此，具有抗生素作用的物質(zhì)可能會成為取代抗生素的候選物質(zhì)。
一個實例是能夠在膜之間轉(zhuǎn)運(yùn)磷脂的磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。據(jù)報道抗微生物的磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白得自包括谷類植物在內(nèi)的一系列植物物種，而且這些蛋白針對不同的病原體具有不同的活性。例如，在US 5,698,200中證實了借助于獲自發(fā)芽谷粒的含水提取物，植物體能夠預(yù)防植物致病菌。
然而，研究得最多的一類保護(hù)劑是抗微生物肽?？咕谋话l(fā)現(xiàn)存在于所有生物物種體內(nèi)，所述生物物種的范圍從植物和昆蟲到動物，包括軟體動物、甲殼綱動物、兩棲動物、鳥類、魚類、哺乳動物和人。
這些肽與細(xì)菌直接發(fā)生作用并將細(xì)菌殺死。這些肽被稱作抗微生物劑是由于它們通常具有寬的活性譜，所述活性包括殺死或中和革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌、真菌(包括酵母)、寄生蟲(包括渦蟲屬和線蟲)、癌細(xì)胞、甚至包膜病毒如HIV和單純性皰疹病毒?？傊?，這些抗微生物劑是從長度僅僅為12個氨基酸到70個以上殘基的分子。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了500多個這種肽。
在這種肽如蜂毒肽、爪蟾抗菌肽、短桿菌肽、殺菌肽和防衛(wèi)素中幾乎總是詳細(xì)研究陽離子抗微生物肽的抗微生物作用模式。所述抗微生物劑分子還通常損傷受其攻擊的生物體的膜。陽離子抗微生物肽被發(fā)現(xiàn)具有體外以及體內(nèi)的殺菌活性。它們殺傷作用快、不易選擇出抗性突變體、與常規(guī)抗生素、其它肽以及溶菌酶具有協(xié)同作用以及能夠殺死動物模型體內(nèi)的細(xì)菌。
結(jié)果，目前研制出了作為新型抗生素藥物的動物源抗微生物肽。實例是合成型的爪蟾抗菌肽(pexiganan)和protegrin的類似物，一種最初從豬嗜中性白細(xì)胞中分離得到的抗微生物肽。
然而，對于新型取代抗生素的生產(chǎn)來說，天然來源被證明是經(jīng)濟(jì)上盈利的。唯一例外的是抗微生物肽乳鏈球菌肽，該肽可以利用對該物質(zhì)具有高抗性的乳球菌菌株來進(jìn)行有效生產(chǎn)。
還發(fā)現(xiàn)愈來愈多的較大分子的蛋白或其片段具有抗微生物活性。例如，鼠類巨噬細(xì)胞蛋白，遍在蛋白似乎與核糖體蛋白S30相同。并且，牛蛙(Rana catesbeina)胃中的兩種抗菌肽得自胃蛋白酶的N-端。同樣，被稱作蟾蜍素I(buforin I)的抗微生物肽是從亞洲蟾蜍(BBRC218408，1996)的胃組織中分離得到的。39個氨基酸長肽的氨基酸序列被發(fā)現(xiàn)與非洲蟾蜍組蛋白H2A的39個氨基端殘基中的37個相同。
另外，完整蛋白分子可能具有抗微生物潛力。在大西洋鮭魚(BBRC284549，2001)的肝、腸和胃的酸性提取物中檢測到了抗微生物活性。利用酸性提取物通過硫酸銨沉淀、大規(guī)模凝膠色譜(凝膠過濾)、反相HPLC和大小排阻HPLC可以從鮭魚肝臟中分離相應(yīng)的抗微生物蛋白。所述鮭魚抗微生物(SAM)蛋白的分子量為27.7Kd并且被鑒定為組蛋白H1蛋白。在WO 200110901中，在用于治療不同真核生物的微生物感染的抗微生物組合物中采用了得自牛胸腺的哺乳動物組蛋白H1蛋白。因此，具有其它明確功能的蛋白似乎具有抗微生物的第二特性。
然而，應(yīng)當(dāng)避免使用牛蛋白，具體地是得自牛胸腺的蛋白，這是因為這種物質(zhì)可能污染了有害病毒，具體地是肝炎病毒或其它病原體，例如朊病毒。牛物質(zhì)-無論是否被污染，當(dāng)計劃被用于人體時，都必須進(jìn)行極其嚴(yán)格的檢測。
而且，新型取代抗生素的分離包括收集特定動物器官或組織，然后進(jìn)行復(fù)雜的純化程序從而獲得能被用于人或家畜的產(chǎn)品。
