專利名稱：菲牛蛭的養(yǎng)殖方法及水蛭素的提取技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)用水蛭的養(yǎng)殖及水蛭素的提取方法，特別是菲牛蛭的養(yǎng)殖及水蛭素的提取方法。
背景技術(shù)：
水蛭素是從吸血水蛭(螞蟥)中提取的一種抗凝血物質(zhì)。水蛭，首載于我國《神農(nóng)本草經(jīng)》，后在《本草綱目》和《中國動物藥》等專著中均有收載。1884年，Haycraft發(fā)現(xiàn)水蛭提取物有抗凝血作用，1955年，MarkwMdt指出這種抗凝血物質(zhì)為蛋白質(zhì)，定名為水蛭素，1986年后基因重組水蛭素問世，為水蛭素的深入研究和臨床應(yīng)用開辟了廣闊前景。根據(jù)文獻(xiàn)記載，天然水蛭素是由65個氨基酸組成的多肽，其作用有以下幾個方面1、具有抗凝血作用。不同來源和結(jié)構(gòu)的水蛭素，其抗凝血機(jī)制不盡相同。因此天然水蛭素可從多個環(huán)節(jié)影響血液凝固和血栓形成。2、抗凝血酶作用。水蛭素的抗凝血酶作用見于歐洲醫(yī)用水蛭(hiNmedic5nalis)Llj、亞洲水牛蛭(菲牛蛭)和印度水蛭等。由這些水蛭中提取的水蛭素含6個分布相似的半胱氨酸殘基，具有相似的三維結(jié)構(gòu)其N端由二硫鍵形成緊密結(jié)構(gòu)，且與凝血酶活性位點(diǎn)結(jié)合；其C端富含酸性氨基酸殘基，則與凝血酶的纖維蛋白原結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合；中間區(qū)的氨基酸殘基協(xié)調(diào)作用。這種結(jié)構(gòu)可以達(dá)到水蛭素與凝血酶呈1∶1的比例形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而對凝血酶有高度特異的抑制作用，起到抑制凝血酶的抗凝血作用。3、抗血小板作用。1992年，Como等從墨西哥水蛭中提取出一種稱為菲牛蛭抗血小板蛋白質(zhì)，具有特異性抑制膠原誘導(dǎo)血小板聚集的作用，而對其他誘導(dǎo)劑(如血、凝血酶等)誘導(dǎo)血小板聚集無抑制作用。1994年，Kmel等從北美水蛭中提取一種含39個氨基酸殘基的多肽，其三維構(gòu)象與水蛭素很相似，C端的RGD序列與血小板膜GPIIb/IIIa相識別，從而抑制了纖維蛋白原介導(dǎo)的血小板聚集作用。4、降解纖維蛋白(原)作用。1984年，Malin-conlco等從亞馬遜巨型水蛭中提取一種稱為hementin的物質(zhì)。這種物質(zhì)可以降解纖維蛋白(原)的特定肋鏈，具有抗凝血酶活性并能顯著抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，對于預(yù)防血栓性疾病的發(fā)生有明顯的作用。
水蛭素的臨床應(yīng)用，目前，由于重組水蛭素的問世，臨床上多用于治療不穩(wěn)定性心絞痛(USA)、急性心肌梗死(AMI)、血管成形術(shù)、術(shù)后血栓形成、血液透析、體外循環(huán)、彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)，以及用于抗腫瘤等。
