專利名稱：分離的噬菌體及其在食品或?qū)櫸锸称分械挠猛镜闹谱鞣椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及噬菌體分離物，該噬菌體分離物對諸如大腸桿菌(Escherichia coli)和沙門氏菌(Salmonella)株系等致病性腸桿菌科(Enteriobacteriaceae)的細菌具有強烈的裂解活性，本發(fā)明還涉及所述的噬菌體分離物用于各種人類或?qū)櫸锸称分幸灾委熁蝾A(yù)防由諸如大腸桿菌或沙門氏菌等致病性腸桿菌科細菌引起的細菌性疾病的用途，尤其用于兒科腸胃炎的噬菌體治療。本發(fā)明還涉及由所述的噬菌體分離物制備的人類或?qū)櫸锸称贰?br> 背景技術(shù)：
過去，使用抗生素來治療各種感染。熟知Selman Waksman在引入和生產(chǎn)鏈霉菌方面的工作和Fleming博士發(fā)現(xiàn)青霉素以及其他人在抗生素領(lǐng)域的工作。多年來，為了使這些“基本”抗生素更有效或為了對這些抗生素敏感的人們進行治療，已對所述的“基本”抗生素進行添加和化學(xué)修飾。
然而，隨著更多的抗生素以不斷增加的速度處方應(yīng)用或使用在各種疾病中，越來越多數(shù)量的細菌對抗生素產(chǎn)生了抗性。如今使用更多劑量的更有效的抗生素來治療更具抗性的細菌株。結(jié)果，產(chǎn)生了對多種抗生素具有抗性的細菌而且一些在醫(yī)院中獲得的革蘭氏陽性細菌感染已變得不能治療。由于更多抗生素的使用和顯示抗性的細菌的數(shù)量增加，已導(dǎo)致需要使用抗生素的時間增長。如今更頻繁使用廣譜、非特異性抗生素，而其中的一些會對患者產(chǎn)生有害效果。此外，對抗生素顯示過敏反應(yīng)的人的數(shù)量似乎在增加。
因此，已尋求其他嘗試方法以首先鑒別細菌然后將其殺死。
已嘗試使用噬菌體來治療細菌性疾病。
在20世紀(jì)初期首先發(fā)現(xiàn)了感染細菌的異質(zhì)性病毒群體。(d′HERELLE，F(xiàn).，《噬菌體，其免疫作用》(The BACTERIOPHAGE.ITS rolein immunity)，由Smith，G.H.翻譯，Williams&WILKINS公司，Baltimore(1922))。目前在科學(xué)研究例如分子生物學(xué)(例如基因載體)和醫(yī)學(xué)診斷(例如細菌的噬菌體分型)中廣泛使用噬菌體。由于噬菌體天然感染并殺死細菌，且細菌是疾病的主要病因，所以傳統(tǒng)上認為在醫(yī)學(xué)治療上可使用噬菌體。
的確，在文獻中已大量報道了在實驗系統(tǒng)中噬菌體的潛在治療用途。
例如，US5,688,501(Merril，等)公開了一種采用對特定細菌具有特異性的裂解性或非裂解性噬菌體治療感染性細菌疾病的方法。
同樣，US 4,957,686(Norris)公開了一種改良的牙齒衛(wèi)生方法，該方法包括將寄生于細菌的噬菌體引入口中，而所述細菌具有很容易粘附于唾液薄膜的特性。
盡管認識到新型的抗微生物治療的價值和重要性，然而在現(xiàn)代療法中，還沒有實現(xiàn)任何實際意義上的噬菌體治療的潛力，也沒有確定用于這種無毒和有效治療的方法、組合物或其他用途，以及實際有效的遞送方式。特別是對于有效地預(yù)防和治療與大腸桿菌相關(guān)的感染，例如腹瀉。
事實上，大腸桿菌是研究非常充分的細菌，具有兩個完全測序的成員非致病性株系K-12(Blattner，F(xiàn).R.，等，1997 Science 277，1453-1474)和致病性株系O157H7(Perna，N.T.等，2001，Nature 409，529-533；Hayaslis等，2001，DNA Research 8，11-22)，其與腸致病性大腸桿菌(EPEC)株系相似。
盡管兩種大腸桿菌噬菌體(λ和T4)是描述得最仔細的生物學(xué)系統(tǒng)(Karam，J.D.，1994，Molecular biology of bacteriophage T4.ASM Press，Washington，DC)，但還需要開發(fā)新型和有用的噬菌體治療劑，該治療劑可用于預(yù)防或治療由細菌性微生物引起的感染性病癥，所述的細菌性微生物例如與兒童和旅行者的腹瀉相關(guān)的大腸桿菌血清型。
還需要開發(fā)在可接受的載體中包含噬菌體治療劑的組合物，可將所述的組合物施用于受細菌性微生物感染的患者。
最后，還需要開發(fā)烈性但非毒性的噬菌體制品，由此使其可用于治療與致病性大腸桿菌或沙門氏菌相關(guān)的細菌性感染。
發(fā)明簡述因此，本發(fā)明的一個目的是開發(fā)新型和有用的噬菌體療法，該療法可用于預(yù)防或治療由致病性腸桿菌科細菌引起的感染，該致病性腸桿菌科細菌引起的感染為例如大腸桿菌感染，特別是人或動物的腹瀉或泌尿疾病或沙門氏菌感染。本發(fā)明的另一目的是提供分離的烈性非毒性噬菌體制品，該制品對致病性腸桿菌科細菌例如大腸桿菌和/或沙門氏菌的株系具有實質(zhì)性的裂解潛力。
本發(fā)明的另一目的是提供所述的噬菌體制品在各種營養(yǎng)組合物、寵物食品、增補劑或藥物組合物中的用途，用于治療或預(yù)防人類或動物中由致病性大腸桿菌和/或沙門氏菌引起的感染。
本發(fā)明的另一目的是提供一種包含至少一種如上所述的噬菌體的營養(yǎng)組合物、寵物食品、增補劑或藥物組合物。
本發(fā)明的另一目的是提供一種采用營養(yǎng)組合物、寵物食品、增補劑或藥物制品中包含的噬菌體治療劑，治療或預(yù)防人類或動物中由致病性腸桿菌科細菌例如大腸桿菌和/或沙門氏菌引起的感染的方法。
本發(fā)明的一個主要優(yōu)點是根據(jù)本發(fā)明選擇的噬菌體制品對引起腹瀉的大腸桿菌株系具有宿主范圍廣的特點，且所述的噬菌體制品是無毒的，所以可將其安全地用于食品組合物中，以有效地預(yù)防或治療由致病性大腸桿菌引起的感染。
根據(jù)本發(fā)明的噬菌體也可用于工業(yè)應(yīng)用。
它們可以有效地在非致病性的大腸桿菌株系上繁殖，卻保持廣泛的宿主范圍。該噬菌體有效地殺死宿主細胞，而且可通過標(biāo)準(zhǔn)的病毒分離方法將噬菌體高度純化。
發(fā)明詳述在下列描述中″NCC″指Nestl éCulture Collection(Nestl éResearchCenter(NRC)，Vers-chez-les-Blanc，洛桑，瑞士)。
