專利名稱：一種預(yù)防人艾滋病毒和其它病原體性傳播的新型殺微生物劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及預(yù)防艾滋傳播的制藥領(lǐng)域，具體地，涉及硝酸鑭和來源于青陽參的β-D-(1-4)-葡聚糖硫酸酯化合物配制而成的復(fù)方制劑。
背景技術(shù)：
性傳播疾病(sexually transmitted disease，STD)已經(jīng)成為我國(guó)和全球的生殖健康和衛(wèi)生防疫的難題。僅以美國(guó)為例，在前十位常見疾病中，STD就有五種。每年的新病例有1200萬，僅1994年的預(yù)防開支達(dá)到170億美元左右，由此可見它的危害。在其他國(guó)家，特別是發(fā)展中國(guó)家(包括中國(guó))，STD引起的危害和損失也是很大的。據(jù)我國(guó)權(quán)威部門公布的材料，我國(guó)性病的年增長(zhǎng)率超過30％，艾滋病和艾滋病毒感染者的增長(zhǎng)率，1999年比1998年分別增長(zhǎng)105％和250％。
在20多種性傳播疾病當(dāng)中，危害最大的是艾滋病。到2002年底，全球已死亡艾滋病人3000萬人，僅2002年就死亡310萬人，有4200萬人感染上了艾滋病毒，2002年就有500萬新感染者，每天有約一萬五千人新感染上艾滋病毒，其中婦女約占總數(shù)的44％。由同性或異性性傳播引起的感染者占80-90％。雖然已有高效聯(lián)合療法(雞尾酒療法)可以減少發(fā)病率和死亡率，但還不能治愈。所需要的醫(yī)療費(fèi)用更是絕大部分發(fā)展中國(guó)家的患者無法承受的開支。根據(jù)消滅天花和脊髓灰質(zhì)炎的經(jīng)驗(yàn)，即使將來研制出高效艾滋病疫苗，其他防治方法也還需要繼續(xù)使用至少五十年。已有研究表明，其它的性傳播疾病會(huì)增加艾滋病毒感染的機(jī)會(huì)，所以針對(duì)殺其它STD病原體的殺微生物劑的使用，除了直接減少這些疾病的發(fā)生之外，還會(huì)間接地阻止艾滋病毒的性傳播。因此，目前的主攻方向是研制出高效、價(jià)廉和安全的針對(duì)艾滋病毒的殺微生物劑。由此可見，研制出實(shí)用的殺微生物劑是社會(huì)十分迫切需要的。
鑒于殺微生物劑在減少性傳播所引起的HIV感染以及其它性傳播病原體引起的疾病的發(fā)生方面可能會(huì)發(fā)揮重要作用，聯(lián)合國(guó)艾滋病總署，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院，疾病控制中心，美國(guó)避孕研究與發(fā)展計(jì)劃(CONRAD)以及許多非政府組織，多種私人基金會(huì)都特別強(qiáng)調(diào)殺微生物劑的研究，某些大的制藥公司也逐步更多地投入資金和參與這類研究。由洛氏基金會(huì)資助，1999年3月29-4月2日在意大利召開的避孕研究與發(fā)展的公立和私立機(jī)構(gòu)合作會(huì)議上，有好幾個(gè)報(bào)告專門闡述了殺微生物劑的重要性和最新研究進(jìn)展。2000年1月13-14日，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的變態(tài)反應(yīng)與傳染病研究所召開了關(guān)于局部使用的殺微生物劑臨床前評(píng)價(jià)的學(xué)術(shù)討論會(huì)。2000年3月13日-16日在美國(guó)首都華盛頓附近的Alexandria，2002年5月在比利時(shí)分別召開了題為Microbicides 2000和2002的大型國(guó)際性學(xué)術(shù)討論會(huì)，每次參加人數(shù)達(dá)600多，來自全世界好幾十個(gè)國(guó)家的代表出席了會(huì)議。聯(lián)合國(guó)艾滋病總署的主任PeterPiot專程出席并做了報(bào)告。我國(guó)的艾滋病毒感染的態(tài)勢(shì)十分嚴(yán)峻。采取有效措施，減少像我國(guó)這樣一個(gè)具有世界最多人口的發(fā)展中國(guó)家的HIV感染的傳播，是十分緊迫的任務(wù)。如前所述，我們不能坐等有效的HIV疫苗來阻止和消滅HIV-1的傳播。即使已有這種疫苗，艾滋病的流行也仍然至少會(huì)持續(xù)50年左右。脊髓灰質(zhì)炎和天花的實(shí)例就已經(jīng)證明這一點(diǎn)。因此，我們不能等到像目前有些發(fā)展中國(guó)家那樣，HIV感染已經(jīng)成災(zāi)，已經(jīng)成為國(guó)家的嚴(yán)重社會(huì)和經(jīng)濟(jì)問題之后再來頭痛醫(yī)頭，腳痛醫(yī)腳。我們必須積極研究新的能夠減少或阻止HIV-1傳播的藥物或制劑，使之造福于社會(huì)和我們整個(gè)民族的未來。
