專利名稱：含殼寡糖的農(nóng)藥組合物及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，更具體地涉及含殼寡糖的農(nóng)藥組合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
植物與病原菌之間依照“基因?qū)颉钡哪Ｊ?，通過信號(hào)相互識(shí)別及傳導(dǎo)(Flor，H.H.(1971)Current status of the gene-for-gene concept.Annu.Rev.Phytopathol.9，275-296)，并調(diào)動(dòng)各自的應(yīng)答系統(tǒng)，其相互競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果導(dǎo)致植物對(duì)病原感病、耐病或抗病。
從信號(hào)傳導(dǎo)途徑來說，對(duì)應(yīng)的R和Avr蛋白的互作符合受體-配體的機(jī)制(Baker B，Zambryski P，Staskawicz B，Dinesh-Kumar SP(1997)Signalingin plant-microbe interactions.Science，276726-733；Lamb CJ(1996)Ligand-receptor mechanism in plant-pathogen recognition.Science，2742038-2039；Martin GB(1999)Functional analysis of plant diseaseresistance genes and their downstream effectors.Curr Opin Plant Biol，2273-279；Staskawicz BJ(2001)Genetics of Plant-Pathogen Interactionsspecifying plant disease resistance.Plant Physiol，12573-76)。
植物和病原菌之間的互作表現(xiàn)為高度復(fù)雜的生物學(xué)過程，細(xì)胞死亡作為在植物感染位點(diǎn)發(fā)生的超敏反應(yīng)的典型特征，能進(jìn)一步引發(fā)遠(yuǎn)處組織作出系統(tǒng)應(yīng)答，即系統(tǒng)獲得性抗性。這種細(xì)胞死亡被認(rèn)為是植物對(duì)抗病原菌的一種主動(dòng)的自殺性行為。
目前認(rèn)為，植物中超敏反應(yīng)所涉及的細(xì)胞死亡同動(dòng)物中所說的程序性細(xì)胞死亡有相似之處(Gilchrist，D.G.(1998)Programmed cell death in plantdiseasethe purpose and promise of cellular suicide.Annu.Rev.Phytopathol.36，393-414)。防衛(wèi)反應(yīng)發(fā)生分為三步完成植物和病原物之間的相互識(shí)別、信號(hào)傳導(dǎo)及應(yīng)答過程。因此，探究這三步的詳細(xì)機(jī)理，已成為闡明植物對(duì)病原微生物的抗性機(jī)制的關(guān)鍵之一。
一般認(rèn)為，植物通過誘導(dǎo)子信號(hào)的傳導(dǎo)作用產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)。誘導(dǎo)子(elicitor)是植物抗病生理過程中誘發(fā)植物產(chǎn)生植保素(phytoalexins)和過敏反應(yīng)(hypersensitive reaction，HR)的因子。包括有各種生物大分子(源于細(xì)菌、真菌和植物的寡糖素、糖蛋白、蛋白和多肽等)和小分子物質(zhì)(水楊酸、茉莉酸等)。誘導(dǎo)子在植物與微生物的相互作用中，能夠高度專一、快速的誘導(dǎo)特定基因的表達(dá)。
