專利名稱：表達(dá)二熒光基因之重組質(zhì)粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個(gè)重組質(zhì)粒，一種產(chǎn)生含有該重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因魚、宿主細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因魚研究系利用基因由異源及同源的調(diào)節(jié)元件所驅(qū)動(dòng)，并由組成型或組織特異性表達(dá)基因所產(chǎn)生的。調(diào)控元件包括抗凍蛋白、鼠金屬硫蛋白、雞的δ-結(jié)晶、鯉魚β肌動(dòng)蛋白、鮭魚組織蛋白H3及鯉魚α球蛋白的基因等等。然而，于轉(zhuǎn)基因魚中使用這些DNA元件有很大的缺點(diǎn)，包括表達(dá)效率低及轉(zhuǎn)基因的鑲嵌型表達(dá)。
將青鳉魚(mekada)β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)的lac報(bào)道基因顯微注射入青鳉魚卵后，雖然表達(dá)很少且具有高度的鑲嵌性，但還是會(huì)導(dǎo)致lacZ基因瞬時(shí)表達(dá)，甚至在第一子代也會(huì)表達(dá)出來(lái)。Hamada等人將綠色熒光蛋白與青鳉魚β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子融合后，顯微注射至魚卵所產(chǎn)生出來(lái)的青鳉魚胚胎的報(bào)告中也有類似的結(jié)果。(Hamada等，1998，MolMarine Biol Biotechnol 7173-180)。
Chi-Yuan Chou等人發(fā)表了一個(gè)兩端連接反向末端重復(fù)序列，以增加青鳉魚體內(nèi)轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率的DNA構(gòu)建質(zhì)粒。轉(zhuǎn)基因在第0代及之后兩代的表達(dá)都呈一致性(Chi-Yuan Chou等，2001，Transgenic Research 10303-315)。此外，Chung-Der Hsiao等人也指出將腺相關(guān)病毒反向末端重復(fù)序列(AAV-ITRs)嵌入轉(zhuǎn)基因后，會(huì)使得斑馬魚第0代的基因表達(dá)一致，并使轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)移很穩(wěn)定(Chung-Der Hsiao等，2001，DevelopmentalDynamics 220323-336)。
斑馬魚(zebrafish；Danio rerio)為脊椎動(dòng)物發(fā)育生物學(xué)研究的一種新的模式生物。以斑馬魚為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ接袔讉€(gè)主要的優(yōu)點(diǎn)，例如卵與胚胎的取得容易、胚胎形成過(guò)程的組織清晰、體外發(fā)育、世代時(shí)間短、及成魚和幼魚皆易于飼養(yǎng)等。
已有人利用包括大鼠肌凝蛋白輕鏈增強(qiáng)子(Moss，J.B.等，Greenfluorescent protein marks skeletal muscle in murine cell lines and zebrafish.Gene 173，8998，1996)、斑馬魚及吳郭魚之第一型類胰島素生長(zhǎng)因子啟動(dòng)子(Chen，J.Y.等，Isolation and characterization of tilapia(Oreochromismossambicus)insulin-like growth factors gene and proximal promoter region(DNA Cell Biol.17，359-376，1998)等各種不同的基因啟動(dòng)子，將已知的熒光基因如GFP基因(其中包括EGFP基因)導(dǎo)入斑馬魚中。這些轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的目的都是為了開發(fā)出一個(gè)可用于分析基因表達(dá)的GFP轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)或測(cè)試基因啟動(dòng)子中的調(diào)控DNA元件。