目前還沒有一種殺微生物劑上市，正在研究之中的殺微生物劑至少有60種以上，按照作用機(jī)理可分為五類(1)直接殺死或滅活病毒和細(xì)菌的制劑；(2)抑制病毒進(jìn)入粘膜細(xì)胞的制劑；(3)抑制病毒與細(xì)胞融合的制劑；(4)抑制HIV與細(xì)胞融合之后的病毒活性或復(fù)制；(5)作為賦形劑的聚合物。其中有30來種是既具有抗微生物的活性，又有避孕或殺精子的活性，有的主要起避孕或殺精子作用，有16種只具有抗微生物的活性，4種具有機(jī)械屏障作用。在這些殺微生物劑當(dāng)中，有3種進(jìn)入臨床III期試驗(yàn)，4種進(jìn)入II期試驗(yàn)，16種進(jìn)入了I期臨床試驗(yàn)。在臨床前研究階段的有33種，其中已做過動(dòng)物試驗(yàn)的有28種，其余5種只有體外試驗(yàn)資料。特別值得指出的是，最新研究資料證明，以表面活性劑和去污劑組成的殺微生物劑(如壬丙醇等)會(huì)增加艾滋病毒性傳播的機(jī)會(huì)。學(xué)術(shù)界已經(jīng)公認(rèn)這類制劑應(yīng)該禁止使用。在我國(guó)，至今還未見類似的研究。
本發(fā)明所說的新型殺微生物劑是一個(gè)復(fù)方制劑，主要組成成分是化合物硝酸鑭和來源于青陽參的β-D-(1-4)-葡聚糖硫酸酯化合物，硝酸鑭分子量小，來源豐富，對(duì)人艾滋病毒及其它某些性傳播病原體引起的疾病有很好的抑制作用，治療指數(shù)達(dá)到700～900，而β-D-(1-4)-葡聚糖硫酸酯化合物是來源于一種特產(chǎn)植物青陽參，分子量為2萬左右的多糖，我們的研究結(jié)果表明，它對(duì)人艾滋病毒的抑制活性(治療指數(shù)TI值)大于1000，它能與HIV-1 GP120的V3區(qū)結(jié)合，從而阻止病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合。本發(fā)明使用復(fù)方可以通過多靶點(diǎn)作用，增強(qiáng)藥物抗病原體的的綜合力量和互補(bǔ)作用，達(dá)到增強(qiáng)藥效的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種預(yù)防艾滋病毒性傳播的新型殺微生物劑。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種預(yù)防艾滋病毒性傳播的新型殺微生物劑在阻止艾滋病毒性傳播中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種預(yù)防艾滋病傳播的新型殺微生物劑在阻止HSV性傳播中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種預(yù)防艾滋病傳播的新型殺微生物劑阻止白色念珠菌性傳播中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種預(yù)防艾滋病傳播的新型殺微生物劑阻止性傳播疾病病原體通過生殖道傳播中的應(yīng)用。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了下面的方案一種預(yù)防艾滋病傳播的新型殺微生物劑，是用硝酸鑭和β-D-(1-4)-葡聚糖硫酸酯化合物作為原料，以重量比為0.1∶1～1000∶1配制而成。
為了更好的了解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，下面用實(shí)驗(yàn)來說明本發(fā)明在阻止性傳播疾病病原體通過生殖道傳播的有益效果。
1、新型殺微生物劑體外抗HIV-1病毒活性檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)方法先進(jìn)行病毒感染性的滴定，在96孔板上，將病毒做倍比稀釋，設(shè)置梯度，并且每個(gè)梯度設(shè)置多個(gè)孔形成一組，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組。每孔加入適當(dāng)?shù)募?xì)胞(2×104/孔)，使每孔的終體積為200μl。37℃，5％CO2培養(yǎng)。第三天補(bǔ)加新鮮完全培養(yǎng)基100μl，第七天在倒置顯微鏡下觀察每孔中病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞致病變效應(yīng)(Cytopathic effect，CPE)，以每孔是否有合胞體的形成來確定；按Reed & Muench方法計(jì)算病毒的TCID50(50％ Tissue culture infectious dose)。