專利名稱：發(fā)菜苗種的人工培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種發(fā)菜苗種的人工培養(yǎng)方法。
由于上述原因，所以發(fā)菜的需求量和貿(mào)易量很大，人們的采集工作也日益加劇，造成發(fā)菜資源漸趨枯竭，生態(tài)環(huán)境嚴(yán)重破壞。因此，國(guó)家現(xiàn)已禁止采集發(fā)菜，并將其列為國(guó)家一級(jí)保護(hù)植物。但由于發(fā)菜的市場(chǎng)需求量依然很大，因而急需開(kāi)展發(fā)菜的人工培養(yǎng)。在發(fā)菜的人工培養(yǎng)方面，由于天然原植體擴(kuò)增速度緩慢和易水解，故急需解決的一個(gè)問(wèn)題是苗種的問(wèn)題，國(guó)內(nèi)不少單位開(kāi)展了研究，但都沒(méi)有取得理想的進(jìn)展。有人通過(guò)對(duì)發(fā)菜原植體節(jié)段培養(yǎng)，生長(zhǎng)速度較慢，在半年的成活期中，一般增長(zhǎng)率為10％左右，在培養(yǎng)前期接種后20天內(nèi)生長(zhǎng)較快，以后生長(zhǎng)速度減慢。有人將發(fā)菜的原植體直接在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)也不可行。在發(fā)菜的生長(zhǎng)中，濕度顯得十分重要，水分又不可過(guò)多，否則膠鞘會(huì)水解，藻體容易壞死；而且水分過(guò)多，細(xì)菌大量繁殖，也會(huì)導(dǎo)致藻體分解死亡；發(fā)菜原植體浸泡在水中時(shí)，光合作用會(huì)受到影響，凈光合作用在3天內(nèi)逐步降低。原植體浸泡在水中時(shí)，沒(méi)有凈光合碳積累，相反由于呼吸作用增強(qiáng)，呼吸作用超過(guò)光合生產(chǎn)，從而可能消耗藻體原有的部分干物質(zhì)，致使藻體不能生長(zhǎng)。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種發(fā)菜苗種的人工培養(yǎng)方法，按以下步驟進(jìn)行a.發(fā)菜原植體的表面處理挑選出的活性強(qiáng)的發(fā)菜原植體，用蒸餾水清洗，在超凈工作臺(tái)上用50-90％的乙醇水溶液浸潤(rùn)10-120秒，再用無(wú)菌水反復(fù)沖洗3-20次，待用；b.發(fā)菜原植體的光合作用活性恢復(fù)將經(jīng)a步驟處理的發(fā)菜原植體在10-35℃，20-140μmolm-2s-1光照強(qiáng)度條件下，進(jìn)行光合作用恢復(fù)，恢復(fù)時(shí)間為7-20小時(shí)，所用的培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)其1；c.發(fā)菜原植體破碎獲得游離單細(xì)胞和藻絲將上述表面消毒和光合作用活性恢復(fù)后的發(fā)菜原植體，在超凈工作臺(tái)上用兩塊滅過(guò)菌的玻璃片壓碎，即可獲得游離單細(xì)胞和藻絲體；
d.液體中藻絲體的培養(yǎng)將從c步驟中獲得的單細(xì)胞及藻絲體轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基2中，在10-150μmolm-2s-1光照，12-38℃的條件下，培養(yǎng)10-28天后，形成鞘增厚的藻絲體；e.藻絲體的轉(zhuǎn)移在超凈工作臺(tái)上用鑷子從液體環(huán)境中取出藻絲體，并轉(zhuǎn)移到瓊脂培養(yǎng)板表面；f.