專利申請(qǐng)WO0049150揭示一種由單一熒光基因(如GFP)所表達(dá)的熒光轉(zhuǎn)基因觀賞魚。不過(guò)，仍然未開發(fā)出任何一種可一致及穩(wěn)定地表達(dá)出二種或二種以上之熒光基因的魚類。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一個(gè)重組質(zhì)粒，包含(a)一個(gè)普遍存在的啟動(dòng)子，(b)一個(gè)熒光基因，該基因可操控連接并插入該普遍存在的啟動(dòng)子之下游，(c)一個(gè)皮膚特異性或肌肉特異性啟動(dòng)子，以及(d)另一個(gè)熒光基因，該基因可操控連接并插入該皮膚特異性或肌肉特異性啟動(dòng)子之下游，其中，該普遍存在的啟動(dòng)子及皮膚特異性或肌肉特異性啟動(dòng)子具有反向性(adverse directional property)，且普遍存在的啟動(dòng)子及皮膚特異性或肌肉特異性啟動(dòng)子分別位于該熒光基因及該另一個(gè)熒光基因之上游，以具有可供所述基因轉(zhuǎn)錄之方向性。
本發(fā)明亦涉及一種含有本發(fā)明質(zhì)粒之宿主細(xì)胞。
另外，本發(fā)明還涉及一個(gè)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因魚之方法，該方法包括a)將本發(fā)明之質(zhì)粒導(dǎo)入魚卵細(xì)胞或胚胎細(xì)胞中，及b)使卵細(xì)胞或胚胎細(xì)胞發(fā)育成魚，其中本發(fā)明之質(zhì)粒導(dǎo)入此魚之基因組中。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一個(gè)可產(chǎn)生同時(shí)表達(dá)二種熒光基因的轉(zhuǎn)基因魚之方法，該方法包含下列步驟a)于適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈钗恢?，以限制酶切割本發(fā)明之質(zhì)粒，以獲得兩個(gè)質(zhì)粒片段I及II，其中該質(zhì)粒I含有本發(fā)明之質(zhì)粒中所定義的a)及b)片段，而該質(zhì)粒II含有本發(fā)明之質(zhì)粒中所定義的c)及d)片段；b)分別將該步驟a)之質(zhì)粒A及B導(dǎo)入魚卵細(xì)胞或胚胎細(xì)胞內(nèi)；及c)使該魚同時(shí)表達(dá)出質(zhì)粒I及II。
本發(fā)明亦涉及一種經(jīng)由所發(fā)明的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化過(guò)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。


圖1顯示表達(dá)二種熒光基因之轉(zhuǎn)基因魚的照片。
圖2顯示質(zhì)粒A和質(zhì)粒B連接后產(chǎn)生質(zhì)粒C之流程圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供了一種可將二種或二種以上(例如綠色及紅色熒光)的基因?qū)媵~體內(nèi)之重組質(zhì)粒。這些魚在一般的光源下，會(huì)呈現(xiàn)出均勻一致且強(qiáng)烈的熒光。
本發(fā)明提供一個(gè)重組質(zhì)粒，包含(a)一個(gè)普遍存在的啟動(dòng)子，(b)一個(gè)熒光基因，該基因可操控連接并插入該普遍存在的啟動(dòng)子之下游，(c)一個(gè)皮膚特異性或肌肉特異性之啟動(dòng)子，以及(d)另一個(gè)熒光基因，該基因可操控連接并插入該皮膚特異性或肌肉特異性啟動(dòng)子之下游，其中該普遍存在的啟動(dòng)子及皮膚特異性或肌肉特異性之啟動(dòng)子具有反向性，且普遍存在的啟動(dòng)子及皮膚特異性或肌肉特異性之啟動(dòng)子分別位于該熒光基因及該另一個(gè)熒光基因之上游，以具有可供所述基因轉(zhuǎn)錄之方向性。
文中提到術(shù)語(yǔ)“上游”及“下游”，意即當(dāng)參考方向定義為從熒光基因的起始密碼子至終止密碼子的方向時(shí)，某一點(diǎn)位于和參考方向同一方向的一端，便稱之為該點(diǎn)的“下游”，而和參考方向相反的一端則為該點(diǎn)的“上游”。
根據(jù)本發(fā)明，其普遍存在的啟動(dòng)子系用于驅(qū)動(dòng)本發(fā)明之質(zhì)粒表達(dá)出熒光基因。普遍存在的啟動(dòng)子及皮膚特異性或肌肉特異性之啟動(dòng)子具有反向性，且普遍存在的啟動(dòng)子位于該熒光基因之上游，以具有可供熒光基因轉(zhuǎn)錄之方向性。普遍存在的啟動(dòng)子優(yōu)選地選自由β-肌動(dòng)蛋白、elongation-1-α、18S-rDNA或5S-rDNA所組成的組。
根據(jù)本發(fā)明，皮膚特異性或肌肉特異性之啟動(dòng)子系用來(lái)驅(qū)動(dòng)熒光基因之表達(dá)。皮膚特異性或肌肉特異性之啟動(dòng)子位于該熒光基因之上游，以具有可供熒光基因轉(zhuǎn)錄之方向性。具皮膚特異性或肌肉特異性之啟動(dòng)子優(yōu)選地選自由α-肌動(dòng)蛋白、肌鈣蛋白(troponin)T、肌鈣蛋白C、肌凝蛋白之重鏈、細(xì)胞角質(zhì)蛋白II C型(cytokeratin type II C)或S-100所組成的組。
