專利名稱：：肌醇六磷酸酶變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及親代肌醇六磷酸酶的變體，具體為熱穩(wěn)定性和/或比活性提高的變體。本發(fā)明也涉及編碼此變體的DNA序列，在重組宿主細(xì)胞生產(chǎn)它們，以及使用所述變體的方法，具體在動(dòng)物飼料領(lǐng)域。優(yōu)選的親代肌醇六磷酸酶是包含SEQIDNO2的隔孢伏革菌屬(Peniophora)肌醇六磷酸酶。
背景技術(shù)：
：名稱為“Modifiedphytases”的EP897010公開了本文未現(xiàn)的(i.a.)煙曲霉(Aspergillusfumigatus)肌醇六磷酸酶的某些變體。名稱為“Consensusphytases”的EP897985公開了本文未現(xiàn)的可基于例如數(shù)個(gè)子囊菌肌醇六磷酸酶的序列多重比對(duì)設(shè)計(jì)的真菌共有(Consensus)肌醇六磷酸酶。名稱為“Thermostablephytasesinfeedpreparationandplantexpression”的WO99/48380涉及使用熱穩(wěn)定的肌醇六磷酸酶的某些方面。熱穩(wěn)定的肌醇六磷酸酶的實(shí)施例見第30頁(yè)粗線下列出的數(shù)個(gè)共有(consensus)肌醇六磷酸酶。名稱為“Improvedphytases”的WO00/43503涉及本文未現(xiàn)的熱穩(wěn)定性增加的某些肌醇六磷酸酶變體，該變體可通過EP897985所述類似的方法來(lái)設(shè)計(jì)。熱穩(wěn)定的肌醇六磷酸酶的實(shí)施例見第54-55頁(yè)粗線下所示。這些肌醇六磷酸酶均與SEQIDNO2具有75％以下的百分比同一性。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供新的和改進(jìn)的肌醇六磷酸酶變體，具體為熱穩(wěn)定性改進(jìn)和/或比活性增加。WO98/28408中公開了來(lái)自Peniophoralycii的肌醇六磷酸酶，并且WO99/49022中公開了它的某些變體(見例如在第76-77頁(yè)的權(quán)利要求31)，然而該變體為本發(fā)明目的已經(jīng)被放棄了。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及親代肌醇六磷酸酶的變體，包含在選自如下區(qū)域的至少一個(gè)區(qū)域的至少一個(gè)位置的取代20；26；28-31；37-48；55-69；73-83；91-119；123-126；135-142；152-163；169-199；204-222；229-238；248-266；284-289；300-308；321-335；343-350；384-398；407-412；和419-430；其中(a)所述變體具有肌醇六磷酸酶活性；并且(b)每個(gè)位置對(duì)應(yīng)于SEQIDNO2的一個(gè)位置；并且(c)所述變體與SEQIDNO2有至少75％的百分比同一性；并且(d)附帶所述變體不是選自如下的PeniophoralyciiCBS686.96肌醇六磷酸酶的變體G26S；Y28N；D29S；F31Y；E42D，K，A；T45R；V46I；W59F；S62D；A64K；R65Q，E，G，A；S66T；R67A，I，Q，K；Q68Y，V，I；K74R，A；A99N；D100S；L102V；P103E；F104L；N107T，Q；S109M；H110S，V；Q111E，N；T112A，S；M116F，I，L；A135S；D137Y；Q138D，S，G；D142A；()154fH；S155N；G156P；E157Q，S；E169S；E170A，P；G171A；()171aS；T174P，A；N177S；N178S，T；M179T，V，L；N182A，V；V184G；D185E；()185eT；G186S，A；D187R，K，S；()187aV，T；E188Q，S，A，V；S189E；V195L；N199A，P；L204N；A207D，H；S216T；D217E；L219Y，T；T220Y，N；L221F；M222L；L230V；()235eE，Q；V248R，I；S249Q，A；E251D；Y254A，L，G；D255N；D257K；Y259F；T262H；P264A；G286R，H；Q287K，S；A288P；T321Q，S，G；M3221；V323I；P324A；A327S，F(xiàn)，I，L；F332Y；N333P；E344R；R346P；W348F；V349L，A，S；D350S，V；G388A；V393R；E395K，T；或L396R。本發(fā)明也涉及編碼所述肌醇六磷酸酶變體的分離的氨基酸序列，和包含所述核苷酸序列的核苷酸構(gòu)建體，載體，及宿主細(xì)胞，以及生產(chǎn)并使用所述肌醇六磷酸酶變體的方法。附圖簡(jiǎn)述圖1提供了含有SEQIDNO2的氨基酸序列的Peniophoralycii肌醇六磷酸酶3D結(jié)構(gòu)的坐標(biāo)。發(fā)明詳述隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶的三維結(jié)構(gòu)根據(jù)在X-RayStructureDetermination，Stout，G.K.andJensen，L.H.，JohnWiley&Sons，Inc.NY，1989給出的X-射線結(jié)晶(crystallographic)方法的原理得到所述Peniophoralycii肌醇六磷酸酶的結(jié)構(gòu)。用同晶置換(isomorphousreplacement)方法在2.2_分辨率下在圖1以標(biāo)準(zhǔn)的PDB格式(ProteinDataBank，BrookhavenNationalLaboratory，Brookhaven，CT)給出所述晶體結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。圖1的PDB文件僅涉及此肌醇六磷酸酶序列的一部分，也就是對(duì)應(yīng)于SEQIDNO2的殘基22-422的部分。分子動(dòng)力學(xué)(Dynamics)(MD)分子動(dòng)力學(xué)(MD)模擬(simulations)指示了所述氨基酸在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)的流動(dòng)性(見McCammon，JAandHarvey，SC.，(1987)，“Dynamicsofproteinsandnucleicacids”，CambridgeUniversityPress)。所述蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)通?？膳c所述結(jié)晶B因子(見Stout，GHandJensen，LH，(1989)，“X-raystructuredetermination”，Wiley)相關(guān)。通過在例如不同溫度進(jìn)行所述MD模擬，可模擬殘基與溫度相關(guān)的流動(dòng)性。建議隨機(jī)誘變流動(dòng)性或柔性(flexibility)(這里指各向同性波動(dòng)(isotropicfluctuations))最高的區(qū)域。可以理解在所述蛋白質(zhì)的某些區(qū)域發(fā)現(xiàn)的高流動(dòng)性，可以通過取代這些殘基來(lái)溫度改進(jìn)(thermallyimproved)。用程序CHARMM(分子模擬(MSI))，用MD在300，350，400，450，和500K處理上述的隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶結(jié)構(gòu)300和600ps，然后用300stepsSteepestDescent，600stepsConjugatedGradients，和3000stepsABNR以0.001kcal/mole的公差等級(jí)(tolerancegrade)最小化。由MD模擬建議誘變?nèi)缦聟^(qū)域300和400K無(wú)水MD37-48，91-119，232-238，300-308，325-335，343-348；300和400K有水MD407-412；300K無(wú)水MD229-236；有周期(period)邊界(boundary)的立方水盒(waterbox)的MD123-126，154-157，204-216，284-289，419-423。按對(duì)X-結(jié)構(gòu)中B-因子的評(píng)估建議誘變?nèi)缦聟^(qū)域73-83，207-217。上述區(qū)域可被組合如下37-48；73-83；91-119；123-126；154-157；204-217；229-238；284-289；300-308；325-335；343-348；407-412；419-423。得自MD模擬的其他區(qū)域是154-163；204-218；323-335；342-350。得自B-因子評(píng)估的其他區(qū)域是1-29，優(yōu)選1-28；59-106；169-171；178-247；339-344；367-371；417向前。更優(yōu)選的區(qū)域是1-24；69-94；182-188；199-220；229-241；368-370；420-423?；钚晕稽c(diǎn)和底物結(jié)合殼(Shells)可用本領(lǐng)域已知的程序，如分子模擬MSI，SanDiego，California的INSIGHTII來(lái)限定包含那些與所述催化殘基(H55，D319，R54)很臨近的氨基酸殘基的活性位點(diǎn)殼。也可限定底物結(jié)合殼，其包含與所述底物結(jié)合位點(diǎn)(H55，R54，R139，N320)很臨近并因此可期待與所述底物接觸的那些氨基酸殘基。很臨近可被限定為與相關(guān)殘基距離例如，0_，15_，16_，或20_?？赏ㄟ^將肌醇六磷酸或其衍生物如肌醇-1，4，5-三磷酸(Brookhavendatabasefile1djx.肌醇-1，4，5-三磷酸)楔入(dock)所述活性位點(diǎn)裂縫(cleft)(所述殘基構(gòu)成(makingup)所述活性位點(diǎn)的表面)來(lái)推斷底物結(jié)合的信息。制備變體的策略基于圖1的3D-結(jié)構(gòu)和SEQIDNO2，隨后對(duì)活性位點(diǎn)和底物結(jié)合殼(16_，優(yōu)選15_，更優(yōu)選10_)的研究，以及分子動(dòng)力學(xué)，主要為了改進(jìn)熱穩(wěn)定性和/或增加比活性，建議對(duì)下述區(qū)域進(jìn)行誘變氨基酸26-31；55-69；99-104；135-142；169-193；253-266；或SEQIDNO2的氨基酸321-323。優(yōu)選對(duì)SEQIDNO2上述區(qū)域的下述位置進(jìn)行誘變G26，P27，Y28，D29，P30，W59，P60，T61，S62，G63，A64，R65，S66，R67，Q68，V69，A99，D100，L102，P103，F(xiàn)104，A135，G136，D137，Q138，V141，D142，E169，E170，N177，N178，M179，P181，N182，D189，T191，W192，L193，Y253，Y254，D257，K258，Y259，Y260，T262，G265，N266，T321，和/或V323。包括下述變體G26S，A；P27X，M；Y28F，N，Q；D29S，T，A；F30X；W59X，F(xiàn)，Y；P60S；T61S；S62A；G63A，S；A64T，K，R，S；R65A；S66K，T；R67X，K，A，L，V，S；Q68E，D，N，M；V69X；A99X，D，S，E，N；D100X，S，E，N；L102V；P103X，E；F104X，L；A135S，D；G136X，S，D；D137S；Q138X，D，N；V141X；D142X；E169A；E170X，A，T；N177D；N178A，G，L；M179V，T；P181X，T，V；N182X，A；D189X；T191X；W192X；L193T，I；Y253N，G；Y254A，G；D257S；K258L；Y259X，F(xiàn)，P，W；Y260X，P，W；T262Y，V；G265X；N266Q；T321Q，L，N；和/或V323I。主要指向所述底物的氨基酸殘基或位置如下P27，Y28，R65，R67，Q68，A99，D100，L102，A135，G136，D137，E169，N177，T191，W192，Y253，Y254，T262，和T321。在一或多個(gè)這些位置改變的變體具體包括，例如包含在這些位置的至少一個(gè)，至少兩個(gè)，至少三個(gè)，至少四個(gè)，至少五個(gè)，至少六個(gè)，至少七個(gè)，至少八個(gè)，至少九個(gè)，或至少十個(gè)改變的變體。在具體實(shí)施方案中，所述變體包含在至少十一個(gè)，至少十二個(gè)，至少十三個(gè)，至少十四個(gè)，至少十五個(gè)，至少十六個(gè)，至少十七個(gè)，至少十八個(gè)，或在所有的十九個(gè)位置上的改變。所述變體的實(shí)施例是選自如下的那些包含至少一個(gè)，兩個(gè)，三個(gè)，四個(gè)，五個(gè)，六個(gè)，七個(gè)，八個(gè)，九個(gè)，或至少十個(gè)突變的變體P27X，M；Y28F，N，Q；R65A；R67X，K，A，L，V，S；Q68E，D，N，M；A99X，D，S，E，N；D100X，S，E，N；L102V；A135S，D；G136X，S，D；D137S；E169A；N177D；T191X；W192X；Y253N，G；Y254A，G；T262Y，V；和/或T321Q，L，N。在具體實(shí)施方案中，所述變體含有至少十一個(gè)，十二個(gè)，十三個(gè)，十四個(gè)，十五個(gè)，十六個(gè)，十七個(gè)，至少十八個(gè)，或十九個(gè)這些突變。具有肌醇六磷酸酶活性的多肽本文中，具有肌醇六磷酸酶活性的多肽(肌醇六磷酸酶)是催化肌醇六磷酸鹽(肌醇六磷酸鹽(hexakisphosphate))水解為(1)肌醇和/或(2)其一磷酸鹽，二磷酸鹽，三磷酸鹽，四磷酸鹽，和/或五磷酸鹽和(3)無(wú)機(jī)磷酸鹽的酶。本文中，術(shù)語(yǔ)肌醇六磷酸酶底物包括本文未示的肌醇六磷酸及任何肌醇六磷酸鹽(肌醇六磷酸的鹽)，及上面(2)所列的磷酸鹽?；ヂ?lián)網(wǎng)上的ENZYME地址(http//www.expasv.ch/enzvme/)匯集了與酶命名相關(guān)的信息。它主要根據(jù)的國(guó)際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)合會(huì)命名委員會(huì)(IUB-MB)推薦并且它描述了每種提供了EC(酶學(xué)委員會(huì))數(shù)字的定性的(characterized)酶(BairochA.TheENZYMEdatabase，2000，NucleicAcidsRes28304-305)。也見NC-IUBMB的EnzymeNomenclature手冊(cè)，1992。根據(jù)所述ENZYME地址，已知兩種不同種類的肌醇六磷酸酶所謂的3-肌醇六磷酸酶(肌醇六磷酸鹽3-磷酸水解酶，EC3.1.3.8)及所謂的6-肌醇六磷酸酶(肌醇六磷酸鹽6-磷酸水解酶，EC3.1.3.26)。本發(fā)明中，肌醇六磷酸酶的定義包括這兩種類型。本發(fā)明中以單位FYT測(cè)定所述肌醇六磷酸酶活性，一FYT為每分鐘釋放(liberates)1微摩爾無(wú)機(jī)正磷酸鹽的酶。在下述條件pH5.5；溫度37℃；底物肌醇六磷酸鈉(C6H6O24P6Na12)濃度為0.0050mol/l。適當(dāng)?shù)募〈剂姿崦冈囼?yàn)(assay)是WO00/20569實(shí)施例1所述的FYT和FTU試驗(yàn)。FTU是為了測(cè)定食物和預(yù)先混合物中的肌醇六磷酸酶活性。所述FYT試驗(yàn)也在本文實(shí)施例2描述。親代肌醇六磷酸酶親代肌醇六磷酸酶是與來(lái)自PeniophoralyciiCBS686.96的肌醇六磷酸酶同源的肌醇六磷酸酶。本文中，同源的是指與本文SEQIDNO2，對(duì)應(yīng)于所述完整(complete)氨基酸序列的氨基酸17-439，包括來(lái)自PeniophoralyciiCBS686.96(WO98/28408的SEQIDNO2)肌醇六磷酸酶的信號(hào)肽部分有至少60％的同一性。通常如下氨基酸同源性部分所述來(lái)測(cè)定同源性。所述親代肌醇六磷酸酶可為野生型或自然出現(xiàn)的多肽，或其等位變體，或其具有肌醇六磷酸酶活性的片段，特別是其成熟部分。它也可為其變體和/或遺傳工程化或合成多肽。在具體實(shí)施方案中所述野生型親代肌醇六磷酸酶是真菌肌醇六磷酸酶，如絲狀真菌的肌醇六磷酸酶，或酵母肌醇六磷酸酶。酵母肌醇六磷酸酶的實(shí)施例是US5830732所述的許旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)肌醇六磷酸酶。在另一具體實(shí)施方案中，所述野生型真菌親代肌醇六磷酸酶來(lái)自絲狀真菌，例如子囊菌(Ascomycota)門或擔(dān)子菌(Basidiomycota)門(分別為子囊菌肌醇六磷酸酶，或擔(dān)子菌肌醇六磷酸酶)。子囊菌肌醇六磷酸酶的實(shí)施例來(lái)自曲霉(Aspergillus)的菌株，例如泡盛曲霉(Aspergillusawamori)PHYA(SWISSPROTP34753，Gene13355-62(1993))，黑曲霉(Aspergillusniger)(無(wú)花果曲霉(ficuum))PHYA(SWISSPROTP34752，EP420358，Gene12787-94(1993))，泡盛曲霉PHYB(SWISSPROTP34755，Gene13355-62(1993))，黑曲霉PHYB(SWISSPROTP34754，Biochem.Biophys.Res.Commun.19553-57(1993))；或翹孢霉屬(Emericella)的菌株，例如構(gòu)巢裸孢殼(Emericellanidulans)PHYB(SWISSPROT000093，Biochim.Biophys.Acta1353217-223(1997))；或噬熱霉屬(Thermomyces)(腐質(zhì)霉屬(Humicola))的菌株，例如WO97/35017所述的細(xì)毛噬熱霉(Thermomyceslanuginosus)肌醇六磷酸酶。其他子囊菌肌醇六磷酸酶的實(shí)施例在公開EP684313(例如來(lái)自煙曲霉，土曲霉(Aspergillusterreus)，和噬熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)；JP11000164(來(lái)自青霉菌屬(Penicillium)菌株的肌醇六磷酸酶)；US6139902(來(lái)自曲霉菌株的肌醇六磷酸酶)，及WO98/13480(Monascusanka肌醇六磷酸酶)。擔(dān)子菌肌醇六磷酸酶的實(shí)施例是所述來(lái)自卷邊樁菇(Paxillusinvolutus)，絨毛栓菌(Trametespubescens)，Agrocybepediades和Peniophoralycii(見WO98/28409)的肌醇六磷酸酶。優(yōu)選的親代肌醇六磷酸酶來(lái)自隔孢伏革菌種，優(yōu)選來(lái)自Peniophoralycii的菌株，最優(yōu)選來(lái)自所述PeniophoralyciiCBS686.96的菌株。不管上述種已知的種名，可以理解其定義包括完好的(perfect)和不完好的狀態(tài)(imperfectstates)，及其它分類學(xué)等效物(equivalent)例如，無(wú)性型。