專利名稱：雙基因特異性表達的轉(zhuǎn)基因抗真菌病害油菜培育方法
技術領域：
本發(fā)明屬于植物基因重組和油菜分子育種技術領域，具體地說涉及到一種利用基因拼接技術構建抗病雙基因特異性表達載體，通過活體轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入油菜中，提高油菜對真菌性病害的抗性，培育一種抗真菌病害的油菜新品種或創(chuàng)造新資源材料的方法。
背景技術：
菌核病是油菜的主要病害，該病是由核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)的子囊孢子直接侵染衰老葉片，或先侵染飄落在衰老葉片上的花瓣后再產(chǎn)生菌絲侵入葉片和植株本體(李強生等，油菜菌核病病原菌浸染條件的研究，2000，安徽農(nóng)業(yè)科學，28(3)314-315..)。幾丁質(zhì)是核盤菌菌絲體細胞壁的主要組成部分。幾丁質(zhì)酶破壞真菌菌絲尖端新合成的幾丁質(zhì)而抑制病菌的生長(Broglie等，Transgenic plants with enhanced resistance to the fungal pathogen，1991，Rhizoctonia solani.Science 2541194--1197.)。通過將幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)移到油菜中可使其幾丁質(zhì)酶活性顯著提高，增強油菜對菌核病等真菌病害的田間耐性(Crison等，F(xiàn)ield tolerance tofungal pathogens of Brassica napus constitutively expression a chimeric chintinases gene，1996.，Nature Biotechnolgy，(14)318-643.)。草酸是核盤菌侵染寄主植物后分泌的毒素。草酸氧化酶分解草酸、緩解核盤菌在油菜體內(nèi)的毒性，轉(zhuǎn)草酸氧化酶基因的轉(zhuǎn)基因油菜的抗病性也得到了一定程度的增強(Poulsen等，Genitic transformation ofBrassica napus，1996，Plant Breeding115209-225；.Thompson C，Degradation of oxalic acid by transgenic oilseed rapeplants expressiong oxalate oxidase，1996，Euphytica 85169～172.)。但研究發(fā)現(xiàn)，具有單一抗病機制的單基因轉(zhuǎn)化往往不能表現(xiàn)出理想的抗病性(Lamb等，Jach等，Enhancedquantitative resistance against fungal disease by combinatorial expression ofdifferent barley antifungal proteins in transgenic tobacco，1995，Plant J.897～109)。以前的研究還表明，組成型表達的幾丁質(zhì)酶基因或草酸氧化酶基因可能嚴重影響轉(zhuǎn)基因植株正常的發(fā)育和結實(Medford等，Alteration ofendogenous cytokinins in transgenic plantsusing a chimeric isopentenyl transferase gene.，1989.，Plant Cell 1403～413.1989；Thompson等，Degradation of oxalic acid by transgenic oilseed rape plants expressiong oxalate oxidase.，1995.，Euphytica 85169～172.)