專利名稱：用于制備各種生物制品的無(wú)病原體特異倉(cāng)鼠的培育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于生成SPF(特異性的不含病原體SPF)倉(cāng)鼠的方法，該倉(cāng)鼠可以用來(lái)制備各種生物制品。特別是，本發(fā)明涉及一種用于生成SPF倉(cāng)鼠的方法，用該倉(cāng)鼠制備的各種生物制品未受到寄生蟲(chóng)、細(xì)菌、以及內(nèi)源性-、外源性病毒等可潛在引起疾病的微生物感染。
背景技術(shù)：
疫苗免疫接種是一種可使人類宿主獲得保護(hù)性和主動(dòng)性免疫力、而不在宿主上產(chǎn)生任何疾病的方法，該方法中利用了與感染性疾病有關(guān)的抗原。例如，疾病相關(guān)病原體的抗原或病原體本身都可適當(dāng)?shù)匾鸷芴禺惖拿庖叻磻?yīng)，該免疫反應(yīng)由體液免疫調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞或由細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)，因此，可使保護(hù)抗體的滴度增加到相同或相近于宿主自然感染后康復(fù)階段(或細(xì)胞毒素T淋巴細(xì)胞的持續(xù)記憶行為)的免疫狀態(tài)。根據(jù)抗原的不同類型以及所采用的不同制備方法，疫苗可分為類毒素疫苗、滅活疫苗、減毒活疫苗以及重組DNA疫苗等。到目前為止，已研制的疫苗多數(shù)是滅活疫苗或減毒活疫苗，其制備過(guò)程包括下列步驟將活病毒接種到某種類型的動(dòng)物源細(xì)胞上、對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)和提取、然后對(duì)其進(jìn)行純化和適當(dāng)加工。因?yàn)椴《揪哂兄荒茉诨罴?xì)胞中增殖的特性，所以必須使用動(dòng)物源(包括人類)細(xì)胞作為制備病毒疫苗的細(xì)胞底物。用于制備疫苗的細(xì)胞系主要分為原始細(xì)胞系、二倍體細(xì)胞系以及連續(xù)細(xì)胞系。通過(guò)在某一特定階段冷凍細(xì)胞系，可制備二倍體細(xì)胞系以及連續(xù)細(xì)胞系，然后可將其確立或控制為用于生產(chǎn)的母體或工作細(xì)胞庫(kù)系統(tǒng)。當(dāng)需要制備一種疫苗時(shí)，將所需數(shù)量的細(xì)胞解凍，然后在特定的階段進(jìn)行培養(yǎng)，即可作為制備疫苗的細(xì)胞系。
同樣，原始細(xì)胞可用于制備脊髓灰質(zhì)炎-、麻疹-、德國(guó)麻疹-、日本腦炎-、或黃熱病活疫苗。對(duì)每一批疫苗制品而言，都可使用原始細(xì)胞生產(chǎn)疫苗制品，該原始細(xì)胞從雞、狗、猴、或倉(cāng)鼠等動(dòng)物中直接分離，然后進(jìn)行了培養(yǎng)。因此，與動(dòng)物組(作為原料來(lái)源)自身安全性有關(guān)的質(zhì)量管理非常重要。經(jīng)過(guò)多年對(duì)PMK細(xì)胞(primary monkey kidney cell，猴原始腎細(xì)胞)安全性的研究，發(fā)現(xiàn)PMK細(xì)胞中存在20種不同類型的潛在病毒，其中一些可能在人體內(nèi)引起致命性疾病，而從二十世紀(jì)50年代開(kāi)始疫苗程序期間，用該P(yáng)MK細(xì)胞制備的麻疹疫苗對(duì)麻痹性麻疹的根除發(fā)揮了巨大的作用。例如，在許多批麻疹滅活疫苗和麻疹活疫苗被接種到幾百萬(wàn)兒童多年后，發(fā)現(xiàn)SV40病毒(猿病毒中一種)，可引起嚙齒類動(dòng)物的癌癥。體外實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，上述病毒可將人體正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化成癌細(xì)胞(Hayflick L.Science，276(5311)337-341，1997)。上述發(fā)現(xiàn)不可避免地激起了對(duì)有關(guān)麻疹疫苗(以PMK細(xì)胞為基礎(chǔ))的可能致癌性的爭(zhēng)論。同樣，在麻疹-、腮腺炎-、或黃熱病疫苗(以雞胚細(xì)胞為細(xì)胞底物)廣泛傳播和使用之后，發(fā)現(xiàn)該雞胚細(xì)胞受到了一種活家禽逆轉(zhuǎn)錄病毒(家禽造白細(xì)胞組織增生病毒)的污染。上述事件引起了很多關(guān)于疫苗對(duì)人體可能致癌性的關(guān)注。隨后更多對(duì)疫苗安全性的爭(zhēng)論，聚焦于細(xì)胞底物(用來(lái)制備疫苗)中的潛在微生物污染。因?yàn)樯鲜鲈?，關(guān)于作為原料來(lái)源以制備生物制品(如疫苗)的動(dòng)物，國(guó)際上建議使用已被確證為SPF(specific pathogen free，特異性不含病原體)的動(dòng)物組。
對(duì)SPF動(dòng)物的大致篩選基于幾個(gè)實(shí)驗(yàn)，如尸體解剖、顯微鏡檢查、培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)、血清學(xué)實(shí)驗(yàn)和組織病理學(xué)實(shí)驗(yàn)等。但是，上述實(shí)驗(yàn)僅僅有助于檢測(cè)寄生蟲(chóng)、細(xì)菌和一些主要病毒的感染，還沒(méi)有建立用來(lái)篩選SPF動(dòng)物的清晰標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)SPF老鼠和SPF小鼠而言，已有檢測(cè)其微生物污染的國(guó)際公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)，與此相比，還沒(méi)有如此一個(gè)用來(lái)篩選SPF倉(cāng)鼠的國(guó)際確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)。目前商業(yè)上使用的SPF倉(cāng)鼠是一種VAF(viral antigen free，無(wú)病毒抗原)倉(cāng)鼠，該VAF倉(cāng)鼠未受幾種病毒微生物污染。即使在被國(guó)際公認(rèn)為SPF動(dòng)物的主要供應(yīng)源的Charles River實(shí)驗(yàn)室公司或Harlan Sprague Dawley公司，只通過(guò)對(duì)3-15種細(xì)菌、2-3種寄生蟲(chóng)和5或6種病毒的簡(jiǎn)單檢測(cè)來(lái)篩選SPF動(dòng)物。來(lái)自上述兩家公司其中之一的VAF倉(cāng)鼠經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)受到了病毒污染。而且，在某些情況下，由于無(wú)癥狀感染，根本無(wú)法長(zhǎng)時(shí)間檢測(cè)到病毒。因此，很可能生物制品(如疫苗等)是以商用VAF倉(cāng)鼠為基礎(chǔ)制備的，而該VAF倉(cāng)鼠受到了可能對(duì)人體有害的微生物的污染。所以，上述生物制品的安全性至今沒(méi)有得到保證。
用SPF倉(cāng)鼠來(lái)制備疫苗的細(xì)胞系通常是PHK細(xì)胞(倉(cāng)鼠原始腎細(xì)胞)。以PHK細(xì)胞為基礎(chǔ)制備的生物制品包括下列例子日本腦炎減毒活疫苗、日本腦炎滅活疫苗、狂犬病疫苗、登革熱疫苗、腎病綜合癥出血熱疫苗以及蜱源性腦脊髓炎疫苗。利用每個(gè)抗原病毒能夠在PHK細(xì)胞中有效地、穩(wěn)定地增殖的生物學(xué)特性，制備了上述疫苗。所以，建立作為原料來(lái)源的SPF倉(cāng)鼠，以用來(lái)提取PHK細(xì)胞(作為不同疫苗制品的細(xì)胞底物)是更為重要的。
因此，在進(jìn)行了許多研究以培育一種能夠安全用于制備用于人體的生物制品的倉(cāng)鼠后，本發(fā)明建立了SPF倉(cāng)鼠組，該倉(cāng)鼠組未受到許多可潛在引起疾病的寄生蟲(chóng)、細(xì)菌和內(nèi)源性、外源性病毒的感染。進(jìn)一步，通過(guò)證實(shí)取自所述SPF倉(cāng)鼠的PHK細(xì)胞及用其制備的生物制品的安全性，完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是提供一種用于生成可以用來(lái)安全制備生物制品的SPF倉(cāng)鼠的方法。
為了達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種用于生成用來(lái)制備生物制品的SPF倉(cāng)鼠的方法，其步驟包括(a)首先，通過(guò)對(duì)寄生蟲(chóng)、細(xì)菌和倉(cāng)鼠病毒的微生物污染實(shí)驗(yàn)，選取未受感染的倉(cāng)鼠，并通過(guò)同窩交配繁殖上述選取的倉(cāng)鼠，然后從所繁殖的倉(cāng)鼠中，第二次選取未受到上述微生物感染的倉(cāng)鼠；(b)將所選取的倉(cāng)鼠進(jìn)行交配，在雌性倉(cāng)鼠懷孕后的第12-14天取其子宮，將所取的子宮引入一個(gè)隔離室，通過(guò)剖腹產(chǎn)取其胚胎，然后在分組小于10000的屏蔽區(qū)內(nèi)，利用代育母鼠來(lái)培育上述所取的胚胎，并(c)通過(guò)同窩交配來(lái)繁殖上述步驟(b)中所培育的倉(cāng)鼠，并對(duì)其進(jìn)行寄生蟲(chóng)、細(xì)菌、倉(cāng)鼠病毒、鼠病毒、內(nèi)源性倉(cāng)鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒、倉(cāng)鼠多瘤病毒(HPyV)、倉(cāng)鼠淋巴瘤病毒和未知倉(cāng)鼠病毒的微生物污染實(shí)驗(yàn)，然后從上述繁殖的倉(cāng)鼠中，選取未受上述微生物感染的倉(cāng)鼠。
本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“生物制品”(或“生物品”)指通過(guò)活組織或其產(chǎn)物所制得的疫苗、培養(yǎng)物和其它制劑，其目的是用于對(duì)人體或動(dòng)物的診斷、免疫接種或治療，或用于相關(guān)研究。
下面將詳細(xì)描述本發(fā)明。
本發(fā)明的特征在于，它提供了一種培育SPF倉(cāng)鼠的方法，該倉(cāng)鼠可用來(lái)安全地制備用于人體和動(dòng)物的生物制品。另外，本發(fā)明的特征在于，為了穩(wěn)定且持續(xù)地提供原始細(xì)胞，以用來(lái)制備上述生物制品，建立了一個(gè)無(wú)菌倉(cāng)鼠組，該倉(cāng)鼠組未受到寄生蟲(chóng)、細(xì)菌、以及內(nèi)源性或外源性病毒等微生物的污染，并提供了用于確定上述倉(cāng)鼠安全性的標(biāo)準(zhǔn)和方法。
本發(fā)明中的倉(cāng)鼠包括可用于制備生物制品的各種倉(cāng)鼠。優(yōu)選金色敘利亞倉(cāng)鼠。盡管中國(guó)成都生物制品研究所已使用了金色倉(cāng)鼠，將其作為疫苗制品細(xì)胞底物的動(dòng)物源，但本發(fā)明中特殊的是，所選擇的金色倉(cāng)鼠用于提供最初的胚胎，該胚胎被轉(zhuǎn)移給純種代育母鼠，由其進(jìn)行培育。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，對(duì)上述金色倉(cāng)鼠組進(jìn)行寄生蟲(chóng)、細(xì)菌及倉(cāng)鼠病毒的微生物污染實(shí)驗(yàn)，從而初次篩選不受微生物污染的倉(cāng)鼠組。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物培育室中繁殖上述選取的倉(cāng)鼠，并再次進(jìn)行上述微生物實(shí)驗(yàn)。從而第二次篩選不受微生物污染的倉(cāng)鼠組。對(duì)于上述微生物實(shí)驗(yàn)而言，有關(guān)技術(shù)中所公開(kāi)的任何方法均可運(yùn)用。特別是，利用參考例1中所描述的方法，本發(fā)明中所進(jìn)行的微生物實(shí)驗(yàn)包括6種外源性和內(nèi)源性寄生蟲(chóng)、11種細(xì)菌、以及7種倉(cāng)鼠病毒(如下表1中所列)。
表1為選取懷孕母鼠而進(jìn)行的微生物實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目