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易辨認(rèn)適當(dāng)?shù)刃锏耐恍浴９娍扇菀椎卦跀?shù)個(gè)培養(yǎng)物保藏中心，如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ)，真菌菌種保藏中心(CBS)，和農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)保藏中心，北方地區(qū)研究中心(NRRL)得到這些種的菌株。另外，可用合適探針從其他來(lái)源，包括從自然(例如土壤，堆肥，水等)分離的微生物鑒定并得到所述多肽。從自然生長(zhǎng)環(huán)境分離微生物的技術(shù)在本領(lǐng)域已知。然后可以通過類似篩選其它微生物的基因或cDNA文庫(kù)得到所述氨基酸序列。一旦已用所述探針檢測(cè)出編碼多肽的氨基酸序列，可用本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的技術(shù)(見例如，Sambrook等，1989，見上文)分離或克隆所述序列。在另一具體實(shí)施方案中所述親代肌醇六磷酸酶是合成的肌醇六磷酸酶。合成的肌醇六磷酸酶是人設(shè)計(jì)的，并希望不會(huì)在自然出現(xiàn)。EP897985和WO00/43503公開了這些合成的，真菌的肌醇六磷酸酶的實(shí)施例，通常叫做共有肌醇六磷酸酶。改組的(Shuffled)肌醇六磷酸酶是合成或遺傳工程化的親代肌醇六磷酸酶的其它實(shí)施例，可如本領(lǐng)域通常已知，例如通過定點(diǎn)誘變，通過PCR(用含有所需突變的PCR片段作為所述PCR反應(yīng)的引物之一)，或通過隨機(jī)誘變來(lái)制備它。合成的肌醇六磷酸酶的概念中還包括任何雜種的(hybrid)或嵌合的肌醇六磷酸酶，即肌醇六磷酸酶含有來(lái)自至少兩個(gè)肌醇六磷酸酶的部分氨基酸序列的組合。所述親代肌醇六磷酸酶可含有所述特定氨基酸序列，或它可能是其等位變體；或其具有肌醇六磷酸酶活性的片段。在一實(shí)施方案中，所述親代肌醇六磷酸酶含有所述特定氨基酸序列或其等位變體；或其具有肌醇六磷酸酶活性的片段。在另一實(shí)施方案中，所述親代肌醇六磷酸酶由特定氨基酸序列或其等位變體；或其具有肌醇六磷酸酶活性的片段組成。特定氨基酸序列的片段是從此氨基酸序列氨基和/或羧基末端缺失一或多個(gè)氨基酸的多肽。在一實(shí)施方案中，所述片段包含至少150，或至少200，或至少250，或至少260，或至少280，或至少300，或至少320，或至少340，或至少360，或至少380，或至少390，或至少400，或至少410，或至少420，或至少430，或至少440，或至少450個(gè)氨基酸殘基。等位變體指占據(jù)相同染色體位點(diǎn)的基因的兩或多個(gè)可選形式中的任一。等位變化通過突變自然出現(xiàn)，并且可導(dǎo)致種群內(nèi)多態(tài)性(polymorphism)?；蛲蛔兛赡苁浅聊?所編碼多肽無(wú)改變)或者可編碼氨基酸序列改變的多肽。多肽的等位變體是基因等位變體所編碼的多肽。所述親代肌醇六磷酸酶也可是上述任一氨基酸序列中的成熟部分。成熟部分指成熟的氨基酸序列并且指在已經(jīng)剪切可能的信號(hào)肽部分后保留的氨基酸序列的那部分。在另一實(shí)施方案中，所述親代肌醇六磷酸酶可以是上述肌醇六磷酸酶的變體，其包含一或多個(gè)氨基酸的取代，缺失，和/或插入。所述肌醇六磷酸酶變體的氨基酸序列可能不同于由于插入或缺失了一或多個(gè)氨基酸殘基和/或用不同氨基酸殘基取代一或多個(gè)氨基酸殘基而特定的氨基酸序列。氨基酸變化優(yōu)選性質(zhì)次要(minornature)的變化，即不顯著影響所述蛋白質(zhì)折疊和/或活性的保守氨基酸取代；小型(small)缺失，通常1到約30氨基酸；小型氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸殘基；至多約20-25殘基的小接頭(linker)肽；或通過改變凈電荷或其他功能，如多組氨酸t(yī)ract，抗原表位或結(jié)合區(qū)來(lái)利于純化的小型延伸。保守取代的實(shí)施例在堿性氨基酸(精氨酸，賴氨酸和組氨酸)，酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)，極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水氨基酸(亮氨酸，異亮氨酸和纈氨酸)，芳香族氨基酸(苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸)，及小(small)氨基酸(甘氨酸，丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸和甲硫氨酸)范圍內(nèi)。通常不改變比活性的氨基酸取代在本領(lǐng)域已知并在例如H.Neurath和R.L.Hill，1979，In，TheProteins，AcademicPress，NewYork中描述。最常出現(xiàn)的交換是Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，AlaNal，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/lle，LeuNal，Ala/Glu，和Asp/Gly以及這些的逆向方式。微生物分類學(xué)(Taxonomy)涉及分類學(xué)的問題可以通過參考分類數(shù)據(jù)庫(kù)，如位于下述互聯(lián)網(wǎng)址http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/taxonomyhome.html/的NCBI分類學(xué)瀏覽器，和/或通過參考分類學(xué)手冊(cè)。本發(fā)明涉及的真菌分類的手冊(cè)優(yōu)選為DictionaryoftheFungi，9thedition，Kirk，P.M.，P.F.Cannon，J.C.David&J.A.Stalpers編輯，CAB出版，2001。合成的肌醇六磷酸酶，如共有的肌醇六磷酸酶，改組的肌醇六磷酸酶，或雜種的肌醇六磷酸酶可含有來(lái)自至少兩種子囊菌肌醇六磷酸酶，至少兩種擔(dān)子菌肌醇六磷酸酶或來(lái)自至少一種子囊菌和至少一種擔(dān)子菌肌醇六磷酸酶的部分氨基酸序列的組合。部分氨基酸序列所來(lái)自的這些子囊菌和擔(dān)子菌肌醇六磷酸酶可為例如，任一本文所指的那些特異性肌醇六磷酸酶。本文中，來(lái)自至少一個(gè)真菌的合成的肌醇六磷酸酶是真菌的肌醇六磷酸酶。另外，僅來(lái)自子囊菌肌醇六磷酸酶的合成的肌醇六磷酸酶是子囊菌肌醇六磷酸酶；并且僅來(lái)自擔(dān)子菌肌醇六磷酸酶的合成的肌醇六磷酸酶是擔(dān)子菌肌醇六磷酸酶。任何來(lái)自至少一種子囊菌肌醇六磷酸酶以及至少一種擔(dān)子菌肌醇六磷酸酶的合成肌醇六磷酸酶可被命名為混合子囊菌/擔(dān)子菌肌醇六磷酸酶。命名隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶指來(lái)自種隔孢伏革菌屬的野生型肌醇六磷酸酶，包括其等位變體，片段或變體，或基于至少一種，優(yōu)選至少兩種隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶，更優(yōu)選只基于隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶制備的合成的肌醇六磷酸酶。隔孢伏革菌種的實(shí)施例為Peniophoraaurantiaca，灰隔孢伏革菌(P.cinerea)，P.decorticans，P.duplex，P.ericsonii，P.incamate，P.lycii，P.meridionalis，裸隔孢伏革菌(P.nuda)，P.piceae，P.pini，P.pithya，P.polygonia，P.proxima，P.pseudo-pini，P.rufa，變色隔孢伏革菌(P.versicolor)，并且被簡(jiǎn)單歸類隔孢伏革菌。優(yōu)選的種是Peniophoralycii。優(yōu)選的菌株是PeniophoralyciiCBS686.96。氨基酸同源性本發(fā)明涉及具有的氨基酸序列與SEQIDNO2(下文“同源肌醇六磷酸酶”)有某種程度同一性的肌醇六磷酸酶。本發(fā)明中，通過程序“align”，它是Needleman-Wunsch序列對(duì)比(即總體序列對(duì)比)來(lái)測(cè)定兩氨基酸序列之間的同一性程度，以及兩核苷酸序列之間的同一性程度。該程序可用于多肽，以及核苷酸序列的序列對(duì)比。所述缺省記分矩陣(matrix)BLOSUM50用于多肽序列對(duì)比，并且所述缺省同一性矩陣用于核苷酸序列對(duì)比。缺口的第一個(gè)殘基的罰分對(duì)多肽是-12并且對(duì)核苷酸是-16。缺口的更多殘基的罰分對(duì)多肽是-2，對(duì)核苷酸是-4?！癆lign”是FASTA軟件包版本v20u6(見W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)，“ImprovedToolsforBiologicalSequenceAnalysis”，PNAS852444-2448，及W.R.Pearson(1990)“RapidandSensitiveSequenceComparisonwithFASTPandFASTA，”MethodsinEnzymology18363-98)的一部分。FASTA蛋白質(zhì)序列對(duì)比使用不限制缺口尺寸的Smith-Waterman算法(見“Smith-Watermanalgorithm”，T.F.Smith和M.S.Waterman(1981)J.Mol.Biol.147195-197)。在具體實(shí)施方案中，所述親代肌醇六磷酸酶的氨基酸序列與SEQIDNO2的同一性程度為至少約55％，或至少約60％，或至少約65％，或至少約70％，或至少約75％，或至少約80％，或至少約85％，或至少約90％，或至少約91％，或至少約92％，或至少約93％，或至少約94％，或至少約95％，或至少約96％，或至少約97％，或至少約98％，或至少約99％。在另一具體實(shí)施方案中，這些同源的親代肌醇六磷酸酶具有的氨基酸序列與所述特定的氨基酸序列差三十，二十五，二十二，二十一，二十，十九，十八，十七，十六，十五，十四，十三，十二，十一，十，九，八，七，六，五，四，三，二，或僅一個(gè)氨基酸。所得變體肌醇六磷酸酶也與SEQIDNO2同源。在具體實(shí)施方案中，所述變體肌醇六磷酸酶含有或具有的氨基酸序列與SEQIDNO2的同一性程度為至少約55％，或至少約60％，或至少約65％，或至少約70％，或至少約71％，或至少約72％，或至少約73％，或至少約74％，或至少約75％，或至少約76％，或至少約77％，或至少約78％，或至少約79％，或至少約80％，或至少約82％，或至少約85％，或至少約87％，或至少約90％，或至少約92％，或至少約95％，或至少約97％。核酸雜交可選的，同源的親代肌醇六磷酸酶，以及變體肌醇六磷酸酶，可被定義為所述核酸序列所編碼，該核酸序列在很低嚴(yán)格條件，優(yōu)選低嚴(yán)格條件，更優(yōu)選中度嚴(yán)格條件，更優(yōu)選中高度嚴(yán)格條件，甚至更優(yōu)選高度嚴(yán)格條件，而且最優(yōu)選很高嚴(yán)格條件下與SEQIDNO1的核苷酸49-1320，或其亞序列(subsequence)或互補(bǔ)鏈雜交(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatus，1989，MolecularCloning，ALaboratoryManual，2dedition，ColdSpringHarbor，NewYork)。亞序列可為至少100個(gè)核苷酸，或至少200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1100，1200，或至少1300個(gè)核苷酸。并且，所述亞序列可編碼具有相關(guān)酶活性的多肽片段。對(duì)于長(zhǎng)度至少100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針，從很低到很高的嚴(yán)格條件被限定為在42℃在5×SSPE，0.3％SDS，200pg/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA，和25％甲酰胺(對(duì)于很低和低嚴(yán)格度)，35％甲酰胺(對(duì)于中度到中高度嚴(yán)格度)，或50％甲酰胺(對(duì)高度和很高嚴(yán)格度)中預(yù)雜交并雜交，之后是標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡法步驟。對(duì)于長(zhǎng)度至少100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針，最后洗滌所述載體物質(zhì)3次，每次用2×SSC，0.2％SDS優(yōu)選在45℃(很低嚴(yán)格度)，更優(yōu)選至少在50℃(低嚴(yán)格度)，更優(yōu)選至少在55℃(中嚴(yán)格度)，更優(yōu)選至少在60℃(中高嚴(yán)格度)，甚至更優(yōu)選至少在65℃(高嚴(yán)格度)，并最優(yōu)選至少在70℃(很高嚴(yán)格度)洗滌15分鐘。對(duì)于長(zhǎng)度約15個(gè)核苷酸到約70個(gè)核苷酸的短探針，嚴(yán)格條件被限定為在5℃到10℃在低于根據(jù)Bolton和McCarthy計(jì)算(1962，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA481390)所計(jì)算的Tm在0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6，6mMEDTA，0.5％NP-40，1×Denhardt′s溶液，1mM焦磷酸鈉，1mM磷酸二氫鈉，0.1mMATP，以及每毫升0.2mg酵母RNA中預(yù)雜交、雜交、并在雜交后洗滌，之后是標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡法步驟。對(duì)于長(zhǎng)度約15個(gè)核苷酸到約70個(gè)核苷酸的短探針，將所述載體物質(zhì)用6×SCC加0.1％SDS洗滌15分鐘一次，并用6×SSC在5℃到10℃在低于所計(jì)算的Tm下洗滌15分鐘各2次。位置編號(hào)本文用來(lái)限定氨基酸位置的命名基本如WO99/49022所述，即參照來(lái)自PeniophoralyciiCBS686.96的肌醇六磷酸酶氨基酸序列，除了本文的編號(hào)從WO99/49022的圖1所示的P_lycii序列S17開始。因此，本文所用的位置數(shù)與WO99/49022的位置數(shù)相差16(見WO99/49022圖1的14頁(yè)26行)。由此可見，例如本文的S1等同于(equivalentto)WO99/49022的S17，并且本文的F8等同于WO99/49022的F24。序列SEQIDNO2含有WO99/49022的圖6所示序列的氨基酸-14-409，對(duì)應(yīng)其圖1所示P_lycii序列的氨基酸16-439。因此本文以從S1開始到E423終止的SEQIDNO2作為編號(hào)位置的基礎(chǔ)。親代肌醇六磷酸酶，以及變體肌醇六磷酸酶，可含有與SEQIDNO2相比的延伸(extension)，即在其N末端和/或C末端。如果存在延伸，此延伸的氨基酸將按本領(lǐng)域通常地來(lái)編號(hào)，即對(duì)于C末端延伸424，425，426以此類推，而且對(duì)于N末端延伸-1，-2，-3以此類推。改變，如取代，缺失，插入本文中，下述為多種途徑的實(shí)施例，其中至少理論上，即在文獻(xiàn)(paper)中的肌醇六磷酸酶變體來(lái)自親代氨基酸序列氨基酸可被另一氨基酸取代；可缺失氨基酸；可插入氨基酸；以及任何數(shù)量的這些改變的任何組合。為本發(fā)明目的，術(shù)語(yǔ)取代指包括任何數(shù)量任何種類的此種改變。這是個(gè)合理限定，因?yàn)槔缛笔Э蔀榘被?，AA，在已知位置nn為空白()取代。可命名此取代為AAnn()。類推，僅在氨基酸，AA下游的已知位置nn插入一個(gè)氨基酸，BB，可被命名為()nnaBB.并且如果將兩個(gè)氨基酸，BB和CC在位置nn插入氨基酸AA的下游，可命名該取代(兩個(gè)取代的結(jié)合)為()nnaBB+()nnbCC，因此在親代序列氨基酸nn和nn+1中產(chǎn)生的所述缺口被指定為(assigned)前述位置數(shù)字，這里為nn的較低級(jí)別(lowercase)或腳注字母a，b，c等。取代基之間的逗號(hào)(，)，如例如在A327S，F(xiàn)，I，L的取代中指“或”，即A327被S，或F，或I，或L取代。取代間的加號(hào)(+)，如例如在29S+125D+324A中的取代指“和”，即這三個(gè)單個(gè)取代組合為一個(gè)相同的肌醇六磷酸酶變體。此限定氨基酸改變的命名也基本如WO99/49022(見其16頁(yè))所述。或者，在不同限定術(shù)語(yǔ)取代時(shí)，本發(fā)明涉及親代肌醇六磷酸酶的變體，包含在選自本文所指的多組區(qū)域的至少一個(gè)位置的改變，其中所述改變?cè)谡紦?jù)所述位置的氨基酸下游獨(dú)立插入至少一個(gè)氨基酸；缺失占據(jù)所述位置的氨基酸；和/或用不同氨基酸取代占據(jù)所述位置的氨基酸；其中所述變體具有肌醇六磷酸酶活性，并且每個(gè)位置對(duì)應(yīng)于具有SEQIDNO2氨基酸序列的酶的氨基酸序列的一個(gè)位置，并且所述變體與SEQIDNO2具有至少75％的百分比同一性；并附帶如本文(d)所限。本文中，術(shù)語(yǔ)“取代”指至少一個(gè)取代。至少一個(gè)指一或多個(gè)，例如一個(gè)，或兩個(gè)，或三個(gè)，或四個(gè)，或五個(gè)，或六個(gè)，或七個(gè)，或八個(gè)，或九個(gè)，或十個(gè)，或十二個(gè)，或十四個(gè)，或十五個(gè)，或十六個(gè)，或十八個(gè)，或二十個(gè)，或二十二個(gè)，或二十四個(gè)，或二十五個(gè)，或二十八個(gè)，或三十個(gè)等等，來(lái)包括大體上任何數(shù)量的取代。然而，本發(fā)明變體用上述程序測(cè)定的所述百分比，仍必須例如，與SEQIDNO2至少75％相同。可將所述取代應(yīng)用到在權(quán)利要求1所提到的任何區(qū)域所包括的任何位置，并且也包括包含任何數(shù)量和種類此類取代的組合的變體。本文所用的取代也包括缺失以及延伸，或插入，其可加到對(duì)應(yīng)于SEQIDNO2的所述序列長(zhǎng)度上。在具體實(shí)施方案中，取代的數(shù)目最多為200，或175，或150，或125，或120，或110，或106，或105，或100，或90，或80，或70，或60，或50，或40，或30，或25。而且，術(shù)語(yǔ)“取代”包括取代為其他十九個(gè)天然氨基酸中的任一個(gè)，或其他氨基酸，如非天然氨基酸。例如在位置20氨基酸Q的取代包括下述取代中的每一個(gè)20A，20C，20D，20E，20F，20G，20H，201，20K，20L，20M，20N，20P，20R，20S，20T，20V，20W，或20Y。這是借助(bytheway)命名20X的等效物(equivalent)，其中X指任何氨基酸。這些取代也能被命名為Q20A，Q20C，Q20X等。以此類推本文提到的每個(gè)位置，來(lái)具體包括任一本文的此類取代。鑒定相應(yīng)的位置編號(hào)對(duì)于PeniophoralyciiCBS686.96的親代肌醇六磷酸酶，所述位置編號(hào)涉及SEQIDNO2的編號(hào)。對(duì)于在另一肌醇六磷酸酶的已知位置，無(wú)論它是親代還是變體肌醇六磷酸酶，總能在SEQIDNO2中發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)位置?