本發(fā)明的目的在于提供一種新型抗微生物劑，其中克服了上述缺陷。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種抗微生物劑，其中避免了對人和/或動物致病的感染病原體進(jìn)行傳代的風(fēng)險。
另一個目的在于提供一種當(dāng)在食物中使用時無味的抗微生物劑。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種生產(chǎn)抗微生物劑的方法，在該方法中使用了廉價的原材料。
另一個目的在于提供一種實施規(guī)模不受限制的抗微生物劑生產(chǎn)方法。
另一個目的在于提供一種生產(chǎn)抗微生物劑的方法，該方法不需要投資制備細(xì)菌發(fā)酵設(shè)備。
這些目的通過利用本發(fā)明要求的用途和方法來實現(xiàn)。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種簡單易行的生產(chǎn)蛋白成分的方法，所述蛋白成分可被用作抗微生物產(chǎn)品，例如被用作藥物，一種生產(chǎn)和運(yùn)輸過程中使用的全防腐劑、一種功能食品和/或營養(yǎng)藥物(neutraceutical)添加劑以及動物飼料添加劑。
蛋白成分可以非常容易地由含植物染色質(zhì)的惰性原材料來制備。在本發(fā)明的方法中，DNA是由植物堿性核染色質(zhì)分離的。優(yōu)選地，所述植物染色質(zhì)得自于植物種子。合適的植物種子得自燕麥、高粱、買羅高粱、小麥、大麥、黑麥、玉米、稻子、油菜、大豆、谷子或蕎麥。然而，任何含染色質(zhì)的植物材料如海藻和其它海洋植物可以被用來大規(guī)模制備抗微生物的蛋白成分。
用于分離蛋白成分的植物染色質(zhì)應(yīng)當(dāng)是異染色質(zhì)(沉默染色質(zhì)或“無用”DNA)。異染色質(zhì)是次乙?；?去乙?；?染色質(zhì)，由于正電性較高所以其結(jié)構(gòu)的凝聚性比過乙酰化的染色質(zhì)更強(qiáng)。
另外，用于進(jìn)一步提取特定蛋白的染色質(zhì)原材料的選擇還取決于植物細(xì)胞組織的定位和分化狀態(tài)。例如，由小細(xì)胞組成的組織具有更高的細(xì)胞密度，因此可能比另一種具有較大細(xì)胞尺寸的等量組織含有更多的核酸和伴生抗菌性蛋白成分。
同樣，由于異染色質(zhì)的含量很高而使得多種植物帶有非常大的基礎(chǔ)基因組，由于可能存在的多倍性而進(jìn)一步增加。就此而論，涉及到以堿基對數(shù)目形式測定的(c-值)每個單倍體細(xì)胞的DNA含量。生物體的DNA含量的變化反映在DNA c-值或基礎(chǔ)基因組的大小上。c-值被定義為通過對在所述生物細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的單拷貝DNA全序列中的堿基對重量或數(shù)目進(jìn)行測定而確定的DNA含量。就是核DNA在其未被復(fù)制的單倍體或配子核中的含量，而與分類群的倍性水平無關(guān)。因此，c-值相當(dāng)于二倍體物種體內(nèi)的基因組尺寸，但總是超過多倍體物種體內(nèi)的基因組尺寸。
而且優(yōu)選地是采用自我更新的未分化的植物干細(xì)胞。這些干細(xì)胞是在分生組織、枝條和根尖的新生部位內(nèi)發(fā)現(xiàn)的。因此，植物幼苗的根尖是提取染色質(zhì)并隨后下游分離本發(fā)明的蛋白成分的優(yōu)選原材料。作為釀酒麥芽和小麥胚油生產(chǎn)過程中的廢料，可以不限量地方便獲取這種原材料。
在最適生長條件下細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂的其它植物原材料也適于制備本發(fā)明的蛋白成分?？梢允褂冒l(fā)芽期的任何幼芽和小根或胚芽。優(yōu)選地可以使用四種玉米之一的能夠發(fā)芽的種子。
本發(fā)明可以使用的有價值的原材料是被稱作綠麥芽的原材料，該原料被用作啤酒生產(chǎn)的原材料。釀造業(yè)由大麥生產(chǎn)綠麥芽，該綠麥芽被潤濕后進(jìn)行6天的發(fā)芽(發(fā)麥芽)。工業(yè)上生產(chǎn)的這種綠麥芽或其副產(chǎn)品(葉根苗(rootlings))可以在本發(fā)明中被用于生產(chǎn)抗微生物蛋白成分。