幾丁質(zhì)是是構(gòu)成病原真菌細(xì)胞壁的主要成分，有研究表明其降解產(chǎn)生寡聚糖胺(殼寡糖)能夠激發(fā)植物產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)。然而，迄今為止，尚沒有將殼寡糖用于農(nóng)用的報(bào)道。
另一方面，各種化學(xué)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境和人類都或多或少地造成各種不利影響，因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的能夠提高植物抗病性的生物農(nóng)藥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新型的提高植物抗病性的生物農(nóng)藥。
本發(fā)明的另一目的是提供所述生物農(nóng)藥制備方法及其應(yīng)用。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種農(nóng)藥組合物，它含有防治有效量的殼寡糖和載體。
在一優(yōu)選例中，殼寡糖的含量為組合物總重量的0.0005-99％，較佳地為0.005-95％，更佳地為0.01-90％。。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物為選自下組的劑型可濕粉劑，可乳化濃縮物，水溶液，乳液，可噴灑溶液，油性或水性分散系，懸浮劑，粉劑，顆粒劑，微膠囊。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物為粉劑，且所述的殼寡糖的含量為組合物總重量的80-90％。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物為水溶液，其中殼寡糖的含量為組合物總重量的0.0005-0.05％。
在另一優(yōu)選例中，所述組合物還含有選自下組的物質(zhì)單分子糖胺、氯化鈉、Tween-20和水。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種提高植物抗病性的方法，包括步驟給所述植物施用有效量的殼寡糖。
在一優(yōu)選例中，所述的植物選自下組水稻、小麥、蔬菜、花卉，且所述的抗病性是抗植物真菌病害。
在另一優(yōu)選例中，殼寡糖的施用有效量為5ppm(0.005g/L)至1000ppm(1g/L)。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種制備殼寡糖的方法，包括以下步驟(a)提供固體幾丁質(zhì)或蚌殼、蝦殼經(jīng)清洗干燥粉碎后的粉末；(b)于密封并有降溫設(shè)施的攪拌器中按1∶5-1∶10的比例加入濃鹽酸；(c)30-45℃攪拌3-12小時(shí)至幾丁質(zhì)全部溶解；(d)在低溫容器中冷卻上清懸浮液至10-20℃；(e)加入NaOH至pH3.0±0.5，產(chǎn)生NaCl沉淀，而可溶性寡聚糖胺于上清中；(f)過濾去鹽，回收寡聚糖胺溶液；(g)脫水干燥。


圖1殼寡糖誘導(dǎo)水稻細(xì)胞死亡的劑量效應(yīng)。
圖2殼寡糖誘導(dǎo)水稻細(xì)胞死亡的時(shí)間效應(yīng)。
圖3不同處理誘導(dǎo)水稻細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生。
圖4不同濃度殼寡糖誘導(dǎo)防衛(wèi)基因的表達(dá)。
圖5殼寡糖誘導(dǎo)防衛(wèi)基因表達(dá)的時(shí)間動(dòng)態(tài)。
圖6不同濃度殼寡糖處理后的水稻葉片Trypan blue染色結(jié)果。
圖7不同濃度殼寡糖處理后的水稻葉片DAB-uptaking結(jié)果。
圖8殼寡糖處理后的不同日期的抗瘟性結(jié)果。