根據(jù)第一方面，從人類糞便樣品和環(huán)境中分離了對致病性腸桿菌科細菌例如大腸桿菌和/或沙門氏菌株系具有實質(zhì)上裂解潛力的宿主范圍廣的肌尾病毒科(Myoviridae)噬菌體。
對患急性腹瀉入院治療的兒童的糞便樣品用噬斑分析進行篩查以檢測針對大腸桿菌的噬菌體的存在。還對不同來源的水進行篩查以檢測噬菌體的存在。這些水(自來水、下水道的水、排水溝的水、池塘中的水、溝渠中的水、街道上的水和市場上的水)來自達卡/孟加拉國和洛桑(下水道的水)。分離并在非致病性實驗室大腸桿菌K-12上擴增了約45種肌尾病毒科的噬菌體。這些分離物對大量致病性大腸桿菌株系顯示了廣泛的宿主范圍?？赏ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)病毒純化方法純化噬菌體。結(jié)果顯示被詳細研究的全部噬菌體均是T4樣噬菌體(具有可收縮尾的專性烈性噬菌體)。所述的鑒別是在大基因組(170 kb)、DNA的修飾(對限制性內(nèi)切酶的消化具有抗性)和形態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)上確定的。
它們可以有效地在非致病性的大腸桿菌株系上繁殖，卻對引起腹瀉的大腸桿菌株系保持廣泛的宿主范圍。T4樣噬菌體有效地殺死宿主細胞。它們是原型(prototype)烈性噬菌體，在感染過程中破壞細菌的基因組。這種特性實質(zhì)上增加了噬菌體治療方法的安全性。
在一個優(yōu)選的實施方式中，所述的噬菌體選自NCC-JS9、NCC-JS31、NCC-JS102.2、NCC-JS150、NCC-JS1、NCC-JS10(再命名為NCC-JS4)(CNCM I-2763)、NCC-JS22、NCC-JS32、NCC-JS114.1、NCC-JS140.1、NCC-JS146.1、NCC-JS65.1、NCC-JS65.2′、NCC-JS76.2′、NCC-JS12、NCC-JS152、NCC-JS66、NCC-JS102.1、NCC-JS140.2、NCC-JS146.2、NCC-JS61.2、NCC-JS61.3、NCC-JS114.3、NCC-JS35(再命名為NCC-JS94.1)(CNCM I-2764)、NCC-JS94.2、NCC-JS98、NCC-JS104、NCC-JS94.3、NCC-JS110.1、NCC-JS110.2、NCC-JS110.3、NCC-JS1.4(再命名為NCC-JSD.1)(CNCM I-2765)、NCC-JSD.3、NCC-JSD.2、NCC-JSD.4、NCC-JSD.5，、NCC-JS142、NCC-JS148和NCC-JSL.1、NCC-JSL.2、NCC-JSL.3、NCC-JSL.4、NCC-JSL.5、NCC-JSF(再命名為NCC-JSL.6)(CNCM I-2766)。
在一個最優(yōu)選的實施方式中，作為例子在Institut Pasteur，28 rue duDocteur Roux，F(xiàn)-75024 Paris c édex 15，法國國立微生物保藏中心，于2001年12月11日，以保藏號CNCM I-2763、CNCM I-2764、CNCM I-2765和CNCM I-2766保藏了噬菌體NCC-JS10、NCC-JS35、NCC-JS1.4和NCC-JSF。
有利地，例如，所保藏的噬菌體能夠裂解42％的引起腹瀉的如下大腸桿菌，該大腸桿菌為Nestl é研究中心(Nestl éResearch Center)的保藏物并由50個株系組成。所述的保藏物代表了引起發(fā)展中國家兒童腹瀉和旅行者腹瀉的大腸桿菌的主要血清型。就本發(fā)明的噬菌體材料而言，隨著包括在此混合物(cocktail)中的單個噬菌體分離物的增加，可獲得60％的覆蓋率。
然而，對除了大腸桿菌種類外的其他共生的腸道細菌沒有威脅。腸道的生態(tài)平衡得以維持(參見實施例3，圖2)。
在噬菌體處理小鼠后，在腸道中不再存在噬菌體。
采用本發(fā)明的噬菌體材料，只附著少于50％的非致病性人腸道大腸桿菌血清型。
因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明涉及至少一種上述的噬菌體分離物在任何食品或藥品或營養(yǎng)增補劑或口服組合物中的用途。食品或藥品的例子是乳、酸乳酪、凝乳、干酪、發(fā)酵乳、基于乳的發(fā)酵產(chǎn)品、冰淇淋、基于發(fā)酵谷物的產(chǎn)品、乳粉、嬰兒制劑或片劑、液體懸浮液、干口服增補劑、濕口服增補劑、干管喂食食品(dry-tube-feeding)和寵物食品?？诜慕M合物可以為膠囊劑、軟膠囊劑、片劑、糊劑、錠劑、膠(gum)、可飲用的溶液或乳劑形式。制備它們的方法是公知常識。
本發(fā)明的組合物還可包含常用的賦形劑，特別是增甜劑、調(diào)味劑或防腐劑。它還可包含益生元(prebiotic)和/或益生微生物。本發(fā)明的組合物可按照大量本領(lǐng)域熟知的技術(shù)中的任何一種技術(shù)配制。
在一個實施方式中，可制備含有至少一種噬菌體的藥物組合物，所述噬菌體的含量為足以在個體中獲得期望效果的量。所述的組合物可以是片劑、液體或干口服增補劑、濕口服增補劑、干管喂食食品、濕管喂食食品等。所述的藥物組合物還將含有載體和賦形劑，該載體和賦形劑適用于將不同性質(zhì)的相應(yīng)活性分子遞送至靶組織。這種類型的載體/賦形劑和其量取決于所述物質(zhì)的性質(zhì)和所考慮的藥物的遞送形式和/或施用方式。應(yīng)意識到，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將基于其自身的知識選擇合適的組分和蓋倫制劑形式。
在另一實施方式中，制備人類食用的食物組合物。該組合物可以是全營養(yǎng)制劑、乳品、冷凍或耐貯存飲料、水、湯、飲食增補劑、肉類替代品、營養(yǎng)棒或糖果。
所述的營養(yǎng)制劑優(yōu)選可腸內(nèi)施用；例如為粉末、液體濃縮物或即食飲料的形式。如果期望制備粉末型營養(yǎng)制劑，將均化的混合物轉(zhuǎn)移到合適的干燥器，例如噴霧干燥器、冷凍干燥器中并轉(zhuǎn)變?yōu)榉勰?br> 在一個優(yōu)選實施方式中，可將噬菌體與溫水一起加到乳制劑中，并可對患有大腸桿菌腸胃炎或沙門氏菌感染或有可能患這種感染的兒童有好處。在北半球的工業(yè)國家，兒科大腸桿菌腹瀉很少見，然而，在諸如墨西哥、巴西、印度和中國等國家卻仍十分普遍。