；蛘?，在可選中，總能發(fā)現(xiàn)一個(gè)位置對(duì)應(yīng)于包含(或具有)所述SEQIDNO2氨基酸序列的肌醇六磷酸酶的氨基酸序列上的一個(gè)位置。命名PeniophoralyciiCBS686.96的肌醇六磷酸酶以外的親代肌醇六磷酸酶的氨基酸序列，或依次(inturn)肌醇六磷酸酶變體的氨基酸序列為SEQ-X。發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)SEQIDNO2的位置N的位置如下親代或變體肌醇六磷酸酶氨基酸序列SEQ-X與上面氨基酸同源性部分所述的SEQIDNO2序列比對(duì)。用下述原理，可以清楚無(wú)誤地從所述序列對(duì)比得到序列SEQ-X上對(duì)應(yīng)于SEQIDNO2的位置N的位置。僅作為例子，參照WO99/49022的圖1，假設(shè)處于簡(jiǎn)單性(simplicity)，序列A_pediades，A_fumigatus或T_lanuginosus是例如已與我們假設(shè)對(duì)應(yīng)于本文所述的SEQIDNO2的P_lycii肌醇六磷酸酶序列比對(duì)的肌醇六磷酸酶變體(為本發(fā)明目的它們本應(yīng)該與SEQIDNO2序列比對(duì))問題1A_pediades的何位置對(duì)應(yīng)于P_lycii的S17(為本發(fā)明目的，該位置被命名為S1)？該答案是A15。問題2在命名為A_fumigatus的肌醇六磷酸酶的何位置對(duì)應(yīng)于P_lycii的55b()(為本發(fā)明目的，該位置被命名為39b())？該答案是S63。問題3A_pediades的何位置對(duì)應(yīng)于P_lycii的L31(為本發(fā)明目的，該位置被命名為L(zhǎng)15)？該答案是()30d。問題4P_lycii的何取代對(duì)應(yīng)于具有取代G3L的假設(shè)(imaginative)T_lanuginosa肌醇六磷酸酶變體？該答案是()-6L(為本發(fā)明目的，該取代被命名為()-22L)。SEQ-X可以是所需(inquestion)肌醇六磷酸酶的成熟部分，或它也可包括信號(hào)肽部分，或它可以是所述具有肌醇六磷酸酶活性的成熟肌醇六磷酸酶的片段，例如SEQIDNO2相同長(zhǎng)度的片段，或如本文所述與SEQIDNO2進(jìn)行序列比對(duì)時(shí)從S1延伸到E423的片段。區(qū)域和位置本文中，術(shù)語(yǔ)區(qū)域指親代肌醇六磷酸酶氨基酸序列的至少一個(gè)位置，術(shù)語(yǔ)位置指此氨基酸序列的氨基酸殘基。一實(shí)施方案中，區(qū)域指親代肌醇六磷酸酶氨基酸序列的一或多個(gè)連續(xù)位置，例如所述序列的一個(gè)，兩個(gè)，三個(gè)，四個(gè)，五個(gè)，六個(gè)，七個(gè)，八個(gè)等等到任何數(shù)目的連續(xù)位置。因此，區(qū)域可僅由一個(gè)位置組成，或它可由任何數(shù)目的連續(xù)位置，如例如，位置37，38和39；或位置37，38，39，40和41；或位置37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47和48組成。為本發(fā)明目的，后三個(gè)區(qū)域分別被命名為37-39，37-41和37-48。這些區(qū)域或范圍的邊界都被包括在所述區(qū)域中。SEQIDNO2是優(yōu)選親代肌醇六磷酸酶氨基酸序列的實(shí)施例。區(qū)域具體包括每個(gè)和每個(gè)它所包含(embrace)的位置。例如區(qū)域37-48具體包括所述位置37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47和48中的每個(gè)。以此類推應(yīng)用到本文提到的其它區(qū)域。熱穩(wěn)定性為本發(fā)明目的，在某種多肽上下文所用的術(shù)語(yǔ)熱穩(wěn)定的涉及該多肽的熔解溫度Tm，其通過在pH5.5用差示掃描量熱法(DSC)來(lái)測(cè)定對(duì)于熱穩(wěn)定多肽，所述Tm為至少61℃。在具體實(shí)施方案中，所述Tm為至少62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，77.5，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100℃。在可選方案中，所述術(shù)語(yǔ)熱穩(wěn)定涉及用DSC在pH7.0測(cè)定的至少49℃，優(yōu)選至少50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，77.5，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，或90℃的熔解溫度。在另一可選方案中，所述術(shù)語(yǔ)熱穩(wěn)定涉及用DSC在pH3.0測(cè)定的至少51℃，優(yōu)選至少52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，77.5，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，或90℃的熔解溫度。在另一可選方案中，所述術(shù)語(yǔ)熱穩(wěn)定涉及用DSC在pH2.5測(cè)定的至少37℃，優(yōu)選至少38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，77.5，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，或90℃的熔解溫度。為測(cè)定Tm，可使用通過SDS-PAGE測(cè)定純度為至少90％(或91，92，93，94，95，96，97或98％)的多肽樣本。另外，根據(jù)在吸光度280nm所測(cè)并且基于所需酶的氨基酸序列來(lái)計(jì)算的消光系數(shù)，所述酶樣本濃度可為0.5-2.5mg/ml蛋白質(zhì)(或0.6-2.4，或0.7-2.2，或0.8-2.0mg/ml蛋白質(zhì))。在所需pH(例如pH5.5，7.0，3.0或2.5)并以恒定加熱速度，例如1，1.5，2，3，4，5，6，7，8，9或10℃/min進(jìn)行DSC。適宜緩沖液的實(shí)施例如實(shí)施例部分所述。在使用如本文實(shí)施例2所述的試驗(yàn)時(shí)優(yōu)選加熱速度的實(shí)施例是1.0，1.5或2.0℃/min。對(duì)于其他標(biāo)本量較小的其他類型的儀器來(lái)說，可用例如3，4，5，6，7，8，9或甚至10℃/min的加熱速度來(lái)得到對(duì)Tm的可靠估計(jì)。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明所述肌醇六磷酸酶變體比所述親代肌醇六磷酸酶更加熱穩(wěn)定。此目的優(yōu)選的親代肌醇六磷酸酶是PeniophoralyciiCBS686.96肌醇六磷酸酶。比活性術(shù)語(yǔ)比活性高，增高或提高指用同種方法測(cè)定，比活性是親代肌醇六磷酸酶比活性的至少105％。在具體實(shí)施方案中，相對(duì)比活性為用同種方法測(cè)定為所述親代肌醇六磷酸酶比活性的至少110，115，120，125，130，140，145，150，160，170，180，190，200，220，240，260，280，300，350或甚至400％。或者可選，術(shù)語(yǔ)高比活性指比活性為至少200FYT/mg酶蛋白質(zhì)(EP)。在具體實(shí)施方案中，所述比活性為至少300，400，500，600，700，800，900，1000，1100，1200，1300，1400，1500，1600，1700，1800，1900，2000，2100，2200，2300，2400，2500，2600，2700，2800，2900或3000FYT/mgEP。用高純度樣本測(cè)定比活性(SDS聚丙烯酰胺凝膠應(yīng)該顯示存在只有一種成分)。所述酶蛋白質(zhì)濃度應(yīng)通過氨基酸分析測(cè)定，并且所述肌醇六磷酸酶活性單位為FYT。比活性是所需特定肌醇六磷酸酶變體的性狀，它通過每mg酶肌醇六磷酸變體酶蛋白質(zhì)以單位FYT測(cè)定的肌醇六磷酸酶活性來(lái)計(jì)算。更多細(xì)節(jié)見實(shí)施例3。本發(fā)明所述肌醇六磷酸酶變體為熱穩(wěn)定的和/或比活性高。在具體實(shí)施方案中它是熱穩(wěn)定的。在另一具體實(shí)施方案中它的比活性高。在第三種具體實(shí)施方案中它是熱穩(wěn)定的，并且比活性高。在其它具體實(shí)施方案中(a)它比親代肌醇六磷酸酶熱穩(wěn)定；(b)比親代肌醇六磷酸酶比活性高；或(c)比親代肌醇六磷酸酶熱穩(wěn)定并且比活性高。低變應(yīng)原(Low-allergenic)變體具體實(shí)施方案中，本發(fā)明所述肌醇六磷酸酶變體(也)是低變應(yīng)原變體，它被設(shè)計(jì)用來(lái)引發(fā)(invoke)接觸動(dòng)物，包括人后下降的免疫應(yīng)答?？衫斫庑g(shù)語(yǔ)免疫應(yīng)答為動(dòng)物免疫系統(tǒng)接觸該肌醇六磷酸酶變體后的任何反應(yīng)。一種免疫應(yīng)答是在接觸動(dòng)物內(nèi)的造成IgE水平升高的變應(yīng)原反應(yīng)。低變應(yīng)原變體可用本領(lǐng)域已知技術(shù)制備。例如所述肌醇六磷酸酶變體可與屏蔽(shielding)參與免疫應(yīng)答的所述肌醇六磷酸酶變體的部分或表位的聚合物部分(moieties)偶聯(lián)。與聚合物偶聯(lián)可能涉及聚合物與所述肌醇六磷酸酶變體的體外化學(xué)偶連，例如如WO96/17929，WO98/30682，WO98/35026，和/或WO99/00489所述。偶連還可或可涉及聚合物與所述肌醇六磷酸酶變體的體內(nèi)化學(xué)偶連。實(shí)現(xiàn)該偶連可通過編碼所述肌醇六磷酸酶變體的核苷酸序列的遺傳工程化，在所述肌醇六磷酸酶變體插入編碼附加糖基化位點(diǎn)的共有序列，并在能夠糖基化所述肌醇六磷酸酶變體的宿主表達(dá)此肌醇六磷酸酶變體，見例如WO00/26354。另一種提供低變應(yīng)原變體的方法是遺傳工程化編碼所述肌醇六磷酸酶變體的核苷酸序列從而造成所述肌醇六磷酸酶變體自身-寡聚體化(self-oligomerize)，結(jié)果為肌醇六磷酸酶變體單體可屏蔽其它肌醇六磷酸酶變體單體的表位并因而降低所述寡聚體的抗原性。該產(chǎn)物及它們的制備物例如見WO96/16177所述。參與免疫應(yīng)答的表位可用多種方法鑒定如WO00/26230和WO01/83559所述的噬菌體展示方法，或EP561907所述的隨機(jī)途徑。一旦鑒定了表位，就可改變其氨基酸序列來(lái)生產(chǎn)免疫性狀改變的所述肌醇六磷酸酶變體，它所用的是已知基因操縱技術(shù)如定點(diǎn)誘變(見例如WO00/26230，WO00/26354和/或WO00/22103)和/或可與所述表位足夠臨近來(lái)進(jìn)行聚合物偶連從而使聚合物屏蔽該表位。核酸序列和構(gòu)建體本發(fā)明也涉及包含編碼本發(fā)明肌醇六磷酸酶變體的核酸序列的核酸序列。術(shù)語(yǔ)“分離的核酸序列”指基本無(wú)其他核酸序列的核酸序列，例如，通過瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定純度至少約20％，優(yōu)選純度至少約40％，更優(yōu)選純度至少約60％，甚至更優(yōu)選純度至少約80％，并且最優(yōu)選純度至少約90％。例如可通過遺傳工程中應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)克隆方法獲得分離的核酸序列，將所述核酸序列從其天然位置重新定位到它將被復(fù)制的不同位置。所述克隆方法可涉及剪切分離包含編碼所述多肽的核酸序列的所需核酸片段，將所述片段插入載體分子，并將所述重組載體引入復(fù)制所述核酸序列多拷貝或克隆的宿主細(xì)胞。所述核酸序列可來(lái)自基因組，cDNA，RNA，半合成的，合成的，或其任何組合物。制備本發(fā)明核酸序列可通過向親代肌醇六磷酸酶編碼序列或其亞序列引入至少一個(gè)突變，其中所述突變核酸序列編碼肌醇六磷酸酶變體。向所述核酸序列引入突變來(lái)將一個(gè)核苷酸變換為另一個(gè)核苷酸，這可用任一本領(lǐng)域已知方法通過定點(diǎn)誘變，例如通過定點(diǎn)誘變，通過隨機(jī)誘變，或通過摻雜(doped)，摻入(spiked)，或定域(localized)隨機(jī)誘變來(lái)完成。隨機(jī)誘變適合作為定域或區(qū)域特異的隨機(jī)誘變來(lái)操作，位于問題所示的翻譯成氨基酸序列的所述基因的至少三個(gè)部分，或在整個(gè)基因內(nèi)。當(dāng)用寡核苷酸進(jìn)行所述誘變時(shí)，在要改變位置上合成所述寡核苷酸時(shí)可將三個(gè)非-親代核苷酸摻雜或摻入所述寡核苷酸?？蛇M(jìn)行摻雜或摻入以避免不必需核苷酸的密碼子?？蓪⑺鰮诫s或摻入的寡核苷酸引入如編碼所述肌醇六磷酸酶的DNA，通過應(yīng)用認(rèn)為合適的例如，PCR，LCR或任何DNA聚合酶和連接酶的任何技術(shù)。優(yōu)選，用“恒定(constant)隨機(jī)摻雜”進(jìn)行所述摻雜，其中每個(gè)位置的野生型和突變的百分比都被預(yù)先限定。并且，該摻雜可針對(duì)優(yōu)先引入某種核苷酸，并進(jìn)而優(yōu)先引入一或多個(gè)特定氨基酸殘基?？蛇M(jìn)行摻雜，例如，從而在在每個(gè)位置引入90％野生型和10％突變。考慮摻雜方案時(shí)另外的考慮是基于遺傳和蛋白質(zhì)-結(jié)構(gòu)限制因素。所述隨機(jī)誘變可有利位于所需親代肌醇六磷酸酶的一部分。當(dāng)所述酶的某些區(qū)域已經(jīng)被鑒定為對(duì)所述酶的已知性狀特別重要時(shí)這，例如可以是有利的。提供本發(fā)明變體的可選方法包括例如，如WO95/22625或WO96/00343所述的基因改組，和如EP897985所述的連續(xù)衍生(derivation)方法。核酸構(gòu)建體核酸構(gòu)建體含有本發(fā)明核酸序列，其可操縱連接到一或多個(gè)控制序列，所述控制序列在與所述控制序列相容的情況下在合適宿主細(xì)胞中指導(dǎo)(direct)所述編碼序列的表達(dá)。表達(dá)將被理解為包括任何涉及生產(chǎn)所述多肽的方法，包括但不限于轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后修飾，翻譯，翻譯后修飾和分泌。表達(dá)載體編碼本發(fā)明肌醇六磷酸酶變體的核酸序列可用的表達(dá)載體通常包括編碼啟動(dòng)子，操縱子，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，翻譯起始信號(hào)和可選抑制子基因或多種激活子(activator)基因的控制序列。所述攜帶編碼本發(fā)明葡萄糖淀粉酶(glucoamylase)變體的DNA序列的重組表達(dá)載體可以為任何載體，其可方便地用重組DNA方法處理，并且選擇載體通常依賴于它所引入的宿主細(xì)胞。此載體可以在引入宿主細(xì)胞后整合到所述宿主細(xì)胞基因組并與它所整合到的染色體一起復(fù)制。所述肌醇六磷酸酶變體也可與至少一種動(dòng)物飼料所需的其它酶共表達(dá)，如木聚糖酶，內(nèi)切葡聚糖酶(endoglucanase)，內(nèi)切-1，3(4)-β-葡聚糖酶(endo-1，3(4)-beta-glucanase)，和/或蛋白酶。該酶可從不同載體，從一個(gè)載體，或混合使用用兩種技術(shù)共表達(dá)。當(dāng)用不同載體時(shí)，該載體可有不同選擇性標(biāo)記和不同的復(fù)制起點(diǎn)。當(dāng)只使用一種載體時(shí)，該基因可從一或多個(gè)啟動(dòng)子表達(dá)。如果在單啟動(dòng)子(二或多順反子)調(diào)節(jié)下克隆，所述基因克隆的順序會(huì)影響所述蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。所述肌醇六磷酸酶變體也可作為融合蛋白質(zhì)表達(dá)，即編碼所述肌醇六磷酸酶變體的基因已經(jīng)融合到編碼其他蛋白質(zhì)的基因框架。此蛋白質(zhì)可以是另一種酶或來(lái)自其它酶的功能域。宿主細(xì)胞本發(fā)明也涉及重組宿主細(xì)胞，包含在多肽重組生產(chǎn)中有利使用的本發(fā)明核酸序列。包含本發(fā)明核酸序列的載體是引入宿主細(xì)胞所以保持所述載體作為染色體整合體或自身復(fù)制染色體外載體。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括任何由于復(fù)制過程中出現(xiàn)突變而不等同于親代細(xì)胞的親代細(xì)胞后代。選擇宿主細(xì)胞很大程度上依賴于編碼所述多肽的基因及其來(lái)源。所述宿主細(xì)胞可以是單細(xì)胞微生物，例如，原核細(xì)胞，或非單細(xì)胞微生物，例如，真核細(xì)胞如動(dòng)物，哺乳動(dòng)物，昆蟲，植物，或真菌細(xì)胞。優(yōu)選動(dòng)物細(xì)胞是非人動(dòng)物細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞，或酵母細(xì)胞，如念珠菌屬(Candida)，漢森氏酵母屬(Hansenula)，克魯維酵母屬(Kluyveromyces)，畢赤酵母屬(Pichia)，酵母菌屬(Saccharomyces)，裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)，或Yarrowia細(xì)胞。所述真菌的宿主細(xì)胞可以是絲狀真菌細(xì)胞，如一種細(xì)胞，包括但不限于，支頂孢屬(Acremonium)，曲霉屬(Aspergillus)，鐮孢菌屬(Fusarium)，腐質(zhì)霉屬(Humicola)，毛霉屬(Mucor)，Myceliophthora，鏈孢霉屬(Neurospora)，青霉菌屬，Thielavia，Tolypocladium，或木霉屬(Trichoderma)?？捎玫膯渭?xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞如革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，包括但不限于芽孢桿菌(Bacillus)細(xì)胞，或鏈霉菌細(xì)胞，或乳酸細(xì)菌細(xì)胞；或革蘭氏陰性細(xì)菌如大腸桿菌和假單胞菌(Pseudomonassp)。乳酸細(xì)菌包括但不限于乳球菌屬(Lactococcus)，乳酸桿菌屬(Lactobacillus)，白聯(lián)珠菌屬(Leuconostoc)，鏈球菌屬，片球菌屬(Pediococcus)，和腸球菌屬(Enterococcus)的菌種。生產(chǎn)方法本發(fā)明也涉及生產(chǎn)本發(fā)明肌醇六磷酸酶的方法包含(a)在有助于生產(chǎn)所述肌醇六磷酸酶變體條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞；和(b)回收所述肌醇六磷酸酶變體。本發(fā)明生產(chǎn)方法中，在適合生產(chǎn)所述多肽的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中用本領(lǐng)域已知方法培養(yǎng)所述細(xì)胞。