，SAG12是擬南芥衰老葉片相關基因啟動子，可以使受其調(diào)控的基因在衰老葉片中特異性表達(Lohman KN等.Molecular analysis of naturalsenescence in Aradopsis thaliana，1994，Physiologia Plantarum 92，332～328)。上述技術雖然在一定程度上解決現(xiàn)有油菜品質(zhì)性狀的改良或者某些抗性的改善等方面產(chǎn)生一些積極的效果，但是這些效果往往比較單一，存在著消耗植物體內(nèi)能源和生理擾亂問題，最終導致改善的效果可能會有較大的損失。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的在于克服現(xiàn)有技術存在的缺陷，將幾丁質(zhì)酶基因和草酸氧化酶基因與擬南芥衰老葉片啟動子SAG12相嵌合，使兩外源基因僅在轉(zhuǎn)基因油菜的衰老葉片中表達，這不僅會大大增強油菜的抗病性，減輕轉(zhuǎn)基因植株的能源消耗和生理擾亂，還將使轉(zhuǎn)基因作物更具有實用性。另外，由于在進化上花瓣是由葉片演化而來，是葉的變態(tài)，上述基因還可能在SAG12的啟動下在花瓣中尤其是將要飄落的花瓣中特異性表達，使核盤菌難以侵染花瓣，從而減輕核盤菌對植株的再侵染。本發(fā)明的另一個目的是創(chuàng)造一種實用性強的高抗真菌病害的轉(zhuǎn)基因油菜，將上述兩種基因用活體轉(zhuǎn)化方法(In planta)共同轉(zhuǎn)化油菜，調(diào)控外源基因在油菜中的表達部位和表達時期，以大幅度減輕轉(zhuǎn)基因?qū)χ仓暾０l(fā)育和結實的影響，從而獲得抗真菌性病害的雙價轉(zhuǎn)基因油菜品種，或者創(chuàng)造油菜育種新種質(zhì)材料，從而減輕轉(zhuǎn)基因植株的能源消耗和生理擾亂，該方法將克服現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因技術效率不高、單基因轉(zhuǎn)化油菜抗病性不強和能源損耗大之不足。
發(fā)明的具體技術方案由以下步驟實現(xiàn)以聚合酶鏈式反應(PCR)擴增的方法從蕓苔屬以外的植物基因組中克隆幾丁質(zhì)酶基因(該基因來源文獻見Broglie，K.E.等，Ethylene-regulated gene expressionmolecular cloning ofthe genes encoding an endochitinase from Phaseolus vulgaris.，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83(18)6820-6824.)和草酸氧化酶基因(該基因的來源見文獻Zhang，Z.等，Germin-like oxalateoxidase，a H2O2-producing enzyme，accumulates in barley attacked by the powdery mildewfungus.，1995，Plant Journal 8139-145.)的氨基酸編碼序列，或用限制性內(nèi)切酶切下克隆在質(zhì)粒中的幾丁質(zhì)酶基因和草酸氧化酶基因的氨基酸編碼序列，從十字花科植物基因組中克隆衰老葉片特異表達的啟動子序列(該啟動子序列來源于文獻Gan，S.and Amasino，R.M.Inhibitionof leaf senescence by autoregulated production of cytokinin.，1995，.Science 270(5244)1986-1988)，或用限制性內(nèi)切酶切下克隆在質(zhì)粒中的擬南芥衰老葉片特異表達啟動子SAG12的DNA序列，然后用基因工程方法將幾丁質(zhì)酶基因和草酸氧化酶基因的氨基酸編碼序列與衰老葉片特異表達啟動子拼接成雙基因表達載體，用活體轉(zhuǎn)化方法將此構建物轉(zhuǎn)入油菜受體中，通過篩選和育種途徑，培育出在真菌性病害尤其是菌核病發(fā)病高峰期在病菌初始侵染部位具有較高抗病性的油菜新品種或新種質(zhì)。