此外，可將噬菌體用于預(yù)防或治療旅行者的腹瀉。
在北美度假的歐洲旅行者或到中美或Carribean的美國旅行者有高危險性患上ETEC感染。
此外，大腸桿菌感染是人類泌尿系感染的常見病因，在工業(yè)國家也是如此。腸外大腸桿菌分離物的O血清型與腸內(nèi)大腸桿菌株系的O血清型不同。然而，許多T4樣噬菌體的廣泛的宿主范圍使得勿庸置疑地許多泌尿系大腸桿菌菌株可被分離自糞便樣品的T4噬菌體裂解。
在另一實施方式中，可用本發(fā)明的至少一種噬菌體分離物來豐富一般食品。例如發(fā)酵乳、酸乳酪、鮮干酪、凝乳、糖果制品例如甜的或增甜的飲料、糖果棒、早餐谷類薄片或棒、飲料、乳粉、豆制品、非乳發(fā)酵品或用于臨床營養(yǎng)的營養(yǎng)增補劑。
因此，本發(fā)明的噬菌體的使用量可以為至少1.104pfu(噬斑形成單位)/ml，更優(yōu)選106pfu/ml。
在另一實施方式中，可制備寵物食品。事實上，大腸桿菌是狗類腹瀉的主要病因。從狗類分離的EPEC和ETEC株系的血清型與人類的部分重合。狗的腸道中含有的大腸桿菌血清型常引起尿道成片感染(smearinfection)。這種犬類的尿道大腸桿菌分離物與人類腸道外大腸桿菌分離物顯示遺傳關(guān)系緊密。寵物制劑優(yōu)選為完全和營養(yǎng)平衡的寵物食品。其還可為寵物的食品增補劑或為藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明的全營養(yǎng)寵物食品制劑可以采用任何適宜形式，例如粉末、干的粗磨食品或小丸或其他干燥形式、擠出形式、半潮濕或濕形式，例如塊狀或條狀或似布丁樣?？蓪⑵淅鋬龌蛞阅唾A存產(chǎn)品形式提供?？赏ㄟ^常規(guī)方法生產(chǎn)這種寵物食品。
在另一實施方式中，可制備食物輔助劑以提高寵物食品的質(zhì)量?？蓪⑹澄镙o助劑裝入膠囊中或以粉劑形式提供并與主食包裝在一起或與主食分別包裝，并且食物輔助劑可為濕的或干的。作為實例，可將含有本發(fā)明的噬菌體的粉末以粉末形式包裝入小袋內(nèi)或置于凝膠或液體或其他合適的載體中。根據(jù)使用說明，可將這些分別包裝的單元與主食一起提供或以多單元包形式提供以與主食一起使用或用于治療。
此外，口服應(yīng)用本發(fā)明的噬菌體或在家庭中噴灑噬菌體可由此對狗和寵物的主人都有利。
在最后的實施方式中，噬菌體可在食品生產(chǎn)中有益處以減少肉類被大腸桿菌和/或沙門氏菌污染的程度。
以下的實施例只是作為舉例說明目的，且無論如何不應(yīng)理解為限制本申請的主題。除非另有說明，所有的百分比以重量百分比的形式給出。在實施例之前為附圖簡述。
附圖簡述


圖1在T4樣噬菌體NCC-J146.1和NCC-JS94.1.存在下，大腸桿菌K12的生長曲線(OD讀數(shù))。將大腸桿菌K12的培養(yǎng)物培養(yǎng)至OD為0.1并用1％的上述噬菌體感染。每10分鐘采樣。
圖2對4只小鼠的小鼠大腸桿菌菌群進行體內(nèi)研究，監(jiān)測42天。以不同濃度將混合噬菌體(NCC-JS94.1，NCC-JS4，NCC-JSD.1和NCC-JSL.6)加至水中3次(換水3次)。給對照小鼠使用相同的水(同樣換水)但不含有混合噬菌體。每天收集糞便一次或兩次。分離噬菌體混合物并測定滴度，測定大腸桿菌菌群。線條代表正常菌群的平均值。
圖3對無菌小鼠的噬菌體感染。給2只無菌小鼠強迫喂食大腸桿菌K-12并持繼一周將噬菌體NCC-JS94.1以終濃度105pfu/ml加至水中。在整個實驗中始終監(jiān)測糞便中的正常菌群和噬菌體的存在。在第三周，再次給小鼠強迫喂食抗噬菌體的ECOR5。再次將NCC-JS94.1加至水中，收集糞便并檢測大腸桿菌和噬菌體的存在。
圖4在用噬菌體處理4只小鼠后當(dāng)從糞便中不再收集到噬菌體時(圖4A)對小鼠進行尸體解剖，且對噬菌體處理的4只另外的小鼠進行尸體解剖(圖4B)。采集不同部位的腸(十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸)、肝臟和淋巴結(jié)并檢測大腸桿菌和噬菌體的存在。柱形代表每組小鼠的平均值。
實施例實施例1選擇本發(fā)明的噬菌體材料和方法糞便樣品的制備在醫(yī)院中在-20℃冷凍保存糞便樣品并在干冰上運送至洛桑。將融化的糞便樣品(約10g)重懸在TS(8.5g/1 NaCl，1g/1胰蛋白胨)中至終體積30ml。然后將重懸的糞便樣品在50ml Falcon管中以10.000rpm離心15分鐘。將1ml每種糞便通過Millex AP20預(yù)過濾器過濾隨后用0.45umMinisart濾器過濾。由于T4噬菌體對反復(fù)凍融敏感，所以在重懸后將所有的糞便樣品保存在+4℃。
細菌的培養(yǎng)將所有的大腸桿菌株系在含有每升2ml硫胺素(2mg/ml)的Hershey液體培養(yǎng)基上增殖，玻璃管中終體積為5ml并在37℃振蕩(240rpm)過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)后，在培養(yǎng)皿(Hershey瓊脂培養(yǎng)基)中劃線以獲得單菌落。為了避免在液體培養(yǎng)基中系列傳代(這可選擇出突變體)，當(dāng)需要時，每次從3個單菌落起始新培養(yǎng)物。在4℃以穿刺培養(yǎng)物的形式保藏原種培養(yǎng)物。
噬斑分析用200μl新生長的過夜培養(yǎng)物和100μl糞便樣品或細胞裂解物接種，在添加有硫胺素的Hershey瓊脂培養(yǎng)基(該培養(yǎng)基上覆蓋有Hershey頂層瓊脂3.5ml)上獲得噬斑。在37℃過夜培養(yǎng)培養(yǎng)皿。
分離噬斑和噬菌體擴增用牙簽挑取單個噬斑，并接種到添加有硫胺素的5ml Hershey液體培養(yǎng)基中，接種1％新鮮生長的培養(yǎng)物和1％噬菌體裂解物。在240rpm振蕩下在37℃進行培養(yǎng)約5小時。當(dāng)發(fā)生裂解時，加入3滴氯仿并輕輕混合。在室溫下將裂解物放置過夜然后在10000rpm下離心10分鐘。為了獲得噬菌體原種，通過小心避開氯仿回收上清液并轉(zhuǎn)入帶有螺旋帽的玻璃管中。加入3滴新鮮的氯仿并將噬菌體原種保存在4℃。用于噬菌體擴增的株系為K-12或O127K63(B74-9)。對于不同的噬菌體分離物使用下述命名法JS(進行噬菌體研究的Josette Sidoti的首字母)其后為患者的ID號碼。對于從同一個患者獲得的多個分離株，該號碼后為另外的數(shù)字(例如JS61.2)。當(dāng)從患者的第二(康復(fù)期)糞便中獲得第二分離物時，在第二數(shù)字上加上標(biāo)(例如JS65.2′)。對于分離自環(huán)境水中的噬菌體，首字母后分別為D(達卡)或L(洛桑)和噬菌體分離物的標(biāo)識符(例如JSL.4)。