用MTT方法測(cè)定細(xì)胞存活和增殖。取適量的細(xì)胞與不同濃度的樣品溶液混合，放置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)三天或者五天，測(cè)定細(xì)胞毒性IC50(50％ inhibition concentration)。然后在96孔平底培養(yǎng)板上，將待測(cè)樣品用培養(yǎng)基進(jìn)行倍比稀釋，設(shè)置適當(dāng)?shù)南♂尪?，每?00μl，設(shè)多個(gè)重復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照。對(duì)于病毒感染的細(xì)胞。每孔加適當(dāng)?shù)募?xì)胞，然后每孔加入適量的病毒上清，每孔的終體積為200μl，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。感染后第3天觀察樣品對(duì)合胞體形成的影響。在倒置顯微鏡下，計(jì)數(shù)病毒誘導(dǎo)細(xì)胞形成的合胞體數(shù)。通過計(jì)算得到新型殺微生物劑的治療指數(shù)。
(3)通過計(jì)算得出新型殺微生物劑的細(xì)胞毒性IC50(對(duì)50％的宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒性的樣品的濃度)；EC50為具有50％合胞體形成抑制率的樣品濃度。治療指數(shù)TI值(therapeutic index)為IC50/EC50的比值。
2、MTT法測(cè)定新型殺微生物劑體外對(duì)白色念珠菌的抑制作用取待試的新型殺微生物劑體10mg，用100μl DMSO助溶后，滴加900μl沙保氏培養(yǎng)基，充分混合后，使?jié)舛葹?0mg/ml，過濾除菌，置4℃保存；首先將待試藥新型殺微生物劑體稀釋至合適的濃度(96孔培養(yǎng)板)同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照和空白對(duì)照。每系列孔(除空白和生長(zhǎng)對(duì)照系列外)取100μl給下一孔，最終留100μl，余下的棄去。用頭孢菌素作陽性對(duì)照，濃度稀釋同待測(cè)新型殺微生物劑體的稀釋；用沙保氏培養(yǎng)基把白色念珠菌懸液濃度從4.5×106cfu/ml調(diào)到4.5×105cfu/ml，將稀釋好的菌液加入板中，每孔100μl，第9孔不加；接種菌液后，培養(yǎng)板于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，觀察生長(zhǎng)情況。待陰性對(duì)照孔生長(zhǎng)良好后，把板1000rpm離心10min。吸出150μl培養(yǎng)基。每孔各加5mg/ml的MTT(含1mM甲萘醌)25μl，放入37℃溫箱4小時(shí)，然后各孔加20％SDS-50％DMF(pH4.7)100μl；培養(yǎng)板37℃放置12小時(shí)后，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)595nm，參考波長(zhǎng)655nm下，測(cè)定OD值。通過計(jì)算得到樣品新型殺微生物劑體對(duì)白色念珠菌的抑制活性。
抑制率(％)＝(1-實(shí)驗(yàn)孔OD值/對(duì)照孔OD值)×1003、PRA法測(cè)定新型殺微生物劑體外對(duì)HSV病毒的抑制作用將Vero細(xì)胞懸液加入24孔板(2-4×105/well)，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)；待細(xì)胞單層鋪滿24孔板后，每孔加200μl病毒上清或培養(yǎng)基，輕搖，使病毒稀釋液和細(xì)胞單層充分接觸，37℃，5％CO2孵育1小時(shí)；用RPMI1640對(duì)藥物作兩倍稀釋，設(shè)置阿昔洛韋做陽性對(duì)照；棄培養(yǎng)基，加入PBS洗板；加入未凝固的瓊脂糖覆蓋培養(yǎng)基(A、B混和液)，每孔1ml。加入稀釋好的待測(cè)藥液，每孔0.5ml，其中第6孔(病毒生長(zhǎng)孔)和第12孔(細(xì)胞生長(zhǎng)孔)不加；置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)三天。然后用2％甲醛固定細(xì)胞10min；加入700μl龍膽紫染液，染色20min；用自來水輕輕洗滌3次，倒置涼干，在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)空斑。通過計(jì)算得到樣品新型殺微生物劑體對(duì)HSV病毒的抑制活性。