因此，二倍體玉米和大麥(DNA的c-值為5,000Mbp)以及洋蔥(DNA的c-值為18,000Mbp)的葉根苗是合適的原始提取材料。優(yōu)選地，抗菌蛋白成分是從DNA的c-值超過了3,000Mbp的染色質(zhì)源中提取的。
特別優(yōu)選地是純化過程的原材料含有分離自S-期的增殖植物細(xì)胞的植物染色質(zhì)。帶有葉根苗以及嫩葉的發(fā)芽種子(谷粒)因而含有大量的S-期細(xì)胞。
本發(fā)明的生產(chǎn)具有抗微生物活性的植物蛋白成分的方法包括以下步驟對植物材料進(jìn)行均質(zhì)化以便使植物染色質(zhì)暴露出來；采用離解劑在疏水條件下解離植物染色質(zhì)；和通過疏水作用分離方法將解離的染色質(zhì)分離成各個級分，其中一個級分含有所述的植物蛋白成分。
因此，首先對植物材料進(jìn)行均質(zhì)化。在這方面，均質(zhì)化作用是指破壞植物材料的細(xì)胞壁，以這種方式使得植物的染色質(zhì)暴露出來并同時獲得了勻漿?？梢酝ㄟ^本技術(shù)領(lǐng)域中的技術(shù)人員已知的多種方法中的任一種來破壞細(xì)胞壁，這些方法包括但不限于高剪切混合、超聲波、機(jī)械裂解、通過增壓進(jìn)行爆裂等。細(xì)胞壁通過合適的裝置來進(jìn)行裂解，從而獲得勻漿。
然后通過利用離解劑的水溶液在疏水性條件下解離勻漿中的植物染色質(zhì)。這類條件是那些促進(jìn)疏水作用的條件。
合適的離解劑是尿素、氯化胍和氯鹽。氯鹽優(yōu)選地是高離子強(qiáng)度的氯化納。
有利的是植物材料的均質(zhì)化是在離解劑中進(jìn)行的。以這種方式可以使純化過程操作簡單并且可以省去若干純化步驟。
通過在含4M氯化納的幾乎飽和的鹽溶液中對麥芽進(jìn)行均質(zhì)化作用來開始綠麥芽的純化過程。通過高離子強(qiáng)度作用解離染色質(zhì)以及核小體，同時避免了蛋白酶對蛋白成分的同步降解。優(yōu)選地所述均質(zhì)化作用是在有疏水性基質(zhì)存在的條件下進(jìn)行的。
然后可以用篩或金屬絲網(wǎng)等對所述勻漿進(jìn)行篩分從而除去保留在其上的細(xì)胞碎片或其它源自植物染色質(zhì)的顆粒。這樣就獲得了一種清澄的溶液從而便于對被解離的植物染色質(zhì)進(jìn)行后續(xù)純化。
然后將被解離的植物染色質(zhì)分離成各個級分，其中一個級分含有具有抗微生物活性的植物蛋白成分。所述級分的分離優(yōu)選地通過疏水作用分離方法來進(jìn)行。優(yōu)選地，所述疏水作用分離方法是疏水層析。
適當(dāng)?shù)姆蛛x方法的其它實例是在聚合體系統(tǒng)中進(jìn)行的分配，諸如分配色譜、逆流分布和氣相分配(gas aphron partition)。或者被解離的染色質(zhì)成分的分離可以利用載有金屬螯合物凝膠或固定化肝素的柱子來進(jìn)行。
用于疏水作用和/或分離過程中的基質(zhì)的功能性配體應(yīng)當(dāng)是醚、異丙基、丁基或辛基。應(yīng)當(dāng)避免使用苯基。優(yōu)選地，功能性配體是交聯(lián)度達(dá)到4％的瓊脂糖基質(zhì)上的丁基。達(dá)到了40-50μmol/ml的配體密度，結(jié)果產(chǎn)生7mg IgG/ml的結(jié)合能力。
例如，篩濾了綠麥芽勻漿后，將疏水性基質(zhì)分批加到所獲得的溶液中，所述疏水基質(zhì)是含有活性丁基的疏水作用色譜凝膠(HIC)。合適的基質(zhì)是購自Inovata AB，Bromma，瑞典的NovaroseS-Butyl1000/40和購自Amersham Pharmacia Biotech，瑞典的ButylSepharose4。然后用高離子強(qiáng)度的鹽溶液沖洗疏水性基質(zhì)從而洗脫出DNA。
繞后將所述基質(zhì)注入到柱子中并用離子強(qiáng)度遞減的氯化鈉進(jìn)行梯度洗脫。在1M NaCl濃度下洗脫出清晰可見的抗微生物蛋白成分。
所述蛋白成分可以通過適于肽/蛋白純化的常規(guī)方法來進(jìn)一步進(jìn)行純化。這些方法包括離心、等電點(diǎn)沉淀、相分離、超濾、凝膠色譜(大小排阻層析)、離子交換層析或HPLC以及這些方法的組合。優(yōu)選地，后續(xù)分離過程是凝膠色譜或離子交換層析。