斑點試驗將3.5ml Hershey頂層瓊脂和200μl新生長的大腸桿菌培養(yǎng)物的混合物傾倒在添加有硫胺素的底層Hershey瓊脂上。當(dāng)頂層瓊脂固化后，在其上以順時針方向點8個10μl過濾并提純后的糞便點。在37℃過夜培養(yǎng)。
在試管中裂解5ml的Hershey液體培養(yǎng)基接種1％新生長的培養(yǎng)物。連續(xù)培養(yǎng)3至5小時，此時未感染的對照細胞達到穩(wěn)定生長期。對用噬菌體接種的細胞中的光密度與模擬感染的對照細胞中的光密度進行目測比較。
噬菌體純化為純化T4樣噬菌體，在含有硫胺素的1升Hershey培養(yǎng)基中接種1％K-12，將細胞培養(yǎng)至OD為0.1，然后用大于1的moi(感染復(fù)數(shù))感染。向裂解物中加入NaCl達到終濃度為0.5 M并在4℃孵育1小時。在Sorvall RC5B離心機中以10000rpm(在4℃離心16分鐘)離心后，向上清液中加入聚乙二醇PEG-6000至終濃度為10％。在4℃輕輕攪動下過夜孵育裂解物。通過以10000rpm離心16分鐘回收用PEG沉淀的噬菌體，將得到的沉淀在3ml噬菌體緩沖液(20mM Tris-HCl pH7.4，100mM NaCl，10mM Mg2SO4)中重懸。將重懸的噬菌體沉淀施加到不連續(xù)CsCl梯度(1.35g/ml CsCl，1.53g/ml，1.65g/ml)上。將梯度在SW55轉(zhuǎn)子中用Beckman L8-60M超速離心機以40000rpm在4℃離心3小時。
結(jié)果噬菌體的分離可從臨床材料(例如糞便)或環(huán)境樣品(例如下水道水)中分離大腸桿菌噬菌體。以前的工作顯示從健康個體的糞便樣品僅能很少地分離到噬菌體，噬菌體滴度低，而且大部分分離物是溫和噬菌體(Furuse，K.，1987，環(huán)境中的大腸桿菌噬菌體分布一般考慮，《Phage Ecology》pp.87-124，J.Wiley，紐約)。與此相反，腹瀉患者的糞便樣品中存在噬菌體高發(fā)率，而且比從健康個體的糞便樣品中獲得的噬菌體具有高滴度，而且大部分噬菌體是烈性噬菌體。為了增加分離T4樣噬菌體的可能性，我們對來自急性腹瀉住院的兒童的糞便樣品進行了研究，所述兒童住在達卡/孟加拉國一個大規(guī)模的腹瀉門診部的普通病房中。在表1中總結(jié)了噬菌體篩查的統(tǒng)計學(xué)方面。
表1噬菌體篩查統(tǒng)計學(xué)
注試驗的檢測限在小于3歲的孟加拉國兒童中腹瀉疾病的平均病因輪狀病毒(rotavirus)26％，彎曲菌屬(Campylobacter)26％，大腸桿菌15％，霍亂弧菌O1(V.cholerae O1)7％，其他弧菌9％，志賀氏菌4％，沙門氏菌＜1％。
在3周內(nèi)從157例急性腹瀉患者采集糞便樣品?；颊呤欠沁x擇的并根據(jù)護士能夠采集并保存糞便樣品來完成采樣。對于52個患者獲得了出院后第二糞便樣品。由于能夠排除大腸桿菌引起的腹瀉，排除了其中17個糞便樣品5個患者患有霍亂(通過米泔汁樣糞便中暗視野顯微鏡觀察弧菌而證實)和12個患有志賀氏菌痢疾(以臨床基礎(chǔ)來診斷帶血的、粘液狀糞便)。這兩種病原體合起來占住院患者的11％。該數(shù)據(jù)與這些病原體在該醫(yī)院腹瀉患者中的平均檢出率一致(霍亂弧菌7％，志賀氏菌屬4％)。
當(dāng)在非致病性實驗室大腸桿菌株系K-12上檢測時，19％的糞便樣品被標(biāo)為陽性，檢測極限為30pfu(噬斑形成單位)/g糞便。在所有患者中排泄到糞便中的噬菌體的最大量為5×104pfu/g糞便。然而，僅有4％的患者顯示這么高的糞便噬菌體滴度。稍低百分比的患者顯示能在致病性EPEC株系O127K63上檢測出的噬菌體(14％的檢出率)。僅有4個糞便樣品在實驗室和致病性大腸桿菌株系上為噬菌體雙陽性，而14個只對K-12為陽性，14個只對EPEC株系O127K63為陽性。很明顯，我們用兩種不同的大腸桿菌指示細胞檢測到兩種明顯不同的噬菌體群體，該兩種噬菌體群體在宿主范圍上極少重疊。令人感興趣地，在致病性大腸桿菌指示細胞上14％的噬菌體檢出率與孟加拉國腹瀉患者的糞便樣品中的致病性大腸桿菌株系的平均檢出率密切相應(yīng)(15％)。
還篩查了達卡/孟加拉國的不同來源的水(自來水、排水溝的水、垃圾中的水、運河中的水、池塘中的水、下水道的水、市場上的水、街道上的水、河流中的水、和溝渠水)以檢測噬菌體的存在。從約100個樣品(每種水來源各約10個)，獲得了6種不同的噬菌體并進行了擴增。其中一個來自自來水、3個來自排水溝的水、1個來自下水道的水。洛桑(瑞士)的下水道中的水也產(chǎn)生了6個噬菌體分離物。
在實驗室大腸桿菌株系上，在康復(fù)期糞便樣品中的噬菌體檢出率比在急性糞便樣品中的低(在所研究的52對糞便樣品中，陽性樣品為4比11)。在致病性大腸桿菌株系上，從康復(fù)期和急性糞便樣品中分離到數(shù)量相當(dāng)?shù)氖删w(在16個研究的糞便樣品中，陽性樣品為5比4)。
在K-12細胞上檢測到的所有噬斑均可在液體培養(yǎng)中生長在K-12上進行擴增。噬菌體滴度從2×104至4×1010pfu/ml。中值滴度為109pfu/ml。擴增的滴度與噬斑大小(大、中、小或極微小)、噬斑透明度(渾濁、清澈)、或起始糞便滴度無關(guān)。類似地，在EPEC株系O127K63上檢測到的噬斑可在該致病性大腸桿菌株系上擴增到1-5×108pfu/ml。
引起腹瀉的大腸桿菌株系的靶群體在50個致病性大腸桿菌株系上選擇具有最廣泛宿主范圍的噬菌體分離物，所述的大腸桿菌株系來自從世界范圍內(nèi)的兒童腹瀉患者分離的主要血清型。表2顯示一些所述的株系。這一組株系涵蓋了14種不同的菌體O抗原(菌體O抗原反映脂多糖抗原(LPS)的不同的糖鏈)，以及14種不同的莢膜抗原K。莢膜抗原K亦反映細菌莢膜物質(zhì)的不同多糖組成，另外，我們還具有許多主要的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)血清型，其分離自世界各地的兒童胃腸炎患者和成人旅行者腹瀉患者(表2)。這些ETEC株系代表了另14種不同的O抗原和13種不同的H抗原。H抗原為來自細菌鞭毛的蛋白質(zhì)抗原。根據(jù)ETEC株系產(chǎn)生的腸毒素，可對它們進一步細分。8個株系產(chǎn)生熱不穩(wěn)定性(LT)和熱穩(wěn)定性(ST)腸毒素。2個僅產(chǎn)生熱不穩(wěn)定性腸毒素；4個僅產(chǎn)生熱穩(wěn)定性腸毒素。