根據(jù)本發(fā)明，任何一種熒光基因都可被插入本發(fā)明質(zhì)粒之啟動(dòng)子的上游。熒光基因優(yōu)選地選自綠色、紅色、黃色或藍(lán)色熒光基因所組成的組。這些熒光基因可在市面上買得到，例如，可購(gòu)自Clonteh LaboratoriesInc.、Lightools Research及BD Biosciences Pharmingen等。以選自由綠色和紅色熒光基因組成的組為優(yōu)選。
Hiroshi Otsuki等人指出，當(dāng)使用普遍存在的啟動(dòng)子時(shí)，水稻作物包括愈合組織(calli)在內(nèi)的所有部分都會(huì)出現(xiàn)綠色熒光(Hiroshi Otsuki，January 12-16，2002，Plant，Animal & Microbe Genomes X Conference)。根據(jù)本發(fā)明，綠色熒光基因可操控連接并插入本發(fā)明之普遍存在的啟動(dòng)子之下游。綠色熒光蛋白(GFP)最初系分離自某種水母(Aequorea victoria)，且可在市面上買得到。GFP和其它生物發(fā)光報(bào)道分子不同，它只要接觸到紫外光或藍(lán)光，便可散發(fā)出明亮綠光。所散發(fā)的綠光是由于水母發(fā)光蛋白(aequorin)的能量轉(zhuǎn)移至GFP所致。GFP為一個(gè)238個(gè)氨基酸所構(gòu)成、分子量為28kDa的蛋白質(zhì)，其光譜主要吸收高峰為395nm、次要高峰為470nm、以及509nm之單一發(fā)射峰。GFP的優(yōu)點(diǎn)在于它的熒光不具物種依賴性，且不需靠底物、輔因子或其它蛋白質(zhì)即可發(fā)出綠光。已有人成功地利用數(shù)種如大腸桿菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞及植物細(xì)胞等宿主生物及細(xì)胞來(lái)表達(dá)出GFP。
根據(jù)本發(fā)明，紅色熒光基因可購(gòu)自BD Bioscience Clontech。在實(shí)施本發(fā)明時(shí)，pDsRed2-1系用來(lái)作為紅色熒光基因的來(lái)源。pDsRed2-1可編碼出DsRed2，它是一種經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)的DsRed變種，可較快成熟且較少非特異性聚集。DsRed2源自于香菇珊瑚的紅色熒光蛋白(drFP583；Matz，M.V.，等(1999)Nature Biotech.17969-973.)，它含有一連串的沉默堿基對(duì)變化，和人類的密碼子選擇偏好于哺乳細(xì)胞中高度表達(dá)相符合(Haas，J.，等(1996)Curr.Biol.6315-324.)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中，當(dāng)DsRed2組成型表達(dá)時(shí)，在轉(zhuǎn)染的24小時(shí)內(nèi)便可以熒光顯微鏡檢測(cè)到散發(fā)出紅色的細(xì)胞。在表達(dá)DsRed1的細(xì)菌及哺乳細(xì)胞系統(tǒng)中經(jīng)常會(huì)觀察到大的不可溶之蛋白質(zhì)聚集，在表達(dá)DsRed2的細(xì)胞中會(huì)戲劇性地減少許多。較快成熟、且較易溶解的紅色熒光蛋白也會(huì)使得宿主細(xì)胞較具耐受性。以DsRed2轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物無(wú)明顯的存活率減少之征兆，而在那些測(cè)試的細(xì)胞株中，表達(dá)DsRed2的細(xì)胞所出現(xiàn)的形態(tài)(如附著力、光線折射)及生長(zhǎng)特征和未轉(zhuǎn)染過(guò)的對(duì)照組一樣。pDsRed2-1是一個(gè)不含啟動(dòng)子的DsRed2載體，可用于監(jiān)控插入多重克隆位點(diǎn)(MCS)中的不同啟動(dòng)子及啟動(dòng)子/增強(qiáng)子組合之轉(zhuǎn)錄作用。將位于DsRed2上游的序列改變?yōu)镵ozak共有的翻譯起始部位(Kozak，M.(1987)Nucleic Acids Res.158125-8148.)，以增加真核細(xì)胞中的翻譯效率。在DsRed2基因下游的SV40多腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)DsRed2 mRNA的3’端作適當(dāng)?shù)奶幚怼］d體主要含有一個(gè)可供表達(dá)SV40T抗原的哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制的SV40起點(diǎn)、一個(gè)在大腸桿菌中用于繁殖的Puc復(fù)制起點(diǎn)、以及一個(gè)制造單股DNA的f1起點(diǎn)。