其操作步驟如下一種培育抗真菌性病害的油菜新品種的方法，其特征在于A、利用聚合酶鏈式反應(RCR)或用限制性內(nèi)切酶分離植物幾丁質(zhì)酶基因和草酸氧化酶基因的氨基酸編碼序列和雙子葉植物基因組衰老葉片特異表達的啟動子序列；B、通過基因重組方法構建適合于在植物中表達的重組雙基因的表達載體C、利用活體轉(zhuǎn)基因方法將外源幾丁質(zhì)酶基因和草酸氧化酶基因?qū)胗筒耸荏w，獲得轉(zhuǎn)化植株
D、借助報告基因和RCR方法鑒定陽性轉(zhuǎn)化株，分單株收種E、種植上季選留的種子，取葉片接種病菌和草酸脅迫鑒定，挑選有希望的株系，利用PCR方法鑒定陽性單株，進一步用分子雜交方法鑒定陽性轉(zhuǎn)化株的整合拷貝數(shù)，將含1至少數(shù)幾個拷貝的抗病轉(zhuǎn)化株自交留種；F、種植收獲的E步驟的種子，繼續(xù)接種病菌和草酸脅迫鑒定，進一步考察轉(zhuǎn)基因油菜抗病能力和農(nóng)藝性狀，從表型穩(wěn)定、抗病性及農(nóng)藝性狀有較大改善的2-3個株系中選擇其純合的單株；G、進一步培育成油菜新品系或育種新資源。
附圖及其說明


圖1本發(fā)明的器官和發(fā)育特異性表達雙基因載體ApSCO的構建示意圖其中A是本發(fā)明的中間載體pSAGOxO的結構示意；B是本發(fā)明的中間載體pSCON的結構示意；C是本發(fā)明的中間載體pSPCHiN的結構示意；D是本發(fā)明的中間載體pApSON的結構示意；E是本發(fā)明的目標載體ApSCO的結構示意；本發(fā)明的積極效果在于1、將幾丁質(zhì)酶基因和草酸氧化酶基因這兩種在抗病機理上十分不同的基因組合在一起，構成了抵抗菌核病害的雙重屏障，使油菜植株表現(xiàn)超強抗病性，創(chuàng)造了一種培育抗真菌性病害油菜育種的新方法；2、由于使用了葉片衰老特異性啟動子，轉(zhuǎn)基因油菜僅僅在需要抵抗病菌的特定時期和特定器官中表現(xiàn)抗病性，可以減輕轉(zhuǎn)基因植株的能源消耗和生理擾亂；3、利用活體轉(zhuǎn)化技術大大提高了轉(zhuǎn)基因的效率，開拓了油菜轉(zhuǎn)基因的新途徑；4、本發(fā)明可以直接應用于其它抗病作物新品種和新資源的創(chuàng)新；5、本發(fā)明采用轉(zhuǎn)基因方法，結合分子生物學技術輔助育種，使油菜特定新品種的選育周期縮短、并使育種的效率得到了較大的提高。
詳細的技術細節(jié)由以下實例給出，但并不限制本發(fā)明的保護范圍。
具體實施例方式
實施例1器官和發(fā)育特異性表達雙基因載體ApSCO的構建1.1含SAG12啟動子、幾丁質(zhì)酶基因和細胞膜引導肽基因的中間載體pSPCHiN的構建用EcoRV和NcoI雙酶切擬南芥葉片衰老啟動子SAG12的質(zhì)粒載體pSG449后，電泳回收1.3kb的片段，并用Klenow片段補平，插入到大麥草酸氧化酶基因載體pHvOxOa的EcoRV位點，得到重組質(zhì)粒pSAGOxO(見附
圖1A)。用BamHI酶切含有幾丁質(zhì)酶(chitinase)基因和葡聚糖酶基因的質(zhì)粒載體pHGC39，回收含有幾丁質(zhì)酶基因和nos終止子的1.4kb片段，插入pSAGOxO的BamHI位點，得到重組質(zhì)粒pSOCN(見附
圖1B)。用EcoRI酶切含草酸氧化酶基因的載體pSOCHiN，回收不含該基因的6.1kb片段，與含細胞膜引導肽基因pr16的質(zhì)粒載體pBS的EcoRI/HindIII雙酶切片段平端連接，得到中間載體pSPCHiN。質(zhì)粒pSPCHiN含有pSAG12啟動子，pr16引導肽基因，幾丁質(zhì)酶基因和tnos終止子(見附