在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，為選取懷孕母鼠(懷孕的雌性倉(cāng)鼠，后來(lái)將其胚胎轉(zhuǎn)移給代育母鼠)，將兩只雌倉(cāng)鼠(至少曾具有一次分娩經(jīng)歷)與一只雄鼠(具有交配經(jīng)歷)一起放在同一籠子中。然后，選取出現(xiàn)了陰道栓的倉(cāng)鼠，對(duì)其進(jìn)行處理，直至懷孕第一天，并繼續(xù)飼養(yǎng)。另外，取來(lái)自Charles River實(shí)驗(yàn)公司的VAF倉(cāng)鼠，對(duì)其進(jìn)行上述微生物污染實(shí)驗(yàn)。確保該VAF倉(cāng)鼠未受污染后，將其用作代育母鼠(雌性倉(cāng)鼠，其接受了懷孕母鼠的胚胎，并照看幼鼠直至斷奶)。


圖1示出了本發(fā)明中SPF倉(cāng)鼠的培育簡(jiǎn)圖。在母鼠懷孕后第12-14天，通過(guò)剖腹產(chǎn)取其子宮，通過(guò)浸泡浴器(充滿了無(wú)菌溶液)，將所取子宮送入隔離室內(nèi)。根據(jù)懷孕母鼠腹部的膨隆程度、陰道口的充血程度和松弛程度，來(lái)決定進(jìn)行剖腹產(chǎn)的合適時(shí)機(jī)。對(duì)上述無(wú)菌溶液而言，可以使用過(guò)氧乙酸溶液、2％Mikro-quat溶液、或碘酒熔液。優(yōu)選過(guò)氧乙酸溶液。另外，所述過(guò)氧乙酸溶液的濃度優(yōu)選0-1-0.2％之間。
從子宮中取其胚胎后，由代育母鼠進(jìn)行培育。該培育過(guò)程優(yōu)選在分組小于10000的SPF屏障區(qū)內(nèi)進(jìn)行，培育過(guò)程遵照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)指南(由韓國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院編制)進(jìn)行。特別是，本發(fā)明人在SPF屏障區(qū)進(jìn)行的培育過(guò)程由韓國(guó)Yonsei大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)研究中心的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物醫(yī)學(xué)部提供，該培育過(guò)程被調(diào)節(jié)為在下列條件下進(jìn)行溫度22-26℃、相對(duì)濕度45-55％、通風(fēng)頻率8-12次/小時(shí)、光強(qiáng)度大于25勒克斯、分組小于10000。通過(guò)同窩交配來(lái)繁殖動(dòng)物。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，為從上述繁殖的動(dòng)物中選取一個(gè)SPF倉(cāng)鼠組，進(jìn)行了對(duì)各種寄生蟲(chóng)、細(xì)菌和病毒(如表2、表3、表4所示)的微生物污染實(shí)驗(yàn)。在下列表2、表3及表4中，比較了本發(fā)明在挑選SPF倉(cāng)鼠時(shí)進(jìn)行的微生物污染實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目和目前VAF倉(cāng)鼠(取自Charles River實(shí)驗(yàn)公司或HarlanSprague Dawley公司)的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。
表2本發(fā)明中為選取一個(gè)SPF倉(cāng)鼠組而進(jìn)行的微生物實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目細(xì)菌

表3本發(fā)明中為選取一個(gè)SPF倉(cāng)鼠組而進(jìn)行的微生物實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目寄生蟲(chóng)

表4本發(fā)明中為選取一個(gè)SPF倉(cāng)鼠組而進(jìn)行的微生物實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目病毒