一種具有新霉素抗藥性盒(Neor)可利用G418來(lái)選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，這個(gè)盒含有SV40早期啟動(dòng)子、Tn5之新霉素/卡那霉素抗藥性基因、以及來(lái)自皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV TK)基因的多腺苷酸信號(hào)。在大腸桿菌中，盒上游的細(xì)菌啟動(dòng)子可表達(dá)出卡那霉素抗藥性。
根據(jù)本發(fā)明，重組質(zhì)粒本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)分子技術(shù)，將含有普遍存在的啟動(dòng)子及一個(gè)熒光基因之質(zhì)粒，以及含有皮膚特異性或肌肉特異性的啟動(dòng)子及另一個(gè)熒光基因之質(zhì)粒結(jié)合起來(lái)所構(gòu)成的。在實(shí)施本發(fā)明時(shí)，以限制酶切割含有普遍存在的啟動(dòng)子及綠色熒光基因的質(zhì)粒，以得到一個(gè)4.7kb的片段。含有皮膚特異性或肌肉特異性的啟動(dòng)子及紅色熒光基因的質(zhì)粒也以限制酶切割而得到一段7.5kb的片段。經(jīng)由接合步驟將所產(chǎn)生的4.7kb片段及7.5kb片段連接在一起。
本發(fā)明提供了一種含有本發(fā)明質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，可利用一些宿主系統(tǒng)來(lái)容納本發(fā)明之質(zhì)粒，這些宿主系統(tǒng)包括以重組噬菌體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌、質(zhì)?；蛘沉NA表達(dá)載體等微生物，以酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母，以病毒表達(dá)載體感染過(guò)的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)，以病毒表達(dá)載體或細(xì)菌表達(dá)載體感染過(guò)的植物細(xì)胞系統(tǒng)，或動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)等，但不僅限于此。
本發(fā)明提供一種以本發(fā)明質(zhì)粒轉(zhuǎn)化過(guò)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。根據(jù)本發(fā)明，此轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以是任何方便取得的動(dòng)物，例如非人類之哺乳動(dòng)物，如用于實(shí)驗(yàn)室測(cè)試過(guò)程中的嚙齒類動(dòng)物及魚類就是一例。使用例如經(jīng)由顯微注射或注射重組載體之傳統(tǒng)又方便的基因操作技術(shù)，將本發(fā)明質(zhì)粒導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)，便可方便地得到本發(fā)明之轉(zhuǎn)基因動(dòng)物?；蚩山?jīng)由導(dǎo)入細(xì)胞的前體而直接或間接進(jìn)入動(dòng)物的一個(gè)細(xì)胞或所有細(xì)胞中?；虿僮骷夹g(shù)包括經(jīng)典的雜交育種、體外授精、導(dǎo)入可能會(huì)整合入染色體中或成為染色體外復(fù)制的DNA之重組DNA分子。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物以轉(zhuǎn)基因魚為優(yōu)選，而以自青鳉魚、斑馬魚、七彩神仙魚、金魚、鏘魚、慈鯛、孔雀魚、龍魚、錦鯉、斗魚或其它觀賞魚中所選出的轉(zhuǎn)基因魚為更優(yōu)選。根據(jù)本發(fā)明，所發(fā)明之轉(zhuǎn)基因魚可表達(dá)出一種摻雜綠色及紅色的顏色。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的質(zhì)?？捎糜诋a(chǎn)生出表達(dá)一種熒光、摻雜熒光及同時(shí)表達(dá)不同熒光的魚。就表達(dá)一種熒光基因來(lái)說(shuō)，利用適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈钏l(fā)明的質(zhì)粒，以產(chǎn)生出含有一種熒光基因的質(zhì)粒片段。將所產(chǎn)生出來(lái)的一段質(zhì)粒導(dǎo)入魚的卵細(xì)胞或胚胎細(xì)胞內(nèi)，以得到表達(dá)一種熒光基因的魚。就表達(dá)摻雜熒光來(lái)說(shuō)，將所發(fā)明的質(zhì)粒導(dǎo)入魚卵或胚胎細(xì)胞內(nèi)，以得到表達(dá)摻雜熒光的魚。就同時(shí)表達(dá)不同的熒光來(lái)說(shuō)，將含有不同熒光基因的不同質(zhì)粒導(dǎo)入魚卵或胚胎細(xì)胞內(nèi)，以得到同時(shí)表達(dá)不同熒光基因的魚。