藻絲體的培養(yǎng)將載玻片放在培養(yǎng)箱中，在20-200μmolm-2s-1光照，12-38℃的條件下培養(yǎng)，用噴水壺，每天定時(shí)、定量、均勻地向培養(yǎng)基表面澆水，澆水次數(shù)為2-8次，每次澆水量為0.12-0.18mlcm-2，即每天從6時(shí)第一次至18時(shí)最后一次，將澆水時(shí)間跨度2-8等分定時(shí)澆水；液體培養(yǎng)基1，由以下成份按比例組成硝酸鈉80～120mg3H2O磷酸氫二鉀 4.24～6.36mg7H2O硫酸鎂 6.24～9.36mg氯化鈣2.24～3.36mg9H2O硅酸鈉 4.8～7.2mg檸檬酸0.48～0.72mg檸檬酸鐵銨0.48～0.72mg己二胺四乙酸 0.08～0.12mg碳酸鈉1.6～2.4mg微量金屬溶液 0.08～0.12ml蒸餾水99.92～99.88ml液體培養(yǎng)基1中的微量金屬溶液由以下成份按比例組成硼酸 228.8～343.2mg4H2O氯化錳 146.4～219.6mg1H2O硫酸錳 122.4～183.6mg7H2O硫酸鋅 18～27mg5H2O硫酸銅6.08～9.12mg鉬酸鈉 2～3mg蒸餾水 100ml液體培養(yǎng)基2，由以下成份按比例組成硝酸鈉 39.68～59.52mg磷酸氫二鉀 3.2～4.8mg7H2O硫酸鎂6.16～9.24mg2H2O氯化鈣3.04～4.56mgH2O硅酸鈉 4.8～7.2mg碳酸鈉 1.6～2.4mg微量元素溶液 0.32～0.48ml土壤浸提液 0.4～0.6ml蒸餾水 99.28～98.92ml用稀鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH值為8.0-8.7液體培養(yǎng)基2中的微量元素溶液由以下成份按比例組成6H2O三氯化鐵 7.36～11.04mg4H2O氯化錳3.44～5.16mg氯化鋅 0.48～0.72mg6H2O氯化鈷0.2～0.3mg2H2O鉬酸鈉0.336～0.504mg己二胺四乙酸鈉 60.4～90.6mg蒸餾水 100ml液體培養(yǎng)基2中的土壤浸提液提取方法取未施過(guò)肥的花園土1kg置于帶蓋鋁鍋中，加入蒸餾水1200ml，在電爐上加熱沸騰2～3小時(shí)，冷卻數(shù)小時(shí)，用砂布和濾紙依次過(guò)濾，獲得的濾液加蒸餾水至總體積1L，高壓滅菌，然后存放于2-4℃?zhèn)溆?；固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基2的基礎(chǔ)上，將瓊脂按0.7-2.0g/100ml比例加入，高壓滅菌，待用；上述氣生條件下瓊脂培養(yǎng)基板的制作在超凈工作臺(tái)上將滅過(guò)菌的固體培養(yǎng)基加熱后，冷卻到38--44℃，按所設(shè)定的瓊脂厚度，用移液槍吸取一定體積，轉(zhuǎn)移到載玻片上，加入細(xì)沙，冷卻，瓊脂的厚度為0.5-3mm，培養(yǎng)基面上的細(xì)沙數(shù)目5-10個(gè)/cm2，即得合適的培養(yǎng)基板。
本發(fā)明較佳的培養(yǎng)方法為，上述d步驟中光照的強(qiáng)度為40-100μmolm-2s-1；f步驟中藻絲體的培養(yǎng)光照條件為60-80μmolm-2s-1。
本發(fā)明最佳的培養(yǎng)方法為，上述d步驟中光照的強(qiáng)度為60μmolm-2s-1；f步驟中藻絲體的培養(yǎng)光照條件為60μmolm-2s-1，澆水頻率為每天5次，澆水量為0.16mlcm-2。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明在液體條件下，獲得了大量可擴(kuò)增的帶鞘藻絲體，從根本上解決了發(fā)菜人工培養(yǎng)中單離細(xì)胞轉(zhuǎn)化成的問(wèn)題，在進(jìn)一步的氣生培養(yǎng)中，在本發(fā)明給定的溫度、光照度及澆水頻率下，藻絲體鞘的顏色從綠色變成棕黃色，再變成棕色，最后變成棕黑色，這一顏色與發(fā)菜天然原植體的顏色接近。初步找到了藻絲體轉(zhuǎn)變成原植體的光溫組合、培養(yǎng)基面、澆水頻率等條件，第一次實(shí)現(xiàn)了真正意義上的發(fā)菜人工培養(yǎng)，為進(jìn)行發(fā)菜的大規(guī)模工廠化生產(chǎn)提供了和技術(shù)上的支持。