表2來自Nestec保藏中心的引起腹瀉的大腸桿菌株系的致病性類型，O-、K-和H-血清型
注第一列給出了大腸桿菌株系的內(nèi)部NRC編號；第二列提供了株系的菌體O、莢膜K或鞭毛H的血清型，黑體O血清型表示該大腸桿菌株系也分離自犬的腹瀉(Sancak，1997)；第三列顯示致病性類型(EPEC致腸病性大腸桿菌；ETEC產(chǎn)腸毒素大腸桿菌；LT、ST為熱不穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性腸毒素)；第四列顯示裂解所示大腸桿菌株系的糞便噬菌體分離物的數(shù)目(檢測了32個糞便噬菌體分離物)。
分離的噬菌體的宿主范圍篩查在第一輪，從腹瀉患者的糞便樣品中分離出32個噬菌體。在來自我們的合并細胞保藏物的50個引起腹瀉的大腸桿菌株系上對這些噬菌體進行系統(tǒng)檢測。在第二輪，獲得具有廣泛宿主范圍的進一步的噬菌體分離物。
宿主范圍檢測涉及大量的噬菌體-細胞組合(N＝32×50＝1600，在50個大腸桿菌株系上)，我們使用斑點試驗來篩查。在這個試驗中，通過在培養(yǎng)皿中的菌苔上點上一滴擴增的噬菌體裂解物，可一次同時檢測8個不同的擴增的噬菌體裂解物。在過夜培養(yǎng)后讀取結(jié)果并且當(dāng)所點區(qū)域上的細菌的生長受到危害或阻止時，將其記為陽性。表3中顯示一些噬菌體分離物的結(jié)果并總結(jié)在表4中。
表3用斑點試驗進行評估的所示大腸桿菌株系對在K-12(K)或O127K63(B)上增殖的糞便噬菌體分離物JS1至JS16感染的敏感性。
表3注第一列中顯示的大腸桿菌株系對第一行中顯示的噬菌體株系的感染的敏感性。噬菌體株系的進一步表征參見表5。第二行提供用于增殖噬菌體的大腸桿菌株系的信息(K非致病性K-12；O致病性O(shè)127K63)?！癤”指示在斑點試驗中生長抑制，空白意味著如對照點(模擬感染)一樣生長。
當(dāng)比較來自同一患者的不同的噬菌體分離物時，獲得了近乎相同的結(jié)果。例如，從患者146的糞便樣品中擴增到2個不同的噬斑。噬菌體NCC-JS146.1在35個細胞上評定為陽性，而噬菌體NCC-JS 146.2感染50個檢測細胞中的36個。除了一個例外，兩個噬菌體在宿主范圍上完全重疊(表3)。在從同一患者的急性和康復(fù)期糞便樣品中分離到的2個噬菌體上也可看到類似的重疊患者65的噬菌體NCC-JS 65.1和NCC-JS 65.2’分別感染26和25個大腸桿菌株系。同樣除了一個例外，在宿主范圍上完全重疊(表3)。來自同一患者的獨立噬菌體分離物間的這種高度的相關(guān)性結(jié)果證明了斑點試驗的可靠性。
對于在非致病性實驗室株系K-12或致病性株系O127:K63上繁殖的噬菌體，宿主范圍顯著不同。前者噬菌體可以在26種(中值)不同的致病性大腸桿菌株系上生長，而后者除了在繁殖細胞上外，僅在一種(中值)致病性株系上生長(表4)。這從患者114的糞便樣品中可得到說明，該樣品為同時在K-12和O127:K63上產(chǎn)生噬菌體的少數(shù)糞便樣品(n＝3)之一。K-12上擴增的噬菌體感染24個致病性株系，而O127:K63上擴增的噬菌體僅感染一個株系(表4)。
表4在達卡的兒童腹瀉患者的糞便樣品中分離的36個噬菌體的特性
注第一列為分離的噬菌體的NRC編號；第二列提供用于繁殖噬菌體的大腸桿菌株系的信息(K非致病性K-12；B致病性O(shè)127K63)；第三列，用NRC編號標(biāo)識的患者(可獲得姓名、性別、年齡、達卡的患者標(biāo)識號，但由于保密性的原因，沒有提供)；第四列，a急性糞便樣品，c康復(fù)期糞便樣品；第五列，噬斑大小g大，m中，s小，pp極微小，t與清澈的噬斑相反為渾濁；第六列，在50個檢測的大腸桿菌株系上用斑點試驗評價的受感染的株系數(shù)目。
在宿主范圍方面，從不同患者分離到的許多噬菌體緊密相關(guān)(例如分離物NCC-JS4、NCC-JS146.1和NCC-JS66感染多達35種細胞，不同的最大數(shù)目是4種細胞；分離物NCC-JS76.2’和NCC-JS12只顯示4種不同)。然而，具有相同的宿主范圍的噬菌體只在宿主范圍非常窄的噬菌體中找到(分離物NCC-JS83.1、NCC-JS89、NCC-JS114.2、NCC-JS83.2和NCC-JS86只感染株系A(chǔ)D-24304和O127K63)。
分離的噬菌體的裂解潛力在培養(yǎng)大腸桿菌株系和噬菌體的試管中以缺乏渾濁度來目測評估細胞裂解。當(dāng)未感染的大腸桿菌株系達到最大混濁度時，讀取實驗結(jié)果。例如噬菌體分離物NCC-JS4、NCC-JS146.1、NCC-JS66和NCC-JS146.2在斑點試驗中對致病性大腸桿菌株系顯示廣泛且非常相似的宿主范圍，但在裂解株系的能力方面卻顯著不同(表5)。噬菌體NCC-JS4裂解50種檢測的大腸桿菌細胞中的13種，而噬菌體NCC-JS146.1、NCC-JS66和NCC-JS146.2僅裂解4至5種大腸桿菌株系，所述株系是被噬菌體NCC-JS10裂解的株系的子集。
表5用在斑點試驗中具有最廣泛宿主范圍的糞便噬菌體(NCC-JS編號)裂解在液體培養(yǎng)物中的所示致病性大腸桿菌株系。

注在第一列中，以NRC編號給出NRC大腸桿菌分離物(對這些株系的其它信息，分別參見表3和表2)。列2至9“+”和“(+)”分別表示所示列的噬菌體可以裂解和部分裂解相應(yīng)行的所示大腸桿菌株系。列10可以裂解所示大腸桿菌株系的不同噬菌體分離物的數(shù)目(檢測的全部噬菌體數(shù)目8)。
在未感染的和被噬菌體感染的K-12細胞生長后進行OD讀數(shù)(
圖1)。觀察到兩種不同類型的OD發(fā)展。在第一種類型中，感染的細胞跟隨未感染細胞的OD發(fā)展直至感染后70至90分鐘。在此相之后，感染細胞的OD降低且在感染后約150分鐘達到背景OD。在第二種類型的感染中(其由大部分噬菌體顯示)，噬菌體感染的細胞顯示出很早就偏離了未感染對照細胞的OD發(fā)展。在感染后約190分鐘觀察到下降至背景水平(
圖1)。