水蛭素干燥狀態(tài)下較穩(wěn)定.室溫下在水中可穩(wěn)定存在6個月，80℃下加熱15分鐘不被破壞。pH值升高則穩(wěn)定性下降，在0.1moL HCl或0.1mol NaOH中可穩(wěn)定15min?？档鞍酌糕c和蛋白酶不破壞水蛭素的活性，而番木瓜蛋白酶胃蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶A則可使之失去活性。
在水蛭養(yǎng)殖方面，目前為了獲得水蛭素，各地都在養(yǎng)殖水蛭，水蛭的物種有多種，如寬體金線蛭、歐洲醫(yī)蛭、日本醫(yī)蛭、菲牛蛭、亞馬遜巨型水蛭等，我國養(yǎng)殖的物種大多為寬體金線蛭，主要是因?yàn)閷掦w金線蛭體形大容易飼養(yǎng)，經(jīng)過科技文獻(xiàn)檢索了解到，目前我國內(nèi)有不少地方辦起了水蛭養(yǎng)殖場，如北京、江蘇吳江、鄭州市、山東曹縣等，但他們養(yǎng)殖的物種大多為寬體金線蛭，飼養(yǎng)寬體金線蛭是以投喂活螺獅為主，輔以蚯蚓，昆蟲的幼蟲等。
菲牛蛭(金邊螞蟥)是我國華南尤其是廣西、廣東、海南等地區(qū)和一些東南亞國家特有的水蛭物種，品質(zhì)最優(yōu)，在廣西分布較為廣泛，該物種所含水蛭素抗凝血物質(zhì)比其它品種水蛭特別是比目前文獻(xiàn)報(bào)道的寬體金線蛭含抗凝血物質(zhì)含量高得多，藥用效果好，寬體金線蛭不含水蛭素。由于菲牛蛭在天氣寒冷的地區(qū)不容易生長，飼養(yǎng)也很不容易，目前未見有養(yǎng)殖菲牛蛭的文獻(xiàn)記載。
在水蛭素的提取方面，目前水蛭素有許多方法，國內(nèi)的水蛭素提取，主要采用將水蛭養(yǎng)殖到一定程度后將其絞碎或者干燥后用化學(xué)藥劑將其提取，這種方法浪費(fèi)資源，而且提取工藝復(fù)雜。
《水生生物學(xué)報(bào)》1997年第2期報(bào)道，1955年德國的Markwardt首次從醫(yī)蛭中分離出較純的水蛭素，此后水蛭素的純化和標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)日趨完善。迄今已有不少有關(guān)的研究報(bào)道和專利，絕大多數(shù)工作是利用歐洲醫(yī)蛭的頭部甚至整個身體做原料，經(jīng)乙醇脫水，然后加丙酮沉淀等一系列步驟而得到水蛭素粗制品的。1970年Markwardt采用乙醇分級沉淀、陽離子交換、凝膠過濾以及陰離子交換等步驟獲得了水蛭素純品。1985年WdsmaM和Marhyardt改進(jìn)了純化方法，采用離子交換與親合色譜相結(jié)合而獲得了高純度的水蛭素。1986年Johmnes等人報(bào)道了一種五步純化法，其中使用了高效液相色譜新技術(shù)。
中國專利也公開了一些水蛭素的提取方法，中國專利<申請?zhí)?amp;gt;92107076<發(fā)明名稱>醫(yī)用天然水蛭素的提取方法，是將將水蛭洗凈去除泥土等雜質(zhì)后，整體搗碎成泥漿狀，再把水蛭漿加溫至60-80℃，并維持2-3分鐘，在加溫后的水蛭漿中加入10％的冰醋酸調(diào)整PH值在4.4-4.6，隨即冷卻至25-30℃，再加10％Na2CO3調(diào)整PH值在6-7，水蛭漿經(jīng)離心收集母液，殘?jiān)尤?.9％的生理鹽水先后浸提2-3次，收集全部浸提液，然后把母液透析36小時，每隔12小時換水一次，透析液用95％以上乙醇沉淀，先加95％乙醇使其含量為61％，放置12小時，傾去上清液，再加同樣濃度的乙醇使其含量為85％，放置24小時，得到水蛭素沉淀，(7)將沉淀低溫干燥得粗制品，(8)粗制品用適量二次蒸餾水溶解。
