專利名稱：一種生物殺線蟲劑的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物殺線蟲的生產(chǎn)方法，屬生物農(nóng)藥領(lǐng)域。
在線蟲的天敵微生物中，食線蟲真菌(nematophagous fungi)是最有研究和開發(fā)價值的重要資源之一。食線蟲真菌按其侵染線蟲的機(jī)制可以分為四大類捕食菌，內(nèi)寄生菌，機(jī)會菌和產(chǎn)毒菌。捕食菌(nematode trappingfungi)是指通過菌絲特化形成捕食器(predacious device)，利用捕食器捕殺線蟲。捕食菌形成的捕食器目前共發(fā)現(xiàn)的有七大類三維菌網(wǎng)，收縮環(huán)，非收縮環(huán)，粘球，粘性分枝，粘性菌絲和冠囊體。捕食菌形成的收縮環(huán)(constricting ring)是由三個細(xì)胞構(gòu)成，通過一段短的菌絲(2-3個細(xì)胞構(gòu)成)與營養(yǎng)菌絲相連接，收縮環(huán)分泌一些物質(zhì)誘吸線蟲穿入環(huán)內(nèi)，一旦線蟲接觸收縮環(huán)，環(huán)細(xì)胞在千分之一秒的時間內(nèi)很快收縮，將線蟲緊緊地套住。之后，環(huán)細(xì)胞分泌一些侵染酶，如蛋白酶等，降解線蟲的體壁，隨后菌絲侵入線蟲體內(nèi)，利用線蟲作為營養(yǎng)不斷生長繁殖，最后導(dǎo)致線蟲死亡。
目前利用捕食菌開發(fā)的線蟲生防制劑已經(jīng)有2個商業(yè)化產(chǎn)品，一個是利用粗壯節(jié)叢孢(Arthrobotrys robusta)開發(fā)的Royal 300。在法國用于防治雙孢蘑菇線蟲，使蘑菇產(chǎn)量比對照提高25％(Cayrol et al.，1978)。另一個是利用不規(guī)則節(jié)叢孢(A.irregalaris)開發(fā)的Royal 350。在法國用于防治番茄根結(jié)線蟲。所利用的這兩種捕食菌都是以三維菌網(wǎng)捕食線蟲，捕食器為三維菌網(wǎng)的捕食菌在土壤中營腐生生活的能力比形成其它類型捕食器的捕食菌要強(qiáng)，強(qiáng)，一般要有線蟲誘導(dǎo)才能產(chǎn)生捕食器，因此，在營養(yǎng)豐富的土壤中很難產(chǎn)生捕食器捕捉線蟲，導(dǎo)致防治效果不穩(wěn)定。
本發(fā)明利用捕食線蟲真菌指狀節(jié)叢孢LX-Ad菌株或由該菌株產(chǎn)生的各種突變株，通過固體和液體培養(yǎng)方法，獲得菌體培養(yǎng)物(包括菌絲，分生孢子和代謝物質(zhì))，添加農(nóng)業(yè)上允許使用的填充料，粘合劑，表面活性劑等有利于有效成分施用和分散的物質(zhì)制成種粉劑，顆粒劑，可濕性粉劑等可用于防治根結(jié)線蟲Meloidogyne spp的菌劑。
本發(fā)明通過以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)微生物菌種的培養(yǎng)(包括微生物試管斜面種子培養(yǎng)、微生物液體種子培養(yǎng))；(2)將液體種子接入固體培養(yǎng)料中或液體培養(yǎng)料中，通過固體培養(yǎng)條件或液體培養(yǎng)條件培養(yǎng)，獲得大量的菌體培養(yǎng)物；(3)根據(jù)劑型需要將菌體培養(yǎng)物與相應(yīng)的填充料，粘合劑，表面活性劑等有利于有效成分施用和分散的物質(zhì)制成粉劑，顆粒劑和可濕性粉劑等植物寄生線蟲生防菌劑。
本發(fā)明使用的微生物是指狀節(jié)叢孢A.dactyloides LX-Ad菌株或由該菌株通過突變、遺傳改造獲得的衍生物。該菌株已于2002年10月9日保存于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No.0805。其特征是在CMA培養(yǎng)基(玉米粉20克，瓊脂18克，水1000毫升)上培養(yǎng)7-14天，菌落白色，菌絲無色，分枝，分隔，分生孢子梗直立，不分枝，長200-600μm，頂端形成小齒梗，小齒梗上著生棒狀分生孢子，分生孢子一個分隔，大小為35-60×7-9μm，小型分生孢子長棍棒形至梨形，有時稍彎，0-2個分隔，大小為16-26×3-5μm。該種微生物以收縮環(huán)捕食線蟲。