例如可在合適培養(yǎng)基中，在允許所述多肽表達(dá)和/或分離的條件下，在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐里用搖瓶培養(yǎng)法，小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括持續(xù)，一批batch，分批fed-batch，或固態(tài)(solidstate)發(fā)酵)培養(yǎng)所述細(xì)胞。所述培養(yǎng)在包含碳和氮源和無(wú)機(jī)鹽的合適營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，用本領(lǐng)域已知方法進(jìn)行。合適培養(yǎng)基可商購(gòu)或可根據(jù)公開組分(例如，見美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄)來(lái)制備。如果所述肌醇六磷酸酶分泌入所述營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，可從所述培養(yǎng)基直接回收它。如其為不分泌型，可從細(xì)胞裂解物回收它。所得肌醇六磷酸酶可用本領(lǐng)域已知方法回收。例如可用常用方法從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基回收它，包括但不限于，離心，過濾，提取，噴霧干燥(spray-drying)，蒸發(fā)，或沉淀。本發(fā)明肌醇六磷酸酶可用多種本領(lǐng)域已知方法純化包括但不限于，層析(chromatography)(例如，離子交換，親和，疏水，色譜聚焦(chromatofocusing)，和尺寸排阻(sizeexclusion))，電泳方法(例如，準(zhǔn)備的等電聚焦)，差別溶解度(differentialsolubility)(例如，硫酸銨沉淀)，SDS-PAGE，或提取法(見例如，ProteinPurification，J.-C.JansonandLarsRyden，editors，VCHPublishers，NewYork，1989)。植物本發(fā)明也涉及用編碼具有本發(fā)明肌醇六磷酸酶活性多肽的核酸序列轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，植物部分，或植物細(xì)胞從而表達(dá)和生產(chǎn)回收量(recoverablequantities)的所述多肽。所述多肽可從植物或植物部分回收?；蛘撸兴鲋亟M多肽的植物或植物部分可被如此應(yīng)用來(lái)提高食物或飼料的質(zhì)量，例如，提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，可口性(palatability)和流變學(xué)(rheological)性質(zhì)，或破壞抗?fàn)I養(yǎng)(antinutritive)因子。在具體實(shí)施方案中，所述多肽靶向種子胚乳貯藏泡(endospermstoragevacuoles)?？梢酝ㄟ^合成帶有合適信號(hào)肽的前體來(lái)得到它，見Horvath等PNAS，F(xiàn)eb.15，2000，vol.97，no.4，p.1914-1919。所述轉(zhuǎn)基因植物可為雙子葉植物或單子葉植物或其工程化變體。單子葉植物實(shí)施例為草，如草地(meadow)草(莓系牧草(bluegrass)，Poa)，牧草(foragegrass)如羊茅屬(festuca)，黑麥草屬(lolium)，溫帶草(temperategrass)，如禾草屬(Agrostis)，和谷物，例如，小麥，燕麥，黑麥(rye)，大麥，大米，蜀黍(sorghum)，和玉蜀黍(maize)(玉米)。雙子葉植物的實(shí)施例為煙草，豆類(legume)，如羽扇豆(lupin)，馬鈴薯，甜菜，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean)，和十字花植物(十字花(Brassicaceae)科)，如花椰菜，油菜籽，和緊密相關(guān)的模型生物體擬南芥(Arabidopsisthaliana)。例如美國(guó)專利5,689,054和美國(guó)專利6,111,168所述的低肌醇六磷酸鹽植物是工程化植物的實(shí)施例。植物部分的實(shí)施例是莖，愈傷組織(callus)，葉，根，果實(shí)，種子和塊莖。特定植物組織如葉綠素，質(zhì)外體，線粒體，液泡，過氧化物酶體和胞質(zhì)也被認(rèn)為是植物部分。并且，任何植物細(xì)胞，無(wú)論是否來(lái)自所述組織被認(rèn)為是植物部分。本發(fā)明范圍也包括此種植物，植物部分和植物細(xì)胞的后代。表達(dá)本發(fā)明多肽的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞可以根據(jù)本領(lǐng)域已知方法構(gòu)建。簡(jiǎn)言之，構(gòu)建所述植物或植物細(xì)胞是通過引入一或多個(gè)編碼本發(fā)明多肽的表達(dá)構(gòu)建體到植物宿主基因組并將所得被修飾植物或植物細(xì)胞增殖(propagate)到轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。為方便，所述表達(dá)構(gòu)建體為含有編碼本發(fā)明多肽的核酸序列的核酸構(gòu)建體，其可操縱地連接到在選定的植物或植物部分表達(dá)所述核酸序列所需的合適調(diào)控序列。并且，所述表達(dá)構(gòu)建體可含有用于鑒定所述表達(dá)構(gòu)建體已整合進(jìn)入的宿主細(xì)胞和將所述構(gòu)建體引入所需植物所必要的DNA序列(后者依賴于所用的DNA方法)的選擇性標(biāo)記。確定所選調(diào)控序列，如啟動(dòng)子和終止子序列及可選信號(hào)或運(yùn)輸(transit)序列是，例如基于需要表達(dá)所述多肽的時(shí)間地點(diǎn)和方式。例如，編碼本發(fā)明多肽的基因表達(dá)可以是構(gòu)成性的(constitutive)或誘發(fā)性的(inducible)，或可以是發(fā)展的(developmental)，階段(stage)或組織特異的，并且所述基因產(chǎn)物可以靶向特定組織或植物部分如種子或葉子。調(diào)控序列，例如見Tague等，1988，PlantPhysiology86506所述。對(duì)于構(gòu)成性表達(dá)，可用所述35S-CaMV啟動(dòng)子(Franck等，1980，Cell21285-294)。器官特異性啟動(dòng)子可為，例如來(lái)自儲(chǔ)藏(storage)累積(sink)組織的啟動(dòng)子如種子，馬鈴薯塊莖和果實(shí)(Edwards&Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24275-303)，或來(lái)自代謝組織如分生組織(Ito等，1994，PlantMol.Biol.24863-878)，種子特異性啟動(dòng)子如來(lái)自大米的谷蛋白，谷醇溶蛋白，球蛋白，或白蛋白啟動(dòng)子(Wu等，1998，PlantandCellPhysiology39885-889)，來(lái)自豆球蛋白B4的蠶豆(Viciafaba)啟動(dòng)子和來(lái)自蠶豆的未知種子蛋白質(zhì)基因(Conrad等，1998，JournalofPlantPhysiology152708-711)，來(lái)自種子油(oil)體蛋白質(zhì)(bodyprotein)的啟動(dòng)子(Chen等，1998，PlantandCellPhysiology39935-941)，來(lái)自Brassicanapus的累積蛋白質(zhì)napA啟動(dòng)子，或任何其它本領(lǐng)域已知的種子特異性啟動(dòng)子，例如，如WO91/14772所述。另外，所述啟動(dòng)子可以是葉子特異性啟動(dòng)子如來(lái)自大米或西紅柿的rbcs啟動(dòng)子(Kyozuka等，1993，PlantPhysiology102991-1000)，小球藻(chlorella)腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因啟動(dòng)子(MitraandHiggins，1994，PlantMolecularBiology2685-93)，或來(lái)自大米的aldP基因啟動(dòng)子(Kagaya等，1995，MolecularandGeneralGenetics248668-674)，或創(chuàng)傷誘發(fā)(woundinducible)啟動(dòng)子如馬鈴薯pin2啟動(dòng)子(Xu等，1993，PlantMolecularBiology22573-588)。也可用啟動(dòng)子增強(qiáng)子元件來(lái)使所述酶在植物中較高表達(dá)。例如，所述啟動(dòng)子增強(qiáng)子元件可為位于所述啟動(dòng)子和編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列之間的內(nèi)含子。例如，Xu等，1993，見上文公開了大米肌動(dòng)蛋白1基因的首個(gè)內(nèi)含子在增強(qiáng)表達(dá)中的用途。又及，所述密碼子用途可根據(jù)所需植物種最優(yōu)化來(lái)提高表達(dá)(參照上面Horvath等)。所述表達(dá)構(gòu)建體的可選標(biāo)記基因和任何其它部分可從本領(lǐng)域選擇。根據(jù)本領(lǐng)域常用技術(shù)將所述核酸構(gòu)建體合并入所述植物基因組，包括土壤桿菌-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，病毒-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，顯微注射，粒子轟擊，基因槍(biolistic)轉(zhuǎn)化和電穿孔(Gasser等，1990，Science2441293；Potrykus，1990，Biol/Technology8535；Shimamoto等，1989，Nature338274)?，F(xiàn)在根瘤土壤桿菌-介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的理想方法(綜述可見HooykasandSchilperoort，1992，PlantMolecularBiology1915-38)。然而它也可用于轉(zhuǎn)化單子葉植物，盡管其它轉(zhuǎn)化方法通常對(duì)于這些植物優(yōu)選。現(xiàn)在產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因單子葉植物理想方法是胚胎愈合組織或發(fā)育中胚胎的粒子轟擊(用轉(zhuǎn)化DNA包被的顯微金或鎢粒子)(Christou，1992，PlantJournal2275-281；Shimamoto，1994，CurrentOpinionBiotechnology5158-162；Vasil等，1992，Bio/Technology10667-674)。轉(zhuǎn)化單子葉植物的替代方法是基于如Omirulleh等，1993，PlantMolecularBiology21415-428所述的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。根據(jù)本領(lǐng)域熟知方法在轉(zhuǎn)化后，選擇已引入了表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體并再生(regenerate)入完整植物。本發(fā)明也涉及生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法，其包含(a)在有助于生產(chǎn)所述肌醇六磷酸酶變體的條件下，培養(yǎng)包含編碼本發(fā)明肌醇六磷酸酶變體的核酸序列的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞；和(b)回收所述肌醇六磷酸酶變體。作為表達(dá)宿主的動(dòng)物本發(fā)明也涉及轉(zhuǎn)基因，非人動(dòng)物，和其產(chǎn)物或元件，其實(shí)施例是體液如奶和血，器官，肉和動(dòng)物細(xì)胞。表達(dá)蛋白質(zhì)的技術(shù)，例如在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中在本領(lǐng)域已知，見例如手冊(cè)ProteinExpressionAPracticalApproach，HigginsandHames(eds)，OxfordUniversityPress(1999)及三本其他的系列手冊(cè)涉及基因轉(zhuǎn)錄，RNA加工作用，和翻譯后加工作用。通常制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，用編碼本發(fā)明肌醇六磷酸酶變體的核酸序列轉(zhuǎn)化選定動(dòng)物的選定細(xì)胞從而表達(dá)并產(chǎn)生該肌醇六磷酸酶變體?？蓮乃鰟?dòng)物，例如從雌性動(dòng)物的奶回收所述肌醇六磷酸酶變體，或可能其表達(dá)對(duì)動(dòng)物自身有利，例如輔助動(dòng)物的消化。動(dòng)物的實(shí)施例將在下述標(biāo)題為動(dòng)物飼料和動(dòng)物飼料添加劑的部分提及。為產(chǎn)生為從該動(dòng)物的奶回收所述肌醇六磷酸酶變體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，可將編碼所述肌醇六磷酸酶變體的基因插入所需動(dòng)物的受精卵，例如通過使用含有合適奶蛋白質(zhì)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體，及編碼所述肌醇六磷酸酶變體的基因。將所述轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體顯微注射到受精卵，并優(yōu)選永久整合到所述染色體。一旦所述卵開始生長(zhǎng)并分裂，將所述可能的(potential)胚胎植入替代(surrogate)母體，并鑒定出攜帶所述轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物。然后可用常用飼養(yǎng)方法(breeding)繁殖所得動(dòng)物?？蓮乃鰟?dòng)物的奶純化肌醇六磷酸酶變體，見例如Meade，H.M.等(1999)ExpressionofRecombinantProteinsinthemilkoftransgenicanimal，GeneExpressionsystemsUsingnaturefortheartofExpression.J.M.FernandezandJ.P.Hoeffler(eds.)，AcademicPress。或者，為產(chǎn)生在其體細(xì)胞和/或生殖細(xì)胞基因組中攜帶核酸序列的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，該核酸序列包括的異種轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體包括編碼所述肌醇六磷酸酶變體的轉(zhuǎn)基因，可將所述轉(zhuǎn)基因可操作連接到首個(gè)唾液腺的調(diào)控序列來(lái)特異性表達(dá)所述肌醇六磷酸酶變體，如WO2000064247所公開。動(dòng)物飼料和動(dòng)物飼料添加劑為本文目的，術(shù)語(yǔ)動(dòng)物包括所有動(dòng)物，包括人。在具體實(shí)施方案中，所述肌醇六磷酸酶變體和本發(fā)明組合物可用作非人動(dòng)物的飼料添加劑。動(dòng)物實(shí)施例為非反芻動(dòng)物和反芻動(dòng)物，如牛，羊和馬。在具體實(shí)施方案中，所述動(dòng)物為非反芻動(dòng)物。非反芻動(dòng)物包括單胃的(mono-gastric)動(dòng)物，例如豬(包括但不限于小豬，生長(zhǎng)(growing)豬和母豬)；家禽如火雞和雞(包括但不限于broilerchicks，下蛋的母雞)；小牛犢；和魚(包括但不限于三文魚)。術(shù)語(yǔ)飼料或飼料組合物指任何適合或?yàn)榱藙?dòng)物攝入的化合物，制備物，混合物，或組合物。將所述飼料喂給動(dòng)物可在進(jìn)食之前，之后或同時(shí)。優(yōu)選后者。本發(fā)明組合物，在為了添加到動(dòng)物飼料中時(shí)，可被稱為動(dòng)物飼料添加劑。此添加劑常含有所需的肌醇六磷酸酶變體，優(yōu)選以穩(wěn)定(stabilized)液體或干燥組合物的形式。所述添加劑可含有其他組分動(dòng)物飼料的組分或成分。所述動(dòng)物飼料的預(yù)混合物(pre-mix)為此動(dòng)物飼料添加劑的特定實(shí)施例。預(yù)混合物可含有所需的酶，及另外至少一種維生素和/或至少一種礦物質(zhì)。因此，在具體實(shí)施方案中，除了多肽組分，本發(fā)明組合物可含有或包含至少一種脂肪可溶性維生素，和/或至少一種水溶性維生素，和/或至少一種痕量礦物質(zhì)。也可包括至少一種常量(macro)礦物質(zhì)。脂肪可溶性維生素的實(shí)施例是維生素A，維生素D3，維生素E，和維生素K，例如維生素K3。水溶性維生素的實(shí)施例是維生素B12，生物素和膽堿，維生素B1，維生素B2，維生素B6，維生素PP(niacin)，葉酸和泛酸鹽(panthothenate)，例如D-泛酸鈣。痕量礦物質(zhì)的實(shí)施例是鎂，鋅，鐵，銅，碘和硒。常量礦物質(zhì)的實(shí)施例是鈣，磷和鈉。另外，可選的飼料添加成分是著色劑(colouringagents)，芳香化合物，穩(wěn)定劑，附加酶，和抗微生物肽。本發(fā)明組合物的附加酶成分包括至少一種具有木聚糖酶活性的多肽；和/或至少一種具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽；和/或至少一種具有內(nèi)切-1，3(4)-β-葡聚糖酶活性的多肽；和/或至少一種具有蛋白酶活性的多肽?？捎萌魏卧囼?yàn)測(cè)定木聚糖酶活性，其中所用底物包括木聚糖中的1，4-β-D-木糖苷內(nèi)部連接(endo-linkage)。測(cè)定木聚糖酶活性的不同類型的底物可商購(gòu)，例如木聚糖酶(Xylazyme)交聯(lián)阿拉伯木聚糖(arabinoxylan)片劑(來(lái)自MegaZyme)，或天青精(azo)-染色阿拉伯木聚糖的不可溶粉末分散體(dispersion)和溶液?？捎萌魏伪绢I(lǐng)域已知內(nèi)切葡聚糖酶試驗(yàn)測(cè)定內(nèi)切葡聚糖酶活性。例如可用多種含纖維素或β-葡聚糖的底物。內(nèi)切葡聚糖酶試驗(yàn)可用AZCL-大麥β-葡聚糖，或優(yōu)選(1)AZCL-HE-纖維素，或(2)天青精-CM-纖維素作為底物。在兩種情況，所述底物降解后在OD595分光光度計(jì)測(cè)量(見對(duì)于AZCL-多糖的內(nèi)(endo)-水解酶試驗(yàn)在http//www.megazvme.com/booklets/AZCLPOL.pdf的Megazyme方法)?？捎萌魏伪绢I(lǐng)域已知的內(nèi)切-1，3(4)-β-葡聚糖酶試驗(yàn)測(cè)定內(nèi)切-1，3(4)-β-葡聚糖酶活性。測(cè)定內(nèi)切-1，3(4)-β-葡聚糖酶活性的優(yōu)選底物是交聯(lián)azo-著色β-葡聚糖大麥底物，其中所述測(cè)定是基于分光光度計(jì)測(cè)量的測(cè)定原理?？捎萌魏卧囼?yàn)測(cè)定蛋白酶活性，其中所用底物包括涉及所需蛋白酶特異性的肽鍵。蛋白酶底物的實(shí)施例是酪蛋白，和pNA-底物，如Suc-AAPF-pNA(例如購(gòu)自SigmaS-7388)。