先按以下配方配制好液體培養(yǎng)基1、2，固體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基板液體培養(yǎng)基1由以下成份按比例組成硝酸鈉 100mg3H2O磷酸氫二鉀 5.3mg7H2O硫酸鎂 7.8mg氯化鈣 2.8mg9H2O硅酸鈉 6mg檸檬酸 0.6mg檸檬酸鐵銨 0.6mg己二胺四乙酸0.1mg碳酸鈉 2mg微量金屬溶液0.1ml蒸餾水 99.9ml液體培養(yǎng)基1中的微量金屬溶液由以下成份按比例組成硼酸286mg4H2O氯化錳 183mg1H2O硫酸錳 153mg7H2O硫酸鋅 22.5mg5H2O硫酸銅 7.6mg鉬酸鈉 2.5mg蒸餾水 100ml液體培養(yǎng)基2，由以下成份按比例組成硝酸鈉 49.6mg磷酸氫二鉀4mg7H2O硫酸鎂 7.7mg2H2O氯化鈣 3.8mgH2O硅酸鈉6mg碳酸鈉2mg微量元素溶液 0.4ml土壤浸提液0.5ml蒸餾水99.1ml用稀鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH值為8.0-8.7液體培養(yǎng)基2中的微量元素溶液由以下成份按比例組成6H2O三氯化鐵 9.2mg4H2O氯化錳 4.3mg氯化鋅0.6mg6H2O氯化鈷 0.25mg2H2O鉬酸鈉 0.42mg己二胺四乙酸鈉75.5mg蒸餾水100ml液體培養(yǎng)基2中的土壤浸提液提取方法取未施過(guò)肥的花園土1kg置于帶蓋鋁鍋中，加入蒸餾水1200ml，在電爐上加熱沸騰2.5小時(shí)，冷卻數(shù)小時(shí)，用砂布和濾紙依次過(guò)濾，獲得的濾液加蒸餾水至總體積1L，高壓滅菌，然后存放于4℃?zhèn)溆?；固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基2的基礎(chǔ)上，將瓊脂按1.2g/100ml比例加入，高壓滅菌，待用；
上述氣生條件下瓊脂培養(yǎng)基板的制作在超凈工作臺(tái)上將滅過(guò)菌的固體培養(yǎng)基加熱后，冷卻到44℃，按所設(shè)定的瓊脂厚度，用移液槍吸取一定體積，轉(zhuǎn)移到載玻片上，加入細(xì)沙，冷卻，瓊脂的厚度為2.0mm左右，培養(yǎng)基面上的細(xì)沙數(shù)目8個(gè)/cm2，可以得出合適的培養(yǎng)基板，瓊脂培養(yǎng)基板制作中，瓊脂培養(yǎng)基厚度及細(xì)沙數(shù)目數(shù)值可上下變化10％內(nèi)也能取得較好效果。
上述培養(yǎng)基各組份的配比是取最佳的數(shù)值，它能最好實(shí)現(xiàn)發(fā)明的目的。但是，本技術(shù)領(lǐng)域的人員可以知道，作為培養(yǎng)基，其各組份的比例在最佳數(shù)值上下變化10％的范圍內(nèi)，培養(yǎng)基仍可以較好實(shí)現(xiàn)發(fā)明的目的，其在組份的比例在最佳數(shù)值上下變化3％的范圍內(nèi)，就能更好實(shí)現(xiàn)發(fā)明的目的。
發(fā)菜苗種的人工培養(yǎng)方法步驟如下a.挑選絲體比較粗，色澤比較亮麗的發(fā)菜原植體0.5克，除去雜草，再用清水洗去里面的雜物，待下一步單離細(xì)胞所用；將篩選出的原植體表面在超凈工作臺(tái)上先用蒸餾水潤(rùn)洗，然后在83％的乙醇里浸潤(rùn)15秒，再用無(wú)菌水反復(fù)沖洗15次，待用；b.將洗干凈的發(fā)菜原植體在30℃，60μmolm-2s-1光照條件下，模擬自然光進(jìn)行光合作用恢復(fù)，恢復(fù)時(shí)間為10小時(shí)，所用培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基1；c.將上述表面消毒和光合作用活性恢復(fù)后的發(fā)菜原植體，在超凈工作臺(tái)上用兩塊滅過(guò)菌的玻璃片輕輕壓碎，即可獲得游離單細(xì)胞和藻絲體；此時(shí)用無(wú)菌水洗入滅過(guò)菌的培養(yǎng)基2中，沉淀片刻，鏡檢，發(fā)現(xiàn)上清液中基本上是單細(xì)胞和藻絲體；