最優(yōu)選地是，制備型凝膠色譜步驟是在填裝了排阻限為100kD的凝膠的柱子中完成的。所述柱子在裝載具有抗生素活性的1M NaCl的級分前用蒸餾水進(jìn)行平衡。然后用蒸餾水或醋酸銨洗脫柱子。這樣在一個且同一步驟中同時達(dá)到了脫鹽和純化的目的。由此蛋白成分不需要進(jìn)一步的純化步驟，例如通過凍干法就能被濃縮至干。
分離出了表觀分子量在10至20kD之間的具有抗微生物特性的蛋白級分。
本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解所述蛋白成分的純化也可以通過本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的其它多種方法來完成，所有這些方法都被包括在本發(fā)明中。
一種絡(luò)合劑如肝素、藻酸、肌醇六磷酸或釩化合物也可被用作離解劑，條件是它能夠?qū)⒅参锶旧|(zhì)解離成其單個組分。作為離解劑，形成藻酸鹽與抗微生物活性的蛋白成分的絡(luò)合物，藻酸是特別優(yōu)選的。這種絡(luò)合物可被用于純化目的或被用于抗微生物活性從中緩慢釋放。
在按照本發(fā)明利用例如疏水作用分離方法將被解離的植物染色質(zhì)分離成各個級分前，被解離的染色質(zhì)的原材料中根本不存在抗微生物活性。當(dāng)植物蛋白成分按照本發(fā)明的方法進(jìn)行純化時，異染色質(zhì)被自動利用。因此，通過物理分離染色質(zhì)成分可以連續(xù)產(chǎn)生生物活性。從理論上講，分離方法能夠使所述成分的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。
通常認(rèn)為抗微生物肽通過正電荷作用于原核生物。預(yù)計按照本發(fā)明的方法獲得的蛋白成分的最可能的作用機(jī)制與其它陽離子多肽的已知作用機(jī)制沒有區(qū)別。然而，已知的堿性肽能夠?qū)崿F(xiàn)與細(xì)胞膜的相互作用，該作用與洗滌劑的作用相類似。蛋白成分的這種作用機(jī)制通過其針對革蘭氏陽性菌以及革蘭氏陰性菌的活性而得到證實。
根據(jù)本發(fā)明，從疏水性基質(zhì)中洗脫出來后可以利用其它純化方法從其它植物材料中獲得其它抗微生物活性的蛋白成分。這是由于源自不同生物材料的蛋白質(zhì)具有不同的后合成修飾模式，該模式反映出植物材料的細(xì)胞活性。因此，分離模式應(yīng)當(dāng)受例如按照本發(fā)明獲得的蛋白成分的乙酰化、磷酸化、甲基化、遍在蛋白化、糖基化以及ADP-核糖基化程度的影響。
相應(yīng)地，從植物染色質(zhì)中分離出的蛋白成分接下來可以進(jìn)行化學(xué)修飾。這種修飾包括分子量和/或乙?；潭确矫娴淖兓⑶視a(chǎn)生生物活性的特異性更強(qiáng)的制劑形式。
由本發(fā)明的方法獲得的蛋白成分的抗微生物效果可以通過采用標(biāo)準(zhǔn)化的Bioscreen方法，以乳鏈菌肽作為對照物來進(jìn)行測定。與乳鏈菌肽相比，采用蛋白成分獲得的效果相當(dāng)于2-4mg/ml，該效果是cidal。而且，獲得了抗革蘭氏陰性菌的效果，該效果是乳鏈菌肽所不具備的。
本發(fā)明的簡單純化方法使得抗微生物蛋白成分的生產(chǎn)不受實施規(guī)模的限制。該方法的產(chǎn)率達(dá)到約1g蛋白/kg原材料(例如葉根苗)。通過利用蛋白合成最多的發(fā)芽種子可以使產(chǎn)率最大化，就象例如通過進(jìn)行6天的發(fā)麥芽所顯示的。當(dāng)使用S-期的增殖植物細(xì)胞時，天然染色質(zhì)蛋白的合成達(dá)到最大化并且能占所合成總蛋白的80％。
根據(jù)本發(fā)明從植物染色質(zhì)中分離得到的作為抗微生物劑的蛋白成分可以通過與一種或多種抗微生物增效劑結(jié)合而得到加強(qiáng)。這種抗微生物增效劑的實例是溶菌酶、精蛋白、螯合劑、正銅化合物和殺菌素。
所述植物染色質(zhì)蛋白成分適用于生產(chǎn)用于治療微生物感染的藥物組合物。本發(fā)明還涉及一種用于治療包括人在內(nèi)的哺乳動物的微生物感染的方法，其中施用了治療有效量的蛋白成分。