另一實(shí)施例是ProtazymeAK(MegazymeT-PRAK制備為片劑的天青精(azurine)染色的交聯(lián)酪蛋白)。WO01/58276的實(shí)施例描述了適合的蛋白酶試驗(yàn)。優(yōu)選試驗(yàn)為實(shí)施例2D的Protazyme試驗(yàn)(如上通常所述按所需蛋白酶調(diào)節(jié)所述pH和溫度)。為試驗(yàn)?zāi)揪厶敲?，?nèi)切葡聚糖酶，β-1，3(4)-葡聚糖酶和蛋白水解酶的活性，按所需酶調(diào)節(jié)試驗(yàn)pH和試驗(yàn)溫度(優(yōu)選接近最適pH的pH，和接近最適溫度的溫度)。優(yōu)選試驗(yàn)pH在2-10，優(yōu)選3-9，更優(yōu)選pH3、4、5、6、7、8的范圍，例如pH3或pH7。優(yōu)選試驗(yàn)溫度在20-80℃，優(yōu)選30-80℃，更優(yōu)選40-75℃，甚至更優(yōu)選40-60℃的范圍，優(yōu)選40或45或50℃。參照合適列表(blind)，例如緩沖列表限定所述酶活性。抗微生物肽實(shí)施例(AMP′s)是保留抗微生物活性的CAP18，亮殺菌素A(LeucocinA)，Tritrpticin，內(nèi)源性抗微生物多肽-1(Protegrin-1)，Thanatin，乳鐵結(jié)合蛋白(Lactoferrin)，Lactoferricin和Ovispirin如Novispirin(RobertLehrer，2000)，及其變體或片段。其他實(shí)施例是抗真菌的多肽(AFP′s)，如保留抗真菌活性的來(lái)自巨大曲霉(Aspergillusgiganteus)和黑曲霉，及其變體和片段的那些多肽，見WO94/01459和PCT/DK02/00289所公開。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明動(dòng)物飼料添加劑應(yīng)包括(或處方認(rèn)為必須包括的)在動(dòng)物飲食或飼料在的水平0.0010-12.0％，或0.0050-11.0％，或0.0100-10.0％；更特別0.05-5.0％；或0.2-1.0％(％指每100克飼料中的克添加劑)。對(duì)于預(yù)混合物特別是這種情況。因此，通過乘以同種組分在最后飼料內(nèi)(in-feed)的濃度，分別為10-10000；20-2000；或100-500(指上述三個(gè)百分比所包括的間隔)可得到所述動(dòng)物飼料添加劑，例如所述預(yù)混合物的單項(xiàng)組分濃度。重要飼料組分的最后飼料內(nèi)濃度可反映所述動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)需要，其通常為有經(jīng)驗(yàn)的營(yíng)養(yǎng)學(xué)家所知，并且在如下公開文獻(xiàn)中提供NRC，Nutrientrequirementsinswine，ninthrevisededition1988，subcommitteeonswinenutrition，committeeonaminalnutrition，boardofagriculture，nationalresearchcouncil.NationalAcademyPress，Washington，D.C.1988；andNRC，Nutrientrequirementsofpoultry，ninthrevisededition1994，subcommitteeonpoultrynutrition，committeeonaminalnutrition，boardofagriculture，nationalresearchcouncil，NationalAcademyPress，Washington，D.C.，1994。所述肌醇六磷酸酶變體當(dāng)然應(yīng)該以有效量，即以足以提高所述飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的量應(yīng)用到動(dòng)物飼料中。現(xiàn)在猜測(cè)以它的給藥在下述劑量范圍0.01-200；或0.01-100；或0.05-100；或0.05-50；或0.10-10-所有這些范圍均以每千克飼料毫克酶蛋白質(zhì)(ppm)為單位。為測(cè)定每千克飼料或飼料添加劑的毫克肌醇六磷酸酶蛋白質(zhì)，從所述飼料組合物或所述飼料添加劑純化所述酶，并且用相關(guān)試驗(yàn)測(cè)定所述純化酶的比活性。也用相同試驗(yàn)測(cè)定所述飼料組合物或所述飼料添加劑的肌醇六磷酸酶活性，并且基于這兩項(xiàng)測(cè)定，計(jì)算每千克飼料的毫克肌醇六磷酸酶蛋白質(zhì)劑量。當(dāng)然，如果存在用于制備所述飼料添加劑或所述飼料的肌醇六磷酸酶變體樣本，從此標(biāo)本測(cè)定比活性(不需要從所述飼料組合物或添加劑純化該酶)?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域已知方法制備本發(fā)明組合物，例如通過將所述肌醇六磷酸酶變體與附加成分(如果有)混合。動(dòng)物飼料組合物或飲食的蛋白質(zhì)含量相對(duì)較高。根據(jù)本發(fā)明的動(dòng)物飼料組合物具有的粗制(crude)蛋白質(zhì)含量為50-800，或75-700，或100-600，或110-500，或120-490g/kg，并還含有本發(fā)明組合物。另外，或或者(對(duì)于上述粗制蛋白質(zhì)的含量)，本發(fā)明動(dòng)物飼料組合物代謝能量(metabolisableenergy)含量為10-30，或11-28，或11-26，或12-25MJ/kg；和/或鈣含量為0.1-200，或0.5-150，或1-100，或4-50g/kg；和/或存在的(available)磷含量為0.1-200，或0.5-150，或1-100，或1-50，或1-25g/kg；和/或甲硫氨酸含量為0.1-100，或0.5-75，或1-50，或1-30g/kg；和/或甲硫氨酸加半胱氨酸含量為0.1-150，或0.5-125，或1-80g/kg；和/或賴氨酸含量為0.5-50，或0.5-40，或1-30g/kg。粗制蛋白質(zhì)以氮(N)乘因子6.25來(lái)計(jì)算，即如AnimalNutrition，4thedition，Chapter13(Eds.P.McDonald，R.A.EdwardsandJ.F.D.Greenhalgh，LongmanScientificandTechnical，1988，ISBN0-582-40903-9)所述，粗制蛋白質(zhì)(g/kg)＝N(g/kg)×6.25。此氮含量可用Kjeldahl方法(A.O.A.C.，1984，OfficialMethodsofAnalysis14thed.，AssociationofOfficialAnalyticalChemists，WashingtonDC)測(cè)定。而且可用其他方法，如所謂的Dumas方法，在該法中所述樣本在氧中燃燒逼供年切所形成的氮?dú)饬孔鳛榈獊?lái)分析并重新計(jì)算。計(jì)算代謝能量可基于NRCpublicationNutrientRequirementsofSwine(1988)pp.2-6，和theEuropeanTableofEnergyValuesforPoultryFeed-stuffs，Spelderholtcentreforpoultryresearchandextension，7361DABeekbergen，TheNetherlands.GrafischbedrijfPonsen&looijenbv，Wageningen.ISBN90-71463-12-5。在一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明所述動(dòng)物飼料組合物包含至少一種植物蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)源。植物蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)源的實(shí)施例有豆科(leguminosae)和芥科(brassica)的大豆，豌豆和油菜籽，以及谷物如大麥，玉蜀黍(玉米)，燕麥，大米，黑麥，蜀黍和小麥。在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明所述動(dòng)物飼料組合物包含0-80％玉蜀黍；和/或0-80％蜀黍；和/或0-70％小麥；和/或0-70％大麥；和/或0-30％燕麥；和/或0-40％大豆粉(meal)；和/或0-10％魚粉(fishmeal)；和/或0-20％乳清。動(dòng)物飲食可以例如被生產(chǎn)為糊狀(mash)飼料(無(wú)顆粒(non-pelleted))或顆粒飼料。通常，混合所碾磨的(milled)飼料(飼料-原料(stuff))并根據(jù)所需種類的說明書來(lái)添加足夠量的必需維生素和礦物質(zhì)。本發(fā)明所述肌醇六磷酸酶變體可以固體或液體酶制劑的形式，或飼料添加劑的形式，如預(yù)混合物來(lái)添加。通常在混合步驟前或之中添加固體組合物；并且通常在制丸(pellet)步驟后添加液體組合物。當(dāng)將本發(fā)明所述肌醇六磷酸酶變體添加到動(dòng)物飼料時(shí)，會(huì)導(dǎo)致所述飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值提高，例如所述動(dòng)物的生產(chǎn)率(growthrate)和/或體重增加和/或飼料轉(zhuǎn)化(conversion)(即攝取飼料重量相對(duì)體重增加)提高。這些結(jié)果可能依次由于一或多個(gè)下述效果所述肌醇六磷酸的磷酸鹽部分螯合二價(jià)和三價(jià)陽(yáng)離子如金屬離子，未示所述必需營(yíng)養(yǎng)離子鈣，鐵，鋅和鎂以及所述痕量礦物質(zhì)錳，銅和鉬。除外，所述肌醇六磷酸也在某種程度上通過靜電作用結(jié)合蛋白質(zhì)。在所述蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，pI以下的pH時(shí)，帶正電荷的蛋白質(zhì)直接結(jié)合所述肌醇六磷酸鹽。在pI以上的pH時(shí)，帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)通過金屬離子結(jié)合到肌醇六磷酸鹽。肌醇六磷酸及其鹽，肌醇六磷酸鹽通常不會(huì)被代謝(metabolized)，因?yàn)樗鼈儾粡哪c胃系統(tǒng)吸收，即從其中的磷，所述螯合金屬離子，和所結(jié)合的蛋白質(zhì)都不可獲得營(yíng)養(yǎng)(nutritionallyavailable)。因此，因?yàn)榱资撬杏袡C(jī)體生長(zhǎng)的必需元件，食物和飼料制劑需要補(bǔ)充無(wú)機(jī)磷酸鹽。通常也必須補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)必需離子如鐵和鈣。并且另外，因?yàn)橥ㄟ^肌醇六磷酸結(jié)合了蛋白質(zhì)，已知飲食的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值降低。在具體實(shí)施方案中所述體重增加為所述對(duì)照的至少101，102，103，104，105，106，107，108，109，或至少110％(無(wú)酶添加)。在另一具體實(shí)施方案中所述飼料轉(zhuǎn)化為與所述對(duì)照相比最多(或不超過)99，98，97，96，95，94，93，92，91或最多90％(無(wú)酶添加)。所述本發(fā)明組合物也可體外應(yīng)用，例如來(lái)處理植物蛋白質(zhì)。本文所用的術(shù)語(yǔ)植物蛋白質(zhì)涉及任何化合物，組分，制劑或混合物，其包括至少一個(gè)衍生自或來(lái)自植物的蛋白質(zhì)，包括修飾的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)衍生物。在具體實(shí)施方案中所述植物蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)含量為至少10，20，30，40，50，或60％(w/w)。植物蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)源的實(shí)施例為谷物如大麥，小麥，黑麥，燕麥，玉蜀黍(玉米)，大米和蜀黍。其它實(shí)施例為來(lái)自豆科和芥科的大豆粉，豌豆和油菜籽粉。所述植物蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)源通常在溶劑中懸浮，例如水溶液如水，并由所述肌醇六磷酸酶變體及附加酶(如果有)的性質(zhì)適當(dāng)注意調(diào)節(jié)所述pH和溫度值。繼續(xù)所述酶反應(yīng)直到達(dá)到所需效果，之后可通過滅活所述酶，例如通過熱處理步驟，來(lái)使反應(yīng)可能停止或可能不停止。在本發(fā)明處理方法的另一具體實(shí)施方案，維持所述酶作用指，例如將所述酶組合物加入植物蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)源，但如此來(lái)說所述酶活性不被改變(switched)直到后面，一旦建立適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件，或一旦滅活任何酶抑制物，或無(wú)論應(yīng)用什么其他途徑來(lái)推遲所述酶的作用所需要時(shí)。產(chǎn)生肌醇六磷酸酶變體的方法另一方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生親代肌醇六磷酸酶的變體的方法，其中所述變體比所述親代肌醇六磷酸酶熱穩(wěn)定性和/或比活性更高，所述方法包含(d)隨機(jī)誘變編碼所述親代肌醇六磷酸酶的DNA序列；(e)在宿主細(xì)胞中表達(dá)在步驟(d)中獲得的所述突變DNA序列，和(f)篩選表達(dá)肌醇六磷酸酶變體的宿主細(xì)胞，該變體比所述親代肌醇六磷酸酶熱穩(wěn)定性和/或比活性更高。本發(fā)明上述方法的步驟(d)如實(shí)驗(yàn)部分所述，優(yōu)選用摻雜引物進(jìn)行。在優(yōu)選實(shí)施方案中，上述方法包括下述在上述步驟(d)-(f)前的附加步驟(a)建立親代肌醇六磷酸酶的3D結(jié)構(gòu)；(b)在升高的溫度下對(duì)(a)的3D結(jié)構(gòu)進(jìn)行MD模擬；(c)鑒定在所述高流動(dòng)性親代肌醇六磷酸酶的氨基酸序列中的區(qū)域(各向同性波動(dòng))并建議隨機(jī)誘變這些，其中至少一個(gè)步驟(c)中鑒定的區(qū)域在步驟(d)中被靶向(targeted)。所述(a)的結(jié)構(gòu)可用同源性模型(modelling)建立。優(yōu)選模型是圖1的結(jié)構(gòu)。升高溫度的實(shí)施例是一或多個(gè)下述溫度300K，350K，400K，450K，500K，和550K。本發(fā)明這方面，所述親代肌醇六磷酸酶可以是野生型親代肌醇六磷酸酶，或其等位變體，或其具有肌醇六磷酸酶活性的片段，或其成熟部分，或其變體，或在其基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的遺傳工程化或合成多肽。下述為優(yōu)選野生型親代肌醇六磷酸酶的實(shí)施例真菌的肌醇六磷酸酶，如絲狀真菌的肌醇六磷酸酶，或酵母肌醇六磷酸酶。酵母肌醇六磷酸酶實(shí)施例是US5830732所述的Schwanniomycesoccidentalis肌醇六磷酸酶。絲狀真菌的肌醇六磷酸酶實(shí)施例是來(lái)自子囊菌門或擔(dān)子菌門的肌醇六磷酸酶(分別為子囊菌肌醇六磷酸酶，或擔(dān)子菌肌醇六磷酸酶)。子囊菌肌醇六磷酸酶實(shí)施例是那些來(lái)自曲霉屬的菌株，例如泡盛曲霉PHYA(SWISSPROTP34753，Gene13355-62(1993))，黑曲霉(無(wú)花果曲霉)PHYA(SWISSPROTP34752，EP420358，Gene12787-94(1993))，泡盛曲霉PHYB(SWISSPROTP34755，Gene13355-62(1993))，黑曲霉PHYB(SWISSPROTP34754，Biochem.Biophys.Res.Commun.19553-57(1993))；或翹孢霉屬的菌株，例如構(gòu)巢裸孢殼PHYB(SWISSPROT000093，Biochim.Biophys.Acta1353217-223(1997))；或噬熱霉屬(腐質(zhì)霉屬)的菌株，例如WO97/35017所述的細(xì)毛噬熱霉肌醇六磷酸酶。其他子囊菌肌醇六磷酸酶的實(shí)施例公開在EP684313(例如來(lái)自煙曲霉，土曲霉，和噬熱毀絲霉；JP11000164(來(lái)自青霉菌屬菌株的肌醇六磷酸酶)；US6139902(來(lái)自曲霉菌株的肌醇六磷酸酶)，及WO98/13480(Monascusanka肌醇六磷酸酶)中。擔(dān)子菌肌醇六磷酸酶的實(shí)施例是所述來(lái)自卷邊樁菇(Paxillusinvolutus)，絨毛栓菌(Trametespubescens)，Agrocybepediades和Peniophoralycii(見WO98/28409)的肌醇六磷酸酶。也為本發(fā)明這方面的目的，最優(yōu)選的所述擔(dān)子菌肌醇六磷酸酶，并且很優(yōu)選的親代肌醇六磷酸酶是來(lái)自PeniphoralyciiCBS686.96的肌醇六磷酸酶(以及上面通常所述的其等位變體，片段等，以及同源肌醇六磷酸酶)。也為本發(fā)明這方面的目的，WO00/43503的下述肌醇六磷酸酶和肌醇六磷酸酶序列是優(yōu)選合成的親代肌醇六磷酸酶的實(shí)施例SEQIDNO22(basidio共有)，SEQIDNO24(共有肌醇六磷酸酶-10的成熟部分)；SEQIDNO26(共有肌醇六磷酸酶-10)；SEQIDNO27(共有肌醇六磷酸酶-11)，SEQIDNO31(共有肌醇六磷酸酶-10-熱(thermo)(3)-Q50T-K91A)，SEQIDNO36(共有肌醇六磷酸酶-12)，SEQIDNO91(共有肌醇六磷酸酶-3-熱(11)-Q50T)，SEQIDNO93(共有肌醇六磷酸酶-3-熱(11)-Q50T-K91A)，SEQIDNO95(共有肌醇六磷酸酶-10-熱(5)-Q50T)；和SEQIDNO97(共有肌醇六磷酸酶-10-熱(5)-Q50T-K91A)，共有肌醇六磷酸酶-10-熱(3)，共有-肌醇六磷酸酶-10-熱(3)-Q50T，共有-肌醇六磷酸酶-10-熱(3)-K91A，共有肌醇六磷酸酶-10-熱(3)的氨基酸27-467，共有肌醇六磷酸酶-10-熱(3)-Q50T的氨基酸27-467，共有肌醇六磷酸酶-10-熱(3)-K91A的氨基酸27-467。其他優(yōu)選合成的親代肌醇六磷酸酶的實(shí)施例是在EP897010公開的煙曲霉肌醇六磷酸酶變體，在EP897985公開的真菌的共有肌醇六磷酸酶及其變體，在WO00/43503公開的煙曲霉肌醇六磷酸酶變體，和命名為共有肌醇六磷酸酶-7的肌醇六磷酸酶，以及共有肌醇六磷酸酶-1的變體。篩選熱穩(wěn)定的肌醇六磷酸酶變體的優(yōu)選方法是實(shí)施例1所述的首次(primary)篩選在適宜固體培養(yǎng)基(例如SC-葡萄糖平板)培養(yǎng)侯選菌落(例如酵母文庫(kù))適當(dāng)?shù)臅r(shí)間(例如30℃3天)，用硝化濾膜(filter)將平板復(fù)制到新平板，孵育適當(dāng)時(shí)間(例如30℃1天)，在適宜pH(例如pH5.5和53℃)將濾膜轉(zhuǎn)移到預(yù)熱的肌醇六磷酸鈉平板，在升高的溫度孵育適當(dāng)?shù)臅r(shí)間(例如在53℃過夜)，移去(remove)濾膜，并倒入含Ca離子的溶液(例如0.5MCaCl2溶液)，選出比所述親代肌醇六磷酸酶清楚邊界(clearingzones)更大的菌落。