4、MTT法檢測(cè)新型殺微生物劑體外對(duì)Vero細(xì)胞的毒性作用在96孔平底培養(yǎng)板上，將待測(cè)化合物用培養(yǎng)基2倍稀釋。作7個(gè)稀釋度，每孔100μl，設(shè)兩個(gè)重復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置不含化合物的細(xì)胞對(duì)照組和空白組及阿昔洛韋陽性對(duì)照；離心(1000rpm，10min)，用完全培養(yǎng)基重懸后每孔加入100μl(4×105/well)懸液；置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)三天。然后將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板低速離心，取150μl培養(yǎng)上清，加入25μl MTT溶液(5mg/ml)，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)，加入20％SDS-50％DMF(pH4.7)，孵育過夜；用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的OD值。通過計(jì)算得到樣品新型殺微生物劑在體外對(duì)細(xì)胞的存活率的影響，了解其毒性作用。
名詞解釋TCID50(50％Tissue culture infectious dose)，即引起50％培養(yǎng)細(xì)胞出現(xiàn)CPE的病毒上清稀釋度；IC50對(duì)50％的宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒性的樣品的濃度；EC50具有50％合胞體形成抑制率的樣品的濃度；治療指數(shù)(therapeutic index，TI值)為IC50/EC50的比值，治療指數(shù)達(dá)到100以上的化合物則視為有抗病毒活性。
具體實(shí)施例方式下面用本發(fā)明的實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
實(shí)施例1β-D-(1-4)-葡聚糖硫酸酯化合物的制備方法根據(jù)已公開專利98118102.3方法制備，取青陽參(Cynanchum otophyllum)植物的根500克，粉碎成粉末后用熱水(94℃)浸提2-3次，合并浸提液，冷卻靜置4小時(shí)，離心沉淀(4000次/分)，傾瀉出上層液，沉淀物除去棄之。上層液用其2-3倍體積的甲醇加入，搖動(dòng)攪拌即有白色絮狀的多糖沉淀，放置過夜，上層液澄清，下層沉淀緊密。用吸液管吸去上層液，下層沉淀離心分離，棄去上層液，下層沉淀物轉(zhuǎn)移至抽濾漏斗抽氧過濾，濾出的沉淀先用丙酮洗滌，后用乙醚洗滌及壓濾，沉淀物在真空干燥器內(nèi)(器內(nèi)有五氧化二磷吸溫劑)抽氣真空干燥6小時(shí)，就得白色多糖10克。
實(shí)施例2新型殺微生物劑體外抗HIV作用檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)在96孔培養(yǎng)板上，將HIV-1(H9/HIV-1IIIB，由英國(guó)MRC惠贈(zèng)，按常規(guī)方法復(fù)蘇，培養(yǎng)，收集，分裝和凍存)貯存液作5倍稀釋，共8梯度，每個(gè)梯度設(shè)6孔，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組。每孔加入C8166細(xì)胞(為T淋巴細(xì)胞系，由英國(guó)Medical ResearchCouncil(MRC)，AIDS Reagent Project惠贈(zèng))50μl(2×104/孔)，每孔終體積為200μl。37℃，5％CO2培養(yǎng)。第三天補(bǔ)加新鮮完全培養(yǎng)基(RPMI-1640)100μl，第七天在倒置顯微鏡下觀察每孔中病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞致病變效應(yīng)(Cytopathic effect，CPE)，以每孔是否有合胞體的形成來確定；按Reed & Muench方法計(jì)算病毒的TCID50(50％Tissue culture infectious dose)，即引起50％培養(yǎng)細(xì)胞出現(xiàn)CPE的病毒上清稀釋度。