首先，本發(fā)明進(jìn)行了對(duì)細(xì)菌(表2所列)、寄生蟲(chóng)(表3所列)、10種倉(cāng)鼠特異性病毒和16種鼠特異性病毒(表4所列)的微生物污染實(shí)驗(yàn)。結(jié)果，選出了一個(gè)被證實(shí)不受微生物污染的SPF倉(cāng)鼠組(見(jiàn)表5-表9)。關(guān)于細(xì)菌和寄生蟲(chóng)的微生物污染實(shí)驗(yàn)，應(yīng)韓國(guó)Yonsei大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)研究中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物醫(yī)學(xué)部的要求，關(guān)于倉(cāng)鼠特異性病毒和鼠特異性病毒的微生物污染實(shí)驗(yàn)，應(yīng)英國(guó)格拉斯哥Q-one Biotech有限責(zé)任公司的要求。
關(guān)于對(duì)所述倉(cāng)鼠病毒的實(shí)驗(yàn)以及血清學(xué)實(shí)驗(yàn)，借助從倉(cāng)鼠中分離的PHK細(xì)胞，進(jìn)行了對(duì)10種特異性外源病毒(如表4所列)的倉(cāng)鼠抗體生成試驗(yàn)(HAP試驗(yàn))。
所述HAP試驗(yàn)在鼠抗體生成試驗(yàn)(MAP試驗(yàn))的基礎(chǔ)上進(jìn)行了修改，最先由Rowe及其同事開(kāi)展(Rowe WP et al，J.Exp.Med.，109379-391，1959；andRowe WP et al.，Virology 11645-649，1960)。它是一種敏感的、特異性的和綜合性的方法，用于檢測(cè)能夠感染倉(cāng)鼠組織的病毒。該實(shí)驗(yàn)將病毒接種在高敏倉(cāng)鼠宿主(未受到10種特異性外源病毒的感染)上，然后進(jìn)行敏感的、特異性的血清學(xué)測(cè)定來(lái)檢測(cè)病毒抗體。
為確定任意外來(lái)病毒感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的最大機(jī)會(huì)，使用了3種接種路線?？趦?nèi)接種物帶來(lái)了能夠進(jìn)入消化道的腸病毒。鼻內(nèi)接種物帶來(lái)了能夠進(jìn)入呼吸系統(tǒng)的呼吸道病毒。腹膜內(nèi)接種物帶來(lái)的病毒可能穿過(guò)消化道粘液膜進(jìn)入體內(nèi)器官。
關(guān)于對(duì)所述鼠病毒的實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行了對(duì)16種特異性病毒(如表4所列)的鼠抗體生成試驗(yàn)(MAP試驗(yàn))。(Rowe WP.，et al，J.Exp.Med.，109379-391，1959；Rowe WP.，et al.，In，The Problems of Laboratory Animal Disease.pp 132-141.ed.RC Harris.Academic Press Inc.，New York，1962；Smith AL.，In，Viral andMycoplasmal Infections of Laboratory Rodents.pp 731-750 eds PN Bhatt，ROJacoby，MC Morse and AE New.Academic Press Inc.，New York，1986)作為檢測(cè)細(xì)胞和/或腫瘤系內(nèi)的外來(lái)鼠科病毒的主要方法，MAP試驗(yàn)已經(jīng)廣泛使用了20年以上。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)將存于實(shí)驗(yàn)材料中的任何鼠科病毒接種到老鼠體內(nèi)，再檢測(cè)被接種老鼠體內(nèi)的抗體產(chǎn)物而進(jìn)行。
為確定任意外來(lái)病毒感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的最大可能性，使用了4種接種路線。口內(nèi)接種物帶來(lái)了能夠進(jìn)入消化道的腸病毒(MHV&GDV II)。鼻內(nèi)接種物帶來(lái)了能夠進(jìn)入呼吸系統(tǒng)的呼吸道病毒(PVM&SEND)。腹膜內(nèi)接種物帶來(lái)的病毒可能穿過(guò)消化道粘液膜進(jìn)入體內(nèi)器官。穿刺部位也充當(dāng)了一種進(jìn)入通道，可引起缺肢畸形。大腦內(nèi)接種物帶來(lái)了能夠直接進(jìn)入大腦腦膜的LCMV病毒。
在LCM激發(fā)實(shí)驗(yàn)中，用一種已知的病毒致命株來(lái)激發(fā)老鼠，觀察每個(gè)工作日直至12天時(shí)的發(fā)病率和死亡率。如果在實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目中存在LCMV的無(wú)毒株，將會(huì)使上述老鼠的免疫力得到激發(fā)，老鼠將會(huì)存活下去。如果實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目中不含所述無(wú)毒株，老鼠將會(huì)在4-12天時(shí)死于激發(fā)量。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是否受到了感染，以及實(shí)驗(yàn)材料中是否含有病毒，對(duì)不同可能的細(xì)菌，通過(guò)不同的技術(shù)來(lái)確定。本發(fā)明中使用的血清學(xué)技術(shù)包括直接熒光抗體(IFA)、酶聯(lián)免疫測(cè)定(ELISA)、補(bǔ)體結(jié)合(CFA)、免疫電子顯微鏡(IEM)、以及血凝抑制反應(yīng)(HAI)。
然后，為了檢測(cè)所選出的SPF倉(cāng)鼠組中是否存在可能引起機(jī)會(huì)感染的潛伏病毒，進(jìn)行了倉(cāng)鼠多瘤病毒(下文中，指‘HPyV’)的感染試驗(yàn)。敘利亞倉(cāng)鼠對(duì)HPyV病毒引起的感染非常敏感，該病毒可導(dǎo)致其毛囊上皮癌。病毒基因組包括大約為5.3kb大小的雙鏈DNA，其開(kāi)放閱讀框架的構(gòu)成呈典型的多瘤病毒狀(Delmas V，et al.，EMBO Journal，41279-1286，1985)。
使用PCR實(shí)時(shí)檢測(cè)對(duì)核苷酸靶分子的拷貝數(shù)進(jìn)行定量測(cè)定。PCR實(shí)時(shí)檢測(cè)利用Taq聚合酶的5’-核苷酸外切酶活性，來(lái)水解一種標(biāo)記了熒光指示劑的Taq Man內(nèi)探針，并冷卻染色(Lee LG，et al.，Nucleic Acids Research213761-3766，1993)。在ABI 7700序列測(cè)定系統(tǒng)中，對(duì)拷貝數(shù)的計(jì)算基于何時(shí)最先檢測(cè)到靶分子的擴(kuò)增。7700系統(tǒng)檢測(cè)出的是閾值循環(huán)數(shù)(CT)，該循環(huán)數(shù)是熒光能在固定的閾值基線之上穿過(guò)的少數(shù)循環(huán)數(shù)。通過(guò)將未知樣本與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，可以確定其絕對(duì)數(shù)量，該標(biāo)準(zhǔn)曲線由已知數(shù)量的靶分子生成(PE Applied Biosystems，1997，Relative quantitation of gene expression，UserBulletin #2.ABI PRISM 7700 Sequence detection system)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)樣本CT數(shù)與已知數(shù)量重組質(zhì)粒分子CT數(shù)的對(duì)比，可以確定實(shí)驗(yàn)樣本中存在的HPyV基因組DNA的數(shù)量，所述重組質(zhì)粒分子中包含HPyV DNA，以用于生成一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。在常規(guī)測(cè)定條件下，測(cè)定100個(gè)pHPyV的基因組。
結(jié)果在本發(fā)明中SPF倉(cāng)鼠的任何組織中，都未檢測(cè)到HPyV-特異性病毒(見(jiàn)表10)。
用于制備生物制品的細(xì)胞系可以在廣泛的宿主范圍內(nèi)產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒。所以，應(yīng)檢測(cè)本發(fā)明中SPF倉(cāng)鼠是否受到了內(nèi)源性倉(cāng)鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒(內(nèi)源性倉(cāng)鼠白血病病毒)的感染。如果證實(shí)了SPF倉(cāng)鼠受到了感染，還應(yīng)檢測(cè)人體細(xì)胞是否受到了SPF倉(cāng)鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染。實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目細(xì)胞系中是否存在逆轉(zhuǎn)錄病毒(能夠感染人類或原始細(xì)胞)，可用下面的探測(cè)細(xì)胞系進(jìn)行測(cè)定人類二倍體細(xì)胞系MRC-5、Burkitt’s淋巴瘤細(xì)胞系Raji、非洲青猴腎細(xì)胞系Vero、幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞系BHK等。MRC-5和Raji細(xì)胞用于檢測(cè)是否存在能感染人體細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒。MRC-5中可復(fù)制C-型逆轉(zhuǎn)錄病毒，而Raji中還可復(fù)制D-型逆轉(zhuǎn)錄病毒(包括松鼠猴逆轉(zhuǎn)錄病毒)。與Vero細(xì)胞的共同培養(yǎng)結(jié)果顯示，該細(xì)胞中可復(fù)制能感染靈長(zhǎng)類的逆轉(zhuǎn)錄病毒，而B(niǎo)HK細(xì)胞代表了倉(cāng)鼠細(xì)胞系中的一種細(xì)胞系。使用如此多種探測(cè)細(xì)胞的原因在于，通過(guò)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目細(xì)胞與不同宿主細(xì)胞的共同培養(yǎng)，未知病毒(可能潛伏于實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目細(xì)胞中)的表達(dá)機(jī)會(huì)可能會(huì)增加。
進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)時(shí)，將實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目細(xì)胞與探測(cè)細(xì)胞共同培養(yǎng)，并且在傳代1階段，除去實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目細(xì)胞。為了擴(kuò)增感染水平較低的病毒，至少對(duì)探測(cè)細(xì)胞進(jìn)行5次傳代。5次傳代后(如果合適，或者進(jìn)行更多的傳代)，從培養(yǎng)物中收集上清液，并通過(guò)產(chǎn)物—促進(jìn)性逆轉(zhuǎn)錄酶(PERT)測(cè)定法，來(lái)檢測(cè)是否存在逆轉(zhuǎn)錄病毒。對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶(HA)活性的測(cè)定而言，PERT測(cè)定是一種非常敏感的測(cè)定方法，有報(bào)道說(shuō)，該方法的敏感性是一般RT測(cè)定法的106倍以上(Silver J，et al，Nucleic Acids Research，213593-3594，1993；and Pyra H，et al.，PNAS，U.S.A.，911544-1548，1994)。BHK細(xì)胞中存在內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒，結(jié)果在進(jìn)行PERT測(cè)定時(shí)出現(xiàn)了陽(yáng)性結(jié)果，基于上述事實(shí)，使用RT測(cè)定法來(lái)檢測(cè)上清液中(取自BHK培養(yǎng)物)是否存在逆轉(zhuǎn)錄病毒。
特別是，在本發(fā)明中，將PHK細(xì)胞(從本發(fā)明的SPF倉(cāng)鼠中分離)分別與MRC-5和Raji細(xì)胞共同培養(yǎng)。結(jié)果，在與所述PHK細(xì)胞共同培養(yǎng)的人體細(xì)胞系中，未發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)的活性，該逆轉(zhuǎn)錄酶的活性是逆轉(zhuǎn)錄酶病毒活性的指示物(見(jiàn)表11和表12)。
在第三個(gè)實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)了本發(fā)明的SPF倉(cāng)鼠是否受到了未知病毒污染物的感染。進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)時(shí)，將探測(cè)細(xì)胞與PHK細(xì)胞(從本發(fā)明的SPF倉(cāng)鼠中分離)共同培養(yǎng)，并在整個(gè)培養(yǎng)期內(nèi)，用顯微鏡觀察該探測(cè)細(xì)胞中是否出現(xiàn)了CPE。另外，利用來(lái)自不同動(dòng)物如幾尼亞豬、雞和人體等的紅細(xì)胞(rbcs)，使上述探測(cè)細(xì)胞進(jìn)行紅細(xì)胞吸附作用。特別是，將PHK細(xì)胞(從本發(fā)明的SPF倉(cāng)鼠中分離)分別與MRC-5、Raji細(xì)胞和Vero細(xì)胞共同培養(yǎng)。利用幾尼亞豬紅細(xì)胞、雞紅細(xì)胞和人體‘O’型紅細(xì)胞的混合物，同樣使上述探測(cè)細(xì)胞進(jìn)行紅細(xì)胞吸附作用。結(jié)果，在上述與本發(fā)明中的PHK細(xì)胞共同培養(yǎng)的各種檢測(cè)細(xì)胞中，未觀察到細(xì)胞病變反應(yīng)(CPE)或紅細(xì)胞吸附作用。
最后一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，利用一種免疫抑制藥物—環(huán)孢霉素，檢測(cè)了本發(fā)明的SPF倉(cāng)鼠中是否存在未知的致淋巴瘤病毒的感染。在抑制了倉(cāng)鼠的免疫功能后的100天時(shí)間內(nèi)，本發(fā)明中的SPF倉(cāng)鼠未發(fā)生腫瘤或其它類似腫瘤的癥狀。
如上所述，可以證明在本發(fā)明中的SPF倉(cāng)鼠中，以及在從該SPF倉(cāng)鼠中提取的PHK細(xì)胞中，沒(méi)有感染細(xì)菌、寄生蟲(chóng)、10種特異性倉(cāng)鼠病毒、16種特異性鼠病毒、倉(cāng)鼠多瘤病毒、內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(倉(cāng)鼠白血病病毒)、未知倉(cāng)鼠淋巴瘤病毒(可潛在引起惡性淋巴瘤)、以及其它未知的倉(cāng)鼠病原體。而且，在由Charles River實(shí)驗(yàn)公司或Harlan Sprague Dawley公司培育的VAF系列倉(cāng)鼠中，僅僅檢測(cè)了是否存在幾種細(xì)菌、寄生蟲(chóng)和4-5種特異性倉(cāng)鼠病毒，沒(méi)有如本發(fā)明一樣，進(jìn)行一個(gè)廣泛的安全性確認(rèn)(見(jiàn)表2、表3和表4)。因此，在安全性上，本發(fā)明中的SPF倉(cāng)鼠優(yōu)于目前的VAF或其它SPF倉(cāng)鼠。所以很明顯，從本發(fā)明的SPF倉(cāng)鼠中提取原始細(xì)胞(優(yōu)選PHK細(xì)胞)，并將其作為細(xì)胞底物以用于制備生物制品是十分有利的。
上述生物制品包括所有的病毒疫苗，該病毒指所有能夠?qū)⒃技?xì)胞(從SPF倉(cāng)鼠中分離)作為宿主細(xì)胞(細(xì)胞底物)，從而在其中增殖的病毒。特定的例子包括在發(fā)明中制備的日本腦炎減毒活疫苗(Tsai et al.，Japaneseencephalitis vaccine.3rd ed.Vaccines，ed.S.A.Plotkin and W.Orenstein.，1999，PhiladelphiaWB Saunders，672-710)、日本腦炎滅活疫苗(Lu et al.，Japaneseencephalitis vaccine.1st ed.Medical Biological Products.1995，BeijingPeoples Medical Publishing House，528)、狂犬病疫苗(Plotkin SA，et al.，Rabiesvaccine，In Plotkin SA，Orenstein WA，eds.(1999)Vaccines(3rd ed.)，Philadelphia，PAWB Saunders company，743-766；Lu et al.，Rabies vaccine.1st ed.Medical Biological Products.1995，Beij ingPeoples Medical Publishing House，552)、登革熱疫苗、腎病綜合征出血熱疫苗(Lu et al.，Hemorrhagic fever vaccine.1st ed.Medical Biological Products.1995，BeijingPeoples Medical PublishingHouse，652)、以及蜱源性腦脊髓炎疫苗(Lu et al.，Tick-borne encephalitis vaccine.1st ed.Medical Biological Products.1995，BeijingPeoples Medical PublishingHouse，540)等。
附圖簡(jiǎn)述
圖1例示了本發(fā)明中產(chǎn)生一個(gè)SPF倉(cāng)鼠的過(guò)程簡(jiǎn)圖。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例下面將借助不同例子對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳述。但應(yīng)注意，本發(fā)明不僅僅局限于這些例子或受這些例子的限制。
<參考例1>
微生物污染實(shí)驗(yàn)1-1)對(duì)寄生蟲(chóng)的檢測(cè)用膠帶取標(biāo)本后，用光顯微鏡檢查是否存在任何外源性寄生蟲(chóng)。同時(shí)，為檢查是否存在任何內(nèi)源性寄生蟲(chóng)，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死，并進(jìn)行解剖，然后準(zhǔn)備好胃、小腸、大腸組織標(biāo)本。將所取標(biāo)本用蘇木精和伊紅染色，然后在光顯微鏡下檢查。
1-2)對(duì)細(xì)菌的檢測(cè)以下列三種方法為基礎(chǔ)，檢查是否存在細(xì)菌。
a.培養(yǎng)法—對(duì)除螺旋菌屬、肺炎支原體、毛狀梭菌外的所有細(xì)菌。
用消毒棉簽取氣管、鼻竇和腸道材料，并將其在培養(yǎng)板上鋪展開(kāi)，以備進(jìn)行細(xì)菌檢測(cè)。然后，遵照SOP(Standard Operating Procedure，標(biāo)準(zhǔn)操作程序)進(jìn)行處理。
b.PCR法—對(duì)螺旋菌屬以SEQ ID NO.1為前引物，以SEQ ID NO.2為逆引物進(jìn)行PCR(J.Clin.Microbiol.，35(6)1620-1623，1997；J.Clin.Microbiol.，39(11)3920-3926，2001)。PCR反應(yīng)在下列操作條件下進(jìn)行變性(94C，30秒)；退火(55℃，30秒)；延伸(72℃，2分鐘)，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，最后一步在72℃下進(jìn)行5分鐘。通過(guò)1.5％NuSieve瓊脂糖凝膠電泳，鑒別上述所得的PCR產(chǎn)物(FMC BioProducts，Rockland，Maine)。
c.ELISA法—對(duì)肺炎支原體和毛狀梭菌遵照廠商操作手冊(cè)的要求，利用Monilisa試劑盒(ICLAS，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物總研究中心，日本)和Murin抗原試劑盒(Intracel，美國(guó))進(jìn)行檢測(cè)。
1-3)對(duì)病毒的檢測(cè)以ELISA法為基礎(chǔ)進(jìn)行病毒檢測(cè)。遵照廠商操作手冊(cè)的要求，利用Monilisa試劑盒(ICLAS，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物總研究中心，日本)和Murin抗原試劑盒(Intracel，美國(guó))進(jìn)行ELISA。特別是，對(duì)上述表1中所列的7種倉(cāng)鼠病毒的檢測(cè)，遵照Smith法(Smith AL.(1986)Serologic tests for detection of antibody torodent viruses.In，Viral and Mycoplasmal Infections of Laboratory Rodents.pp731-750.eds.PN Bhatt，RO Jacoby，MC Morse and AE New.Academic Press Inc.，Orlando)和Lewis法(Lewis AM，Rowe WP，Turner HC and Heubner RJ.(1965)Lymphocytic choriomeningitis virus in hamster tumorspread to hamsters andhumans.Science，150，363-364)等進(jìn)行。除倉(cāng)鼠病毒之外，對(duì)其它病毒的檢測(cè)，在相應(yīng)例子中進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明。
<參考例2>
手術(shù)隔離室的準(zhǔn)備將一個(gè)手術(shù)隔離室(Daehan Biolink Co.Ltd.，Korea)的內(nèi)部用酒精和葡糖酸氯己定溶液消毒，然后用活動(dòng)氣流保持其正壓。將一個(gè)浸泡浴器內(nèi)充滿0.2％過(guò)氧乙酸溶液。把操作工具和其他必需品放進(jìn)該隔離室內(nèi)，以備外科手術(shù)用，另外準(zhǔn)備一個(gè)血瓊脂平板(SIGMA)，以備立即檢測(cè)可能存在于標(biāo)本(剛剛?cè)∽耘咛?中的微生物污染。
<例1>
篩選用于生產(chǎn)SPF倉(cāng)鼠的倉(cāng)鼠1-1)倉(cāng)鼠組的初次篩選遵照參考例1中所述的方法，將取自中國(guó)成都生物制品研究所的金色敘利亞倉(cāng)鼠進(jìn)行微生物污染實(shí)驗(yàn)(如表1)。結(jié)果，初次篩選出了未受微生物污染的倉(cāng)鼠組。
1-2)繁殖首次篩選出的倉(cāng)鼠組，并進(jìn)行第二次篩選在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物培育室里，通過(guò)同窩交配，將上述例1-1)中選出的倉(cāng)鼠組進(jìn)行3代以上的繁殖。再次進(jìn)行上述例1-1)中的微生物污染實(shí)驗(yàn)，從而第二次篩選出未受污染的動(dòng)物。然后，將選出的動(dòng)物分配到新的小組中，接著進(jìn)行繁殖。
<例2>
SPF倉(cāng)鼠的產(chǎn)生和繁殖2-1)懷孕母鼠和代育母鼠的篩選為挑選可通過(guò)剖腹產(chǎn)提供胚胎的懷孕母鼠，從例1-2)篩選出的倉(cāng)鼠組中，選取兩只具有一次以上分娩經(jīng)歷的雌鼠，并將其與一只具有交配經(jīng)歷的雄鼠放在同一籠中。第二天，選出生成了陰道栓的雌鼠，對(duì)其進(jìn)行處理，直至懷孕第一天，并繼續(xù)飼養(yǎng)。另外，將來(lái)自Charles River實(shí)驗(yàn)公司的VAF金色敘利亞倉(cāng)鼠(Harlan，USA)進(jìn)行上述微生物污染實(shí)驗(yàn)(如上述例1-1)所述)，并使用與上述同樣的方法，將確保未受污染的倉(cāng)鼠進(jìn)行交配，以獲取懷孕母鼠。由此獲得了代育母鼠。代育母鼠比懷孕母鼠早交配一天。選出在懷孕母鼠預(yù)產(chǎn)期前一天生產(chǎn)的動(dòng)物，并將其作為代育母鼠，以用來(lái)培育所述懷孕母鼠的胚胎。
2-2)通過(guò)剖腹產(chǎn)獲取胚胎以懷孕母鼠腹部的膨隆程度、陰道口的充血程度和松弛程度為基礎(chǔ)，確定剖腹產(chǎn)的合適時(shí)機(jī)。在懷孕后的第13.5天，進(jìn)行剖腹產(chǎn)。首先，注射CO2以處死懷孕的母鼠，然后用消毒皂(手用碘皂，美國(guó)QUIP實(shí)驗(yàn)公司)清洗尸體外表，并用酒精紗布進(jìn)行消毒。再用碘酒溶液進(jìn)一步消毒。進(jìn)行消毒時(shí)，懷孕母鼠的陰道開(kāi)放區(qū)和生殖區(qū)需格外注意，應(yīng)徹底清洗。打開(kāi)死亡動(dòng)物的腹部，取出子宮。用鉗子結(jié)扎每個(gè)卵巢兩側(cè)的區(qū)域，并用手術(shù)剪剪開(kāi)。再用鉗子結(jié)扎子宮頸區(qū)，并用手術(shù)剪剪開(kāi)。用碘酒溶液對(duì)切口處進(jìn)行消毒，并使子宮角朝下，將子宮穿過(guò)隔離室的浸泡浴器，從而引入隔離室的內(nèi)部(見(jiàn)
圖1)，所述隔離室在上述參考例2中已經(jīng)備好。然后，用消毒紗布和棉球盡可能快的除去子宮表面的消毒液，接著切開(kāi)子宮以取出胚胎。將上述獲取的胚胎移至手術(shù)臺(tái)上，該手術(shù)臺(tái)已提前備好并進(jìn)行了保暖。注意不要讓胚胎接觸化學(xué)溶液如消毒液等。大約半小時(shí)后，檢查完胚胎狀況，選出能自主呼吸的胚胎。然后，將代育母鼠的排泄物涂到胚胎上，并分配給每個(gè)代育母鼠8個(gè)胚胎。利用在手術(shù)中分離的胎盤等，對(duì)胚胎進(jìn)行微生物污染實(shí)驗(yàn)。
<例3>
在無(wú)菌環(huán)境中飼養(yǎng)和繁殖胚胎在SPF屏障區(qū)里，飼養(yǎng)上述例2中獲取的胚胎，所述SPF屏障區(qū)由韓國(guó)Yonsei大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)研究中心的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物醫(yī)學(xué)部提供。將所述屏障區(qū)調(diào)節(jié)到下列條件溫度22-26℃、相對(duì)濕度45-55％、通風(fēng)頻率8-12次/小時(shí)、光強(qiáng)度大于25勒克斯、分組小于10000。關(guān)于飲用水，供給氯化物濃度低于2％的離子水。關(guān)于飼養(yǎng)原料，供給經(jīng)過(guò)射線照射消毒的嚙齒類動(dòng)物普通食物(LabDiet Co.，USA)。關(guān)于倉(cāng)鼠后代的組成，將飼養(yǎng)的倉(cāng)鼠進(jìn)行分組，從而使每一代中有8個(gè)以上的繁殖組。為了進(jìn)行近親繁殖，采用同窩交配法，在該方法中，交配在同一窩中進(jìn)行。
<例4>
SPF倉(cāng)鼠的篩選4-1)細(xì)菌和寄生蟲(chóng)污染實(shí)驗(yàn)。
將從例3的繁殖組里選出的每一只倉(cāng)鼠，進(jìn)行細(xì)菌和寄生蟲(chóng)(如表2、表3所列)的微生物污染實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)根據(jù)上述參考例1中所述的方法進(jìn)行。如下表5所示，結(jié)果證實(shí)了在上述選出的倉(cāng)鼠組中，未檢測(cè)到寄生蟲(chóng)和細(xì)菌。
表5細(xì)菌和寄生蟲(chóng)污染實(shí)驗(yàn)結(jié)果