優(yōu)選地，本發(fā)明質(zhì)粒可用來(lái)產(chǎn)生出表達(dá)單一綠色熒光基因、單一紅色熒光基因、摻雜綠色及紅色熒光基因或同時(shí)表達(dá)綠色及紅色熒光基因的魚。就表達(dá)綠色熒光的魚來(lái)說(shuō)，以限制酶于適當(dāng)?shù)奈恢们懈畋景l(fā)明之質(zhì)粒，以得到一個(gè)含有普遍存在的啟動(dòng)子及操控連接并插入該普遍存在啟動(dòng)子的下游之綠色熒光基因的質(zhì)粒。將所產(chǎn)生的質(zhì)粒導(dǎo)入魚卵或胚胎內(nèi)，便可表達(dá)出綠色熒光。就表達(dá)紅色熒光的魚來(lái)說(shuō)，以限制酶于適當(dāng)?shù)奈恢们懈畋景l(fā)明之質(zhì)粒，以得到一個(gè)含有皮膚特異性或肌肉特異性的啟動(dòng)子及操控連接并插入該皮膚特異性或肌肉特異性的啟動(dòng)子下游之紅色熒光基因的質(zhì)粒，并將所產(chǎn)生的質(zhì)粒導(dǎo)入魚卵細(xì)胞或胚胎細(xì)胞內(nèi)，便可表達(dá)出紅色熒光。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明提供了一個(gè)可產(chǎn)生出表達(dá)摻雜熒光的轉(zhuǎn)基因魚之方法，該方法包含a)將發(fā)明之質(zhì)粒導(dǎo)入魚卵細(xì)胞或胚胎細(xì)胞中，及b)讓卵細(xì)胞或胚胎細(xì)胞發(fā)育成魚，其中將所發(fā)明之質(zhì)粒導(dǎo)入魚的基因組中，以得到可表達(dá)出摻雜熒光的魚。熒光基因以選自綠色、紅色、黃色或藍(lán)色熒光基因所組成的組為優(yōu)選，如熒光基因選自綠色或紅色熒光基因所組成的組則更優(yōu)選。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明提供了一個(gè)可產(chǎn)生出同時(shí)表達(dá)兩種不同熒光的轉(zhuǎn)基因魚之方法，該方法包含下列步驟a)以限制酶于適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈钗恢们懈顧?quán)利要求1的質(zhì)粒后，可得到I及II兩個(gè)質(zhì)粒片段，其中質(zhì)粒I含有權(quán)利要求1所定義之片段a)及b)，質(zhì)粒II含有權(quán)利要求1所定義之片段c)及d)；b)將步驟a)所述的各個(gè)質(zhì)粒A及質(zhì)粒B分別導(dǎo)入魚卵細(xì)胞或胚胎細(xì)胞中，c)使前述的魚同時(shí)表達(dá)出質(zhì)粒I及II。
根據(jù)本發(fā)明，從發(fā)明的方法所制造出來(lái)的魚，可同時(shí)表達(dá)出兩種不同的熒光。以限制酶于適當(dāng)?shù)奈恢们懈畋景l(fā)明之質(zhì)粒，以得到兩個(gè)質(zhì)粒，其中一個(gè)質(zhì)粒含有普遍存在的啟動(dòng)子及一個(gè)操控連接并插入該普遍存在啟動(dòng)子的下游的熒光基因，另一個(gè)質(zhì)粒則含有皮膚特異性或肌肉特異性的啟動(dòng)子及另一個(gè)操控連接并插入該皮膚特異性或肌肉特異性啟動(dòng)子下游的熒光基因。然后，將所產(chǎn)生的兩個(gè)質(zhì)粒分別導(dǎo)入魚中，以各自表達(dá)出不同的熒光基因。熒光基因選自綠色、紅色、黃色或藍(lán)色熒光基因所組成的組為優(yōu)選，如熒光基因選自于含有綠色及紅色熒光基因的所組成的組則更為優(yōu)選。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，從本發(fā)明方法所得到的魚可同時(shí)顯示出紅色及綠色熒光。優(yōu)選地，從本發(fā)明方法所得到的魚可利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)來(lái)進(jìn)一步育種繁殖，以得到一致及穩(wěn)定表達(dá)紅色和綠色熒光的魚類。