再將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板低速離心后，小心吸去150μl上清，然后每孔加5mg/ml MTT溶液(3，(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazoliumbromide)；SDS(Sodium Dodecyl sulfate)；DMF(N，N’-Dimethyl formamine)20μl，37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)，每孔加100μl 20％SDS-50％DMF，37℃孵育過夜，用Bio-Rad 3550 ELISA儀(測(cè)定波長(zhǎng)為595nm；參考波長(zhǎng)為655nm)檢測(cè)。取4×105/ml C8166細(xì)胞懸液100μl與不同濃度的樣品溶液混合，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)三天或五天，然后測(cè)定其細(xì)胞毒性IC50(50％ inhibitionconcentration)。在96孔平底培養(yǎng)板上，將待測(cè)樣品用培養(yǎng)基進(jìn)行5倍稀釋，共八個(gè)稀釋度，每孔100μl，設(shè)2個(gè)重復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照。對(duì)于HIV感染的細(xì)胞。每孔加4×105/ml的C8166細(xì)胞80μl，然后每孔加入20μl HIV-1上清，每孔的終體積為200μl，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。感染后第3天觀察樣品對(duì)合胞體形成的影響。在倒置顯微鏡下，計(jì)數(shù)HIV-1誘導(dǎo)C8166細(xì)胞形成的合胞體數(shù)。EC50(50％ effective concentration)為抑制合胞體形成達(dá)50％時(shí)的樣品的濃度。得到以下的結(jié)果合胞體形成法測(cè)新型殺微生物劑的抗HIV-1IIIB作用和MTT法測(cè)對(duì)C8166細(xì)胞的毒性作用

實(shí)施例3新型殺微生物劑對(duì)HSV-1的抑制作用和對(duì)Vero細(xì)胞的毒性作用一、PRA法測(cè)定新型殺微生物劑對(duì)HSV-1的抑制作用1、將Vero細(xì)胞懸液加入24孔板(2-4×105/well)，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)；2、待細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層，鋪滿24孔板板底后，快速融解HSV-1，然后每孔加200μl病毒上清或培養(yǎng)基，輕晃板，使病毒稀釋液和細(xì)胞單層充分接觸，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育1小時(shí)；
3、另一塊板中用RPMI1640對(duì)藥物作兩倍稀釋，用阿昔洛韋做陽性對(duì)照；4、小心吸出培養(yǎng)基(注意不要碰壁)，每孔加入1mlPBS輕輕洗板一次；5、加入未凝的覆蓋培養(yǎng)基(A、B混和液)，每孔1ml。及時(shí)加入稀釋好的待測(cè)藥液，每孔0.5ml，6孔(病毒生長(zhǎng)孔)和12孔(細(xì)胞生長(zhǎng)孔)不加；ARPMI1640+2％FCS 12ml37℃水浴保溫B1％瓊脂糖(現(xiàn)配) 13ml60℃水浴保溫6、置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)三天。第三天移出培養(yǎng)基，并每孔加入1ml2％甲醛固定細(xì)胞，10min；7、加入700μl龍膽紫染液，染色20min；8、移出染液，用自來水輕輕洗滌3次，倒置涼干，在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)空斑。
根據(jù)下例公式計(jì)算化合物對(duì)HSV-1的抑制率

二、MTT法檢測(cè)新型殺微生物劑對(duì)Vero細(xì)胞的毒性作用1、在96孔平底培養(yǎng)板上，將待測(cè)新型殺微生物劑用培養(yǎng)基進(jìn)行2倍稀釋。共7個(gè)稀釋度，每孔100μl，設(shè)兩個(gè)重復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置不含新型殺微生物劑的細(xì)胞對(duì)照組和空白組及阿昔洛韋陽性對(duì)照；2、離心Vero細(xì)胞(1000rpm，10min)，用完全培養(yǎng)基重懸后每孔加入100μl(4×105/well)懸液；3、置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)三天。第三天將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板低速離心后，吸取150μl培養(yǎng)上清，再加入25μl MTT溶液(5mg/ml)，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)左右，加入20％SDS-50％DMF(pH4.7)，孵育過夜；4、用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的OD值，根據(jù)下面公式計(jì)算出細(xì)胞存活率