微生物斜面種子培養(yǎng)方法 (為敘述方便，將成分為糖蜜20g，玉米粉5g，硫酸銨5g，氯化鈉6g，硫酸二氫鉀0.5g，檸檬酸三鈉4.5g，水1000ml的培養(yǎng)基命名為MC培養(yǎng)基)將微生物的菌絲或孢子接種到MC培養(yǎng)基斜面上，15-35℃下培養(yǎng)4-20天后獲得斜面種子。液體種子的培養(yǎng)方法將斜面種子接種到三角瓶中的MC液體培養(yǎng)基中，15-35℃，搖床培養(yǎng)(轉(zhuǎn)速為50-200rpm，培養(yǎng)3-7天)，也可以靜止培養(yǎng)(4-14天)。
微生物固體條件下的大量繁殖方法固體培養(yǎng)料的成分可以是單一的麥麩，小麥粒或粉，高粱粉，玉米粉或者粒，紅薯粉，米糠，大米，棉籽殼，禾本科植物的莖葉粉碎物，淀粉，黃豆粉，也可以是其中的兩種或兩種以上成分的組合。將固體培養(yǎng)料用水潤濕，調(diào)節(jié)水分含量至混合物重量百分比的20-45％，用塑料袋(瓶)，玻璃瓶或淺盤等容器裝料，滅菌后用斜面種子或液體種子接種，15-35℃下培養(yǎng)10-60天。
微生物液體條件下的大量繁殖方法將斜面菌種接種到MC平板上，20-29℃下培養(yǎng)4-10天獲得平板種子，取平板種子菌絲塊15-40塊(直徑＝3mm)，接種到裝有1升MC培養(yǎng)基的2升三角瓶中，在20-29℃，轉(zhuǎn)速為100-250rpm的搖床上培養(yǎng)4-8天后的培養(yǎng)物作為在20立升，50立升，1000-4000立升發(fā)酵罐生產(chǎn)這種微生物時的接種體。在20立升，50立升中發(fā)酵罐的培養(yǎng)溫度控制在28-32℃，培養(yǎng)時間40-96小時。在1000-4000立升發(fā)酵罐中的培養(yǎng)溫度控制在25-37℃，作為一級種時培養(yǎng)時間為48-120小時。將一級種接入10000-30000立升發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度控制在28-35℃，培養(yǎng)時間為96-150小時，在發(fā)酵罐中培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為300-500rmp。
菌劑各種劑型的制備如下粉劑的制備微生物大量菌體制備好以后作為原藥與粉碎(粒徑小于1毫米以下)的單一或組合的各種植物、礦物或合成材料的填料(如草粉，米糠，木屑，滑石，葉蠟石，高嶺土，膨潤土，凹凸棒土，硅藻土，陶土，草炭等)和助劑(如烷基芳基聚氧乙基醚，脂肪醇，氧乙基醚，烷基萘磺酸鹽，木質(zhì)素磺酸鹽以及它們的復(fù)配物)混合，混合物中微生物的重量百分比為15-75％?；旌现髮⑺窒鄬穸日{(diào)節(jié)到10％以下，包裝，室溫或4-10℃下保存。
顆粒劑的制備按粉劑的方法將菌體與填料和助劑混合，用造粒機(jī)制成直徑為1-4mm，長度為0.5-8cm的顆粒，在30-35℃下烘干到水分含量小于10％，制成顆粒劑。顆粒劑中微生物的重量百分比為15-75％。
可濕性粉劑的制備微生物大量發(fā)酵生產(chǎn)以后，將發(fā)酵物與填料(同粉劑)，潤濕劑(茶枯，皂角，土溫60，拉開粉，洗衣粉，十二烷基苯磺酸鈉等)，分散劑(No，NNO，PolyFON，SOPA，HO，拉散劑MF等)，穩(wěn)定劑(如抗壞血酸)均勻混合，將水分調(diào)節(jié)到2％以下。在制備時先將微生物發(fā)酵物以外的成分混合并粉碎小于44微米后再與菌體混合?？蓾裥苑蹌┲形⑸锏闹亓堪俜直葹?5-75％。
以上菌劑的使用方法可以是拌種，拌土穴施、溝施，也可以是噴霧。
以上菌劑的使用時期可以是種子期，苗期和成株期。
本發(fā)明產(chǎn)品對根結(jié)線蟲的防治試驗(yàn)試驗(yàn)一液體培養(yǎng)法制備的粉劑防治根結(jié)線蟲的室內(nèi)和溫室實(shí)驗(yàn)1.試驗(yàn)菌劑粉劑(其中，填料為85％草炭，15％硅藻土，助劑為烷基萘磺酸鹽和木質(zhì)素磺酸鹽，菌劑中微生物的重量百分比為15％)。
2.試驗(yàn)方法將粉劑與沙土(40％的粗沙，10％的細(xì)沙，5煤渣，45％的泥土)混合。設(shè)以下處理，a.以20g菌劑/升沙土的比例混合，b.以10g菌劑/升沙土的比例混合，c.以5g菌劑/升沙土的比例混合，d.用經(jīng)高溫滅菌的菌劑，以10g菌劑/升沙土的比例混合，e.不加菌劑的沙土。