圖1C)。
1.2含草酸氧化酶基因的中間載體ApSON的構建用BamHI和XbaI雙酶切載體pHGC39，回收13kb片段，補平末端，與載體pSAGOxO被XbaI和HindIII雙酶切回收并補平末端的3.1kb片段連接，得到載體ApSON(見附
圖1D)。
1.3器官和發(fā)育特異性表達雙基因載體ApSCO的構建用XbaI和HindIII雙酶切中間載體pSPCHiN，回收3.7kb片段，插入到載體ApSON的EcoRV位點中，得到重組質(zhì)粒ApSCO(見附
圖1E)。
實施例2以活體轉(zhuǎn)化法(in planta)轉(zhuǎn)化甘藍型油菜吸取甘油冷凍保存的含有載體ApSCO的農(nóng)桿菌100μl，接種于10ml新鮮的LB(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，PH7.0)培養(yǎng)基中，在28℃左右150rpm振蕩培養(yǎng)過夜。將上述培養(yǎng)物10ml接種于1L含有50mg·L-1的卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，在28℃左右150rpm振蕩培養(yǎng)24小時以上，直至OD660＝1-1.5。
將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌懸液在8000g下離心8分鐘，沉淀后的農(nóng)桿菌用1升新鮮的LB培養(yǎng)基重新懸浮。實驗采用農(nóng)桿菌懸浮液直接浸染油菜花序的方法，浸染前確?；ㄉ蠜]有露水和泥土，然后選擇那些花即將開放的分枝，并且把分枝上已經(jīng)開放的花剪掉。浸染時將整個分枝浸于農(nóng)桿菌懸浮液中并上下?lián)u動1分鐘左右。在確保所有花都已被浸染后，用紙袋將處理過的花序套住。
整個過程自第一次浸染后每天或隔天進行一次，共10至15次。每次浸染選擇清晨和傍晚進行，以避免太陽紫外線過強使農(nóng)桿菌活性降低。雨天暫停浸染。
于終花期將花序上的紙袋取下，管理好植株。待種子成熟時，將經(jīng)過活體轉(zhuǎn)化法處理過的分枝剪下單獨收獲種子，曬干后脫粒并干燥儲藏。
實施例3轉(zhuǎn)基因油菜植株的篩選與分子生物學鑒定3.1卡那霉素篩選活體轉(zhuǎn)化法(in planta)處理種子在經(jīng)過活體轉(zhuǎn)化(in planta)處理的種子中選擇較飽滿者，用0.1％的升汞浸泡12到15分鐘，然后經(jīng)無菌水清洗三次后，均勻撥撒于含有卡那霉素270mg·L-1的MS固體培養(yǎng)基上(見Murashige T and Skoog F.A revised medium for rapid growth and bioassays with tobaccotissue culture.，1962，Physiologia Plantarum 15473-497)。四到五天后，萌發(fā)的幼苗中轉(zhuǎn)入外源基因者具有卡那霉素抗性，可以正常存活；未轉(zhuǎn)入外源基因的幼苗不具有卡那霉素抗性，子葉葉片邊緣褐化，在子葉及第一片真片表面出現(xiàn)白斑，葉柄變紫變紅，最終死掉。將存活下來的幼苗移栽至營養(yǎng)缽，經(jīng)DNA檢測確信外源基因的存在后移至土壤中。
3.2轉(zhuǎn)基因油菜植株的PCR檢測a)微量法提取油菜葉片總DNA取轉(zhuǎn)基因植株的幼嫩葉片，放在1.5ml的Eppendof管中，加入0.2ml微量提取液。每10mlDNA微量提取液含1ml Tris-HCl(1M，PH8.0)，1ml EDTA(0.5M，PH8.0)，5ml NaCl(2M)，69.44μl新鮮的ME。用鉆頭將Eppendof管中葉片磨碎。再加入0.7ml微量提取液劇烈振蕩，然后在冰上靜置30min。在Eppendof管中加入0.5ml苯酚，上下顛倒混合后在12000rpm下離心5min，吸取2/3體積上清移置新的1.5ml Eppendof管中，再加入0.6倍體積的異丙醇，在12000rpm下離心6min，倒掉上清，待沉淀吹干后用30μl TE溶解。