所述蛋白成分可以口服使用以便治療牙齒和牙床疾病，局部外用以便治療諸如皮膚病、皮膚和頭發(fā)疾病和耳-眼科疾病。所述植物染色質(zhì)蛋白成分還可被用于體腔如口、喉、肺、陰道和直腸，以及在攝入了致病性微生物后用于治療胃腸疾病的單次口服。
當(dāng)?shù)鞍壮煞直挥米骺刮⑸飫r，可以將其配制成含多種鹽和緩沖劑的緩沖含水介質(zhì)。優(yōu)選地，所述鹽是堿和堿土鹵化物，例如氯化鈉、氯化鉀或硫酸鈉?？梢允褂酶鞣N諸如緩沖劑如檸檬酸鹽、磷酸鹽、HEPES、Tris等，針對其目的這種緩沖劑的使用量是生理可接受的。
可以使用各種賦形劑或其它添加劑，在這種情況下將所述蛋白成分配制成凍干粉末以便隨后以溶液形式使用。所述賦形劑可包括各種多元醇、惰性粉末或其它膨脹劑。
本發(fā)明的用途還包括一種含殺死細(xì)菌或真菌有效量的純化蛋白成分和適當(dāng)載體的組合物。這種組合物可以以多種抵抗細(xì)菌和真菌的方式進(jìn)行使用，例如在家庭或?qū)嶒炇沂褂玫目刮⑸镏苿┲惺褂昧吮炯夹g(shù)領(lǐng)域中公知的載體。
不同組合物針對不同的微生物具有不同程度的活性。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地測定用于殺死有害微生物如細(xì)菌和真菌和其它有害病原體的有效量。
本發(fā)明的蛋白成分還可以與其它作為防腐劑的蛋白質(zhì)結(jié)合從而防止該蛋白成分發(fā)生蛋白降解?；蛘撸景l(fā)明的蛋白成分或組合物可以作為防腐劑或消毒劑用于多種制劑中，諸如用于接觸鏡片溶液、軟膏、洗發(fā)劑、藥物、食品等中。蛋白成分的用量根據(jù)其它成分的性質(zhì)、所需的抗微生物防護(hù)程度和所述組合物的目的用途來進(jìn)行變化。
所述蛋白成分例如可以與合適的載體一起在一種表面消毒和冷凍滅菌的組合物中使用和用作為食品高壓巴氏消毒的輔劑以及在組合物中作為水防腐劑，例如在魚養(yǎng)殖中作為水防腐劑。當(dāng)被包封在填充材料中以便從中進(jìn)行緩釋時，所述蛋白成分還能以殺菌有效量進(jìn)行使用。
實施例參照下列實施例將對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述和說明。然而應(yīng)當(dāng)注意，無論如何這些實施例不應(yīng)被解釋為是對本發(fā)明的限制。
實施例1.抗菌測定以其兩倍的濃度向微滴板上的各孔中注入300μl培養(yǎng)基(營養(yǎng)肉湯+1％葡萄糖)。加入樣品一式兩份至蛋白成分的終濃度分別為2、0.5和0.2mg/ml蛋白。
使用兩種測試微生物熒光假單胞菌(革蘭氏陰性需氧細(xì)菌)和無害李斯特氏菌(革蘭氏陽性需氧細(xì)菌)。
所述細(xì)菌菌株的過夜培養(yǎng)物用蛋白胨水溶液進(jìn)行稀釋，并將50μl的每個菌株加到孔中，其濃度為104個細(xì)胞/ml。使用了不含測試細(xì)菌材料的對照孔(陽性對照)。
于30℃下將所述平板在Bio-screen分析裝置中溫育72小時，每15分鐘記錄增加的可見光吸光度，該吸光度代表細(xì)菌的生長。
實施例2.提取和分級分離當(dāng)對植物蛋白和多肽進(jìn)行提取和分級分離時，由于植物組織在結(jié)構(gòu)、生理學(xué)和生物化學(xué)功能方面存在著差異，因此常常不能使用常規(guī)或傳統(tǒng)的動物緩沖液和/或浸漬技術(shù)。植物組織內(nèi)的大分子組分(例如酚化合物、碳水化合物和烴化合物)和相互作用愈復(fù)雜以及細(xì)胞壁愈致密，則需要植物提取制劑的浸漬和分離方法的條件愈嚴(yán)格，從而保證多肽的完整性。
對大麥葉(1kg，鮮重)進(jìn)行提取和分級分離，該提取和分級分離采用的是由Langenbuch等，Plant Molecular Biology 2，207-220(1983)記載的方法。采用0.4N的硫酸獲得了大麥的核染色質(zhì)，產(chǎn)率通常為10-20mg.。
接著進(jìn)行特殊的次分級分離技術(shù)的操作來對蛋白成分進(jìn)行大規(guī)模的制備型分離。利用在乙醇(80％)HCl(0.25N)中的溶解度上的差異獲得了特定的蛋白成分(MW 17,300)。