d.將從c中獲得的單細(xì)胞及藻絲體在液體培養(yǎng)基2中，在100μmolm-2s-1光照，30℃的條件下，培養(yǎng)14天后，形成鞘增厚的藻絲體；e.在超凈工作臺(tái)上用鑷子輕輕從液體環(huán)境中取出藻絲體，并轉(zhuǎn)移到瓊脂培養(yǎng)板表面；f.將載玻片放在培養(yǎng)箱中，模擬自然光，在160μmolm-2s-1光照，38℃的條件下培養(yǎng)，用噴水壺，每天定時(shí)、定量、均勻地向培養(yǎng)基表面澆水，每天澆水頻率為6次，每次澆水量為0.18ml cm-2，即每天從6時(shí)至18時(shí)，模擬自然條件下日出、日落規(guī)律來(lái)設(shè)定澆水時(shí)間，將第一次澆水與最后一次澆水時(shí)間的跨度6等分，第一次為6時(shí)，最后一次為18時(shí)；該澆水條件和培養(yǎng)基面上，藻絲體鞘的顏色從綠色變成棕黃色，再變成棕色，最后變成棕黑色，這一顏色與發(fā)菜天然原植體的顏色接近，形態(tài)一致，兩個(gè)月內(nèi)增長(zhǎng)1.7mm左右。
實(shí)施例2液體培養(yǎng)基1、液體培養(yǎng)基2、固體培養(yǎng)基及固體培養(yǎng)基板的配制方法與實(shí)施例1相同。
發(fā)菜苗種的人工培養(yǎng)方法的步驟如下a.挑選絲體比較粗，色澤比較亮麗的發(fā)菜原植體0.5克，除去雜草，再用清水洗去里面的雜物，待下一步單離細(xì)胞所用；將篩選出的原植體表面在超凈工作臺(tái)上先用蒸餾水潤(rùn)洗幾遍，然后60％的乙醇里浸潤(rùn)58秒，再用無(wú)菌水反復(fù)沖洗7次，待用；
b.將洗干凈的發(fā)菜原植體在10℃，30μmolm-2s-1光照，模擬自然光條件下進(jìn)行光合作用恢復(fù)，恢復(fù)時(shí)間為12小時(shí)，所用培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基1；c.將上述表面消毒和光合作用活性恢復(fù)后的發(fā)菜原植體，在超凈工作臺(tái)上用兩塊滅過(guò)菌的玻璃片輕輕壓碎，即可獲得游離單細(xì)胞和藻絲體；此時(shí)用無(wú)菌水洗入滅過(guò)菌的固體培養(yǎng)基中，沉淀片刻，鏡檢，發(fā)現(xiàn)上清液中基本上是單細(xì)胞和藻絲體；d.將從c中獲得的單細(xì)胞及藻絲體在液體培養(yǎng)基2中，模擬自然光，在20μmolm-2s-1光照，15℃的條件下，培養(yǎng)24天后，形成鞘增厚的藻絲體；e.在超凈工作臺(tái)上用鑷子輕輕從液體環(huán)境中取出藻絲體，并轉(zhuǎn)移到瓊脂培養(yǎng)板表面；f.將載玻片放在培養(yǎng)箱中，模擬自然光，在30μmolm-2s-1光照，20℃的條件下培養(yǎng)，用噴水壺，每天定時(shí)、定量、均勻地向培養(yǎng)基表面澆水，每天澆水頻率為3次，每次澆水量為0.14ml cm-2，即每天從6時(shí)至18時(shí)，模擬自然條件下日出、日落規(guī)律來(lái)設(shè)定澆水時(shí)間，將第一次澆水與最后一次澆水時(shí)間的跨度3等分，第一次為6時(shí)，最后一次為18時(shí)；該澆水條件和培養(yǎng)基面上，藻絲體鞘的顏色從綠色變成棕黃色，再變成棕色，最后變成棕黑色，這一顏色與發(fā)菜天然原植體的顏色接近，形態(tài)一致，兩個(gè)月內(nèi)增長(zhǎng)1mm左右。
較佳實(shí)施例3液體培養(yǎng)基1、液體培養(yǎng)基2、固體培養(yǎng)基及固體培養(yǎng)基板的配制方法與實(shí)施例1相同。