另一優(yōu)選篩選方法是如實(shí)施例1所述的二次(secondary)篩選(浸沒(submerse)培養(yǎng)，建立上清的肌醇六磷酸酶活性比溫度曲線，選擇比所述親代肌醇六磷酸酶操作更好的侯選(在較高溫度活性越高越好))。對(duì)這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)，在熱穩(wěn)定性部分指出那些可選溫度?？扇鐚?shí)施例1所述在結(jié)合/連續(xù)應(yīng)用所述兩種方法。優(yōu)選隨機(jī)誘變方法是摻雜的，及摻入寡改組(oligoshuffling)。上述產(chǎn)生肌醇六磷酸酶變體方法甚至更優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法可重復(fù)(iterative)，指在第一步，所述親代肌醇六磷酸酶是上述肌醇六磷酸酶之一，例如所述隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶，在第二步所述親代肌醇六磷酸酶是比其熱穩(wěn)定更高的變體X，第三步中所述親代肌醇六磷酸酶是比X熱穩(wěn)定性甚至更高的變體Y，以此類推。比活性提高的優(yōu)選篩選方法是實(shí)施例1所指的首次篩選方法。另一比活性提高的優(yōu)選篩選方法是實(shí)施例1所指的二次篩選方法。本發(fā)明也涉及生產(chǎn)可得或生產(chǎn)上述肌醇六磷酸酶變體可得的通過肌醇六磷酸酶變體，包含(a)培養(yǎng)宿主細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)包含所述變體的上清；并(b)回收所述變體。進(jìn)一步通過下述實(shí)施例描述本發(fā)明，其不應(yīng)作為限制本發(fā)明范圍。具體實(shí)施方案本發(fā)明一方面是在隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶骨架通過與其他骨架，優(yōu)選同源的骨架同源性序列對(duì)比，轉(zhuǎn)移所選(陽(yáng)性，就是說例如熱穩(wěn)定性和/或比活性提高)突變。此概念可如下描述在如下面所列舉的那些權(quán)利要求和附加具體實(shí)施方案中的每一個(gè)，用“來(lái)自PeniophoralyciiCBS686.96的肌醇六磷酸酶”取代“親代肌醇六磷酸酶”并加入下述權(quán)利要求與來(lái)自PeniophoralyciiCBS686.96肌醇六磷酸酶同源的肌醇六磷酸酶變體，該變體包含在對(duì)應(yīng)于那些在附加實(shí)施方案所權(quán)利要求并列舉的至少一個(gè)位置的取代，通過將所述同源的肌醇六磷酸酶與如上SEQIDNO2序列比對(duì)推導(dǎo)出所述對(duì)應(yīng)位置。權(quán)利要求了本發(fā)明所述肌醇六磷酸酶變體的多種具體實(shí)施方案，并且在如下列舉了附加具體實(shí)施方案。本發(fā)明也涉及下述實(shí)施方案的下述方面分離的氨基酸序列；核苷酸構(gòu)建體；重組表達(dá)載體；重組宿主細(xì)胞；生產(chǎn)方法；轉(zhuǎn)基因植物，或植物部分；轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，或產(chǎn)品，或其組分/元素(元件)；組合物如飼料添加劑，和動(dòng)物飼料；使用的方法和過程；及用途(如本文所權(quán)利要求)。本文具體包括的組合物包含至少一個(gè)任何所述權(quán)利要求或任何上述實(shí)施方案的肌醇六磷酸酶變體。所述動(dòng)物飼料優(yōu)選含有至少一種植物蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)源。親代肌醇六磷酸酶的變體，包含在至少一個(gè)選自如下的位置的取代20；26；28；29；30；31；37；38；39；40；41；42；43；44；45；46；47；48；55；56；57；58；59；60；61；62；63；64；65；66；67；68；69；73；74；75；76；77；78；79；80；81；82；83；91；92；93；94；95；96；97；98；99；100；101；102；103；104；105；106；107；108；109；110；111；112；113；114；115；116；117；118；119；123；124；125；126；135；136；137；138；139；140；141；142；152；153；154；155；156；157；158；159；160；161；162；163；169；170；171；172；173；174；175；176；177；178；179；180；181；182；183；184；185；186；187；188；189；190；191；192；193；194；195；196；197；198；199；204；205；206；207；208；209；210；211，212；213；214；215；216；217；218；219；220；221；222；229；230；231；232；233；234；235；236；237；238；248；249；250；251；252；253；254；255；256；257；258；259；260；261；262；263；264；265；266；284；285；286；287；288；289；300；301；302；303；304；305；306；307；308；321；322；323；324；325；326；327；328；329；330；331；332；333；334；335；343；344；345；346；347；348；349；350；384；385；386；387；388；389；390；391；392；393；394；395；396；397；398；407；408；409；410；411；412；419；420；421；422；423；424；425；426；427；428；429；430；其中(a)所述變體具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每個(gè)位置對(duì)應(yīng)于SEQIDNO2的一個(gè)位置；(c)所述變體與SEQIDNO2具有至少75％的百分比同一性；并且(d)附帶所述變體不是選自如下的PeniophoralyciiCBS686.96肌醇六磷酸酶的變體G26S；Y28N；D29S；F31Y；E42D，K，A；T45R；V46I；W59F；S62D；A64K；R65Q，E，G，A；S66T；R67A，I，Q，K；Q68Y，V，1；K74R，A；A99N；D100S；L102V；P103E；F104L；N107T，Q；S109M；H110S，V；Q111E，N；T112A，S；M116F，I，L；A135S；D137Y；Q138D，S，G；D142A；()154fH；S155N；G156P；E157Q，S；E169S；E170A，P；G171A；()171aS；T174P，A；N177S；N178S，T；M179T，V，L；N182A，V；V184G；D185E；()185eT；G186S，A；D187R，K，S；()187aV，T；E188Q，S，A，V；S189E；V195L；N199A，P；L204N；A207D，H；S216T；D217E；L219Y，T；T220Y，N；L221F；M222L；L230V；()235eE，Q；V248R，I；S249Q，A；E251D；Y254A，L，G；D255N；D257K；Y259F；T262H；P264A；G286R，H；Q287K，S；A288P；T321Q，S，G；M3221；V3231；P324A；A327S，F(xiàn)，I，L；F332Y；N333P；E344R；R346P；W348F；V349L，A，S；D350S，V；G388A；V393R；E395K，T；和L396R。親代肌醇六磷酸酶的變體，包含在選自如下區(qū)域的至少一個(gè)區(qū)域的至少一個(gè)位置的取代20；26；28-31；37-48；55-69；73-83；91-119；123-126；135-142；152-163；169-199；204-222；229-238；248-266；284-289；300-308；321-335；343-350；384-398；407-412；和419-430；其中(a)所述變體具有肌醇六磷酸酶活性；并且(b)每個(gè)位置對(duì)應(yīng)于SEQIDNO2的一個(gè)位置；并且(c)所述變體與SEQIDNO2具有至少75％的百分比同一性；并且其中在位置26；28；29；31；42；45；46；59；62；64；65；66；67；68；74；99；100；102；103；104；107；109；110；111；112；116；135；137；138；142；154f；155；156；157；169；17O；171；171a；174；177；178；179；182；184；185；185e；186；187；187a；188；189；195；199；204；207；216；217；219；220；221；222；230；235e；248；249；251；254；255；257；259；262；264；286；287；288；321322；323；324；327；332；333；344；346；348；349；350；388；393；395；和396的所述變體選自26A，C，D，E，F(xiàn)，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；28A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W；29A，C，E，F(xiàn)，T，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；31A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W；42C，F(xiàn)，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；45A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，V，W，Y；46A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；59A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，Y；62A，C，E，F(xiàn)，G，H，i，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；64C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；65C，D，F(xiàn)，H，I，K，L，M，N，P，S，T，V，W，Y；66A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，V，W，Y；67C，D，E，F(xiàn)，G，H，L，M，N，P，S，T，V，W，Y；68A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，K，L，M，N，P，R，S，T，W；74C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，L，M，N，P，Q，S，T，V，W，Y；99C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W，Y100A，C，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；102A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；103A，C，D，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y；104A，C，D，E，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；107A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，P，R，S，V，W，Y；109A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，N，P，Q，R，T，V，W，Y；110A，C，D，E，F(xiàn)，G，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，W，Y；111A，C，D，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，P，R，S，T，V，W，Y；112C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，V，W，Y；116A，C，D，E，G，H，K，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；135C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；137A，C，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W；138A，C，E，F(xiàn)，H，I，K，L，M，N，P，R，T，V，W，Y；142C，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；154fA，C，D，E，F(xiàn)，G，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；155A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，T，V，W，Y；156A，C，D，E，F(xiàn)，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y；157A，C，D，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，R，T，V，W，Y；169A，C，D，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；170C，D，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y；171C，D，E，F(xiàn)，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；171aA，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；174C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，V，W，Y；177A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，T，V，W，Y；178A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，V，W，Y；179A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，N，P，Q，R，S，W，Y；182C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，W，Y；184A，C，D，E，F(xiàn)，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；185A，C，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；185eA，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，V，W，Y；186C，D，E，F(xiàn)，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；187A，C，E，F(xiàn)，G，H，I，L，M，N，P，Q，T，V，W，Y；187aA，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，W，Y；188C，D，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，R，T，W，Y；189A，C，D，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；195A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；199C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，Q，R，S，T，V，W，Y；204A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，M，P，Q，R，S，T，V，W，Y；207C，E，F(xiàn)，G，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；216A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，V，W，Y；217A，C，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；219A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，V，W；220A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，V，W；221A，C，D，E，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；222A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；230A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；235eA，C，D，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，R，S，T，V，W，Y；248A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，K，L，M，N，P，Q，S，T，W，Y；249C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，R，T，V，W，Y；251A，C，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；254C，D，E，F(xiàn)，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W；255A，C，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W，Y；257A，C，E，F(xiàn)，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；259A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W；262A，C，D，E，F(xiàn)，G，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，V，W，Y；264C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y；286A，C，D，E，F(xiàn)，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W，Y；287A