測定所述蛋白成分抵抗普通住屋李斯特氏菌和假單胞菌菌株的抗微生物活性。
通過采用既溶解于乙醇又溶解于水的級分實現(xiàn)了對兩種微生物生長的總抑制作用。該效果是濃度依賴型的，即必須達(dá)到一定的臨界值(稀釋度為1∶1時沒有獲得效果)。
抗微生物活性僅僅局限于特定的MW17300蛋白成分。分子量較大的蛋白成分沒有活性。
實施例3.其它的提取和分級分離方法按照Sidorova & Konarev，Biokhimiia 46，1298(1981)中所記載的方法對兩周齡的豌豆、小麥、黑麥和棉花幼苗進(jìn)行次分級分離。
得到MW 17300的特定蛋白成分和分子量更大的蛋白成分。
測定所述蛋白成分的抗微生物活性并且結(jié)果與實施例1中的結(jié)果相同。
實施例4.改進(jìn)的分級分離方法從本地的釀酒廠獲得綠色麥芽。利用常規(guī)的麥芽處理方法使該麥芽發(fā)芽6天。
將綠色麥芽(100g)懸浮在4M NaCl中并在Braun混合器中進(jìn)行大約10分鐘的均化。利用20μm的濾網(wǎng)對勻漿進(jìn)行過濾，然后將得到的溶液加到20g的疏水性基質(zhì)(NovaroseS-Butyl 1000/40Inovata AB，瑞典)中，該疏水性基質(zhì)被4M NaCl所平衡。將該混合物攪拌10分鐘并利用40μm的濾網(wǎng)對基質(zhì)進(jìn)行過濾。
然后將所述基質(zhì)裝載到柱(25×50mm)上并在洗脫前用4M NaCl進(jìn)行沖洗。正如在254nm下所測得的洗脫液的吸光度增加了一樣，在該高離子強(qiáng)度下，DNA不與所述基質(zhì)結(jié)合，因而在裝柱和柱沖洗過程中被洗脫出來。
在分別用2M NaCl、1M NaCl和水分步洗脫后，通過276nm下的UV吸收來記錄不同的蛋白峰。這與非染色質(zhì)物質(zhì)在2M NaCl下的解吸作用一致。
實施例5.次分級分離方法利用NovaroseSE-100/40，(Inovata AB，瑞典)的柱子(25×500mm)通過制備型凝膠色譜手段以0.1M醋酸銨對在實施例4中于1MNaCl下解吸下來的級分進(jìn)一步進(jìn)行次分級分離。
獲得了三種蛋白級分并進(jìn)行凍干。中間蛋白級分的保留體積相應(yīng)于分子量在10至20Kd之間。
因此，在該分子量范圍內(nèi)的低乙?；氖杷詨A性蛋白中，植物染色質(zhì)是用于分離的合適來源，其中所述疏水性堿性蛋白帶有較多的正電荷。
通過利用NovaroseSE-100/17，(Inovata AB，瑞典)的柱子(8×300mm)在pH 7.0的0.1M磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行分析型的凝膠色譜，發(fā)現(xiàn)該級分的平均分子量約為14kD。
實施例6.其它的分級分離方法以與實施例4同樣的條件但以NovaroseS-Phenyl(Inovata AB，瑞典)為疏水性基質(zhì)進(jìn)行對比實驗。當(dāng)用1M NaCl洗脫柱子時未能檢測到蛋白的解吸，用水洗脫后只獲得了一個級分。22％的乙醇水溶液也沒能使蛋白物質(zhì)從疏水性基質(zhì)上解吸，表明基質(zhì)與蛋白物質(zhì)間結(jié)合的疏水性極強(qiáng)。
實施例7.抗微生物活性的確定檢測按照實施例5獲得的中間級分的抗微生物活性。通過將凍干級分溶解在磷酸鹽緩沖液(pH 7，0)中，使?jié)舛冗_(dá)到4mg/ml來制備樣品。然后用磷酸鹽緩沖液將這些溶液稀釋四至十倍。
當(dāng)按照實施例4和5的方案進(jìn)行制備時，所得到的結(jié)果與實施例5中由MW17,300的特定蛋白成分獲得的結(jié)果密切相關(guān)。
應(yīng)當(dāng)注意的是由凝膠色譜方法得到的其它級分根本不具有抗微生物活性。
實施例8.c-值的效果按照實施例4和5中記載的方法從72小時的擬南芥和小麥幼苗的染色質(zhì)中分離抗微生物活性相似的蛋白成分。這些物種的10-20kD的中間級分的平均產(chǎn)率顯著不同，相對而言小麥?zhǔn)欠浅：线m的提取源。與大麥相比，所需的級分以約兩倍的含量存在。