圖9殼寡糖處理后水稻植株抗性增強(qiáng)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明對(duì)殼寡糖的作用機(jī)理進(jìn)行了廣泛而深入的研究，首次發(fā)現(xiàn)殼寡糖可引起水稻過敏性樣細(xì)胞死亡，強(qiáng)烈激活水稻等植物的防衛(wèi)反應(yīng)，從而增強(qiáng)了植物的抗病性。因此，殼寡糖可作為誘導(dǎo)植物抗病的誘導(dǎo)劑而用于農(nóng)業(yè)。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
本發(fā)明農(nóng)用組合物的活性成分是殼寡糖(Oligo-GlcNAc)。以水稻為例，殼寡糖能夠誘導(dǎo)懸浮培養(yǎng)的水稻細(xì)胞和幼葉細(xì)胞發(fā)生過敏性反應(yīng)死亡，并強(qiáng)烈激活防衛(wèi)反應(yīng)基因RCH10、PAL等表達(dá)，產(chǎn)生氧進(jìn)發(fā)。處理的水稻植株明顯增強(qiáng)了對(duì)稻瘟病等的抗性。
殼寡糖的制備方法是已知的，一種優(yōu)選的方案如下固體幾丁質(zhì)或蚌殼、蝦殼經(jīng)清洗干燥粉碎后的粉末→于密封并有降溫設(shè)施的攪拌器中按1∶10的比例加入濃鹽酸→30-45℃攪拌3-12小時(shí)至幾丁質(zhì)全部溶解→在低溫容器中冷卻上清懸浮液至10-20℃→逐步加入5N NaOH至pH3.0產(chǎn)生NaCl沉淀，而可溶性寡聚糖胺于上清中→過濾去鹽(鹽可回收作為工業(yè)用鹽)→寡聚糖胺溶液脫水干燥即為成品→粉末干燥保存。
本發(fā)明組合物通常含總量0.0005-99wt％的活性成分(即殼寡糖)。濃縮型的農(nóng)藥中活性成分的含量較高，如80-90％，而稀釋型農(nóng)藥和實(shí)際使用的組合物中活性成分含量較低，通常為0.0005-0.05％。此外，還可以包含其他合適的化學(xué)殺菌劑、、增效劑、微量元素、穩(wěn)定劑、粘合劑、潤(rùn)濕劑、分散劑、乳化劑、滲透劑、溶劑、充填劑等常用組分。
本發(fā)明組合物中還可以含有例如選擇性除草劑和其他具有殺蟲活性的物質(zhì)，化肥和/或生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。
本發(fā)明組合物在用于提高植物的抗病性。組合物適用的形式包括適合噴灑、噴霧和低容量或超低容量噴灑的氣霧劑和水性或非水性溶液或分散系。優(yōu)選方式是水性母液和易溶于水的顆粒形式。
在制備組合物時(shí)合適的固體稀釋劑包括硅藻土，玉米殼，磷酸三鈣，軟木粉，高嶺土、膨潤(rùn)土或硅鎂土等粘土，和水溶性聚合物。
此外，固體組合物還可以含有一種或多種相容性潤(rùn)濕劑，分散劑，乳化劑或色素，這些成分在固態(tài)時(shí)也可起稀釋劑的作用。
這樣的固體組合物可以是粉劑，顆粒劑或可濕粉劑的形式。通常通過研磨獲得粉劑，通過造?；驂浩@得顆粒劑、片劑或磚型劑。
液體組合物的形式可以是溶液，懸浮液和乳液，也可以將其包在天然或合成聚合物中，并可以包含潤(rùn)濕劑、分散劑或乳化劑。這樣的乳液、懸浮液或溶液可用水性、有機(jī)或水-有機(jī)稀釋劑來制備水溶性聚合物(以及上述稀釋劑的混合物)。此外，所述稀釋劑中可含有例如以上所述離子型或非離子型的潤(rùn)濕劑、分散劑或乳化劑或它們的混合物。
可用多種方法將組分配成制劑。合適的制劑可選自例如水溶液(SL)，可濕粉劑(WP)，可乳化濃縮物(EC)，可噴灑溶液或乳液，油性或水性分散劑，懸浮劑，粉劑(DP)，顆粒劑。
各種制劑的原理都是已知的，并在例如以下文獻(xiàn)中有所描述Winnacker-Kuchler，“Chemische Technologie″化學(xué)技術(shù)，Vol.7，C.Hauser Verlag Munich，第4版，1986；van Valkenburg，“農(nóng)藥劑型”，Marcel Dekker N.Y.，第2版，1972-73；K.Martens，“噴霧干燥手冊(cè)”，第3版，G.Goodwin Ltd.London。