*-未檢測(cè)到4-2)病毒污染實(shí)驗(yàn)將從例4-1)中選出的倉(cāng)鼠進(jìn)行不同種類病毒的微生物污染實(shí)驗(yàn)。所有的病毒實(shí)驗(yàn)應(yīng)英國(guó)格拉斯哥Q-One Biotech公司所要求。
4-2-1)對(duì)10種倉(cāng)鼠特異性病毒的實(shí)驗(yàn)a.血清學(xué)實(shí)驗(yàn)從每個(gè)例4-1)里篩選出的實(shí)驗(yàn)組中，取5只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血清進(jìn)行ELISA分析(Smith AL.，Viral and Mycoplasmal Infections of Laboratory Rodents.731-750，1986；Lewis AM et al.，Science，150363-364，1965；Baum SG et al.，N.Eng.Med.，274934-936，1966)。首先，將表4中10種特異性倉(cāng)鼠病毒的抗體預(yù)覆于微量滴定平板上。將備好的血清標(biāo)本加到每個(gè)孔中，并將平板在室溫下溫育1小時(shí)。以VAF LVG敘利亞倉(cāng)鼠的血清為陰性對(duì)照，該VAF LVG敘利亞倉(cāng)鼠的年齡為3-4周，雌性，在屏蔽區(qū)內(nèi)飼養(yǎng)。以曾暴露于每一種病毒抗原的倉(cāng)鼠的血清為陽(yáng)性對(duì)照。然后用PBS/0.05％吐溫20，將平板清洗3遍，并將結(jié)合了過(guò)氧化物酶的異種lgG加到平板的每個(gè)孔中。再將平板在室溫下溫育1小時(shí)，然后將其用PBS/0.05％吐溫20清洗3遍。其后，將鄰苯二胺和尿素/H2O2底物加到平板的每個(gè)孔中。然后在室溫避光條件下，將平板溫育20分鐘。溫育之后，讀出在490nm下的吸光率，從而檢測(cè)是否存在特異性倉(cāng)鼠病毒。結(jié)果，篩選出了完全未受到任何倉(cāng)鼠病毒感染的倉(cāng)鼠組。下表6中概括了上述篩選出的倉(cāng)鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
表6倉(cāng)鼠病毒血清學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