<申請?zhí)?amp;gt;95105650<發(fā)明名稱>動物血水蛭水解法及其水蛭水解血，是關(guān)于動物血的新的利用方法，使食血水蛭充分吸取動物血，數(shù)分鐘至數(shù)小時后用物理或化學(xué)方法使血液從水蛭體內(nèi)流出，收集流出的橙紅色血液體，再從血中提取水蛭素。該法獲得的水蛭水解血有含中小分子量蛋白質(zhì)或肽的動物血，還含有水蛭素、消化血液的纖維蛋白酶(原)、透明質(zhì)酸酶及其它目前難以測定的有用的水蛭分泌物。本法能有效降解動物血并使之含有醫(yī)用價(jià)值的水蛭素、透明質(zhì)酸酶等水蛭分泌物，水蛭還可多次使用，提高其利用率。
技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明人在經(jīng)過幾年的研究和探索，了解到菲牛蛭(金邊螞蟥)所含水蛭素抗凝血物質(zhì)比其它物種水蛭特別是比目前文獻(xiàn)報(bào)道的寬體金線蛭含抗凝血物質(zhì)含量高，藥用效果好的優(yōu)點(diǎn)后，經(jīng)歷多次試驗(yàn)后，終于摸索出人工飼養(yǎng)菲牛蛭和從菲牛蛭中提取水蛭素的方法，取得了較好的經(jīng)濟(jì)效益。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下1、菲牛蛭的人工飼養(yǎng)通過引進(jìn)優(yōu)良種源或野外捕捉到健壯的菲牛蛭、放在水體干凈的水池或池塘中進(jìn)行人工分級分段馴化、喂養(yǎng)，并維持適宜的溫度，進(jìn)行人工繁殖，待飼養(yǎng)到一定程度，即可提取水蛭素。
以上所述的人工分級分段馴化、喂養(yǎng)的方法是把繁育種苗和飼養(yǎng)小苗放在小水池中，這樣由于面積比較小，可以比較細(xì)致的喂養(yǎng)和料理，可以提高繁育和生長率。等到生長比較大，菲牛蛭可以自己覓食時再放到大面積的池塘里養(yǎng)殖。也可以繼續(xù)把它們分類放在小池里，進(jìn)行工廠化養(yǎng)殖，一般每立方米水可放成品600-1500條左右，如果要增加在飼養(yǎng)過程中可以采用流動的水和通過加氧措施，冬天要注意保溫。
以上所述的人工分級分段馴、喂養(yǎng)的方法還包括喂食，包括用0.05-0.2％鈉鹽處理得到的新鮮牛血、豬血、羊血等，所述的鈉鹽包括乙酸鈉、磷酸鈉、檸檬酸鈉、精氨酸鈉、賴氨酸鈉、抗壞血酸鈉、胱氨酸鈉，主要使血液不凝固，在喂食過程中將不凝固的血液放到盛有海棉的碟子上，然后將碟子放到浮在養(yǎng)殖池水中的泡沫板上，同時一邊攪動池水，讓菲牛蛭吸引過來覓食。也可將已經(jīng)加有藥品的腥畜血液用牛小腸、豬小腸或人工腸衣裝好，然后用細(xì)線將小腸捆成每節(jié)2-3厘米的節(jié)狀直接防入養(yǎng)殖水中喂養(yǎng)。