b)PCR檢測以提取的植株葉片總DNA為模板，根據(jù)nptII基因的表達序列設計并合成引物5’-CGTAAAGCACGAGGAAGC-3’和5’-AATGAACTCCAGGACGAGG-3’。設計PCR反應總體積為20μl，其中模板500ng，7dNTP 0.2mmol·L-1，引物濃度0.5μmol·L-1。將各組分均勻混合在9600熱循環(huán)儀上進行PCR反應94℃ 3min；94℃ 1min，68℃ 1min，72℃ 2min，35個循環(huán)；72℃延伸10min4℃保存，通過凝膠電泳檢測PCR擴增片段。電泳檢測擴增完畢，在1×TAE緩沖液中，1％的瓊脂糖凝膠，100v電壓下電泳分離擴增產(chǎn)物。
3.3轉(zhuǎn)基因植株的Southern-blot分析用SDS法大批量地提取總DNA，用堿轉(zhuǎn)移法進行Southern-blot分析(見孟金陵等，用RFLP標記分析甘藍型油菜的遺傳多樣性，1996，遺傳學報，23(4)293-306.)3.4反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)用TRIZOL(Gibco公司產(chǎn)品)提取RNA(方法參見Gibco公司說明書)。用反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV RTase)和RNA抑制劑(購自Promega公司)進行反轉(zhuǎn)錄PCR(方法參見J.薩姆布魯克等，分子克隆實驗指南，1993年，科學出版社出版)。
實施例4轉(zhuǎn)基因油菜植株的抗病性鑒定4.1離體葉片接種鑒定將核盤菌在25℃黑暗條件下培養(yǎng)1-2天后接種葉片(離體葉片的獲得與接種方法參考Zhao，Meng 2002.Genetic analysis of loci associated with partial resistance to Sclerotiniasclerotiorum in rapeseed(Brassica napus L.).Theor.Appl.Genet.)病斑直徑作為抗感反應的指標。根據(jù)測得的病斑直徑可以計算出各株系的病斑指數(shù)DI＝∑(ng)/(CN)×100％，g為轉(zhuǎn)基因植株病斑直徑，n為每單株所測病斑數(shù)或葉片數(shù)，N為所測病斑或葉片總數(shù)，C為對照病斑直徑。
4.2離體花瓣接種鑒定在油菜的盛花期，每棵單株剪下一只花枝。將該花枝插在一個三角瓶內(nèi)，三角瓶放在一個托盤上，等待花瓣自然脫落。將自然脫落的花瓣放在新鮮嫩綠的葉片上，然后在花瓣上接一個菌絲塊，在26℃培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)48小時后觀察。
4.3離體葉片草酸抗性鑒定在油菜生育期的大約十葉期，摘取貼近地面的無破損，無病蟲害的衰老葉片(帶柄)編號放入一次性塑料袋。將葉片的葉柄插在一個三角瓶內(nèi)，三角瓶內(nèi)盛有濃度為20mmol/L的草酸溶液，對照為水。在28℃，每天光照12小時，三天后觀察性狀。
離體葉片受草酸毒害的分級標準為0級，液面以上部分無病狀；1級，葉柄有棕腐病斑；2～5級，棕腐病斑和枯萎面積占總葉面的比例分別為＜1/4，1/4～1/2，1/2～3/4及＞3/4。根據(jù)草酸毒害級別求草酸毒害指數(shù)TI＝∑(ng)/(5N)×100％，g為毒害級別，n為每級別中植株數(shù)或葉片數(shù)，N為植株或葉總數(shù)，5為最高級別。