得到以下的試驗(yàn)結(jié)果表1 新型殺微生物劑對(duì)HSV-1的抑制作用和對(duì)Vero細(xì)胞的毒性作用

實(shí)施例4MTT法測(cè)定新型殺微生物劑對(duì)白色念珠菌的抑制作用1、取待新型殺微生物劑10mg，用100μl DMSO助溶后，滴加900μl沙保氏培養(yǎng)基，充分混合后，使?jié)舛葹?0mg/ml，過濾除菌，置4℃保存；2、待試新型殺微生物劑使用前稀釋至合適的濃度(96孔培養(yǎng)板)注第8孔加不含藥的沙保氏培養(yǎng)基100μl，作陰性對(duì)照；3、第9孔加200μl生理鹽水，作空白對(duì)照，設(shè)三孔重復(fù)。每系列孔(除空白和生長(zhǎng)對(duì)照系列外)取100μl給下一孔，最終留100μl，余下的棄去。
4、用頭孢菌素作陽性對(duì)照，濃度稀釋同待測(cè)藥物稀釋；5、用沙保氏培養(yǎng)基把菌懸液濃度從4.5×106cfu/ml調(diào)到4.5×105cfu/ml，將稀釋好的菌液加入板中，每孔100μl，第9孔不加；6、接種菌液后，培養(yǎng)板于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，觀察生長(zhǎng)情況。待陰性對(duì)照孔生長(zhǎng)良好后，把板1000rpm離心10min。吸出150μl培養(yǎng)基。每孔各加5mg/ml的MTT(含1mM甲萘醌)25μl，放入37℃溫箱4小時(shí)，然后各孔加20％SDS-50％DMF(pH4.7)100μl；7、培養(yǎng)板37℃放置12小時(shí)后，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)595nm，參考波長(zhǎng)655nm下，測(cè)定OD值。根據(jù)下面公式計(jì)算出化合物對(duì)白色念珠菌的抑制作用；8、抑制率(％)＝(1-實(shí)驗(yàn)孔OD值/對(duì)照孔OD值)×1009、MIC90＝抑制率高于90％的濃度-(抑制率高于90％的濃度-抑制率低于90％的濃度)×(高于90％的抑制率-90)/(高于90％的抑制率-低于90％的抑制率)得到以下結(jié)果MTT法測(cè)定新型殺微生物劑對(duì)白色念珠菌的抑制作用

權(quán)利要求
1.一種預(yù)防人艾滋病毒和其它病原體性傳播的新型殺微生物劑，是用硝酸鑭和β-D-(1-4)-葡聚糖硫酸酯化合物作為原料，以重量比為1∶1000至1000∶1配制而成。
2.權(quán)利要求1所述的一種預(yù)防人艾滋病毒和其它病原體性傳播的新型殺微生物劑，硝酸鑭和β-D-(1-4)-葡聚糖硫酸酯化合物為藥效部分，按藥效部分與賦型劑重量比為1∶100～1∶1000000的比例加入賦型劑，制成片劑、乳劑、膠囊、凝膠。
3.權(quán)利要求1所述的一種預(yù)防人艾滋病毒和其它病原體性傳播的新型殺微生物劑，在抗艾滋病毒傳播中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述的一種預(yù)防人艾滋病毒和其它病原體性傳播的新型殺微生物劑，在抗HSV傳播中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述的一種預(yù)防人艾滋病毒和其它病原體性傳播的新型殺微生物劑，在抗白色念珠菌傳播中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種預(yù)防人艾滋病毒和其它病原體性傳播的新型殺微生物劑，具體地，是硝酸鑭和來源于青陽參的β－D－(1－4)－葡聚糖硫酸酯化合物配制而成的復(fù)方制劑。此復(fù)方制劑可用于預(yù)防人艾滋病毒、HSV、白色念珠菌的性傳播，而且毒性小、應(yīng)用廣，是優(yōu)良的殺微生物劑。
文檔編號(hào)A01N59/16GK1533778SQ0312116
公開日2004年10月6日 申請(qǐng)日期2003年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月31日
發(fā)明者賁昆龍 申請(qǐng)人:昆明中海潮生物工程有限公司