噬菌體的純化用6種不同的噬菌體接種1升體積的K-12培養(yǎng)物產(chǎn)生噬菌體滴度約6×107至1010噬斑形成單位(pfu)/ml。用聚乙二醇沉淀來自裂解物的噬菌體，用CsCl密度梯度離心進一步純化所獲得的噬菌體沉淀?；厥瘴挥贑sCl梯度中的噬菌體帶，進行透析以從其中除去鹽溶液。
下表以監(jiān)測病毒感染力的回收量的方式記載了所述噬菌體純化方法的效率。用噬菌體NCC-JS10觀察到噬菌體感染力的最高起始滴度，然而，這種噬菌體幾乎是最難純化的。噬菌體回收率僅為起始感染物質(zhì)的0.3-5％。對于其他噬菌體，常規(guī)為至少10％回收率?；厥章士筛哌_粗裂解物中起始感染力的40％。
表6在聚乙二醇沉淀(PEG)后及在Cs密度梯度離心(CsCl)及透析后T4樣噬菌體的回收
注第一列標(biāo)識噬菌體分離物，獨立實驗的結(jié)果以括號中的數(shù)字區(qū)分開；第二列顯示以噬斑形成單位表示的1升細胞裂解物中的噬菌體總量；第三列提供了PEG沉淀中的噬斑形成單位的總量，在括號中顯示相對于裂解物中的量的百分比回收率；第四列提供在從CsCl密度梯度離心分離的經(jīng)透析的噬菌體帶中的噬斑形成單位的總量，括號中顯示相對于裂解物中的量的百分比回收率。
實施例2具有170-kb基因組大小的噬菌體的表征材料和方法脈沖場電泳(PFGE)將含有106噬菌體形成單位的所示噬菌體的1％瓊脂糖的PFGE塊在裂解緩沖液(0.05M EDTA，10mM Tris pH 8.0，1％SDS和50μg蛋白酶K)中孵育過夜并在10ml TE(10mM Tris pH 8.0，1mM EDTA)中洗滌3次，1小時。通過在1％瓊脂糖低溶點膠(0.5％TBE45mM Tris-硼酸鹽，1mMEDTA)中電泳來分析所述的塊，所述的電泳條件為6V/cm，14℃，電泳20小時，脈沖時間為1-20秒。所述的膠用溴化乙錠(0.5μg/ml)染色30分鐘。
DNA純化純化的噬菌體在37℃用終濃度為1mg/ml的蛋白酶K處理2小時并加入3M乙酸鈉pH4.3。DNA用苯酚-氯仿提取兩次并用2倍體積的乙醇沉淀。在離心后，用70％乙醇洗滌所述的沉淀并在50ml TE中重懸。按照生產(chǎn)商提供的說明用限制性酶消化DNA。
電子顯微鏡法將一滴噬菌體懸液滴加到formvar-碳包被的銅載網(wǎng)上5分鐘，用移液器移走懸液并立即用溶液A和B的混合液代替(A2％鉬酸銨，pH 7.0，；B溶于蒸餾水的7.5mg桿菌肽)。1分鐘后，用濾紙去除液體。于80kV在Philips CM12透射電子顯微鏡中檢測所述的載網(wǎng)(放大倍數(shù)176′000×或224′000×)。
結(jié)果選擇來自不同患者的12個糞便樣品用于進一步特性描述，所述樣品顯示具有170-kb基因組的噬菌體。我們通過電子顯微鏡研究了這些噬菌體的形態(tài)學(xué)，所有的噬菌體都屬于具有長的可收縮尾的肌尾病毒科。明顯與熟知的大腸桿菌噬菌體T4在形態(tài)學(xué)上非常相似。例如，伸長的頭部約110nm乘75nm。頸部將頭與尾鞘分開。尾鞘由環(huán)狀亞結(jié)構(gòu)構(gòu)成，長約95nm，寬約18nm。尾以基板結(jié)構(gòu)結(jié)束，該基板結(jié)構(gòu)上結(jié)合有短的尾刺和長的尾絲。尾絲約150nm長并且約在纖維中部的關(guān)節(jié)處彎折。觀察到具有40nm可收縮尾鞘的噬菌體。在這些噬菌體中，內(nèi)部尾管延伸超出可收縮的尾鞘。不同的負染色法選擇性地揭示出這些噬菌體的各種形態(tài)學(xué)特征。例如，尾鞘的環(huán)狀結(jié)構(gòu)和尾收縮后其結(jié)構(gòu)的改變用乙酸雙氧鈾染色最宜觀察，而尾絲用磷鎢酸負對比染色看得更好。偶爾，在頸部可見頸須。
使用基于DNA的技術(shù)來區(qū)分在當(dāng)前調(diào)查中分離的T4樣噬菌體。T4噬菌體含有葡糖基化羥甲基胞嘧啶而不是胞嘧啶。這種修飾使T4噬菌體對多數(shù)限制性酶消化具有抗性。已知僅有少數(shù)酶可剪切T4 DNA(EcoRV、NdeI、PacI、SwaI、SspI和SphI)。然而，在從不同患者選擇的9個T4樣噬菌體分離物中，沒有一個被EcoRV、NdeI、SwaI或SphI消化，僅有2個被SspI消化，而所有的至少部分被PacI消化。
在下面的步驟中，我們用標(biāo)記的T4 DNA作為探針在Southern印跡上檢測了PacI消化的噬菌體DNA。在高嚴(yán)格雜交條件下，一些分離物與T4探針顯示了廣泛的交叉雜交，而其他的顯示較弱的交叉雜交或與T4缺乏DNA同源性。
使用引物對(FR60和FR61)利用PCR確認了這些Southern雜交，所述的引物對來自用于診斷T4-型噬菌體的T-偶數(shù)亞群(Repoila et al 1994genomic polymorphism in the T-even bacteriophages.EMBO J 134181-4192)的T4基因32序列。在所述印跡上與T4 DNA交叉雜交的噬菌體在PCR分析中顯示清晰的陽性PCR結(jié)果，而不與T4交叉雜交的噬菌體分離物不顯示PCR帶，或PCR帶微弱。然后針對基因32的PCR產(chǎn)物為陰性的噬菌體分離物用基于一組引物(引物MziaI和caps8)的PCR分析法再次進行檢測，所述的引物位于T4基因23序列中，可用于檢測T4型噬菌體的pseudo T-偶數(shù)和schizo T-偶數(shù)亞群以及T-偶數(shù)(Tetard等2001，多樣的T4型噬菌體的主要頭尾基因的系統(tǒng)發(fā)生，J.Bacteriol.183(1)358-366)。除了2種噬菌體分離物外，其余的所有噬菌體分離物都產(chǎn)生鑒別性g23擴增產(chǎn)物(表7)。所述的例外為糞便分離物JS98和瑞士下水道水分離物JSL.3。在電子顯微鏡下，兩種噬菌體都顯示相當(dāng)傳統(tǒng)的T4樣形態(tài)學(xué)。在Southern印跡中，JSL.3與另一瑞士下水道水分離物JSL.5強烈交叉雜交，但是與其他幾種噬菌體(包括T4)僅微弱交叉雜交。JSL.5與許多分離物起微弱反應(yīng)，但明顯不與T4起反應(yīng)。
表7基因32和基因23鑒別性PCR試驗的總結(jié)