用于本發(fā)明組合物的所需的配制助劑，(例如惰性物質(zhì)，表面活性劑，溶劑和其他添加劑)，也是已知的，其描述例如Watkins“殺蟲粉劑稀釋劑和載體手冊(cè)”第2版，Darland Books，Caldwell N.J.；H.v.Olphen，“粘土膠體化學(xué)導(dǎo)引”第2版，J.Wiley & Sons，N.Y.，Marsden，“溶劑指南”第2版，Interscience，N.Y.1950；McCutcheon′s，“除垢劑和乳化劑年刊”，MC Publ.Corp.，RidgewoodN.J.；Sisley和Wood，“表面活性劑百科全書”，Chem.Publ.Co.Inc.，N.Y.1964；Schonfelt，“Grenzflachenaktive Athylenoxidaddukte”表面活性環(huán)氧乙烷加成產(chǎn)物，Wiss.Verlagsgesell.，Stuttgart 1976；Winnacker-Kuchler，“ChemischeTechnologie″化學(xué)技術(shù)，Vol.7，C.Hauser Verlag Munich，第4版，1986。
可濕粉劑可均勻分散于水。除活性物質(zhì)之外，可濕粉劑還可包含潤(rùn)濕劑，分散劑，稀釋劑等無環(huán)境公害的物質(zhì)。粉劑的制備可以是將活性物質(zhì)與精細(xì)粉碎后的滑石、高嶺土、膨潤(rùn)土之類天然粘土或硅藻土等固體物質(zhì)一同研磨。顆粒劑的制備可以是用活性物質(zhì)噴涂吸附于惰性物質(zhì)顆粒，或?qū)⒒钚晕镔|(zhì)溶液通過粘合劑(例如聚乙烯醇、聚丙烯酸鈉，或礦物油)施加于載體(例如砂、高嶺土或惰性物質(zhì)顆粒)表面。如果欲與化肥混合施用，則可將合適的活性物質(zhì)象制備化肥顆粒那樣制備成顆粒。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，提供了一種母液。它是用如下方法制備的殼寡糖粉末→按10或20mg/ml(1％或2％)制成水溶液→過濾滅菌→室溫保存有效期可達(dá)半年以上，低溫4℃保存有效期達(dá)兩年以上。
原則上，本發(fā)明的農(nóng)用制劑包含0.0005-2wt％殼寡糖，較佳地0.005-1wt％，更佳地0.05-0.5wt％。例如，可濕粉劑中，活性物質(zhì)的濃度約為0.005-2wt％；其余為常規(guī)制劑組分。如果是可乳化濃縮物，活性物質(zhì)的濃度可以約為0.5-2wt％，以0.5-1wt％為佳。粉劑型制劑中，活性物質(zhì)占約0.005-2wt％，以0.005-0.5wt％為佳；可噴灑溶液中，活性物質(zhì)占約0.0005-2wt％，以0.0052-1wt％為佳。如果是顆粒劑，原則上，水可分散的顆粒含約0.005-1wt％活性物質(zhì)，播撒顆粒中含0.005-0.5wt％。施用濃度在5ppm(0.005g/L)至1000ppm(1g/L)之間，較佳地50-200ppm，更佳地100-500ppm。
可用本發(fā)明組合物保護(hù)的植物種類可本發(fā)明組合物和方法保護(hù)的植物沒有特別限制，可以是谷類作物(如玉米，小麥，稻，高粱)，尤其是稻類；田間、林間、種植院、暖房、果園和葡萄園中的觀賞作物、種植院作物和林木，例如棉花，煙草，蔬菜(例如豆類，油菜，葫蘆，萵苣，洋蔥，西紅柿和胡椒)，田間作物(如馬鈴薯，甜菜，落花生，大豆，油菜)，甘蔗，草地和林木(如玉米，高粱，紫花苜蓿)，種植院作物(茶葉，咖啡，可可，香蕉，油棕，椰子，橡膠，香料)，果園和小樹林(如核果，柑橘，獼猴桃，鱷梨，芒果，橄欖和胡桃)，葡萄園，暖房、花園或公園中的觀賞作物，花卉和灌木，樹林、種植院和花圃中的林木(包括落葉林木和常青林木)。
可防治的病害種類可用本發(fā)明方法防治的病害主要是各類真菌引起的病害，例如稻瘟病。