以上所述的人工繁殖包括到一定時候需要加入野生的優(yōu)良品種交配，使之不產(chǎn)生近親繁殖，規(guī)模化養(yǎng)殖以及水蛭素提取等步驟完成。在野外捕捉到的菲牛蛭經(jīng)過鑒定后，將它放在小水池里，使其適應(yīng)新的環(huán)境，然后通過人工分級分段飼養(yǎng)。
2、從菲牛蛭中提取水蛭素上述提到，目前提取水蛭素的方法大多采用將水蛭整體打漿或曬干然后用溶劑提取，雖然文獻(xiàn)介紹了使食血水蛭充分吸取動物血，數(shù)分鐘至數(shù)小時后用物理或化學(xué)方法使血液從水蛭體內(nèi)流出，收集流出的橙紅色血液體，再從血中提取水質(zhì)素，這種方法仍然復(fù)雜，成本也較高。
本發(fā)明提取水蛭素的方法包括菲牛蛭原料選擇和清洗，采用化學(xué)物質(zhì)刺激鮮活菲牛蛭使其分泌出唾液，然后對其唾液過濾，再將水蛭素粗品進(jìn)行深加工得到符合醫(yī)用的水蛭素。
以上所述的菲牛蛭原料選擇和清洗是從飼養(yǎng)池內(nèi)撈出成熟、健康的菲牛蛭放到盛有清水的池子中，每隔2天換水清洗一次，不喂食，如此保持10-30天，最后用蒸餾水浸泡10-30分鐘。
以上所述的菲牛蛭喂飽誘導(dǎo)物質(zhì)和擠壓的方法是將清洗干凈的菲牛蛭用誘導(dǎo)物質(zhì)充分喂飽菲牛蛭，然后對菲牛蛭進(jìn)行擠壓使其分泌出唾液(水蛭素粗品)，所采用的所采用的誘導(dǎo)物質(zhì)包括無機(jī)鹽、有機(jī)酸和濃度較低的無機(jī)酸，包括乙酸、鹽酸、磷酸、檸檬酸、精氨酸、賴氨酸、抗壞血酸、胱氨酸、氯化鈉、氯化鉀、碳酸鈉、磷酸鈉、磷酸二氫鉀的一種或兩種、兩種以上的混合物，其濃度為0.1-3％，使水溶液的PH在4.5-6.8之間。具體方法是先配置好純凈的混合水溶液，讓菲牛蛭充分吃飽，然后對其進(jìn)行擠壓，使其分泌出唾液，每條鮮活菲牛蛭可以反復(fù)提取6-7次，每次能提取水蛭素粗品6-7毫升左右。
將水蛭素粗品進(jìn)行深加工包括分離和純化和陰離子交換柱層析、凝膠過濾柱層析；分離和純化的方法是將從上述菲牛蛭體內(nèi)提取出的唾液腺分泌物提取液中加4倍置冰箱中預(yù)冷的含水15％的丙酮，攪拌后置冰箱中過夜，吸出上清丙酮并離心，在沉淀中加入預(yù)冷的三氯乙酸使其溶解，離心除去殘?jiān)蠘舆M(jìn)行柱層析。
陰離子交換柱層析的方法是取適量DEAE-C加蒸餾水使其膨脹，按常規(guī)方法依次用NaoH-NaCl混合液、HCl及NaOH-NaCl混合液各浸泡30分后用蒸餾水洗滌至中性。裝柱至所需高度，用檸檬酸一檸檬酸鈉緩沖液平衡，5ml的唾液腺分泌物濃縮液或上述三氯乙酸溶液上樣進(jìn)行梯度洗脫并用記錄儀繪出洗脫曲線，分段收集洗脫液，經(jīng)檢測，將有活力部分集中于透析袋中用甘油濃縮，再用雙縮腮法測總蛋白含量，繼續(xù)以下的柱層析。
凝膠過濾柱層析的方法是取適量的加蒸餾水浸泡2-4h，按常規(guī)方法用NaoH-NaCl混合液浸泡0.5h，抽濾除去堿液并用蒸餾水洗滌至中性，加熱煮沸除去氣泡。裝柱至所需高度，用TRIS-HCl-NaCl緩沖液平衡，將上述有活力洗脫液的濃縮液上樣、洗脫并用記錄儀繪出洗脫曲線，分段收集洗脫液，分別檢測活力，將有活力部分集中于透析袋中用甘油濃縮。再測活力后，待用分光光度計(jì)在200nm至400nm波長范圍內(nèi)掃描。