本發(fā)明的效果的舉例1.本實驗通過活體轉(zhuǎn)化方法在T0代獲得99株轉(zhuǎn)基因植株。對T1代的6個株系的抗性分析表明，轉(zhuǎn)基因株系離體葉片接種核盤菌后的平均病斑直徑為1.47±0.22cm，僅為對照的1/2，病情指數(shù)和草酸毒素指數(shù)均大幅度下降(表1)。離體花瓣接種平均病斑直徑也比對照小32.4％。
表1 T1代轉(zhuǎn)基因油菜植株的病情指數(shù)和草酸毒素指數(shù)比較株系編號 病情指數(shù) 病斑直 病斑直徑 對照品種 毒素毒素抗性(％) 徑 變異系數(shù) 病斑直徑 指數(shù)變異系數(shù)(cm) (cm) (％)Z3 52.90 1.510.34 2.85 45.00 0.62Z6 50.70 1.450.25 2.85 34.50 0.68N1 51.50 1.320.27 2.57 56.00 0.64N2 61.70 1.590.33 2.57 50.00 0.58X8 48.10 1.470.13 3.06 42.50 0.34X2048.70 1.490.08 3.06 55.40 0.16平均值 52.27 1.470.22 2.83 47.20.502.外源抗病基因在轉(zhuǎn)基因植株中特異性表達。轉(zhuǎn)基因植株衰老葉片平均病斑直徑擴展速率比幼嫩葉片小72％，接種24小時后，轉(zhuǎn)基因植株衰老葉片平均病斑直徑比幼嫩葉片小61.9％。所有當選轉(zhuǎn)基因株系后代育性良好，表型正常。
權利要求
1.一種培育抗真菌性病害的油菜新品種的方法，其特征在于A、利用聚合酶鏈式反應(RCR)或用限制性內(nèi)切酶分離植物幾丁質(zhì)酶基因和草酸氧化酶基因的氨基酸編碼序列和雙子葉植物基因組衰老葉片特異表達的啟動子序列；B、通過基因重組方法構建適合于在植物中表達的重組雙基因的表達載體C、利用活體轉(zhuǎn)基因方法將外源幾丁質(zhì)酶基因和草酸氧化酶基因?qū)胗筒耸荏w，獲得轉(zhuǎn)化植株D、借助報告基因和RCR方法鑒定陽性轉(zhuǎn)化株，分單株收種E、種植上季選留的種子，取葉片接種病菌和草酸脅迫鑒定，挑選有希望的株系，利用PCR方法鑒定陽性單株，進一步用分子雜交方法鑒定陽性轉(zhuǎn)化株的整合拷貝數(shù)，將含1至少數(shù)幾個拷貝的抗病轉(zhuǎn)化株自交留種；F、種植收獲的E步驟的種子，繼續(xù)接種病菌和草酸脅迫鑒定，進一步考察轉(zhuǎn)基因油菜抗病能力和農(nóng)藝性狀，從表型穩(wěn)定、抗病性及農(nóng)藝性狀有較大改善的2-3個株系中選擇其純合的單株；G、進一步培育成油菜新品系或育種新資源。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用RCR或限制性內(nèi)切酶分離植物幾丁質(zhì)酶基因和草酸氧化酶基因的氨基酸編碼序列和雙子葉植物基因組衰老葉片特異表達的啟動子序列，通過基因重組技術構建適合于在植物中表達的重組雙基因的表達載體。利用活體或離體轉(zhuǎn)基因方法將外源幾丁質(zhì)酶基因和草酸氧化酶基因?qū)胗筒耸荏w，獲得轉(zhuǎn)化植株。通過分子輔助選擇并結合常規(guī)育種提高了油菜對真菌性病害的抗性，創(chuàng)造了一種抗病油菜新品種或創(chuàng)造油菜新資源材料的新方法。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因油菜僅僅在需要抵抗病菌的特定時期和特定器官中表現(xiàn)抗病性，可以減輕轉(zhuǎn)基因植株的能源消耗和生理擾亂。本發(fā)明也可以用于其他植物的育種上。
文檔編號A01H5/00GK1519323SQ03118509
公開日2004年8月11日 申請日期2003年1月23日 優(yōu)先權日2003年1月23日
發(fā)明者孟金陵, 徐光碩, 趙建偉, 饒勇強 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學