防治方法將組合物施用于生長(zhǎng)中的作物的合適方法包括葉面噴灑劑，粉劑，顆粒劑，用液體灌溉、粉劑、顆粒劑、和泡沫劑處理土壤和根。此外，本發(fā)明組合物可用于防治受植物病害侵食的植株部位，例如將本發(fā)明化合物施用于水稻葉面可防治稻瘟病。優(yōu)選的施用方式是對(duì)葉施用。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以看出，組合物的施用比需隨例如溫度、濕度、待處理區(qū)域和待處理植物等外界條件而改變。因此，施用比應(yīng)可在一較寬的范圍內(nèi)變化。本發(fā)明組合物的使用頻率可由農(nóng)民、病害防治專業(yè)人士或其他本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)預(yù)期效果來選擇。
一種優(yōu)選的方案如下對(duì)于植物真菌病害的防治，將1％或2％的母液按1∶100至1∶1000配成使用液，苗期至成株期均可噴灑。一般作物在苗期至開花期間用此藥液共噴3次，每間隔15天噴一次，防病率達(dá)50％以上。發(fā)病期間配合使用少量化學(xué)農(nóng)藥效果更佳。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1水稻懸浮細(xì)胞的準(zhǔn)備水稻懸浮細(xì)胞在N6液體培養(yǎng)基中于26℃搖床(80rpm)暗培養(yǎng)，每7～10天換一次新鮮培養(yǎng)液。
N6液體培養(yǎng)基配方如下KNO32.83g/L (NH4)2SO40.463g/LKH2PO40.4g/L MgSO4·7H2O 0.185g/LCaCl2·2H2O 0.166g/L MnSO4·H2O 3.3mg/LZnSO4·7H2O 1.5mg/L H3BO31.6mg/LKI 0.8mg/LFeSO4·7H2O28mg/L Na2EDTA 37mg/L煙酸(B5)0.5mg/L 硫胺素·HCl(B1)0.1mg/L吡哆酸·HCl(B6) 0.5mg/L 肌醇酯 100mg/L蔗糖30g/L2，4-D 2mg/L脯氨酸 2.3g/L 色氨酸 50mg/LpH5.8實(shí)施例2殼寡糖和母液的制備殼寡糖制備過程如下固體幾丁質(zhì)或蚌殼、蝦殼經(jīng)清洗干燥粉碎后的粉末→于密封并有降溫設(shè)施的攪拌器中按1∶10的比例加入濃鹽酸→45℃攪拌3-12小時(shí)至幾丁質(zhì)全部溶解→在低溫容器中冷卻上清懸浮液至10-20℃→逐步加入5N NaOH至pH3.0產(chǎn)生NaCl沉淀，而可溶性寡聚糖胺于上清中→過濾去鹽(鹽可回收作為工業(yè)用鹽)→寡聚糖胺溶液脫水干燥即為成品→粉末干燥保存。
例如，幾丁質(zhì)(Sigma)0.2g經(jīng)過鹽酸降解過夜，用5N的NaOH調(diào)節(jié)pH3-4，經(jīng)過過濾去鹽脫水干燥后，制成10mg/ml的寡聚糖水溶性母液，0.45um的微孔濾膜過濾，于-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例3殼寡糖誘導(dǎo)水稻懸浮細(xì)胞死亡分別以0、100、200、500、1000ng/ml濃度的殼寡糖處理換培養(yǎng)基4天后的水稻懸浮細(xì)胞，于26℃搖床(80rpm)暗培養(yǎng)24小時(shí)，經(jīng)0.05％的Evans blue染色15min，水洗6次將未結(jié)合的染料去除。從中稱取100mg細(xì)胞，用50％的甲醇(含1％SDS)1.5ml于50℃水浴30min，期間要不斷的搖動(dòng)，以便充分脫色，測(cè)量洗脫液600nm的光吸收值。同時(shí)，以80℃水浴處理10min作為細(xì)胞完全死亡的對(duì)照，分析細(xì)胞死亡的劑量效應(yīng)。以1μg/ml濃度的殼寡糖對(duì)水稻懸浮細(xì)胞做同樣的處理，分別在12小時(shí)和24小時(shí)后，經(jīng)過染色和脫色處理，測(cè)量洗脫液600nm的光吸收值，分析細(xì)胞死亡出現(xiàn)的進(jìn)程。