與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明的突出實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步是1、菲牛蛭(金邊螞蟥)含抗凝血物質(zhì)比其它品種水蛭特別是比目前文獻(xiàn)報(bào)道的寬體金線蛭含抗凝血物質(zhì)含量高，也比日本醫(yī)蛭的藥用效果好。
2、飼養(yǎng)技術(shù)先進(jìn)，特別是采用不凝固的血液既能保證血液不腐變，又使菲牛蛭能吸到新鮮血液，保證了菲牛蛭的健康。
3、采用人工分級分段馴養(yǎng)、喂養(yǎng)的方法能保證菲牛蛭生長狀態(tài)良好不會發(fā)生小菲牛蛭無法搶食而生長緩慢的現(xiàn)象。
4、加入野生的優(yōu)良品種交配，使之不產(chǎn)生近親繁殖的方法能保障菲牛蛭不發(fā)生退化。
5、最重要的一點(diǎn)是本發(fā)明采用廣西特有的菲牛蛭活體提取水蛭素的方法，使每條鮮活菲牛蛭可以反復(fù)提取6-7次，每次能提取6-7毫升左右，經(jīng)離心分離、離子交換等措施得到液體的水蛭素、或者經(jīng)干燥得到固體水蛭素。每周可以提取1次，這樣不但方法簡單容易操作，產(chǎn)品質(zhì)量好，又節(jié)約資源，提高菲牛蛭利用價(jià)值。菲牛蛭養(yǎng)殖1年可提取，菲牛蛭的生命周期為5年左右。
具體實(shí)施例方式
一、菲牛蛭飼養(yǎng)實(shí)施例實(shí)施例1，野外捕捉到健壯的菲牛蛭，按大小放在小水池(一般每個4-8平方米為好)中進(jìn)行細(xì)致的喂養(yǎng)和料理，每立方米水可放成品600-1500條左右，在飼養(yǎng)過程中可以采用流動的水和通過加氧措施，喂食的食物包括加入鈉鹽的新鮮牛血、豬血、羊血等，所述的鈉鹽包括乙酸鈉、磷酸鈉、檸檬酸鈉、精氨酸鈉、賴氨酸鈉、抗壞血酸鈉、胱氨酸鈉，主要使血液不凝固，在喂食過程中將不凝固的血液放到盛有海棉的碟子上，然后將碟子放到浮在養(yǎng)殖池水中的泡沫板上，同時一邊攪動池水，讓菲牛蛭吸引過來覓食。在繁殖時用引進(jìn)優(yōu)良種源健壯的菲牛蛭與之交配。
實(shí)施例2，引進(jìn)優(yōu)良種源健壯的菲牛蛭，按大小放在小水池(一般每個4-8平方米為好)中進(jìn)行細(xì)致的喂養(yǎng)和料理，每立方米水可放成品600-1500條左右，在飼養(yǎng)過程中可以采用流動的水和通過加氧措施，喂食的食物包括用0.05-0.2％鈉鹽處理得到的新鮮牛血、豬血、羊血等，所述的鈉鹽包括乙酸鈉、磷酸鈉、檸檬酸鈉、精氨酸鈉、賴氨酸鈉、抗壞血酸鈉、胱氨酸鈉，主要使血液不凝固，用牛小腸、豬小腸或人工腸衣裝好，然后用細(xì)線將小腸捆成每節(jié)2-3厘米的節(jié)狀直接防入養(yǎng)殖水中喂養(yǎng)。在繁殖時用野外捕捉到健壯的菲牛蛭與之交配。
二、菲牛蛭提取水蛭素實(shí)施例實(shí)施例1，從飼養(yǎng)池內(nèi)撈出成熟、健康的菲牛蛭放到盛有清水的池子中，每隔2天換水清洗一次，不喂食，如此保持10-30天，最后用蒸餾水浸泡10-30分鐘，將清洗干凈的菲牛蛭用乙酸、檸檬酸、氯化鈉、碳酸鈉混合物的水溶液，其濃度為0.1％，PH在4.5，溶解于蒸餾水后充分喂飽菲牛蛭，然后對菲牛蛭進(jìn)行擠壓使其分泌出唾液(水蛭素粗品)，和加入酸的濃度使水溶液的PH在5-6.5之間。具體方法是先配置好純凈的酸溶液，讓菲牛蛭充分吃飽，然后對其進(jìn)行擠壓，使其分泌出唾液得到水蛭素粗品，然后對其唾液經(jīng)離心除雜，再進(jìn)行分離和純化。