下列實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但非欲限制本發(fā)明之范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1 建構(gòu)包含GFP序列的質(zhì)粒分離具皮膚特異性或肌肉特異性和能普遍存在地表達(dá)斑馬魚cDNA之無(wú)性繁殖株。cDNA無(wú)性繁殖系之分離與定序如Gong，Z.等在Gene201，87-98(1997)中所述?；旧?，隨機(jī)cDNA無(wú)性繁殖株是選自斑馬魚胚胎和成魚之cDNA基因庫(kù)，且經(jīng)由單一定序反應(yīng)來(lái)部份定序每一cDNA無(wú)性繁殖株。這段部分序列隨后用來(lái)確認(rèn)已定序無(wú)性繁殖株之潛在功能和組織特異性。
如圖2所示，質(zhì)粒A為一構(gòu)建質(zhì)粒之結(jié)構(gòu)觀。GFP由普遍存在之啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)。當(dāng)質(zhì)粒被NotI及PstI限制酶線性化后，以去氧核苷酸(dNTP)將其粘性末端填平，再自瓊脂糖凝膠電泳中回收4.7kb之片段。此質(zhì)粒依本發(fā)明說(shuō)明構(gòu)建質(zhì)粒之組成。
實(shí)施例2 建構(gòu)一段包含紅色熒光蛋白序列的質(zhì)粒如實(shí)施例1，質(zhì)粒B為如圖2所示構(gòu)建質(zhì)粒之結(jié)構(gòu)觀。DsRed由皮膚特異性或肌肉特異性之啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)。當(dāng)質(zhì)粒被PstI限制酶線性化后，以去氧核苷酸(dNTP)將其粘性末端填平，再自瓊脂糖凝膠電泳中回收7.5kb的片段。此質(zhì)粒依本發(fā)明說(shuō)明構(gòu)建質(zhì)粒之組成。
實(shí)施例3 通過(guò)連接質(zhì)粒A和B來(lái)構(gòu)建質(zhì)粒如圖2所示，質(zhì)粒C為一構(gòu)建質(zhì)粒之結(jié)構(gòu)，表示為經(jīng)由限制酶NotI所切割之線性化片段，或是經(jīng)由限制酶NotI或SalI所切割之線性化片段。此質(zhì)粒依本發(fā)明說(shuō)明用于基因轉(zhuǎn)移的構(gòu)建質(zhì)粒之組成。
實(shí)施例4 引入質(zhì)粒及熒光鏡檢在人工條件十四小時(shí)光照與十小時(shí)黑暗下及以Tetramin(TetraGermany)飼育斑馬魚。受精三十分鐘內(nèi)收集卵且去除連結(jié)細(xì)絲。將受精卵保持在6℃直到用DNA片段顯微注射為止，該DNA片段(如以NotI切割之線性化質(zhì)粒C或以NotI及SalI切割之線性化質(zhì)粒C)于第一次分裂前，以10μg/ml濃度注入細(xì)胞質(zhì)。在26℃于蒸餾水中培育經(jīng)注射卵。在明亮域下用解剖立體顯微鏡(MZAPO，Leica，Germany)觀察胚胎。檢測(cè)綠及/或紅色熒光之暗域發(fā)光系以配備GFP及/或紅色熒光蛋白之立體顯微鏡執(zhí)行。用帶有ISO 400底片與底片定時(shí)曝光之控制器之相機(jī)拍照。
實(shí)施例5制造可表達(dá)兩種熒光之轉(zhuǎn)基因斑馬魚斑馬魚繁殖將一池的雄性及雌性斑馬魚養(yǎng)在一個(gè)60×20×30厘米之玻璃魚缸，將溫度設(shè)在28.5℃及14小時(shí)的照光周期。每天以豐年蟲喂魚兩次，之后，挑選出數(shù)對(duì)強(qiáng)壯之雄性與雌性斑馬魚，并置于一個(gè)附有收集卵的網(wǎng)子之30×10×20厘米的孵育槽中。為了建立轉(zhuǎn)基因株，將一對(duì)轉(zhuǎn)基因魚和野生種養(yǎng)在22×14×13厘米的缸中。
基因轉(zhuǎn)移和原種轉(zhuǎn)基因魚(transgenic founder)之篩選以塑料毛細(xì)管收集受精卵，并放在架子內(nèi)。在開口10μm的玻璃針中裝滿線性化的質(zhì)粒溶液，并以礦物油固定。接著將體積2-4nl的DNA樣本顯微注射至單細(xì)胞之受精卵中。將注射過(guò)之受精卵放在含有低濃度的甲基藍(lán)溶液之培養(yǎng)皿中孵化，并置于設(shè)定28℃之培養(yǎng)箱中。于第三天時(shí)，使用熒光顯微鏡即可觀察到表達(dá)出熒光的胚胎。五天后，將熒光斑馬魚移至飼養(yǎng)之魚缸中。12周后便可達(dá)到性成熟。
熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚之種系傳遞的產(chǎn)生將帶有熒光表達(dá)的推定原種轉(zhuǎn)基因魚和野生株進(jìn)行雜交。轉(zhuǎn)基因F2(第二代)由兩個(gè)熒光F1之間互相雜交而來(lái)，這種魚終其一生都可觀察到熒光的表達(dá)。