結(jié)果如圖1和圖2所示。過敏性細(xì)胞死亡是植物與病原菌非親和互作的典型特征。通過不同劑量的殼寡糖處理水稻細(xì)胞24小時(shí)后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的死亡是隨著殼寡糖濃度的增加而增加的，以1μg/ml的殼寡糖處理水稻細(xì)胞，就能夠?qū)⑵渫耆珰⑺?見圖1)。用1μg/ml殼寡糖分別對(duì)水稻細(xì)胞進(jìn)行12和24小時(shí)的處理，結(jié)果表明處理12小時(shí)后細(xì)胞死亡就明顯產(chǎn)生，至24小時(shí)即完全死亡(見圖2)。因此得出，殼寡糖是一種水稻細(xì)胞死亡的強(qiáng)烈激發(fā)子。
實(shí)施例4抗病信號(hào)的產(chǎn)生與防衛(wèi)基因的激活(a)H2O2的產(chǎn)生新鮮的水稻懸浮細(xì)胞(轉(zhuǎn)接第4天)用于活性氧的測(cè)定。
以1μg/ml濃度的殼寡糖處理的水稻懸浮細(xì)胞，分別于26℃搖床(80rpm)暗培養(yǎng)0、30min、1hr、3hr、6hr、12hr、24hr，用0.2μm孔徑的針筒式漏斗過濾培養(yǎng)液，取其200μl加入5μl 1mmol/LHPTS底物，5分鐘混合后，在熒光儀(Perkin ElmerLS50B)上測(cè)定活性氧的濃度(參數(shù)為激發(fā)波長(zhǎng)405nm，發(fā)射波長(zhǎng)512nm)。
結(jié)果如圖3所示?；钚匝醯漠a(chǎn)生是植物主要防衛(wèi)反應(yīng)之一。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以1μg/ml濃度的殼寡糖處理的水稻懸浮細(xì)胞，在0.5小時(shí)左右開始產(chǎn)生一個(gè)H2O2小峰，6小時(shí)達(dá)到另一個(gè)高峰(見圖3)。此后，殼寡糖誘導(dǎo)的活性氧產(chǎn)生逐漸減弱。該結(jié)果非常類似病原菌或激發(fā)子產(chǎn)生的兩次氧進(jìn)發(fā)現(xiàn)象。
(b)防衛(wèi)基因的表達(dá)以不同濃度的殼寡糖處理水稻懸浮細(xì)胞，于26℃搖床(80rpm)暗培養(yǎng)12小時(shí)后提取細(xì)胞的總RNA(Trizol法)，Northern blot檢測(cè)防衛(wèi)抗病基因RCH10，PAL的表達(dá)。以1μg/ml濃度的殼寡糖處理水稻細(xì)胞，分別于26℃搖床(80rpm)暗培養(yǎng)0min、30min、1hr、3hr、6hr、12hr、24hr后，提取細(xì)胞的總RNA(Trizol法)，Northern blot檢測(cè)防衛(wèi)基因RCH10，PAL，CatB的表達(dá)動(dòng)態(tài)。
結(jié)果如圖4和5所示。以不同濃度的殼寡糖處理水稻懸浮細(xì)胞，12小時(shí)后0.01ug/ml的殼寡糖便能夠強(qiáng)烈激活防衛(wèi)基因RCH10和PAL的表達(dá)，0.5ug/ml的處理量就可達(dá)到防衛(wèi)基因的表達(dá)量最大(見圖4)。以1μg/ml濃度的殼寡糖處理水稻細(xì)胞，進(jìn)行防衛(wèi)基因激活的時(shí)間動(dòng)態(tài)研究。2小時(shí)后能夠激活防衛(wèi)基因RCH10和PAL的表達(dá)，在8-12小時(shí)的表達(dá)量就可以達(dá)到最大；防衛(wèi)基因CatB在殼寡糖處理2小時(shí)后能夠被抑制表達(dá)(見圖5)，再次證實(shí)CatB可能是一個(gè)抗病反應(yīng)的負(fù)調(diào)控因子(He，Z.Et al.(2000)Perception of brassinosteroidsby the extracellular domain of the receptor kinase BRIl.Science.288，2360-2363)。
實(shí)施例5殼寡糖誘導(dǎo)水稻葉片產(chǎn)生過敏性反應(yīng)(a)殼寡糖誘導(dǎo)水稻葉片細(xì)胞死亡分別以0、1、5、10、100ug/ml濃度的殼寡糖噴灑到三葉期感病水稻H7S的植株上，24小時(shí)后，剪取葉片，放入沸水浴狀態(tài)下的0.1mg/ml的Trypan blue染色液(乳酸∶甘油∶酚∶水＝1∶1∶1∶1，再加入等體積的96％乙醇)中染色5min，室溫下放置1hr，將葉片于2.5mg/ml的水合氯醛中脫色過夜。保存于50％的甘油中，觀察細(xì)胞死亡產(chǎn)生情況并拍照記錄。