發(fā)菜苗種的人工培養(yǎng)方法的步驟如下a.挑選絲體比較粗，色澤比較亮麗的發(fā)菜原植體0.5克，除去雜草，再用清水洗去里面的雜物，待下一步單離細(xì)胞所用；將篩選出的原植體表面在超凈工作臺(tái)上先用蒸餾水潤(rùn)洗幾遍，然后88％的乙醇里浸潤(rùn)12秒，再用無(wú)菌水反復(fù)沖洗10次，待用；b.將洗干凈的發(fā)菜原植體在22℃，30μmolm-2s-1光照條件下，模擬自然光進(jìn)行光合作用恢復(fù)，恢復(fù)時(shí)間為8小時(shí)，所用培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基1；c.將上述表面消毒和光合作用活性恢復(fù)后的發(fā)菜原植體，在超凈工作臺(tái)上用兩塊滅過(guò)菌的玻璃片輕輕壓碎，即可獲得游離單細(xì)胞和藻絲體；此時(shí)用無(wú)菌水洗入滅過(guò)菌的固體培養(yǎng)基中，沉淀片刻，鏡檢，發(fā)現(xiàn)上清液中基本上是單細(xì)胞和藻絲體；d.將從c中獲得的單細(xì)胞及藻絲體在液體培養(yǎng)基2中，模擬自然光，在80μmolm-2s-1光照，20℃的條件下，培養(yǎng)28天后，形成鞘增厚的藻絲體，e.在超凈工作臺(tái)上用鑷子輕輕從液體環(huán)境中取出藻絲體，并轉(zhuǎn)移到瓊脂培養(yǎng)板表面；f.將載玻片放在培養(yǎng)箱中，在70μmolm-2s-1光照，28℃的條件下培養(yǎng)，用噴水壺，每天定時(shí)、定量、均勻地向培養(yǎng)基表面澆水，每天澆水頻率為7次，每次澆水量為0.12ml cm-2，即每天從6時(shí)至18時(shí)，模擬自然條件下日出、日落規(guī)律來(lái)設(shè)定澆水時(shí)間，將第一次澆水與最后一次澆水時(shí)間的跨度7等分，第一次為6時(shí)，最后一次為18時(shí)；該澆水條件和培養(yǎng)基面上，藻絲體鞘的顏色從綠色變成棕黃色，再變成棕色，最后變成棕黑色，這一顏色與發(fā)菜天然原植體的顏色接近，形態(tài)一致，兩個(gè)月內(nèi)增長(zhǎng)1.4mm左右。最佳實(shí)施例4液體培養(yǎng)基1、液體培養(yǎng)基2、固體培養(yǎng)基及固體培養(yǎng)基板的配制方法與實(shí)施例1相同。發(fā)菜苗種的人工培養(yǎng)方法步驟如下a.挑選絲體比較粗，色澤比較亮麗的發(fā)菜原植體0.5克，除去雜草，再用清水洗去里面的雜物，待下一步單離細(xì)胞所用；將篩選出的原植體表面在超凈工作臺(tái)上先用蒸餾水潤(rùn)洗幾遍，然后75％的乙醇里浸潤(rùn)45秒，再用無(wú)菌水反復(fù)沖洗15次，待用；b.將洗干凈的發(fā)菜原植體在25℃，45μmolm-2s-1光照條件下進(jìn)行光合作用恢復(fù)，恢復(fù)時(shí)間為14小時(shí)，所用培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基1；c.將上述表面消毒和光合作用活性恢復(fù)后的發(fā)菜原植體，在超凈工作臺(tái)上用兩塊滅過(guò)菌的玻璃片輕輕壓碎，即可獲得游離單細(xì)胞和藻絲體；此時(shí)用無(wú)菌水洗入滅過(guò)菌的固體培養(yǎng)基中，沉淀片刻，鏡檢，發(fā)現(xiàn)上清液中基本上是單細(xì)胞和藻絲體；d.將從c中獲得的單細(xì)胞及藻絲體在固體培養(yǎng)基2中，模擬自然光，在60μmolm-2s-1光照，25℃的條件下，培養(yǎng)16天后，形成鞘增厚的藻絲體，e.在超凈工作臺(tái)上用鑷子輕輕從液體環(huán)境中取出藻絲體，并轉(zhuǎn)移到瓊脂培養(yǎng)板表面；f.將載玻片放在培養(yǎng)箱中，模擬自然光，在60μmolm-2s-1光照，25℃的條件下培養(yǎng)，用噴水壺，每天定時(shí)、定量、均勻地向培養(yǎng)基表面澆水，每天澆水頻率為5次，每次澆水量為0.16ml cm-2，即每天從6時(shí)至18時(shí)，模擬自然條件下日出、日落規(guī)律來(lái)設(shè)定澆水時(shí)間，將第一次澆水與最后一次澆水時(shí)間的跨度5等分，第一次為6時(shí)，最后一次為18時(shí)；該澆水條件和培養(yǎng)基面上，藻絲體鞘的顏色從綠色變成棕黃色，再變成棕色，最后變成棕黑色，這一顏色與發(fā)菜天然原植體的顏色接近，形態(tài)一致，兩個(gè)月內(nèi)增長(zhǎng)2.5mm左右。