實施例9.分析電泳按照標(biāo)準(zhǔn)方案(Panyim & Chalkley，Biochem.83972，1969)進(jìn)行的分析電泳顯示出多個MW17,300的特定蛋白成分的變體，而沒有顯示分子量在28,000和35,000間的蛋白成分的具有較高分子量的次級級分。
這些結(jié)果還反映了植物物種間在基因組大小上存在著差異。與小麥相比，擬南芥具有200Mbp的小二倍體基因組和較低的產(chǎn)率，所述小麥具有17.000Mbp的大六倍體基因組。
因此，提取率與以c-值表示的基因組大小密切相關(guān)。
對比實施例1.與動物組蛋白的比較由于在實施例5的緩沖分離介質(zhì)中進(jìn)行的色譜分析產(chǎn)生分子量約為14kD的分子，該分子量對應(yīng)于牛組蛋白H2A和H2B的分子量，所以進(jìn)行了本發(fā)明的蛋白成分與動物組蛋白之間的比較。
通過在pH7.0的0.1M磷酸鹽緩沖液中利用NovaroseSE-100/17，(Inovata AB，瑞典)的柱子(8×300mm)進(jìn)行分析凝膠色譜來對商購的牛組蛋白H2A和H2B(Sigma，USA)和實施例4中得到的分子量在10和20kD之間的中間級分進(jìn)行平行對照實驗。
測定獲得的所有級分的抗微生物活性，重復(fù)分離自植物染色質(zhì)的蛋白成分的陽性結(jié)果。
另一個對比實驗證明接近空白的第一個級分不具有任何抗微生物活性，該第一個級分預(yù)計是植物組蛋白H1的位置。而且，再一次證明在動物與植物之間，核小體在鹽溶液中的解離模式存在著差異，并且用于動物的常規(guī)方法不能用于植物。
對比實施例2.水性溶劑的提取提取完整植物組織多肽的方法很少。所使用的方法能夠制備各種組織的級分，這些級分富含亞細(xì)胞成分。相反，對于動物系統(tǒng)來說已經(jīng)記載了多種大體上“通用的”制備技術(shù)。
這種技術(shù)由Karen Barrett，US 5698200進(jìn)行了研究，同時檢測了幾種簡單的針對發(fā)芽谷粒的水性溶劑提取方法。
US 5698200的實施例1和2中公開的相同下游技術(shù)被用于作為原材料的大麥葉(參照實施例2)。
僅僅鑒定了10-20kD范圍內(nèi)的貯存蛋白。這些蛋白根本不具有任何抗細(xì)菌活性。
得出的結(jié)論是通過US 5698200中記載的任何方法都不能使染色質(zhì)釋放出來，所述原材料是胞質(zhì)物質(zhì)。最有可能的是，獲得了硫素，該硫素是公知的植物防御素，其特征是2-3kD低分子量的細(xì)胞毒性硫多肽。
權(quán)利要求
1.分離自植物染色質(zhì)的蛋白成分在被解離后作為抗微生物劑的用途，所述蛋白成分的表觀分子量在10至20kD之間。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其中所述植物染色質(zhì)是異染色質(zhì)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的用途，其中所述植物染色質(zhì)具有超過3000Mbp的DNA c-值。
4.如權(quán)利要求1至3中任一項所述的用途，其中所述植物染色質(zhì)得自植物種子。
5.如權(quán)利要求4所述的用途，其中所述得自植物種子是得自燕麥、小麥、大麥、黑麥、玉米、稻子、油菜、大豆、谷子或蕎麥。
6.如權(quán)利要求4或5所述的用途，其中所述植物染色質(zhì)得自發(fā)芽過程中的所述種子。
7.如權(quán)利要求6所述的用途，其中所述抗微生物劑是抗革蘭氏陽性菌以及革蘭氏陰性菌的。
8.如權(quán)利要求7所述的用途，其中所述革蘭氏陽性菌是無害李斯特氏菌。
9.如權(quán)利要求7所述的用途，其中所述革蘭氏陰性菌是熒光假單胞菌。
10.如權(quán)利要求1至9中任一項所述的用途，其中所述蛋白成分與至少一種抗菌增效劑聯(lián)用。
11.如權(quán)利要求10所述的用途，其中所述至少一種抗菌增效劑是溶菌酶、精蛋白、螯合劑、正銅化合物或殺菌素。
12.如權(quán)利要求1至11中任一項所述的用途，其中所述蛋白成分與一種絡(luò)合劑進(jìn)行絡(luò)合以便從中緩慢釋放。