不同劑量殼寡糖處理的三葉期水稻幼苗，其葉片經(jīng)Trypan blue染色，發(fā)現(xiàn)有明顯的細(xì)胞死亡斑點(diǎn)，且隨著處理劑量的不同細(xì)胞死亡的產(chǎn)生有一定差異，5ug/ml殼寡糖處理的水稻葉片即產(chǎn)生明顯的細(xì)胞死亡(見圖6)。結(jié)果表明殼寡糖誘導(dǎo)葉片細(xì)胞死亡產(chǎn)生所需劑量要高于懸浮細(xì)胞。
(b)殼寡糖誘導(dǎo)水稻葉片細(xì)胞產(chǎn)生H2O2沉積在過氧化物酶存在下，DAB(diaminobenzidine)一旦與H2O2接觸，迅速形成紅褐色聚合物沉積。分別以0、1、5、10、100ug/ml濃度的殼寡糖噴灑到三葉期感病水稻H7S的植株上，24小時(shí)后，切取葉片浸泡在1mg/ml的3，3’-diaminobenzidine-HCl(pH3.8)中置25℃、光照8小時(shí)，取出后置于96％乙醇中沸水浴煮沸10min脫色，在新鮮的乙醇中泡4小時(shí)(25℃)后觀察葉片中的紅褐色沉淀并拍照記錄。
不同濃度殼寡糖處理后的水稻，其葉片經(jīng)DAB染色，發(fā)現(xiàn)有明顯的H2O2沉積的斑點(diǎn)(見圖7)，從而證明殼寡糖能引起水稻細(xì)胞產(chǎn)生過敏性反應(yīng)(Hypersensitive Response，HR)的氧進(jìn)發(fā)(Oxidative burst)。因而可以初步斷定，上述細(xì)胞死亡的產(chǎn)生是基于一種過敏性反應(yīng)的機(jī)理。
實(shí)施例6殼寡糖誘導(dǎo)水稻抗病性檢測(cè)以5μg/ml的殼寡糖(0.01％Tween20)處理市售的水稻植株H7S，水處理作為陰性對(duì)照。8小時(shí)后接種稻瘟病(以每個(gè)視野BLAST的孢子數(shù)為50左右為佳)，28℃暗培養(yǎng)24小時(shí)后，光照14小時(shí)、黑暗10小時(shí)繼續(xù)培養(yǎng)6天，觀察抗病性并統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況。同時(shí)，以抗病品系H7R作為抗病對(duì)照。
結(jié)果如圖8和9所示。重復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)過5ug/ml的殼寡糖處理的水稻植株對(duì)稻瘟病的抗性明顯增強(qiáng)，其病斑級(jí)數(shù)為2-3級(jí)，抗病植株為1-2級(jí)，而未經(jīng)處理的植株極大部分病斑為感病病斑，發(fā)病級(jí)數(shù)在4-5級(jí)。結(jié)果表明5ug/ml殼寡糖的處理防病效果可以達(dá)到50％以上(見圖8，9)。
討論植物誘導(dǎo)抗病反應(yīng)是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的過程。研究表明，作為真菌細(xì)胞壁的主要成分之一，殼寡糖能夠強(qiáng)烈誘導(dǎo)水稻細(xì)胞發(fā)生防衛(wèi)反應(yīng)，進(jìn)而引發(fā)系統(tǒng)抗病性的增強(qiáng)。本發(fā)明的細(xì)胞、生化和分子生物學(xué)上證實(shí)了殼寡糖誘發(fā)的這些反應(yīng)，非常類似于病原菌引起的過敏性反應(yīng)包括細(xì)胞死亡、氧進(jìn)發(fā)和防衛(wèi)基因的激活。
本發(fā)明的研究結(jié)論認(rèn)為，殼寡糖可以作為一種強(qiáng)烈的細(xì)胞死亡和系統(tǒng)誘導(dǎo)抗病性的激發(fā)子。殼寡糖的這種激發(fā)作用可能在不同植物上表現(xiàn)不同，有必要對(duì)不同植物進(jìn)行相應(yīng)的機(jī)理研究。