分離和純化唾液腺分泌物的制備是將250-300ml從上述菲牛蛭體內(nèi)提取出的唾液腺分泌物提取液中加4倍置冰箱中預(yù)冷的含水15％的丙酮，攪拌后置冰箱中過夜，吸出上清丙酮并離心，在沉淀中加入預(yù)冷的三氯乙酸(約25ml)使其溶解，離心除去殘?jiān)?，待上樣進(jìn)行柱層析。
陰離子交換柱層析取適量DEAE加蒸餾水使其膨脹，按常規(guī)方法依次用0.5MOL/L NaOH-NaCl混合液、0.5mol/L HCl及0.5mol/L NaOH-NaCl混合液各浸泡30分后用蒸餾水洗滌至中性。裝柱(2cm×60cm)至所需高度，用pH4.6的0.1mol/L檸檬酸一檸檬酸鈉緩沖液平衡，5ml的唾液腺分泌物濃縮液或上述三氯乙酸溶液上樣進(jìn)行梯度洗脫并用記錄儀繪出洗脫曲線，分段收集洗脫液。經(jīng)檢測，將有活力部分集中于透析袋中用甘油濃縮，再用雙縮腮法測總蛋白含量，繼續(xù)以下的柱層析。
陰離子交換柱層析取適量DEAE-C加蒸餾水使其膨脹，按常規(guī)方法依次用0.5MOL/LNaOH-NaCl混合液、0.5mol/L HCl及0.5mol/L NaOH-NaCl混合液各浸泡30分后用蒸餾水洗滌至中性。裝柱(2cm×60cm)至所需高度，用pH4.6的0.1mol/L檸檬酸一檸檬酸鈉緩沖液平衡，5ml的唾液腺分泌物濃縮液或上述三氯乙酸溶液上樣進(jìn)行梯度洗脫并用記錄儀繪出洗脫曲線，分段收集洗脫液。經(jīng)檢測，將有活力部分集中于透析袋中用甘油濃縮，再測總蛋白含量，繼續(xù)以下的柱層析。
實(shí)施例2，從飼養(yǎng)池內(nèi)撈出成熟、健康的菲牛蛭放到盛有清水的池子中，每隔2天換水清洗一次，不喂食，如此保持10-30天，最后用蒸餾水浸泡10-30分鐘，將清洗干凈的菲牛蛭用精氨酸、胱氨酸、磷酸鈉混合物的水溶液，其濃度為0.5％，PH在4.5-6.8之間，溶解于蒸餾水后充分喂飽菲牛蛭，然后對菲牛蛭進(jìn)行擠壓使其分泌出唾液(水蛭素粗品)然后對其唾液經(jīng)離心除雜，再按實(shí)施例1的方法進(jìn)行分離和純化。
實(shí)施例3，從飼養(yǎng)池內(nèi)撈出成熟、健康的菲牛蛭放到盛有清水的池子中，每隔2天換水清洗一次，不喂食，如此保持10-30天，最后用蒸餾水浸泡10-30分鐘，將清洗干凈的菲牛蛭用鹽酸、碳酸鈉、磷酸二氫鉀混合物的水溶液，其濃度為3％，PH在6，溶解于蒸餾水后充分喂飽菲牛蛭，然后對菲牛蛭進(jìn)行擠壓使其分泌出唾液(水蛭素粗品)，將這些水蛭素粗品再按常規(guī)方法提純。
實(shí)施例4，從飼養(yǎng)池內(nèi)撈出成熟、健康的菲牛蛭放到盛有清水的池子中，每隔2天換水清洗一次，不喂食，如此保持10-30天，最后用蒸餾水浸泡10-30分鐘，將清洗干凈的菲牛蛭用抗壞血酸、胱氨酸、氯化鈉混合物的水溶液，其濃度為0.5％，PH在5.5之間，溶解于蒸餾水后充分喂飽菲牛蛭，然后對菲牛蛭進(jìn)行擠壓使其分泌出唾液(水蛭素粗品)，然后對其唾液經(jīng)離心除雜，再按實(shí)施例1的方法進(jìn)行分離和純化。