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，L，M，N，P，R，T，V，W，Y；288C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y；321A，C，D，E，F(xiàn)，H，I，K，L，M，N，P，R，V，W，Y；322A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，K，L，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；323A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；324C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y；327C，D，E，G，H，K，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；332A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W；333A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，Q，R，S，T，V，W，Y；344A，C，D，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W，Y；346A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，Q，S，T，V，W，Y；348A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，Y；349C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，T，W，Y；350A，C，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，W，Y；388C，D，E，F(xiàn)，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；393A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，W，Y；395A，C，D，F(xiàn)，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，V，W，Y；和396A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，M，N，P，Q，S，T，V，W，Y；親代肌醇六磷酸酶的變體，包含在選自如下區(qū)域的至少一個(gè)區(qū)域的至少一個(gè)位置的取代20；28-31；37-48；55-69；91-119；123-126；152-163；169-199；204-222；229-238；248-266；284-289；321-335；343-350；384-398；407-412；和419-430；其中(a)所述變體具有肌醇六磷酸酶活性；并且(b)每個(gè)位置對(duì)應(yīng)于SEQIDNO2的一個(gè)位置；并且(c)所述變體與SEQIDNO2具有至少75％的百分比同一性；并且(d)附帶所述變體不是選自如下的PeniophoralyciiCBS686.96肌醇六磷酸酶的變體Y28N；D29S；F31Y；E42D，K，A；T45R；V46I；W59F；S62D；A64K；R65Q，E，G，A；S66T；R67A，I，Q，K；Q68Y，V，I；A99N；D100S；L102V；P103E；F104L；N107T，Q；S109M；H110S，V；Q111E，N；T112A，S；M116F，I，L；()154fH；S155N；G156P；E157Q，S；E169S；E170A，P；G171A；()171aS；T174P，A；N177S；N178S，T；M179T，V，L；N182A，V；V184G；D185E；()185eT；G186S，A；D187R，K，S；()187aV，T；E188Q，S，A，V；S189E；V195L；N199A，P；L204N；A207D，H；S216T；D217E；L219Y，T；T220Y，N；L221F；M222L；L230V；()235eE，Q；V248R，I；S249Q，A；E251D；Y254A，L，G；D255N；D257K；Y259F；T262H；P264A；G286R，H；Q287K，S；A288P；T321Q，S，G；M3221；V3231；P324A；A327S，F(xiàn)，I，L；F332Y；N333P；E344R；R346P；W348F；V349L，A，S；D350S，V；G388A；V393R；E395K，T；和L396R。親代肌醇六磷酸酶的變體，包含在選自如下的至少一個(gè)位置的取代20；29；45；63；69；92；93；95；97；98；99；102；110；114；118；125；152；156；157；160；163；183；185；187；190；191；194；199；205；210；218；222；234；248；286；321；323；324；328；330；334；343；344；345；347；349；350；384；395；398；409；421；422；423；424；425；426；427；428；429；430；其中(a)所述變體具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每個(gè)位置對(duì)應(yīng)于SEQIDNO2一個(gè)位置；并且(c)所述變體與SEQIDNO2具有至少75％的百分比同一性；并且(d)附帶所述變體不是選自如下PeniophoralyciiCBS686.96肌醇六磷酸酶的變體D29S；T45R；A99N；L102V；H110S，V；G156P；E157Q，S；D185E；()185eT；D187R，K，S；()187aV，T；N199A，P；M222L；V248R，I；G286R，H；T321Q，S，G；V3231；P324A；E344R；V349L，A，S；D350S，V；和E395K，T。親代肌醇六磷酸酶的變體，包含選自如下的至少一個(gè)位置的取代20；29；45；63；69；92；93；95；97；98；99；102；110；114；118；125；152；156；157；160；163；183；185；187；190；191；194；199；205；210；218；222；234；248；286；321；323；324；328；330；334；343；344；345；347；349；350；384；395；398；409；421；422；423；424；425；426；427；428；429；430；其中(a)所述變體具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每個(gè)位置對(duì)應(yīng)于SEQIDNO2一個(gè)位置；并且(c)所述變體與SEQIDNO2具有至少75％的百分比同一性；并且(d)其中在位置29；45；99；102；110；156；157；185；185e；187；187a；199；222；248；286；321；323；324；344；349；350；和395的所述變體選自29A，C，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；45A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，V，W，Y；99C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W，Y；102A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，W，T；110A，C，D，E，F(xiàn)，G，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，W，Y；156A，C，D，E，F(xiàn)，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y；157A，C，D，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，R，T，V，W，Y；185A，C，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；185eA，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，V，W，Y；187A，C，E，F(xiàn)，G，H，I，L，M，N，P，Q，T，V，W，Y；187aA，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，W，Y；199C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，Q，R，S，T，V，W，Y；222A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；248A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，K，L，M，N，P，Q，S，T，W，Y；286A，C，D，E，F(xiàn)，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W，Y；321A，C，D，E，F(xiàn)，H，I，K，L，M，N，P，R，V，W，Y；323A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；324C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y；344A，C，D，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W，Y；349C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，T，W，Y；350A，C，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，W，Y；和395A，C，D，F(xiàn)，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，V，W，Y。所述權(quán)利要求或任何上述實(shí)施方案的變體，其含有至少一個(gè)選自如下的取代20R；29N，C，T；45A；63N；69A；92L；93I；95R，H，M，N，S，T；97V；98G；99D；102I；110Y，R，W；114A；118A；125D；152A；156C，R；157K；160R；163P；183K，A，W，G；185A，H，N，P，K；187G；190S，K；191L，R，S；194R；199S；205S；210G；218T；2221；234K，S；248A，C，D，E，G，H，S，T；286S；321A；323A；324S，L；328T；330R；334E，D，G；343N；344A，V，S；345D，H；347Q，P；349M，K；D350T，M，I，L；384S，A；395G；398T；409S；421R，S；422R；423N；424S；425L；426E；427G；428R；429I；和430M。所述權(quán)利要求或任何上述實(shí)施方案的變體，其中所述親代肌醇六磷酸酶i)具有的氨基酸序列與SEQIDNO2的氨基酸序列有至少約60％，優(yōu)選至少60％的同一性；ii)在低嚴(yán)格條件與SEQIDNO1的核苷酸49-1320或其互補(bǔ)鏈雜交的氨基酸序列所編碼；iii)為真菌的肌醇六磷酸酶，優(yōu)選擔(dān)子菌肌醇六磷酸酶或混合子囊菌/擔(dān)子菌肌醇六磷酸酶，如隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶，例如來(lái)自Peniophoralycii，例如PeniophoralyciiCBS686.96的肌醇六磷酸酶。所述權(quán)利要求或任何上述實(shí)施方案的肌醇六磷酸酶變體，其為熱穩(wěn)定的和/或比活性高，優(yōu)選比所述親代肌醇六磷酸酶熱穩(wěn)定性和/或比活性高。親代肌醇六磷酸酶的變體，包含選自如下區(qū)域的至少一個(gè)區(qū)域的至少一個(gè)位置的取代20；29；37-48；63；69；73-83；91-119；123-126；154-157；163；183；187；194；199；204-218；229-238；248；284-289；300-308；323-335；343-350；384；395；398；407-412；和419-430；其中(a)所述變體具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每個(gè)位置對(duì)應(yīng)于SEQIDNO2一個(gè)位置；并且(c)所述變體與SEQIDNO2具有至少75％的百分比同一性；并且(d)附帶所述變體不是選自如下PeniophoralyciiCBS686.96肌醇六磷酸酶的變體D29S；E42D，K，A；T45R；V46I；K74R，A；A99N；D100S；L102V；P103E；F104L；N107T，Q；S109M；H110S，V；Q111E，N；T112A，S；M116F，I，L；S155N；()154fH；G156P；E157Q，S；D187R，K，S；()187aV，T；N199A，P；L204N；A207D，H；S216T；D217E；L230V；()235eE，Q；V248R，I；G286R，H；Q287K，S；A288P；V3231；P324A；A327S，F(xiàn)，I，L；F332Y；N333P；E344R；R346P；W348F；V349L，A，S；D350K，A；和E395K，T。親代肌醇六磷酸酶的變體，包含選自如下至少一個(gè)位置的取代20；29；37；38；39；40；41；42；43；44；45；46；47；48；63；69；73；74；75；76；77；78；79；80；81；82；83；91；92；93；94；95；96；97；98；99；100；101；102；103；104；105；106；107；108；109；110；111；112；113；114；115；116；117；118；119；123；124；125；126；154；155；156；157；163；183；187；194；199；204；205；206；207；208；209；210；211，212；213；214；215；216；217；218；229；230；231；232；233；234；235；236；237；238；248；300；301；302；303；304；305；306；307；308；323；324；325；326；327；328；329；330；331；332；333；334；335；343；344；345；346；347；348；349；350；384；395；398；407；408；409；410；411；412；419；420；421；422；423；424；425；426；427；428；429；430；其中(a)所述變體具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每個(gè)位置對(duì)應(yīng)于SEQIDNO2一個(gè)位置；并且(c)所述變體與SEQIDNO2具有至少75％的百分比同一性；并且(d)附帶所述變體不是選自如下PeniophoralyciiCBS686.96肌醇六磷酸酶的變體D29S；E42D，K，A；T45R；V46I；K74R，A；A99N；D100S；L102V；P103E；F104L；N107T，Q；S109M；H110S，V；Q111E，N；T112A，S；M116F，I，L；S155N；()154fH；G156P；E157Q，S；D187R，K，S；()187aV，T；N199A，P；L204N；A207D，H；S216T；D217E；L230V；()235eE，Q；V248R，I；G286R，H；Q287K，S；A288P；V3231；P324A；A327S，F(xiàn)，I，L；F332Y；N333P；E344R；R346P；W348F；V349L，A，S；D350K，A；和E395K，T。親代肌醇六磷酸酶的變體，包含選自如下區(qū)域的至少一個(gè)區(qū)域的至少一個(gè)位置的取代20；29；37-48；63；69；73-83；91-119；123-126；154-157；163；183；187；194；199；204-218；229-238；248；284-289；300-308；323-335；343-350；384；395；398；407-412；和419-430；其中(a)所述變體具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每個(gè)位置對(duì)應(yīng)于SEQIDNO2一個(gè)位置；并且(c)所述變體與SEQIDNO2具有至少75％的百分比同一性；并且其中在位置29，42，45，46，74，99，100，102，103，104，107，109，110，111，112，116，155，154，156，157，187，187a，199，204，207，216，217，230，235e，248，286，287，288，323，324，327，332，333，344，346，348，349，350，395的所述變體選自29A，C，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；42C，F(xiàn)，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；45A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，V，W，Y；46A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；74C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W，Y；99C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W，Y；100A，C，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；102A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；103A，C，D，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y；104A，C，D，E，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；107A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，P，R，S，V，W，Y；109A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，N，P，Q，R，T，V，W，Y；110A，C，D，E，F(xiàn)，G，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，W，Y；111A，C，D，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，P，R，S，T，V，W，Y；112C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，V，W，Y；116A，C，D，E，G，H，K，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；155C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，T，V，W，Y；154fA，C，