*NC陰性對(duì)照*PC陽(yáng)性對(duì)照*-未檢測(cè)到*+檢測(cè)到b.倉(cāng)鼠抗體生成試驗(yàn)(HAP試驗(yàn))為了更精確地檢測(cè)上述10種特異性病毒(已知感染了倉(cāng)鼠組織)是否已存在于倉(cāng)鼠組(已在上述步驟a中篩選出)中，進(jìn)行了HAP試驗(yàn)。本發(fā)明所用的HAP試驗(yàn)在MAP試驗(yàn)的基礎(chǔ)上作了輕微修改，該MAP最先由Rowe及其同事開(kāi)展(Rowe WP et al，J.Exp.Med.，109379-391，1959；and Rowe WP etal.，Virology 11645-649，1960)。從倉(cāng)鼠(已在上述步驟a中篩選出)中分離出PHK細(xì)胞，并將其接種在雌性VAF LVG敘利亞金色倉(cāng)鼠中，該金色敘利亞倉(cāng)鼠為雌性，年齡3-4周。實(shí)驗(yàn)期間，將已被接種的倉(cāng)鼠置于高壓滅菌的微隔離單元內(nèi)，該隔離單元內(nèi)有草墊、水和食物，從而避免PHK細(xì)胞的污染病毒之外的病毒感染。在接種后的第二十八天，從所有動(dòng)物中取血清樣本。利用血清學(xué)測(cè)定法，在所有血清樣本中測(cè)定10種不同的病毒抗體。依照Hartley等方法(Hartley JW et al.，Virology，11645-649，1960)，用IFA法(直接免疫螢光測(cè)定)確定HANT抗體。用ELISA測(cè)定法確定其余9種病毒抗體。如下表7中所示，證實(shí)了沒(méi)有產(chǎn)生任何對(duì)受試倉(cāng)鼠病毒的抗體。該結(jié)果與上述步驟a中的結(jié)果一致。
表7 HAP試驗(yàn)結(jié)果

*-未檢測(cè)到4-2-2)對(duì)16種特異性鼠病毒的檢測(cè)為了證實(shí)倉(cāng)鼠組(已在上述例4-2-1中篩選出)是否已經(jīng)感染了鼠病毒，利用從所述倉(cāng)鼠中分離出的PHK細(xì)胞，進(jìn)行了MAP試驗(yàn)(Rowe WP.，et al，J.Exp.Med.，109379-391，1959；Rowe WP.，et al.，In，The Problems of LaboratoryAnimal Disease.pp 132-141.ed.RC Harris.Academic Press Inc.，New York，1962；Smith AL.，In，Viral and Mycoplasmal Infections of Laboratory Rodents.pp731-750 eds PN Bhatt，RO Jacoby，MC Morse and AE New.Academic Press Inc.，New York，1986)。
首先，在20只VAF老鼠(CD 1株，取自Harlan UK公司)上接種PHK細(xì)胞，所述PHK細(xì)胞取自上述步驟a中的倉(cāng)鼠。在接種后的第4天，處死4只老鼠，分離出其血漿。利用分光光度計(jì)測(cè)定法，檢測(cè)LDH(乳酸脫氫酶)的活性水平，從而確定是否存在LDV(乳酸脫氫酶—激發(fā)病毒)。結(jié)果證實(shí)，在接種了本發(fā)明里PHK細(xì)胞的老鼠中，其LDH活性與陰性對(duì)照的LDH活性相同(見(jiàn)下表8)。上述結(jié)果表明，上述4-2-1)中篩選出的倉(cāng)鼠未受LDV感染。
表8 LDV感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在接種后的第23天，用一種已知的LCMV致死株(淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒，Armstrong株)來(lái)激發(fā)4只老鼠，并觀察每一個(gè)工作日直至12天時(shí)的發(fā)病率和死亡率。如果上述PHK細(xì)胞沒(méi)有感染LCMV，動(dòng)物將會(huì)在4-12天內(nèi)死亡。在接種LCMV后的12天內(nèi)，接種了本發(fā)明里倉(cāng)鼠PHK細(xì)胞的4只老鼠全部死亡。該結(jié)果表明，本發(fā)明中生產(chǎn)的倉(cāng)鼠沒(méi)有感染LCMV。
在接種后的第31天，從剩余的老鼠中提取血清標(biāo)本，并通過(guò)血清學(xué)實(shí)驗(yàn)，來(lái)測(cè)定是否存在老鼠病毒的抗體。如下面表9中所述，在接種了本發(fā)明里PHK細(xì)胞的老鼠的血清中，未檢測(cè)到15種不同類型的鼠病毒。
表9 MAP試驗(yàn)結(jié)果

*-未檢測(cè)到根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了本發(fā)明中所建立的SPF倉(cāng)鼠組未感染任何微生物，包括19種細(xì)菌、6種寄生蟲(chóng)、以及10種倉(cāng)鼠病毒和16種鼠病毒。
<例5>
檢測(cè)不同類型病毒感染的附加實(shí)驗(yàn)本發(fā)明中，對(duì)例4中篩選出的SPF倉(cāng)鼠進(jìn)行了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)是否存在內(nèi)源性或外源性的病毒感染。
5-1)對(duì)倉(cāng)鼠多瘤病毒(HPyV)感染的檢測(cè)從例4中篩選出的SPF倉(cāng)鼠中取一只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，根據(jù)已知方法，分離其肝、脾、淋巴結(jié)、肺和腎組織。然后，利用ABI 7700序列檢測(cè)系統(tǒng)(PE AppliedBiosystems，1997，Relative quantitation of gene expression，User Bulletin #2)，檢測(cè)上述分離出的組織中是否存在HPyV-特異性序列。在96孔反應(yīng)平板的單個(gè)孔中進(jìn)行PCR反應(yīng)。以從上述組織中分離出的DNA為模板。將TaqMan PCR反應(yīng)混合物(包含TaqMan緩沖液A、Mg2+、dNTPs、AmpErase LNG、AmpliTaqGold DNA聚合酶、TaqMan HPyV-特異性引物以及熒光探針)加入反應(yīng)中。將反應(yīng)平板放進(jìn)ABI 7700反應(yīng)器中，在該反應(yīng)器中進(jìn)行AmpErase和AmpliTaq的活化和擴(kuò)增反應(yīng)。在50℃下進(jìn)行所述AmpErase反應(yīng)2分鐘。然后在95℃下進(jìn)行AmpliTaq Gold活化反應(yīng)10分鐘。另外，設(shè)定PCR反應(yīng)條件為共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，包括在95℃下變性15秒，在60℃下退火/延伸1分鐘。對(duì)對(duì)照組而言，在陰性對(duì)照組中，不使用模板進(jìn)行PCR；而在陽(yáng)性對(duì)照組中，以含HPyV靶基因的重組phaPV為模板進(jìn)行PCR。結(jié)果如下表10中所示。所以，證實(shí)了在本發(fā)明中SPF倉(cāng)鼠的所有組織內(nèi)，未檢測(cè)到HPyV—特異性序列。
表10倉(cāng)鼠多瘤病毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果