實(shí)施例5，從飼養(yǎng)池內(nèi)撈出成熟、健康的菲牛蛭放到盛有清水的池子中，每隔2天換水清洗一次，不喂食，如此保持10-30天，最后用蒸餾水浸泡10-30分鐘，將清洗干凈的菲牛蛭用磷酸、賴氨酸、碳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀混合物的水溶液，其濃度為1.5％，PH在5.0之間，溶解于蒸餾水后充分喂飽菲牛蛭，然后對菲牛蛭進(jìn)行擠壓使其分泌出唾液(水蛭素粗品)，然后對其唾液經(jīng)離心除雜，再按實(shí)施例1的方法進(jìn)行分離和純化。
權(quán)利要求
1.一種菲牛蛭的養(yǎng)殖方法及水蛭素的提取技術(shù)，其特征在于通過引進(jìn)優(yōu)良種源或野外捕捉到健壯的菲牛蛭、放在水體干凈的水池或池塘，人工分級分段馴化、喂養(yǎng)、維持適宜的溫度，進(jìn)行人工繁殖，待飼養(yǎng)到一定程度，采用誘導(dǎo)物質(zhì)刺激鮮活菲牛蛭使其分泌出唾液，然后對其唾液經(jīng)過進(jìn)一步的純化分離便可以得到天然水蛭素，再將水蛭素粗品進(jìn)行深加工得到符合醫(yī)用的水蛭素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菲牛蛭的養(yǎng)殖方法及水蛭素的提取方法，其特征在于菲牛蛭的養(yǎng)殖方法是人工分級分段馴化、喂養(yǎng)的方法是把繁育種苗和飼養(yǎng)小苗放在小水池中，喂食，所喂食的食物包括用0.05-0.2％鈉鹽處理得到的新鮮牛血、豬血、羊血等，使血液不凝固，在喂食過程中將不凝固的血液放到盛有海棉的碟子上，然后將碟子放到浮在養(yǎng)殖池水中的泡沫板上，同時一邊攪動池水，讓菲牛蛭吸引過來覓食，或者將已經(jīng)加有藥品的腥畜血液用牛小腸、豬小腸或人工腸衣裝好，然后用細(xì)線將小腸捆成每節(jié)2-3厘米的節(jié)狀直接防入養(yǎng)殖水中喂養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菲牛蛭的養(yǎng)殖方法及水蛭素的提取方法，其特征在于所述的人工繁殖包括到一定時候在野外捕捉到的菲牛蛭經(jīng)過鑒定后，將它放在小水池里，使其適應(yīng)新的環(huán)境，然后通過人工分級分段飼養(yǎng)，再進(jìn)行育種和繁殖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的菲牛蛭的養(yǎng)殖方法及水蛭素的提取方法，其特征在于使血液不凝固的處理新鮮牛血、豬血、羊血0.05-0.2％鈉鹽包括乙酸鈉、磷酸鈉、檸檬酸鈉、精氨酸鈉、賴氨酸鈉、抗壞血酸鈉、胱氨酸鈉。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菲牛蛭的養(yǎng)殖方法及水蛭素的提取方法，其特征在于提取水蛭素的方法包括菲牛蛭原料選擇和清洗，采用化學(xué)物質(zhì)刺激鮮活菲牛蛭使其分泌出唾液，然后對其唾液過濾，再將水蛭素粗品進(jìn)行深加工得到符合醫(yī)用的水蛭素。