室內(nèi)實(shí)驗(yàn)是取200ml的每種土樣放到250ml有螺旋蓋的的容器內(nèi)，輕輕壓實(shí)，接種花生根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)的卵約10000粒，將濕度調(diào)到8％，蓋上蓋子后將整個容器置于一密閉的溫度為25℃，濕度為100％的大容器中，放置4周后，用漏斗分離法(Whitehead and Hemming，1965)分離、記數(shù)土壤中的線蟲。
溫室實(shí)驗(yàn)是以10g菌劑/升沙土的比例混合，在直徑為15cm的塑料缽中填加1000ml菌劑-沙土混合物，設(shè)5個重復(fù)，接種花生根結(jié)線蟲(Meloidogyneincognita)的卵約10000粒/缽，2周后，移栽剛發(fā)芽的番茄種子，每缽2粒。4周后記數(shù)根系上的瘤結(jié)數(shù)。以不加菌劑的沙土做對照。
3.結(jié)果室內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果顯示(表1)，在每升沙土加10g菌劑的處理中，菌劑對花生根結(jié)線蟲M.incognita卵的致死率高達(dá)92.36％。
表1菌劑對花生根結(jié)線蟲M.incognita卵的致死率(％)處理 幼蟲數(shù)量 致死率A73 94.07B94 92.36C52157.64D1175 4.47E1230 /溫室試驗(yàn)的結(jié)果為對照的瘤結(jié)數(shù)為302個/株，菌劑處理的瘤結(jié)數(shù)為64個/株，瘤結(jié)減少率為78.80％。
試驗(yàn)二固體培養(yǎng)法制備的顆粒劑防治根結(jié)線蟲的溫室實(shí)驗(yàn)1.試驗(yàn)菌劑顆粒劑(其中，填料為75％草炭，10％硅藻土，15％高嶺土，助劑為烷基萘磺酸鹽和木質(zhì)素磺酸鹽，菌劑中微生物的重量百分比為75％)。
2.試驗(yàn)方法按試驗(yàn)一的方法進(jìn)行。
3.結(jié)果對照的瘤結(jié)數(shù)為351個/株，菌劑處理的瘤結(jié)數(shù)為43個/株，瘤結(jié)減少率為84.9％。
試驗(yàn)三顆粒劑防治根結(jié)線蟲的溫室實(shí)驗(yàn)1.試驗(yàn)菌劑本發(fā)明液體培養(yǎng)法制備的顆粒劑，其中，填料為75％草炭，10％硅藻土，15％高嶺土，助劑為烷基萘磺酸鹽和木質(zhì)素磺酸鹽，菌劑中微生物的重量百分比為45％。
對照藥劑5％涕滅威顆粒劑(山東寧陽化工廠)2、試驗(yàn)處理(1)生物殺線蟲顆粒劑1千克/畝(2)生物殺線蟲顆粒劑1.5千克/畝(3)生物殺線蟲顆粒劑2千克/畝(4)生物殺線蟲顆粒劑2.5千克/畝(5)5％涕滅威顆粒劑1千克/畝
(6)5％涕滅威顆粒劑2.5千克/畝(7)空白對照3、實(shí)驗(yàn)方法供試作物為煙草(Nicotiana tabacum)的云煙87品種，感染花生根結(jié)線蟲(Meloidogyne arenaria)；地點(diǎn)為云南嵩明縣接屆村，黃壤土。試驗(yàn)小區(qū)面積為20平方米，每處理四次重復(fù)，小區(qū)排列采取隨機(jī)排列法。在煙苗移栽時，將藥劑與部分土壤混合，施于根際，實(shí)驗(yàn)期間按常規(guī)管理。實(shí)驗(yàn)時間2001年5月1日至2001年8月30日。
4、調(diào)查方法2001年8月30日煙葉全部采收后調(diào)查根結(jié)病情指數(shù)，病株率，土壤中的幼蟲數(shù)，平均每克根系的卵粒數(shù)，雌蟲數(shù)。病情指數(shù)按煙草病害藥效試驗(yàn)方法Y/cT40-1996計(jì)算。防治效果＝對照線蟲數(shù)[幼蟲+卵+雌蟲]-處理線蟲數(shù)]/對照線蟲數(shù)*100％。
5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表1實(shí)驗(yàn)結(jié)果

6.結(jié)果分析從表1可以看出，使用本發(fā)明制備的菌劑對田間防治煙草根結(jié)線蟲都有不同程度的防治效果，與對照相比較能顯著降低田間的線蟲數(shù)量，根結(jié)線蟲造成的危害明顯比對照減輕。防治效果隨施用量的增加而增加，當(dāng)施用量在2.0-2.5千克/畝的防治效果沒有顯著性差異，防效在78.2-81.1％之間，其防治效果與每畝施用2.5千克5％涕滅威顆粒劑(防效84.7％)相當(dāng)。從表中結(jié)果可以看出用本發(fā)明制備的菌劑在田間的施用量適宜在每畝2千克左右。