*-未檢測(cè)到*+檢測(cè)到5-2)對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的檢測(cè)從例4篩選出的SPF倉(cāng)鼠中分離PHK細(xì)胞，并將該P(yáng)HK細(xì)胞分別與人類二倍體細(xì)胞系MRC-5、人類Burkitts淋巴瘤細(xì)胞系Raji共同培養(yǎng)，然后檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄病毒的生成。首先，將PHK細(xì)胞(從本發(fā)明中的SPF倉(cāng)鼠上分離)與探測(cè)細(xì)胞(MRC-5或Raji細(xì)胞)共同培養(yǎng)4-5天。所述探測(cè)細(xì)胞系來(lái)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。在傳代1階段，除去所述PHK細(xì)胞，并將探測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)5代以上。為了使錯(cuò)誤的陽(yáng)性信號(hào)最小化，加入了CTNEAT(小牛胸腺活化DNA)，所述錯(cuò)誤陽(yáng)性信號(hào)由DNA聚合酶的類-逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)活性引起，而該CTNEAT可干擾DNA聚合酶的類-RT活性。在陽(yáng)性對(duì)照中，加入了類微粒病毒(VLPs)。然后，收集探測(cè)細(xì)胞5代培養(yǎng)后的上清液。根據(jù)公開(kāi)已知的方法，利用PERT測(cè)定法(產(chǎn)物增強(qiáng)性逆轉(zhuǎn)錄酶測(cè)定)來(lái)檢測(cè)是否存在逆轉(zhuǎn)錄病毒(Lugert R，et al.，Biotechniques，20(2)210-217，1996；Pyra H，etal.，PNAS.U.S.A.，911544-1548，1994)。將探測(cè)細(xì)胞接種在復(fù)式反孔平板的底部。結(jié)果，在接種了PHK細(xì)胞的培養(yǎng)物中未檢測(cè)到RT活性(相關(guān)內(nèi)容見(jiàn)表11、表12)。上述結(jié)果表明，本發(fā)明中SPF倉(cāng)鼠的PHK細(xì)胞未受到逆轉(zhuǎn)錄病毒(有可能感染人)的污染。
表11逆轉(zhuǎn)錄病毒MRC-5細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

*CT閾值循環(huán)*+陽(yáng)性*-陰性表12逆轉(zhuǎn)錄病毒Raji細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

*CT閾值循環(huán)*+陽(yáng)性*-陰性5-3)對(duì)未知倉(cāng)鼠病毒感染的檢測(cè)在本發(fā)明的SPF倉(cāng)鼠中，還檢測(cè)了是否可能存在未知的倉(cāng)鼠病毒污染，該病毒有可能會(huì)造成對(duì)各種探測(cè)細(xì)胞的機(jī)會(huì)感染。關(guān)于探測(cè)細(xì)胞，采用了人類二倍體細(xì)胞系MRC-5、人類Burkitt淋巴瘤細(xì)胞系Raji、非洲青猴腎細(xì)胞系Vero，所有的探測(cè)細(xì)胞來(lái)自ATCC。將探測(cè)細(xì)胞(MRC-5、Raji或Vero細(xì)胞)與PHK細(xì)胞(從本發(fā)明的SPF倉(cāng)鼠中分離)共同培養(yǎng)4-5天。在傳代1階段，除去PHK細(xì)胞，將探測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)5代以上。然后，在整個(gè)培養(yǎng)期內(nèi)，用顯微鏡觀察探測(cè)細(xì)胞中是否出現(xiàn)CPE。結(jié)果，整個(gè)培養(yǎng)期內(nèi)，在接種的培養(yǎng)物中未觀察到CPF。
另外，利用幾內(nèi)亞豬紅細(xì)胞、雞紅細(xì)胞和人類‘O’型血紅細(xì)胞的混合物，檢驗(yàn)了探測(cè)細(xì)胞對(duì)其的紅細(xì)胞吸附能力。在4℃下，使PHK細(xì)胞(取自本發(fā)明的SPF倉(cāng)鼠中)對(duì)幾內(nèi)亞豬紅細(xì)胞、雞紅細(xì)胞和人類‘O’型血紅細(xì)胞的混合物進(jìn)行紅細(xì)胞吸附作用，至少進(jìn)行30分鐘。以接種了培養(yǎng)基的探測(cè)細(xì)胞為陰性對(duì)照組，以接種了甲型流感病毒的MRC-5細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照組。結(jié)果，在陰性對(duì)照組和接種了PHK細(xì)胞的培養(yǎng)物(5次傳代后)中，未觀察到對(duì)人類‘O’型血紅細(xì)胞、雞紅細(xì)胞和幾內(nèi)亞豬紅細(xì)胞的紅細(xì)胞吸附作用。
因?yàn)樵趯HK細(xì)胞與各種探測(cè)細(xì)胞共同培養(yǎng)了很長(zhǎng)時(shí)間后，在所述PHK細(xì)胞中仍未觀察到CPF和紅細(xì)胞吸附作用，所以可以說(shuō)，在本發(fā)明SPF倉(cāng)鼠的PHK細(xì)胞中，不存在來(lái)自倉(cāng)鼠的未知病毒感染。
5-4)對(duì)未知倉(cāng)鼠淋巴瘤病毒感染的檢測(cè)取20只新生的SPF幼倉(cāng)鼠，對(duì)其施用免疫抑制藥物—環(huán)孢菌素，以抑制其免疫活性。在確保降低了其免疫活性后，以所述動(dòng)物為實(shí)驗(yàn)組。將實(shí)驗(yàn)組倉(cāng)鼠飼養(yǎng)100天以上，每周監(jiān)測(cè)是否發(fā)生了惡性淋巴瘤或其他腫瘤。在陽(yáng)性對(duì)照組中，準(zhǔn)備20只接種了HeLa腫瘤細(xì)胞(ATCC)的倉(cāng)鼠。在陰性對(duì)照組中，準(zhǔn)備10只未施用上述免疫抑制藥物的健康倉(cāng)鼠。100天后，將確定未發(fā)生惡性淋巴瘤或其它腫瘤的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死，并進(jìn)行尸檢。在每一個(gè)已被處死的動(dòng)物中，檢測(cè)淋巴結(jié)、脾、胰腺、腎、肺和肝等中的腫瘤痕跡。同時(shí)檢測(cè)其它異常。結(jié)果顯示，在抑制其免疫力后的100天時(shí)間內(nèi)，本發(fā)明的SPF倉(cāng)鼠中未發(fā)現(xiàn)腫瘤或其它類似腫瘤的損害。上述結(jié)果表明，在本發(fā)明的SPF倉(cāng)鼠中，沒(méi)有潛伏未知的倉(cāng)鼠病毒。
通過(guò)上述結(jié)果，可以證明本發(fā)明在例4中所篩選出的SPF倉(cāng)鼠中，沒(méi)有感染任何不同類型的寄生蟲(chóng)、細(xì)菌、病毒、倉(cāng)鼠病毒、鼠病毒以及其它已知/未知的病原體。而且，還可以證明，從本發(fā)明的SPF倉(cāng)鼠中提取的PHK細(xì)胞適用于制備生物制品(如疫苗等)。
<例6>
從本發(fā)明的SPF倉(cāng)鼠中分離PHK細(xì)胞，并用該P(yáng)HF細(xì)胞制備日本肝炎減毒活疫苗將本發(fā)明中的SPF倉(cāng)鼠(年齡為10-14天)用CO2氣體處死。消毒后，將其移至一個(gè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室中，分組小于10000。無(wú)菌狀態(tài)下取所述動(dòng)物的腎。將所收集到的幼倉(cāng)鼠的腎用EMEM介質(zhì)清洗，然后加入胰蛋白酶溶液。將浸泡在該胰蛋白酶溶液中的腎在37℃下溫育1-3小時(shí)。溫育后，將胰蛋白酶作用后的腎懸浮液用介質(zhì)(含血清)清洗，并借助玻璃珠獲取單一的細(xì)胞懸浮液。用含有血清的介質(zhì)將上述細(xì)胞懸浮液直接稀釋到適當(dāng)?shù)捏w積，并將其轉(zhuǎn)移到T-燒瓶中。通過(guò)繁殖獲取要求數(shù)量的細(xì)胞后，用不含血清的介質(zhì)清洗該細(xì)胞，并在EMEM介質(zhì)中將上述細(xì)胞培育大約1小時(shí)，該EMEM介質(zhì)中含日本肝炎病毒減毒株SA14-14-2(KCTC 0316 BP)。除去含病毒的培養(yǎng)基后，再將上述細(xì)胞培育3-4天，從而繁殖所述病毒。觀察到75％或更多的CPE后，收集含病毒的懸浮液，凈化和無(wú)菌過(guò)濾后，在2-8℃下貯存，以備QC檢測(cè)。然后，進(jìn)行最后的配方(加入穩(wěn)定劑)、填充和真空冷凍干燥。
<實(shí)驗(yàn)例1>
對(duì)本發(fā)明中日本肝炎減毒活疫苗的安全測(cè)試為證實(shí)日本肝炎減毒活疫苗對(duì)人體的安全性，進(jìn)行了安全測(cè)試，所述日本肝炎減毒活疫苗用本發(fā)明中SPF倉(cāng)鼠(例5)的PHK細(xì)胞配制。
1-1)對(duì)HPyV的檢測(cè)為檢測(cè)在本發(fā)明的日本肝炎減毒活疫苗中是否存在HPyV，利用ABI 7700序列探測(cè)系統(tǒng)，確定了是否存在HPyV特異性序列，方法如例5-1)所述。結(jié)果概括于下表13中。
表13對(duì)倉(cāng)鼠多瘤病毒的檢測(cè)結(jié)果

*-未檢測(cè)到*+檢測(cè)到1-2)HAP試驗(yàn)為檢測(cè)在本發(fā)明的日本肝炎減毒活疫苗中是否存在倉(cāng)鼠病毒，利用例4-2-1)步驟b中所描述的方法，進(jìn)行了HAP試驗(yàn)。結(jié)果概括于下表14中，非常明顯，在本發(fā)明的日本肝炎減毒活疫苗中，未檢測(cè)到任何一種倉(cāng)鼠病毒。
表14 HAP試驗(yàn)結(jié)果