實(shí)施例6熒光轉(zhuǎn)基因魚的潛在應(yīng)用熒光轉(zhuǎn)基因魚在市場(chǎng)上可用來(lái)作為觀賞魚?？蛇M(jìn)行GFP轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與野生魚類或另一種轉(zhuǎn)基因魚的配種來(lái)開發(fā)出穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因株。經(jīng)由分離出更多的斑馬魚基因啟動(dòng)子，例如具有眼睛特異性、骨特異性、尾巴特異性等，以及/或經(jīng)由傳統(tǒng)的方法飼養(yǎng)這些轉(zhuǎn)基因斑馬魚，便可制造出更多種類的熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚。
因?yàn)樗{(lán)色熒光蛋白(BFP)基因、黃色熒光蛋白(YFP)基因及青綠色熒光蛋白(CFP)基因都可于Clonetech買得到，因此利用相同的技術(shù)便可產(chǎn)生出多種顏色的熒光魚。例如，在具有眼睛特異性的啟動(dòng)子之下帶有GFP、在具有皮膚特異性的啟動(dòng)子之下帶有BFP、以及在具有肌肉特異性的啟動(dòng)子之下帶有YFP的轉(zhuǎn)基因魚，將出現(xiàn)下列多種的熒光色綠眼、藍(lán)皮膚及黃眼睛。將具有不同組織特異性的啟動(dòng)子及熒光蛋白基因重新組合后，將可創(chuàng)造出更多不同顏色變化的轉(zhuǎn)基因魚。利用相同組織來(lái)表達(dá)二種或二種以上不同的熒光蛋白，便可創(chuàng)造出一種中間色。
通過(guò)使用重金屬(例如鎘、鈷、鉻)或荷爾蒙(例如雌激素、雄性素或其它類固醇荷爾蒙)可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，可開發(fā)出一種用來(lái)監(jiān)控環(huán)境污染及評(píng)估人類飲用及水耕用的水質(zhì)之生物感測(cè)系統(tǒng)。在這樣的一個(gè)生物感測(cè)系統(tǒng)中，當(dāng)如重金屬及雌激素(或其衍生物)之類的污染物在水中環(huán)境達(dá)到域值濃度時(shí)，轉(zhuǎn)基因魚便會(huì)發(fā)出綠色的熒光(或其它顏色，視所使用之熒光蛋白基因而定)。此一生物感測(cè)系統(tǒng)優(yōu)于傳統(tǒng)的分析方法，因其速度快、可看得見(jiàn)、以及可直接鑒別出水中環(huán)境所發(fā)現(xiàn)到的復(fù)雜混合物中的特定化合物，且便于攜帶或較不需要附屬的儀器。除此之外，生物感測(cè)系統(tǒng)也可提供有關(guān)生物毒性之直接信息，且其為生物所能分解及可再生的。
數(shù)種物質(zhì)的環(huán)境監(jiān)控，亦可通過(guò)創(chuàng)造出一種具有可編碼出由對(duì)各種物質(zhì)有反應(yīng)的啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)之不同顏色的熒光蛋白的基因之轉(zhuǎn)基因魚，然后便可觀察到魚在環(huán)境中所顯示出的特定顏色。或者，也可以特有的載體來(lái)轉(zhuǎn)化一些魚，然后可將這些魚摻入用來(lái)監(jiān)測(cè)環(huán)境的魚群中，并觀察每一只魚所表達(dá)出來(lái)的顏色。
此外，熒光轉(zhuǎn)基因魚在科學(xué)研究材料的市場(chǎng)中應(yīng)該也具有價(jià)值，因?yàn)樗鼈兛捎糜谌缱粉櫦?xì)胞品系及細(xì)胞遷移之胚胎方面的研究。表達(dá)GFP之轉(zhuǎn)基因魚的細(xì)胞也可用來(lái)作為細(xì)胞移植及細(xì)胞核移植實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞及遺傳標(biāo)記。
本發(fā)明已成功地證明可在斑馬魚上建構(gòu)兩個(gè)熒光基因，這也能用于其它種類的魚，例如青鳉魚、金魚、包括錦鯉在內(nèi)的鯉魚、鰍魚、吳郭魚、吻仔魚、鯰魚、天使魚、七彩神仙魚、鰻魚、斗魚、蝦虎魚、馬甲魚、孔雀魚、劍尾魚(紅劍)、hatchet魚、摩利魚、淡水鯊魚等。
以上所述者，僅為本發(fā)明部份優(yōu)選實(shí)施例的說(shuō)明，故凡應(yīng)用本發(fā)明說(shuō)明書及權(quán)利要求書的等效方法的變化，理應(yīng)包含在本發(fā)明之專利范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一個(gè)重組質(zhì)粒，包含(a)一個(gè)普遍存在的啟動(dòng)子，(b)一個(gè)熒光基因，該基因可操控連接并插入該普遍存在的啟動(dòng)子的下游，(c)一個(gè)皮膚特異性或肌肉特異性的啟動(dòng)子，以及(d)另一個(gè)熒光基因，該基因可操控連接并插入該皮膚特異性或肌肉特異性啟動(dòng)子的下游，其中該普遍存在的啟動(dòng)子及皮膚特異性或肌肉特異性啟動(dòng)子具有反向性，且該普遍存在的啟動(dòng)子及皮膚特異性或肌肉特異性啟動(dòng)子分別位于該熒光基因及該另一個(gè)熒光基因的上游，以具有可供所述基因轉(zhuǎn)錄的方向性。