本發(fā)明具有原料成本低，生產(chǎn)工藝先進(jìn)，菌體產(chǎn)量高，所制成的菌劑對植物寄生線蟲有很好的防效等優(yōu)點(diǎn)。
實(shí)施例2液體培養(yǎng)大規(guī)?；a(chǎn)制備粉劑的方法按液體種子∶MC培養(yǎng)基＝1∶20(V/V)的比例將種子接入裝有3200立升MC培養(yǎng)基的4000立升發(fā)酵罐中，32℃，450rpm，培養(yǎng)96小時后接入裝有28000立升MC培養(yǎng)基30000立升發(fā)酵罐，32℃，450rpm條件下培養(yǎng)4天。按實(shí)例1中的方法生產(chǎn)和制備粉劑，其中，按菌體(體積)∶草炭(重量)∶硅藻土(重量)＝45毫升∶45克∶10克的比例混合，這樣制備的菌劑中微生物含量約45％。
實(shí)施例3固體培養(yǎng)小規(guī)模化生產(chǎn)制備顆粒劑的方法將培養(yǎng)料(25％麥麩，45％紅薯粉，25％草粉，5％黃豆粉)混合均勻，用適量的水調(diào)節(jié)培養(yǎng)料的水分含量到35％，然后將培養(yǎng)料裝入塑料袋，每袋1公斤，121℃下滅菌4小時，冷卻后在塑料袋培養(yǎng)料的兩端分別接種5毫升液體種子，25℃下培養(yǎng)30天后，將菌絲長滿培養(yǎng)料按體積比為1∶1與25％的硅藻酸鈉溶液混合，然后用造粒機(jī)制成直徑為4mm，長度為4.5cm的顆粒，在32℃下烘干到水分含量小于10％，制成顆粒劑。這樣制備的顆粒劑中微生物的重量百分比約75％，實(shí)施例4可濕性粉劑的小量制備按實(shí)施例1方法生產(chǎn)微生物，用板框過濾去2/3的液體，將菌體與填料按15克∶85克的比例混合，其中填料為95％草炭，2％吐溫-60，1％十二烷基苯磺酸鈉，1％拉散劑MF，1％抗壞血酸，混合后將水分調(diào)節(jié)到2％以下。這樣制備的可濕性粉劑中微生物的重量百分比約15％
權(quán)利要求
1.一種生物殺線蟲菌劑的生產(chǎn)方法，其生產(chǎn)工序包括微生物菌種培養(yǎng)，微生物液體條件下或固體條件下的大量繁殖和菌劑加工，其特征在于1.1所用的微生物為指狀節(jié)叢孢Arthrobotrys.dactyloides LX-Ad菌株，該菌株2002年10月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCCNo.0805；1.2微生物液體下大量繁殖所用的培養(yǎng)基成分為糖蜜20g，玉米粉5g，硫酸銨5g，氯化鈉6g，硫酸二氫鉀0.5g，檸檬酸三鈉4.5g，水1000ml；1.3微生物固體下大量繁殖的培養(yǎng)基成分可以是單一的麥麩，小麥?；蚍?，高粱粉，玉米粉或者粒，紅薯粉，米糠，大米，棉籽殼，禾本科植物的莖葉粉碎物，淀粉，黃豆粉，也可以起其中兩種或兩種以上成分的組合；1.4微生物在該菌劑中的重量百分比為15％-75％，菌劑的相對濕度小于10％。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物殺線蟲菌劑的生產(chǎn)方法，屬生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。該生產(chǎn)方法的工序包括微生物菌種培養(yǎng)，微生物的大量繁殖及菌劑加工。本發(fā)明使用的微生物為指狀節(jié)叢孢Arthrobotrys dactyloides LX－Ad菌株，該菌株2002年10月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No.0805。利用本發(fā)明生產(chǎn)的菌劑對植物寄生線蟲有很好的防效。具有原料成本低，生產(chǎn)工藝先進(jìn)，菌體產(chǎn)量高，所制成的菌劑對植物寄生線蟲有很好的防效等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號A01N63/00GK1462583SQ03117930
公開日2003年12月24日 申請日期2003年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月21日
發(fā)明者莫明和, 張克勤, 周薇 申請人:云南大學(xué)