*-未檢測(cè)到1-3)用LCM激發(fā)的MAP試驗(yàn)為檢測(cè)在本發(fā)明的日本肝炎減毒活疫苗中是否存在鼠病毒，利用例4-2-2)中所描述的方法，進(jìn)行了MAP試驗(yàn)。將例6中的日本肝炎減毒活疫苗再懸浮在1-5ml/瓶的DMEM介質(zhì)中。用DMEM介質(zhì)將中和抗血清以1∶10的比例稀釋。然后，將所述疫苗與上述稀釋的中和抗血清以1∶1的比例混合，并在37℃下培育1小時(shí)，從而生成了實(shí)驗(yàn)樣本。在20只SPF老鼠(CD1株，Harlan UK公司)上接種該樣本。在接種后的第13天，處死4只老鼠，通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定法，測(cè)定死亡老鼠的血漿中的LDH活性水平。如下表15中所述，在接種了本發(fā)明中PHK細(xì)胞的老鼠上，其LDH活性微低于陰性對(duì)照組的LDH活性。
表15 LDV感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在接種后的第14天，用LCM病毒(Amstrong株)激發(fā)4只老鼠，觀察每個(gè)工作日直至12天時(shí)的發(fā)病率和死亡率。7天后，所有的老鼠死亡。上述結(jié)果可以證實(shí)，在用本發(fā)明PHK細(xì)胞制備的日本肝炎減毒活疫苗中，未攜帶LCM病毒。
另外，在接種后的第34天，從剩余的老鼠中取血，并對(duì)其血清進(jìn)行血清學(xué)實(shí)驗(yàn)。如下表16中所示，未檢測(cè)到15種鼠病毒中的任何一種。
表16 MAP試驗(yàn)結(jié)果