實施例3用本發(fā)明的噬菌體進行的體內(nèi)實驗材料和方法試驗動物使用8周齡的C3H雄性小鼠(除了另有提示，5個一組)用于感染實驗。把每只小鼠放在具有過濾蓋(filtered-top)的籠子中。飲用的水使用無菌Vittel。每天收集一次糞便并將其重懸在1ml PBS(磷酸緩沖鹽水)中。為了對大腸桿菌進行計數(shù)，將10進制稀釋的重懸糞便放在Drigalski瓊脂(Biorad)上。將噬菌體加入飲用的水中。過濾0.5ml重懸糞便并對噬菌體進行計數(shù)。當(dāng)在水中還存在噬菌體時處死小鼠并進行尸體解剖。取出不同的器官(結(jié)腸、十二指腸、回腸、空腸、淋巴結(jié)和肝臟)并檢測大腸桿菌和噬菌體的存在。
在小鼠模型中體內(nèi)噬菌體混合物的活性在前兩周，先使用正常的水然后使用無菌Vittel。在第三周，在前2天，以終濃度為103噬斑形成單位(pfu)/ml向飲用水中加入4種T-4樣噬菌體(JS94.1、JSD.1、JS4和JSL.6)的混合物，然后以105pfu/ml加入直至本周結(jié)束。在第四周，提供無菌Vittel。以終濃度105pfu/ml第二次向水中加入噬菌體，然后提供無菌水，最后為107pfu/ml噬菌體。在整個實驗中始終監(jiān)測噬菌體。
噬菌體的劑量反應(yīng)效果如前所述，交替地給予水和同樣的噬菌體。使用4只小鼠，每只接受單一濃度的噬菌體。第一只小鼠接受的噬菌體終濃度為103pfu/ml，第二只小鼠接受的噬菌體終濃度為104pfu/ml，第三只小鼠接受的為105pfu/ml，最后一只接受的為106pfu/ml。在整個實驗中始終監(jiān)測噬菌體。
使用無菌小鼠的噬菌體感染使用8周齡的C3H無菌雄性小鼠。在整個實驗中使用無菌Vittel作為飲用水。使用4只小鼠，其中2只被迫食用大腸桿菌K12(0.5ml，濃度為108cfu/ml)。每天收集一次糞便并在Drigalski平板上對大腸桿菌細胞進行計數(shù)。1周后，以濃度105pfu/ml喂給噬菌體。每天采集4次糞便。重懸的糞便稀釋液放在Drigalski上并在過濾后對噬菌體進行計數(shù)。3天后，喂給水并在接下來那周的開始，第二次強迫喂食大腸桿菌ECOR5。在同樣的情況下，喂給噬菌體并用與上述相同的方法處理重懸的糞便。
結(jié)果在第一步中，研究了大腸桿菌的正常菌群。給5只鼠喂食正常的水兩周然后使用無菌Vittel。每天收集糞便然后重懸，在選擇性培養(yǎng)基中對大腸桿菌細胞進行計數(shù)。在常規(guī)小鼠中，我們發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的正常菌群在105至107cfu/g之間變化(圖3)。黑線顯示的平均值是線性的(R2＝0.0002)，為106cfu/g，這與Poulsen等獲得的結(jié)果是一致的(1994，從rRNA原位雜雜推出的小鼠大腸中大腸桿菌的空間分布，Infect.Immun.62(11)5191-5194)。兩周后，喂給直接在飲用水中稀釋的T4樣噬菌體混合物。持繼幾天，向水中加入的濃度為103pfu/ml并以103pfu/ml的濃度從糞便中回收到噬菌體，顯示噬菌體可以通過腸道而存活。大腸桿菌正常菌群沒有受噬菌體的存在影響。甚至如果將濃度提高到105pfu/ml持繼一周，大腸桿菌還約為106cfu/g并且從糞便中回收的噬菌體在105至106pfu/g之間。當(dāng)僅喂給無菌Vittel水時，從糞便中不再回收到噬菌體。當(dāng)將噬菌體分別以終濃度105pfu/ml和107pfu/ml兩次再喂給小鼠時，也獲得了同樣的觀察結(jié)果。從糞便中回收的噬菌體的量與接受的噬菌體成比例，顯示噬菌體在小鼠腸道中幾乎不或沒有發(fā)生擴增。當(dāng)小鼠一旦飲食純水，從糞便中不能回收到噬菌體。大腸桿菌正常菌群未改變，意味著在腸道中存在的噬菌體沒有影響該菌群。當(dāng)在腸道中存在噬菌體時，進行了尸體解剖，在圖4B中顯示了這些結(jié)果。采集不同的器官。發(fā)現(xiàn)噬菌體主要在結(jié)腸和十二指腸，而在淋巴結(jié)和肝臟中沒有發(fā)現(xiàn)噬菌體。這提示噬菌體不進入血液系統(tǒng)。在常規(guī)小鼠中，大腸桿菌的存在水平非常低，因為僅在結(jié)腸和回腸中觀察到幾個細胞。
在無菌小鼠中的裂解活性在無菌小鼠模型中檢測了噬菌體的感染性，使大腸桿菌K12在2個8周齡的C3H無菌雄性小鼠中建群。獲得水平為108cfu/g，該水平比在常規(guī)小鼠中的水平高，但對于無菌小鼠是正常的(Poulsen等)。在飲用水中以105pfu/ml的濃度加入噬菌體時，在半天內(nèi)，在糞便中回收到的確高的噬菌體濃度，顯示噬菌體在腸道中裂解K-12并擴增。在該半天內(nèi)，大腸桿菌的水平劇烈下降。一天后，噬菌體仍處于高水平，而大腸桿菌還能存活并保持在濃度為105cfu/g。甚至如果從水中去除噬菌體，在糞便中還存在噬菌體，在3天內(nèi)觀察到降低2個對數(shù)(log)。
在強迫喂食ECOR5后(該ECOR5為從人類正常菌群中分離的大腸桿菌)，高水平的大腸桿菌再次在小鼠中建菌(約1010cfu/g)。ECOR5不受在本實驗中已使用的噬菌體JS94.1的影響，鑒于該原因，建菌快并且穩(wěn)定。甚至當(dāng)將噬菌體再次加入飲用水中，細胞計數(shù)保持相同但噬菌體滴度達到喂給小鼠的水中的濃度。
當(dāng)在腸道中不再存在噬菌體時，進行尸體解剖，圖4A顯示了結(jié)果。大腸桿菌似乎主要定居在結(jié)腸和腸道的一小部分。還測定了噬菌體滴度且在檢測的任何器官中均沒有發(fā)現(xiàn)噬菌體(未顯示數(shù)據(jù))。
在消化道-腸道中存活的不同噬菌體交替地，喂給無菌Vittel一周，在接下來的一周喂給終濃度為107pfu/ml的噬菌體。檢測了4種不同的噬菌體(分別為JS4、JSD.1、JSL.6和JS94.1)。用噬菌體處理4只小鼠。將最后一只小鼠作為對照，并只接受無菌Vittel水。在整個實驗中始終監(jiān)測噬菌體。
在本實驗中，我們將組成前面試驗的混合物的T4樣噬菌體一個接一個喂給5只小鼠。以相同的方式處理所有的噬菌體。向水中加入噬菌體并在1天后以喂給的相同濃度在糞便中回收到噬菌體。當(dāng)從水中去除噬菌體后時，在24小時后，在糞便中不再發(fā)現(xiàn)噬菌體。無論在飲用水中使用何種噬菌體，均獲得了相同的結(jié)果。
如果給4只不同的小鼠喂給4種不同濃度的這些噬菌體，可觀察到劑量反應(yīng)效果。當(dāng)使用的濃度非常低(103pfu/ml)時，在糞便中存在噬菌體，但是不穩(wěn)定。當(dāng)將該濃度提高1個對數(shù)時，在整個處理過程中糞便中始終存在噬菌體且以較高的水平被回收。當(dāng)再多1個和2個對數(shù)時，獲得相同的觀察結(jié)果。