13.如權(quán)利要求12所述的用途，其中所述絡(luò)合劑是藻酸。
14.如權(quán)利要求1至13中任一項所述的用途，其中所述蛋白成分以殺菌有效量與適當(dāng)?shù)妮d體一起被含在一種作為食品添加劑的組合物中。
15.如權(quán)利要求1至13中任一項所述的用途，其中所述蛋白成分與適當(dāng)?shù)妮d體一起被含在一種作為促進(jìn)生長的動物飼料添加劑的組合物中。
16.如權(quán)利要求1至13中任一項所述的用途，其中所述蛋白成分以殺菌有效量與適當(dāng)?shù)妮d體一起被含在一種組合物中，該組合物用于表面的消毒和冷消毒并且作為食品高壓巴氏消毒的輔劑。
17.如權(quán)利要求1至13中任一項所述的用途，其中所述蛋白成分以殺菌有效量被包封在填充材料中以便從中緩慢釋放。
18.如權(quán)利要求1至13中任一項所述的用途，其中所述蛋白成分以殺菌有效量與適當(dāng)?shù)妮d體一起被含在一種作為水防腐劑的組合物中。
19.如權(quán)利要求18所述的用途，其被用于養(yǎng)漁業(yè)。
20.一種生產(chǎn)具有抗微生物活性的植物蛋白成分的方法，其包括以下步驟對植物材料進(jìn)行均質(zhì)化以便使植物染色質(zhì)暴露出來；采用離解劑在疏水條件下解離植物染色質(zhì)；和通過疏水作用分離方法將解離的染色質(zhì)分離成各個級分，其中一個級分含有所述的植物蛋白成分。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述的均質(zhì)化是在所述的離解劑中進(jìn)行的。
22.如權(quán)利要求20或21所述的方法，其中所述離解劑是尿素、氯化胍或氯鹽。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述氯鹽是氯化鈉。
24.如權(quán)利要求20或21所述的方法，其中所述離解劑是絡(luò)合劑，與所述蛋白成分形成一種絡(luò)合物。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述絡(luò)合劑是肝素、藻酸、肌醇六磷酸或釩化合物。
26.如權(quán)利要求20所述的方法，其中進(jìn)行了所述的分離。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述疏水作用分離方法是疏水性層析、金屬螯合層析、分配層析、逆流分布或氣相分配。
28.如權(quán)利要求26或27所述的方法，其中所述疏水作用分離方法中的功能性配體是乙醚、異丙基、丁基或辛基。
29.如權(quán)利要求26所述的方法，其中在所述疏水作用分離過程之后接著另一個分離過程。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述另一個分離過程是凝膠色譜或離子交換層析。
31.分離自植物染色質(zhì)的蛋白成分在被解離后在制備用于治療微生物感染的藥物中的用途，所述蛋白成分的表觀分子量在10至20kD之間。
32.用于治療包括人在內(nèi)的哺乳動物體內(nèi)微生物感染的方法，其中施用了治療有效量的被解離后的蛋白成分，所述蛋白成分分離自植物染色質(zhì)，其表觀分子量在10至20kD之間。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離自植物染色質(zhì)的蛋白成分在被解離后作為抗微生物劑的用途，所述蛋白成分的表觀分子量在10至20kD之間。所述植物蛋白成分通過包括以下步驟的方法來生產(chǎn)對植物材料進(jìn)行均質(zhì)化以便使植物染色質(zhì)暴露出來；采用離解劑在疏水性條件下解離植物染色質(zhì)；和通過疏水作用分離方法將解離的染色質(zhì)分離成各個級分，其中一個級分含有所述的植物蛋白成分。
文檔編號A23K1/175GK1561164SQ02819376
公開日2005年1月5日 申請日期2002年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月29日
發(fā)明者U·羅瑟曼 申請人:瑞典環(huán)境Svv股份公司