6.根據(jù)權(quán)利要求1和5所述的菲牛蛭原料選擇和清洗是從飼養(yǎng)池內(nèi)撈出成熟、健康的菲牛蛭放到盛有清水的池子中，每隔2天換水清洗一次，不喂食，如此保持10-30天，最后用蒸餾水浸泡10-30分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求1和5所述的菲牛蛭的養(yǎng)殖方法及水蛭素的提取方法，其特征在于所述的刺激鮮活菲牛蛭使其分泌出唾液的化學(xué)物質(zhì)包括無機(jī)鹽、有機(jī)酸和濃度較低的無機(jī)酸乙酸、鹽酸、磷酸、檸檬酸、精氨酸、賴氨酸、抗壞血酸、胱氨酸、氯化鈉、氯化鉀、碳酸鈉、磷酸鈉、磷酸二氫鉀的其中一種或兩種、兩種以上的混合物，其水溶液濃度為0.1-3％，PH在4.5-6.8之間。
8.根據(jù)權(quán)利要求1和5所述的菲牛蛭的養(yǎng)殖方法及水蛭素的提取方法，其特征在于將水蛭素粗品進(jìn)行深加工包括分離和純化和陰離子交換柱層析、凝膠過濾柱層析；分離和純化的方法是將從上述菲牛蛭體內(nèi)提取出的唾液腺分泌物提取液中加4倍置冰箱中預(yù)冷的含水15％的丙酮，攪拌后置冰箱中過夜，吸出上清丙酮并離心，在沉淀中加入預(yù)冷的三氯乙酸使其溶解，離心除去殘?jiān)?，待上樣進(jìn)行柱層析。陰離子交換柱層析的方法是取適量DEAE加蒸餾水使其膨脹，按常規(guī)方法依次用NaOH-NaCl混合液、HCl及NaoH-NaCl混合液各浸泡30分后用蒸餾水洗滌至中性，裝柱至所需高度，用檸檬酸一檸檬酸鈉緩沖液平衡，5ml的唾液腺分泌物濃縮液或上述三氯乙酸溶液上樣進(jìn)行梯度洗脫并用記錄儀繪出洗脫曲線，分段收集洗脫液，經(jīng)檢測，將有活力部分集中于透析袋中用甘油濃縮，再測總蛋白含量，繼續(xù)以下的柱層析。凝膠過濾柱層析的方法是取適量的加蒸餾水浸泡2-4h，按常規(guī)方法用NaOH-NaCl混合液浸泡0.5h，抽濾除去堿液并用蒸餾水洗滌至中性，加熱煮沸除去氣泡。裝柱至所需高度，用TRIS-HCl-NaCl緩沖液平衡，將上述有活力洗脫液的濃縮液上樣、洗脫并用記錄儀繪出洗脫曲線，分段收集洗脫液，分別檢測活力，將有活力部分集中于透析袋中用甘油濃縮，再測活力后，待用分光光度計(jì)在波長范圍內(nèi)掃描。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種菲牛蛭的養(yǎng)殖方法及水蛭素的提取方法，是通過引進(jìn)優(yōu)良種源或野外捕捉到健壯的菲牛蛭，進(jìn)行人工分級分段馴、喂養(yǎng)，進(jìn)行人工繁殖，待飼養(yǎng)到一定程度，采用化學(xué)物質(zhì)刺激鮮活菲牛蛭使其分泌出唾液，然后對其唾液進(jìn)一步分離過濾得到水蛭素粗品，再將水蛭素粗品進(jìn)行深加工得到符合醫(yī)用的水蛭素，該菲牛蛭含抗凝血物質(zhì)比其它品種菲牛蛭含量高，藥用效果好，提取水蛭素方法簡單，提取水蛭素后將菲牛蛭放回水池養(yǎng)殖，相隔一周或10天又可以再提取，每條鮮活菲牛蛭可以反復(fù)提取6－7次，每次能提取水蛭素粗品6－7毫升左右，產(chǎn)品質(zhì)量好，又節(jié)約資源，提高了菲牛蛭的利用價(jià)值。
文檔編號A01K67/00GK1423929SQ0311356
公開日2003年6月18日 申請日期2003年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月15日
發(fā)明者周維海 申請人:周維海