實施例4干寵物食品飼料混合物由下列物質(zhì)構(gòu)成約58重量％的玉米、約5.5重量％玉米面筋、約22重量％雞肉粗粉、2.5％干菊苣、106pfu/ml噬菌體混合物、鹽、維生素和構(gòu)成其余部分的礦物質(zhì)。將所述的飼料混合物裝入預(yù)處理器(preconditioner)并使其潤濕。然后將變濕的飼料裝入擠出機-蒸煮機并使其膠化。迫使離開擠出機的膠化基質(zhì)通過模具并被擠出。將擠出物切成適于喂給狗的塊，在約110℃干燥約20分鐘，并冷卻以形成塊。
這種干燥的狗食能夠預(yù)防或治療寵物中由諸如大腸桿菌或沙門氏菌等致病性腸桿菌科細菌引起的感染性疾病，例如胃腸炎、腹瀉或泌尿疾病。
實施例5營養(yǎng)制劑制備一種營養(yǎng)組合物，其中每100g粉末包含15％蛋白水解物、25％脂肪、55％碳水化合物(包括麥芽糖糊精37％、淀粉6％、蔗糖12％)、痕量維生素和少量元素以滿足每日需要、2％礦物質(zhì)和3％水分和106pfu/ml噬菌體混合物。將13g這種粉末在100ml水中混合。獲得的制劑特別旨在用于預(yù)防人類中的胃腸炎、腹瀉或泌尿疾病。
權(quán)利要求
1.宿主范圍廣泛的噬菌體分離物制品，該制品對諸如大腸桿菌和或沙門氏菌菌株等致病性腸桿菌科的細菌具有實質(zhì)性的裂解潛力，該制品是烈性的并且是非毒性的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的噬菌體分離物，該分離物為肌尾病毒科噬菌體，優(yōu)選T4樣噬菌體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的噬菌體分離物，其中所述的分離物選自NCC-JS9、NCC-JS31、NCC-JS102.2、NCC-JS150、NCC-JS1、NCC-JS10(再命名為NCC-JS4)(CNCM I-2763)、NCC-JS22、NCC-JS32、NCC-JS114.1、NCC-JS140.1、NCC-JS146.1、NCC-JS65.1、NCC-JS65.2’、NCC-JS76.2′、NCC-JS12、NCC-JS152、NCC-JS66、NCC-JS102.1、NCC-JS140.2、NCC-JS146.2、NCC-JS61.2、NCC-JS61.3、NCC-JS114.3、NCC-JS35(再命名為NCC-JS94.1)(CNCM I-2764)、NCC-JS94.2、NCC-JS98、NCC-JS104、NCC-JS94.3、NCC-JS110.1、NCC-JS110.2、NCC-JS110.3、NCC-JS1.4(再命名為NCC-JSD.1)(CNCM I-2765)、NCC-JSD.3、NCC-JSD.2、NCC-JSD.4、NCC-JSD.5，、NCC-JS142、NCC-JS148和NCC-JSL.1、NCC-JSL.2、NCC-JSL.3、NCC-JSL.4、NCC-JSL.5、NCC-JSF(再命名為NCC-JSL.6)(CNCM 1-2766)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的噬菌體分離物或其混合物，該分離物或其混合物能夠預(yù)防或治療人類或動物中由致病性腸桿菌科細菌引起的感染性疾病，諸如大腸桿菌或沙門氏菌感染，例如胃腸炎、腹瀉或泌尿疾病。
5.至少一種權(quán)利要求1至4任一項所述的噬菌體分離物制品在制備用于預(yù)防或治療人類或動物中由諸如大腸桿菌或沙門氏菌等致病性腸桿菌科細菌引起的感染的食品或?qū)櫸锸称贰I養(yǎng)組合物、增補劑或藥物組合物中的用途。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其中所述的感染為人類或動物中的胃腸炎、腹瀉或泌尿疾病。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的用途，其中所述噬菌體分離物的量至少為1×104pfu(噬斑形成單位)/ml。
8.一種食品或?qū)櫸锸称?、營養(yǎng)組合物、增補劑或藥物組合物，其包含至少一種權(quán)利要求1至4任一項所述的噬菌體分離物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述噬菌體分離物或噬菌體分離物的混合物的含量至少為約1×104pfu(噬斑形成單位)/ml。
10.一種預(yù)防或治療人類或動物中由諸如大腸桿菌或沙門氏菌等致病性腸桿菌科細菌引起的感染的方法，該方法包括給個體施用有效量的至少一種權(quán)利要求1至4任一項所述的噬菌體分離物或含有其的組合物。
11.一種在兒童中治療或預(yù)防大腸桿菌引起的胃腸炎的方法，該方法包括施用含有至少一種權(quán)利要求1至4任一項所述的噬菌體分離物的組合物。
12.一種在個體中治療或預(yù)防旅行者腹瀉或ETEC感染的方法，該方法包括施用含有至少一種權(quán)利要求1至4任一項所述的噬菌體分離物的組合物。
13.一種治療或預(yù)防人類或動物的泌尿感染的方法，該方法包括施用含有至少一種權(quán)利要求1至4任一項所述的噬菌體分離物的組合物。
14.一種在寵物中治療或預(yù)防大腸桿菌引起的腹瀉的方法，該方法包括施用含有至少一種權(quán)利要求1至4任一項所述的噬菌體分離物的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及噬菌體分離物，該噬菌體分離物對諸如大腸桿菌和/或沙門氏菌株系等致病性腸桿菌科的細菌具有強烈的裂解活性。本發(fā)明還涉及所述的噬菌體分離物用于各種人類或?qū)櫸锸称分幸灾委熁蝾A(yù)防由諸如大腸桿菌或沙門氏菌等致病性腸桿菌科細菌引起的細菌性疾病的用途，尤其是用于兒科腸胃炎或沙門氏菌感染的噬菌體治療。本發(fā)明還涉及由所述的噬菌體分離物制備的人類或?qū)櫸锸称贰?br> 文檔編號A23K1/17GK1602353SQ02824839
公開日2005年3月30日 申請日期2002年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月13日
發(fā)明者H·布呂索, S·謝努菲, J·西多蒂, A·布呂坦 申請人:雀巢產(chǎn)品有限公司