雖然本文已詳細(xì)描述了本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施例，但是，本領(lǐng)域技術(shù)中，普通的技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到只要不脫離所附權(quán)利要求的內(nèi)容，本發(fā)明在實(shí)施過(guò)程各個(gè)參數(shù)還可以有多種變化。
權(quán)利要求
1.一種發(fā)菜苗種的人工培養(yǎng)方法，按以下步驟進(jìn)行a.發(fā)菜原植體的表面處理 挑選出的活性強(qiáng)的發(fā)菜原植體，用蒸餾水清洗，在超凈工作臺(tái)上用50-90％的乙醇水溶液浸潤(rùn)10-120秒，再用無(wú)菌水反復(fù)沖洗3-20次，待用；b.發(fā)菜原植體的光合作用活性恢復(fù)發(fā)菜原植體在10-35℃，20-140μmolm-2s-1光照條件下進(jìn)行光合作用恢復(fù)，恢復(fù)時(shí)間為7-20小時(shí)，所用培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基1；c.發(fā)菜原植體破碎獲得游離單細(xì)胞和藻絲將上述表面消毒和光合作用活性恢復(fù)后的發(fā)菜原植體，在超凈工作臺(tái)上用兩塊滅過(guò)菌的玻璃片壓碎，即可獲得游離單細(xì)胞和藻絲體；d.液體中藻絲體的培養(yǎng)將從c步驟中獲得的單細(xì)胞及藻絲體轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基2中，在10-150μmolm-2s-1光照，12-38℃的條件下，培養(yǎng)10-28天后，形成鞘增厚的藻絲體；e.藻絲體的轉(zhuǎn)移在超凈工作臺(tái)上用鑷子從液體環(huán)境中取出藻絲體，并轉(zhuǎn)移到瓊脂培養(yǎng)板表面；f.藻絲體的培養(yǎng)將載玻片放在培養(yǎng)箱中，在20-200μmolm-2s-1光照，12-38℃的條件下培養(yǎng)，用噴水壺，每天定時(shí)、定量、均勻地向培養(yǎng)基表面澆水，每天澆水頻率為2-8次，每次澆水量為0.12-0.18mlcm-2，即每天從6時(shí)第一次至18時(shí)最后一次，將澆水時(shí)間跨度2-8等分定時(shí)澆水；液體培養(yǎng)基1由以下成份按比例組成硝酸鈉 80～120mg3 H2O磷酸氫二鉀 4.24～6.36mg7 H2O硫酸鎂 6.24～9.36mg氯化鈣 2.24～3.36mg9H2O硅酸鈉 4.8～7.2mg檸檬酸 0.48～0.72mg檸檬酸鐵銨 0.48～0.72mg己二胺四乙酸 0.08～0.12mg碳酸鈉 1.6～2.4mg微量金屬溶液 0.08～0.12ml蒸餾水 99.92～99.88ml液體培養(yǎng)基1中的微量金屬溶液由以下成份按比例組成硼酸 228.8～343.2mg4H2O氯化錳 146.4～219.6mg1H2O硫酸錳 122.4～183.6mg7H2O硫酸鋅 18～27mg5H2O硫酸銅 6.08～9.12mg鉬酸鈉 2～3mg蒸餾水 100ml液體培養(yǎng)基2由以下成份按比例組成硝酸鈉 39.68～59.52mg磷酸氫二鉀 3.2～4.8mg7H2O硫酸鎂 6.16～9.24mg2H2O氯化鈣 3.04～4.56mgH2O硅酸鈉 4.8～7.2mg碳酸鈉 1.6～2.4mg微量元素溶液 0.32～0.48ml土壤浸提液 0.4～0.6ml蒸餾水 99.28～98.92ml用稀鹽酸氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值為8.0-8.7液體培養(yǎng)基2中的微量元素溶液由以下成份按比例組成6H2O三氯化鐵7.36～11.04mg4H2O氯化錳 3.44～5.16mg氯化鋅 0.48～0.72mg6H2O氯化鈷 0.2～0.3mg2H2O鉬酸鈉 0.336～0.504mg己二胺四乙酸鈉60.4～90.6mg蒸餾水 100ml液體培養(yǎng)基2中的土壤浸提液提取方法取未施過(guò)肥的花園土1kg置于帶蓋鋁鍋中，加入蒸餾水1200ml，在電爐上加熱沸騰2～3小時(shí)，冷卻數(shù)小時(shí)，用砂布和濾紙依次過(guò)濾，獲得的濾液加蒸餾水至總體積1L，高壓滅菌，然后存放于2-4℃?zhèn)溆?