*-未檢測(cè)到1-4)PERT測(cè)定在本發(fā)明的日本肝炎減毒活疫苗中，對(duì)是否存在逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行了檢測(cè)。本發(fā)明進(jìn)行了PERT測(cè)定，所述PERT測(cè)定法用于檢測(cè)具有酶活性的逆轉(zhuǎn)錄酶微粒，該法具有很高的靈敏度。首先，取例6中制備的活疫苗3ml，以大約11000g的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，從而對(duì)其進(jìn)行凈化，接著使其經(jīng)過(guò)0.45μm的消毒過(guò)濾器，從而除去殘余的碎片。然后，將上述處理后的疫苗以100000g的轉(zhuǎn)速超離心60分鐘，使其呈丸狀。將每個(gè)小丸再懸浮在100μl裂解緩沖液中，以釋放RT的活性。然后利用Pyra等公布的方法(Pyra H，et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.，911544-1548，1994)進(jìn)行PERT測(cè)定。結(jié)果證實(shí)在本發(fā)明的日本肝炎減毒活疫苗中，RT活性為陰性。上述結(jié)果表明，在本發(fā)明的日本肝炎減毒活疫苗中不存在逆轉(zhuǎn)錄病毒。
1-5)對(duì)未知病毒污染的體外測(cè)定通過(guò)將本發(fā)明中的日本肝炎減毒活疫苗與探測(cè)細(xì)胞系共同培養(yǎng)，本發(fā)明確定了該疫苗中是否有病毒感染。以人體近—三倍體細(xì)胞系H9(ATCC)為探測(cè)細(xì)胞。首先，將本發(fā)明日本肝炎減毒活疫苗的接種株與H9細(xì)胞系共同培養(yǎng)。在傳代1階段，除去接種株。將探測(cè)細(xì)胞繼續(xù)傳代5次以上。在整個(gè)培養(yǎng)期，用顯微鏡觀察探測(cè)細(xì)胞中是否出現(xiàn)CPE。在上述H9培養(yǎng)物中未觀測(cè)到CPE。
5次傳代后，從H9培養(yǎng)物中收集上清液，并通過(guò)PERT測(cè)定法來(lái)檢測(cè)是否存在逆轉(zhuǎn)錄病毒(Pyra H，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91544-1548，1994)。在接種了疫苗接種株的H9培養(yǎng)物中，未檢測(cè)到RT活性。
另外，在4℃下，借助幾尼亞豬紅細(xì)胞、雞紅細(xì)胞和人類‘O’型紅細(xì)胞的混合物，使H9細(xì)胞(接種了本發(fā)明的日本肝炎減毒活疫苗)進(jìn)行紅細(xì)胞吸附作用，至少進(jìn)行30分鐘。結(jié)果，在該H9細(xì)胞中未觀察到紅細(xì)胞吸附作用。因?yàn)樵贖9細(xì)胞(接種了本發(fā)明的日本肝炎減毒活疫苗)中未檢測(cè)到CPF、RT活性和紅細(xì)胞吸附作用，所以可以說(shuō)，本發(fā)明的日本肝炎減毒活疫苗未攜帶病毒污染。
1-6)對(duì)未知病毒污染的體內(nèi)測(cè)定根據(jù)CPMP和FDA的要求(Committee for Proprietary Medicinal ProductsAdHoc Working Party on Biotechnology/Pharmacy.J.Biol.Stand.，17213-222，1989；and Points to consider in characterization of cell lines used to producebiologicals，1993.Center for Biologics Evaluation and Research.Food and DrugAdministration，Gethesda MD 20205，USA)，為檢測(cè)本發(fā)明的日本肝炎減毒活疫苗中是否存在外來(lái)病毒因子，通過(guò)對(duì)胚胎、哺乳期小鼠、成年鼠和幾尼亞豬的接種，本發(fā)明進(jìn)行了下列體內(nèi)測(cè)定。
(1)樣本配制將本發(fā)明中的日本肝炎減毒活疫苗(已經(jīng)在例6中制備)再懸浮在1.5ml/瓶的DMEM中。用DMEM介質(zhì)將中和抗血清以1∶10的比例稀釋，將上述疫苗與該稀釋的中和抗血清以1∶1的比例混合，并在37℃下培育1小時(shí)。
(2)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)a.對(duì)哺乳期小鼠的實(shí)驗(yàn)首先，確定本發(fā)明中制備的疫苗對(duì)哺乳期小鼠的安全性。通過(guò)肌肉內(nèi)(0.01ml)、腹膜內(nèi)(0.1ml)、大腦內(nèi)(0.01ml)注射路徑，將上述步驟(1)中制備的樣本接種到哺乳期小鼠上(第一次接種)，該哺乳期小鼠至少20只，來(lái)自2窩或2窩以上。通過(guò)同樣的路徑，將DMEM介質(zhì)接種到另外一組哺乳期小鼠上，并作為陰性對(duì)照組。觀察小鼠是否出現(xiàn)如虛弱、震顫、癱瘓或死亡等任何疾病反應(yīng)，持續(xù)觀察14天。14天后，處死小鼠。分離出小鼠的器官，溶解并攪勻。用與第一次接種同樣的方法，將該器官懸浮液接種在另外一組新的哺乳期小鼠上(第二次接種)。同樣觀察該組小鼠14天。第一次接種中，在接種的24小時(shí)后，20只小鼠中存活了19只(存活率為95％)。對(duì)死亡的哺乳期小鼠進(jìn)行尸檢后，未觀察到病毒感染。第二次接種中，在接種的24小時(shí)后，所有的小鼠存活(存活率為100％)。
b.對(duì)成年鼠的實(shí)驗(yàn)通過(guò)肌肉內(nèi)(0.1ml)、腹膜內(nèi)(0.5ml)、大腦內(nèi)(0.031ml)注射路徑，將上述樣本接種到10只成年鼠上(SPF，CD 1株)。以同樣的路徑，將DMEM介質(zhì)接種到陰性對(duì)照組老鼠上。然后，觀察小鼠是否出現(xiàn)任何疾病反應(yīng)，持續(xù)觀察28天。結(jié)果，在接種的24小時(shí)后，所有的老鼠存活(存活率為100％)。
c.對(duì)幾內(nèi)亞豬的實(shí)驗(yàn)最后一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)肌肉內(nèi)(0.1ml)注射路徑，將上述樣本接種到5只成年幾內(nèi)亞豬(SPF，Duncan Hartley株)上。在陰性對(duì)照組中，以同樣的路徑將DMEM介質(zhì)接種到5只幾內(nèi)亞豬上。觀察上述幾內(nèi)亞豬是否出現(xiàn)任何疾病反應(yīng)，持續(xù)觀察28天。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在接種的24小時(shí)后，所有的幾內(nèi)亞豬存活(存活率為100％)。
(3)胚胎實(shí)驗(yàn)a.羊膜內(nèi)注射進(jìn)行羊膜內(nèi)注射時(shí)，選取10個(gè)10-11天大的SPF胚胎，將0.1ml上述樣本接種到其羊膜腔內(nèi)。另外選取10個(gè)10-11天大的SPF胚胎，將0.1mlDMEM介質(zhì)接種到其羊膜腔內(nèi)，并作為陰性對(duì)照組。選取第三組10個(gè)10-11天大的SPF胚胎，將0.1ml甲型流感病毒接種到其羊膜腔內(nèi)，并作為陽(yáng)性對(duì)照組。接種后，將胚胎在35-36℃下培育5天。收集羊水并混合。對(duì)混合后的羊水進(jìn)行血細(xì)胞凝集反應(yīng)(HA)活性測(cè)定。通過(guò)對(duì)羊水的連續(xù)2倍稀釋，在微量滴定平板上進(jìn)行HA測(cè)定。清洗雞和幾內(nèi)亞豬后，取其紅細(xì)胞，將該紅細(xì)胞中分別以0.5％懸浮液的形式加入上述平板中，并分別在2-8℃下培育1-2小時(shí)、在17-20℃下培育1-2小時(shí)，然后觀察該復(fù)式平板上的HA活性。結(jié)果顯示，在受試胚胎的羊水中，其HA活性與陰性對(duì)照組相近。另外，根據(jù)接種后24小時(shí)的生存測(cè)試，9個(gè)受試胚胎中，有8個(gè)存活(存活率為89％)。
b.尿囊內(nèi)注射進(jìn)行尿囊內(nèi)注射時(shí)，選取10個(gè)10-11天大的SPF胚胎，將0.1ml上述樣本接種到其尿囊腔內(nèi)(第一次傳代)。另外選取10個(gè)10-11天大的SPF胚胎，將0.1mlDMEM介質(zhì)接種到其尿囊腔內(nèi)，并作為陰性對(duì)照組。選取第三組10個(gè)10-11天大的SPF胚胎，將0.1ml甲型流感病毒(ATCC VR-547)接種到其尿囊腔內(nèi)，并作為陽(yáng)性對(duì)照組。接種后，將胚胎在35-36℃下培育3天。收集其尿囊液并混合。取混合后尿囊液中的一份，冷凍并在-70℃時(shí)或-70℃以下儲(chǔ)存，直至對(duì)其進(jìn)行HA活性測(cè)定、或?qū)⑵淅^代接種到新的一組胚胎中為止。
從最初通過(guò)尿囊接種了上述樣本的胚胎中，取其0.2ml混合后的尿囊液，將其一一接種到7個(gè)10-11天大的胚胎上，從而將該尿囊液進(jìn)行了傳代(第二次傳代)。從最初接種了DMEM介質(zhì)的胚胎中取其尿囊液，并通過(guò)同樣的途徑，將該尿囊液傳代到新的一組7個(gè)10-11天大的胚胎上。從最初接種了甲型流感病毒的胚胎中取其尿囊液，并通過(guò)同樣的途徑，將該尿囊液傳代到新的一組7個(gè)10-11天大的胚胎上。3天后，收集尿囊液，混合并測(cè)定其HA活性。利用與上述羊膜內(nèi)試驗(yàn)同樣的方法，進(jìn)行HA測(cè)定。
測(cè)定結(jié)果顯示，在受試胚胎的尿囊液中，其HA活性與陰性對(duì)照組相近。另外，根據(jù)接種后24小時(shí)的生存測(cè)試，在第一次傳代中，所有的胚胎保持存活(存活率為100％)，在第二次傳代中，7個(gè)胚胎中有5個(gè)保持存活(存活率為71％)。
c.卵黃囊內(nèi)注射進(jìn)行卵黃囊內(nèi)注射時(shí)，選取10個(gè)6-7天大的SPF胚胎，將0.1ml上述樣本接種到其卵黃囊腔內(nèi)(第一次傳代)。另外選取10個(gè)6-7天大的SPF胚胎，將0.1mlDMEM介質(zhì)接種到其卵黃囊內(nèi)，并作為陰性對(duì)照組。將上述胚胎在35-36℃下培育9天。然后，檢測(cè)該胚胎的存活率。收集上述卵黃囊，清洗并混合。然后將其制備成10％的懸浮液，并繼代接種到新的一組7個(gè)6-7天大的胚胎上(第二次傳代)。從注射了DMEM的胚胎中取其卵黃囊，同樣制備成10％的懸浮液，并將其繼代接種到新的一組7個(gè)6-7天大的胚胎上，以作為陰性對(duì)照組。9天后，檢測(cè)所有胚胎的生存能力。
上述結(jié)果顯示，第一次傳代中，在接種后的24小時(shí)內(nèi)，10只受試胚胎都保持存活(存活率為100％)，第二次傳代中，7只受試動(dòng)物都保持存活(存活率為100％)。
綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，證實(shí)在用本發(fā)明SPF倉(cāng)鼠的PHK細(xì)胞制備的日本肝炎減毒活疫苗中，未受到任何病毒感染。
工業(yè)應(yīng)用如上所述，根據(jù)本發(fā)明中的方法而生成的SPF倉(cāng)鼠未攜帶任何寄生蟲(chóng)、細(xì)菌、或其它各種內(nèi)源性或外源性病毒污染物。因此，從該SPF倉(cāng)鼠中提取的原始細(xì)胞、以及用該細(xì)胞制備的生物制品不會(huì)引起微生物污染物的機(jī)會(huì)感染，而在用于制備目前的生物制品(如疫苗等)的動(dòng)物細(xì)胞中，有可能存在該微生物污染物。所以，在本發(fā)明的SPF倉(cāng)鼠中，所提取的倉(cāng)鼠組織及其培養(yǎng)物的上清液可以安全用于制備各種生物制品，以備人體使用。
權(quán)利要求
1.一種用于生成SPF(特異性的不含病原體)倉(cāng)鼠，從而用來(lái)制備生物制品的方法，其步驟包括(a)首先，通過(guò)對(duì)寄生蟲(chóng)、細(xì)菌和倉(cāng)鼠病毒的微生物污染實(shí)驗(yàn)，選取未受感染的倉(cāng)鼠，并通過(guò)同窩交配繁殖上述選取的倉(cāng)鼠，然后從所繁殖的倉(cāng)鼠中，第二次選取未受到上述微生物感染的倉(cāng)鼠；(b)將所選取的倉(cāng)鼠進(jìn)行交配，在雌性倉(cāng)鼠懷孕后的第12-14天取其子宮，將所取的子宮引入一個(gè)隔離室，通過(guò)剖腹產(chǎn)取其胚胎，然后在分組小于10000的屏蔽區(qū)內(nèi)，利用代育母鼠來(lái)培育上述所取的胚胎，并(c)通過(guò)同窩交配來(lái)繁殖上述步驟(b)中所培育的倉(cāng)鼠，并對(duì)其進(jìn)行寄生蟲(chóng)、細(xì)菌、倉(cāng)鼠病毒、鼠病毒、內(nèi)源性倉(cāng)鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒、倉(cāng)鼠多瘤病毒(HPyV)、倉(cāng)鼠淋巴瘤病毒和未知倉(cāng)鼠病毒的微生物污染實(shí)驗(yàn)，然后從上述繁殖的倉(cāng)鼠中，選取未受上述微生物感染的倉(cāng)鼠。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述用于制備生物制品的SPF倉(cāng)鼠是用于提取倉(cāng)鼠原始腎細(xì)胞(PHK細(xì)胞)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中上述步驟(a)中的倉(cāng)鼠是金色敘利亞倉(cāng)鼠。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中上述步驟(a)或(c)中的寄生蟲(chóng)包括體內(nèi)寄生蟲(chóng)和體外寄生蟲(chóng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述體內(nèi)寄生蟲(chóng)包括肝毛細(xì)線蟲(chóng)、膜殼絳蟲(chóng)屬、家兔腦胞內(nèi)原蟲(chóng)、鼠賈第鞭毛蟲(chóng)(Girdia muris)、鼠六鞭毛蟲(chóng)(Spironucleus muris)和管狀線蟲(chóng)屬。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中上述步驟(a)中的細(xì)菌包括支氣管敗血性鮑特菌、庫(kù)氏棒狀桿菌、螺旋菌屬、肺炎支原體、沙門氏菌屬、鼠傷寒沙門氏菌、肺炎鏈球菌、銅銹色假單胞菌、親肺炎巴斯德氏菌、金黃色葡球菌和毛狀梭菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中上述步驟(a)中的倉(cāng)屬病毒包括仙臺(tái)(SEND)、鼠肺炎病毒(PVM)、鼠微小病毒(MVM)、鼠Kilham病毒(KRV)、3型呼吸道腸道病毒(Reo-3)、淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦炎病毒(LCMV)、Toolans H-1病毒(H-1)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中上述步驟(b)中的代育母鼠是一種不含病毒抗原(VAF)的倉(cāng)鼠。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中上述步驟(c)中的細(xì)菌還包括假單胞菌屬、巴斯德氏菌屬、催產(chǎn)克雷伯桿菌、多殺巴斯德菌、肺炎克雷伯桿菌、B組β-鏈球、G組β-鏈球、β-鏈球菌屬，以及上述步驟(a)中的細(xì)菌。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(c)中的倉(cāng)鼠病毒還包括泰勒鼠腦脊髓炎病毒(GD-7)、猿病毒5(SV5)、漢灘病毒(HANT)，以及上述步驟(a)中的倉(cāng)鼠病毒。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中上述步驟(c)中的鼠病毒包括淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦炎病毒(LCMV)、鼠肝炎病毒(MHV)、鼠肺炎病毒(PVM)、鼠微小病毒(MVM)、仙臺(tái)(SEND)、缺肢畸型病毒(ECTRO)、幼鼠獸疫腹瀉病毒(EDIM)、3型呼吸道腸道病毒(REO-3)、鼠腦脊髓炎病毒(GDVII)、鼠腺病毒(MAD)、多瘤病毒(POLY)、漢灘病毒(HANT)、鼠胸腺病毒(MTV)、鼠巨細(xì)胞病毒(MCMV)、鼠肺炎病毒(K)、乳酸鹽脫氫酶-促病毒(LDV)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生物制品選自一組疫苗，其中包括日本腦炎減毒活疫苗、日本腦炎滅活疫苗、狂犬病疫苗、登革熱疫苗、腎病綜合征出血熱疫苗、以及蜱源性腦脊髓炎疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于生成SPF(特異性的不含病原體SPF)倉(cāng)鼠的方法，該倉(cāng)鼠可以用來(lái)制備各種生物制品。特別是，本發(fā)明涉及一種用于生成SPF倉(cāng)鼠的方法，用該倉(cāng)鼠制備的各種生物制品未受到寄生蟲(chóng)、細(xì)菌、以及內(nèi)源性、外源性病毒等可潛在引起疾病的微生物感染。因?yàn)楦鶕?jù)本發(fā)明中的方法而生成的SPF倉(cāng)鼠未攜帶任何污染物，如寄生蟲(chóng)、細(xì)菌、以及內(nèi)源性或外源性病毒等，所以從該SPF倉(cāng)鼠中提取的原始細(xì)胞、以及用該細(xì)胞制備的生物制品不會(huì)引起任何微生物污染物的機(jī)會(huì)感染，而在用于制備目前的生物制品(如疫苗等)的動(dòng)物細(xì)胞中，有可能存在該微生物污染物。因此，可以安全地利用本發(fā)明中生成的SPF倉(cāng)鼠制備各種生物制品，以備人體使用。
文檔編號(hào)A01K67/00GK1517009SQ03157520
公開(kāi)日2004年8月4日 申請(qǐng)日期2003年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月10日
發(fā)明者成濟(jì)慶, 吳承炫, 申善行 申請(qǐng)人:格羅瓦克斯有限公司