用殼寡糖處理后，水稻植株抗病性明顯增強(qiáng)。表現(xiàn)為水稻葉片出現(xiàn)細(xì)胞死亡斑點(diǎn)，也即發(fā)生了HR反應(yīng)；并且經(jīng)過DAB染色的水稻葉片會(huì)在防衛(wèi)反應(yīng)中由于產(chǎn)生了H2O2而出現(xiàn)紅褐色斑點(diǎn)；稻瘟病接種后，經(jīng)過殼寡糖處理后的水稻植株抗性明顯增強(qiáng)，其病斑級(jí)別下降，侵染速度減慢。與感病對(duì)照相比，病害指數(shù)下降了50％。本發(fā)明表明，殼寡糖作為一種來源廣泛的有機(jī)制劑，作為生物農(nóng)藥有廣闊的應(yīng)用前景，預(yù)計(jì)可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生針對(duì)不同的真菌細(xì)菌、和病毒病的抗性。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種農(nóng)藥組合物，其特征在于，它含有防治有效量的殼寡糖和載體。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，殼寡糖的含量為組合物總重量的0.0005-99％。
3.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，殼寡糖的含量為組合物總重量的0.005-95％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其為選自下組的劑型可濕粉劑，可乳化濃縮物，水溶液，乳液，可噴灑溶液，油性或水性分散系，懸浮劑，粉劑，顆粒劑，微膠囊。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，所述的組合物為粉劑，且所述的殼寡糖的含量為組合物總重量的80-90％。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，所述的組合物為水溶液，其中殼寡糖的含量為組合物總重量的0.0005-0.05％。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，所述組合物還含有選自下組的物質(zhì)單分子糖胺、氯化鈉、Tween-20和水。
8.一種提高植物抗病性的方法，其特征在于，包括步驟給所述植物施用有效量的殼寡糖。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的植物選自下組水稻、小麥、蔬菜、花卉，且所述的抗病性是抗植物真菌病害。
10.一種制備殼寡糖的方法，其特征在于，包括以下步驟(a)提供固體幾丁質(zhì)或蚌殼、蝦殼經(jīng)清洗干燥粉碎后的粉末；(b)于密封并有降溫設(shè)施的攪拌器中按1∶5-1∶10的比例加入濃鹽酸；(c)30-45℃攪拌3-12小時(shí)至幾丁質(zhì)全部溶解；(d)在低溫容器中冷卻上清懸浮液至10-20℃；(e)加入NaOH至pH3.0±0.5，產(chǎn)生NaCl沉淀，而可溶性寡聚糖胺于上清中；(f)過濾去鹽，回收寡聚糖胺溶液；(g)脫水干燥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種農(nóng)藥組合物，它含有防治有效量的殼寡糖和載體。本發(fā)明還公開了組合物的制備方法及其在提供植物抗病性方面的用途。本發(fā)明的組合物可強(qiáng)烈激活水稻等植物的防衛(wèi)反應(yīng)，從而增強(qiáng)了抗病性。
文檔編號(hào)A01N31/04GK1520723SQ0311527
公開日2004年8月18日 申請(qǐng)日期2003年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月30日
發(fā)明者何祖華, 寧偉, 李群 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海植物生理研究所