；固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基2的基礎(chǔ)上，將瓊脂按0.7-2.0g/100ml比例加入，高壓滅菌，待用；上述氣生條件下瓊脂培養(yǎng)基板的制作在超凈工作臺(tái)上將滅過(guò)菌的固體培養(yǎng)基加熱后，冷卻到38--44℃，按所設(shè)定的瓊脂厚度，用移液槍吸取一定體積，轉(zhuǎn)移到載玻片上，加入細(xì)沙，冷卻，瓊脂的厚度為0.5-3mm左右，培養(yǎng)基面上的細(xì)沙數(shù)目5-10個(gè)/cm2，即得合適的培養(yǎng)基板。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)的發(fā)菜培養(yǎng)方法，其特征在于該培養(yǎng)方法中，其d步驟中光照的強(qiáng)度為40-100 μmolm-2s-1；f步驟中藻絲體的培養(yǎng)光照條件為60-80μmolm-2s-1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所說(shuō)的發(fā)菜培養(yǎng)方法，其特征在于該培養(yǎng)方法中，其d步驟中光照的強(qiáng)度為60μmolm-2s-1；f步驟中藻絲體的培養(yǎng)光照條件為60μmolm-2s-1，澆水頻率為每天5次，澆水量為0.14-0.16mlcm-2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)的發(fā)菜培養(yǎng)方法，其特征在于該培養(yǎng)方法中，各培養(yǎng)基的各組份取值下項(xiàng)增加5％，上項(xiàng)減小5％。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)的發(fā)菜培養(yǎng)方法，其特征在于該培養(yǎng)方法中，各培養(yǎng)基的各組份取值下項(xiàng)增加7％，上項(xiàng)減小7％。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種發(fā)菜苗種的人工培養(yǎng)方法。該方法主要的步驟是挑選發(fā)菜的原植體用蒸餾水清洗，然后用乙醇浸潤(rùn)，再用無(wú)菌水反復(fù)沖洗；將洗干凈的發(fā)菜原植體在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行光合作用恢復(fù)；將發(fā)菜原植體壓碎，即可獲得游離單細(xì)胞和藻絲體；單細(xì)胞及藻絲體在液體培養(yǎng)基中，適當(dāng)?shù)墓鉁亟M合下，培養(yǎng)形成鞘增厚的藻絲體，從液體環(huán)境中取出藻絲體，并轉(zhuǎn)移到瓊脂培養(yǎng)板表面；每天定時(shí)、定量、均勻地向培養(yǎng)基表面澆水。本發(fā)明找到了藻絲體轉(zhuǎn)變成原植體的光溫組合、培養(yǎng)基面、澆水頻率等條件，為進(jìn)行發(fā)菜的大規(guī)模人工培養(yǎng)提供了苗種和技術(shù)上的支持。
文檔編號(hào)A01G1/04GK1460711SQ0312693
公開(kāi)日2003年12月10日 申請(qǐng)日期2003年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月20日
發(fā)明者高坤山, 葉長(zhǎng)鵬 申請(qǐng)人:汕頭大學(xué)