2.權(quán)利要求1的重組質(zhì)粒，其中該普遍存在的啟動(dòng)子可選自由β-肌動(dòng)蛋白、elongation-1-α、18S-rDNA或5S-rDNA所組成的組。
3.權(quán)利要求1的重組質(zhì)粒，其中該皮膚特異性或肌肉特異性的啟動(dòng)子可選自由α-肌動(dòng)蛋白、肌鈣蛋白(troponin)T、肌鈣蛋白C、肌凝蛋白重鏈、細(xì)胞角質(zhì)蛋白II C型(cytokeratin type II C)或S-100所組成的組。
4.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求1的質(zhì)粒。
5.一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因魚的方法，該方法包含a)將權(quán)利要求1的質(zhì)粒導(dǎo)入魚卵細(xì)胞或胚胎細(xì)胞中，以及b)使該卵細(xì)胞或胚胎細(xì)胞發(fā)育成魚，其中權(quán)利要求1的質(zhì)粒導(dǎo)入此魚的基因組中。
6.權(quán)利要求5的轉(zhuǎn)基因魚，其中該魚可選自由青鳉魚、斑馬魚、七彩神仙魚、金魚、鳉魚、慈鯛、孔雀魚、龍魚、鯉魚或斗魚所組成的組。
7.一種轉(zhuǎn)基因魚，其包含(a)一個(gè)普遍存在的啟動(dòng)子，(b)一個(gè)熒光基因，該基因可操控連接并插入該普遍存在的啟動(dòng)子的下游，(c)一個(gè)皮膚特異性或肌肉特異性啟動(dòng)子，以及(d)另一個(gè)熒光基因，該基因可操控連接并插入該皮膚特異性或肌肉特異性啟動(dòng)子的下游，其中該普遍存在的啟動(dòng)子及皮膚特異性或肌肉特異性啟動(dòng)子具有反向性，且該普遍存在的啟動(dòng)子及皮膚特異性或肌肉特異性啟動(dòng)子分別位于該熒光基因及該另一個(gè)熒光基因的上游，以具有可供所述基因轉(zhuǎn)錄的方向性。
8.權(quán)利要求7的轉(zhuǎn)基因魚，其中該熒光基因選自由綠色、紅色、黃色或藍(lán)色熒光基因所組成的組。
9.權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)基因魚，其中該熒光基因選自由綠色和紅色熒光基因所組成的組。
10.一種制造同時(shí)表達(dá)兩種不同熒光基因的轉(zhuǎn)基因魚的方法，該方法包含下列步驟a)在適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈钗恢?，以限制酶切割?quán)利要求1的質(zhì)粒，以獲得兩個(gè)質(zhì)粒片段I及II，其中該質(zhì)粒I含有權(quán)利要求1所定義的a)及b)片段，而質(zhì)粒II則含有權(quán)利要求1所定義的c)及d)片段；b)分別將該步驟a)的質(zhì)粒I及II導(dǎo)入魚卵細(xì)胞或胚胎細(xì)胞內(nèi)，及c)使該魚同時(shí)表達(dá)出質(zhì)粒I及II。
11.權(quán)利要求10的方法，其中該熒光基因可選自由綠色、紅色、黃色或藍(lán)色熒光基因所組成的組。
12.權(quán)利要求11的方法，其中該熒光基因可選自由綠色或紅色熒光基因所組成的組。
全文摘要
本發(fā)明提供一個(gè)重組質(zhì)粒，其包含(a)一個(gè)普遍存在的啟動(dòng)子，(b)一個(gè)熒光基因，該基因可操控連接并插入該普遍存在的啟動(dòng)子的下游，(c)一個(gè)皮膚特異性或肌肉特異性的啟動(dòng)子，以及(d)另一個(gè)熒光基因，該基因可操控連接并插入該皮膚特異性或肌肉特異性啟動(dòng)子的下游，其中，該普遍存在的啟動(dòng)子及皮膚特異性或肌肉特異性的啟動(dòng)子具有反向性，且普遍存在的啟動(dòng)子及皮膚特異性或肌肉特異性的啟動(dòng)子分別位于該熒光基因及該另一個(gè)熒光基因的上游，以具有可供所述基因轉(zhuǎn)錄的方向性。此外，本發(fā)明亦提供一種宿主細(xì)胞，一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因魚及帶有本發(fā)明質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因魚。
文檔編號(hào)A01K67/027GK1590548SQ0315792
公開日2005年3月9日 申請(qǐng)日期2003年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月29日
發(fā)明者蔡懷楨 申請(qǐng)人:邰港科技股份有限公司, 蔡懷楨