D，E，F(xiàn)，G，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；156A，C，D，E，F(xiàn)，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y；157A，C，D，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，R，T，V，W，Y；187A，C，E，F(xiàn)，G，H，I，L，M，N，P，Q，T，V，W，Y；187aA，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，W，Y；199C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，Q，R，S，T，V，W，Y；204A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，M，P，Q，R，S，T，V，W，Y；207C，E，F(xiàn)，G，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；216A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，V，W，Y；217A，C，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；230A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；235eA，C，D，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，R，S，T，V，W，Y；248A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，K，L，M，N，P，Q，S，T，W，Y；286A，C，D，E，F(xiàn)，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W，Y；287A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，L，M，N，P，R，T，V，W，Y；288C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y；323A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；324C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y；327C，D，E，G，H，K，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；332A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W；333A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，Q，R，S，T，V，W，Y；344A，C，D，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W，Y；346A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，Q，S，T，V，W，Y；348A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，Y；349C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，T，W，Y；350C，E，F(xiàn)，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；和395A，C，D，F(xiàn)，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，V，W，Y。親代肌醇六磷酸酶的變體，包含選自如下至少一個(gè)位置的取代20；29；45；63；69；95；97；98；99；102；114；118；125；163；183；187；194；199；205；218；234；248；323；324；328；330；334；343；344；345；347；349；350；384；395；398；421；422；423；424；425；426；427；428；429；430；其中(a)所述變體具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每個(gè)位置對(duì)應(yīng)于SEQIDNO2一個(gè)位置；并且(c)所述變體與SEQIDNO2具有至少75％的百分比同一性；并且(d)附帶所述變體不是選自如下PeniophoralyciiCBS686.96肌醇六磷酸酶的變體D29S；T45R；A99N；L102V；D187R，K，S；()187aV，T；N199A，P；V248R，I；V3231；P324A；E344R；V349L，A，S；D350K，A；和E395K，T。親代肌醇六磷酸酶的變體，包含選自如下區(qū)域的至少一個(gè)區(qū)域的至少一個(gè)位置的取代20；29；37-48；63；69；73-83；91-119；123-126；154-157；163；183；187；194；199；204-218；229-238；248；284-289；300-308；323-335；343-350；384；395；398；407-412；和419-430；其中(a)所述變體具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每個(gè)位置對(duì)應(yīng)于SEQIDNO2一個(gè)位置；并且(c)所述變體與SEQIDNO2具有至少75％的百分比同一性；并且其中在位置29，45，99，102，187，187a，199，248，323，324，344，349，350，和395的所述變體選自29A，C，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；45A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，V，W，Y；99C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W，Y；102A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；187A，C，E，F(xiàn)，G，H，I，L，M，N，P，Q，T，V，W，Y；187aA，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，W，Y；199C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，Q，R，S，T，V，W，Y；248A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，K，L，M，N，P，Q，S，T，W，Y；323A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；324C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y；344A，C，D，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W，Y；349C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，T，W，Y；350C，E，F(xiàn)，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；和395A，C，D，F(xiàn)，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，V，W，Y。上述任何實(shí)施方案的變體含有選自如下的至少一個(gè)取代20R；29N，C，T；45A；63N；69A；92L；93I；95R；97V；98G；99D；102I；110Y；114A；118A；125D；163P；183K；187G；194R；199S；205S；218T；234K，S；248A；323A；324S，L；328T；330R；334E，D，G；343N；344A，V，S；345D，H；347Q，P；V349M；D350V，T；384S，A；395G；398T；409S；421R，S；422R；423N；424S；425L；426E；427G；428R；429I；和430M。上述任何實(shí)施方案的變體，該變體含有一個(gè)選自如下取代或取代組合的取代或取代組合20R+95R+97V+98G；29N+102I；29N+118A；29N+234S；29N+324S；29N+163P+324S；29N+163P+324S+395G；29S；29S+205S；29S+125D+324A；29S+324A+350V；29S+125D+324A+350V；29S+125D+324A+234K+330R；29S+125D+324A+330R+395G；29S+99D+125D+324A+334E+350V；29S+125D+324A+218T+344S+350V；29S+125D+324A+234K+330R+395G；29S+324A+125D+350V+63N+218T+334E+183K+421S；29S+324A+125D+350V+45A+69A+99D+110Y+334E+344S；29T+324L；45A+350V+421R+422R+423N+424S+425L+426E+427G+428R+429I+430M；69A+334E；99D+398T；114A+187G+194R+324S；114A+187G+194R+324S；218T+334G；323A+324S；324S；324S+328T；324S+395G；324S+345D+347Q；330R；334E+344A；334D+343N+344V；345H+347P+350V；和350V。親代肌醇六磷酸酶的變體，包含選自如下區(qū)域的至少一個(gè)區(qū)域的至少一個(gè)位置的取代20；29；37-40；45；47-48；63；69；73-83；91-98；99；102；103；110；113-119；123-125；154-157；163；183；187；194；199；204-218；229-238；248；284-289；300-308；323-324；328-335；343-347；349；350；384；395；398；407-412；和419-430；其中(a)所述變體具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每個(gè)位置對(duì)應(yīng)于SEQIDNO2一個(gè)位置；并且(c)所述變體與SEQIDNO2具有至少75％的百分比同一性；并且(d)附帶所述變體不是選自如下PeniophoralyciiCBS686.96肌醇六磷酸酶的變體D29S；T45R；K74R，A；A99N；L102V；P103E；H110S，V；M116F，I，L；S155N；()154fH；G156P；E157Q，S；D187R，K，S；()187aV，T；N199A，P；L204N；A207D，H；S216T；D217E；L230V；()235eE，Q；V248R，I；G286R，H；Q287K，S；A288P；V3231；P324A；F332Y；N333P；E344R；R346P；V349L，A，S；D350K，A；和E395K，T。親代肌醇六磷酸酶的變體，包含選自如下區(qū)域的至少一個(gè)區(qū)域的至少一個(gè)位置的取代20；29；37-48；63；69；73-83；91-119；123-126；152-163；183-199；204-218；229-238；248；284-289；300-308；323-335；343-350；384；395；398；407-412；和419-430；其中(a)所述變體具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每個(gè)位置對(duì)應(yīng)于SEQIDNO2一個(gè)位置；并且(c)所述變體與SEQIDNO2具有至少75％的百分比同一性；并且(d)附帶所述變體不是選自如下PeniophoralyciiCBS686.96肌醇六磷酸酶的變體D29S；E42D，K，A；T45R；V46I；K74R，A；A99N；D100S；L102V；P103E；F104L；N107T，Q；S109M；H110S，V；Q111E，N；T112A，S；M116F，I，L；()154fH；S155N；G156P；E157Q，S；V184G；D185E；()185eT；G186S，A；D187R，K，S；()187aV，T；E188Q，S，A，V；S189E；V195L；N199A，P；L204N；A207D，H；S216T；D217E；L230V；()235eE，Q；V248R，I；G286R，H；Q287K，S；A288P；V3231；P324A；A327S，F(xiàn)，I，L；F332Y；N333P；E344R；R346P；W348F；V349L，A，S；D350S，V；和E395K，T。親代肌醇六磷酸酶的變體，包含選自如下至少一個(gè)位置的取代20；29；37；38；39；40；41；42；43；44；45；46；47；48；63；69；73；74；75；76；77；78；79；80；81；82；83；91；92；93；94；95；96；97；98；99；100；101；102；103；104；105；106；107；108；109；110；111；112；113；114；115；116；117；118；119；123；124；125；126；152；153；154；155；156；157；158；159；160；161；162；163；183；184；185；186；187；188；189；190；191；192；193；194；195；196；197；198；199；204；205；206；207；208；209；210；211，212；213；214；215；216；217；218；229；230；231；232；233；234；235；236；237；238；248；284；285；286；287；288；289；300；301；302；303；304；305；306；307；308；323；324；325；326；327；328；329；330；331；332；333；334；335；343；344；345；346；347；348；349；350；384；395；398；407；408；409；410；411；412；419；420；421；422；423；424；425；426；427；428；429；430；其中(a)所述變體具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每個(gè)位置對(duì)應(yīng)于SEQIDNO2一個(gè)位置；并且(c)所述變體與SEQIDNO2具有至少75％的百分比同一性；并且(d)附帶所述變體不是選自如下PeniophoralyciiCBS686.96肌醇六磷酸酶的變體D29S；E42D，K，A；T45R；V46I；K74R，A；A99N；D100S；L102V；P103E；F104L；N107T，Q；S109M；H110S，V；Q111E，N；T112A，S；M116F，I，L；()154fH；S155N；G156P；E157Q，S；V184G；D185E；()185eT；G186S，A；D187R，K，S；()187aV，T；E188QSAV；S189E；V195L；N199A，P；L204N；A207D，H；S216T；D217E；L230V；()235eE，Q；V248R，I；G286R，H；Q287K，S；A288P；V3231；P324A；A327S，F(xiàn)，I，L；F332Y；N333P；E344R；R346P；W348F；V349L，A，S；D350S，V；和E395K，T。親代肌醇六磷酸酶的變體，包含選自如下區(qū)域的至少一個(gè)區(qū)域的至少一個(gè)位置的取代20；29；37-48；63；69；73-83；91-119；123-126；152-163；183-199；204-218；229-238；248；284-289；300-308；323-335；343-350；384；395；398；407-412；和419-430；其中(a)所述變體具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每個(gè)位置對(duì)應(yīng)于SEQIDNO2一個(gè)位置；并且(c)所述變體與SEQIDNO2具有至少75％的百分比同一性；并且其中在位置29，42，45，46，74，99，100，102，103，104，107，109，110，111，112，116，154，155，156，157，184，185，185e，186，187，187a，188，189，195，199，204，207，216，217，230，235e，248，286，287，288，323，324，327，332，333，344，346，348，349，350，395的所述變體選自29A，C，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；42C，F(xiàn)，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；45A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，V，W，Y；46A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；74C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W，Y；99C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W，Y；100A，C，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；102A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；103A，C，D，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y；104A，C，D，E，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；107A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，P，R，S，V，W，Y；109A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，N，P，Q，R，T，V，W，Y；110A，C，D，E，F(xiàn)，G，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，W，Y；111A，C，D，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，P，R，S，T，V，W，Y；112C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，V，W，Y；116A，C，D，E，G，H，K，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；154fA，C，D，E，F(xiàn)，G，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；155A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，T，V，W，Y；156A，C，D，E，F(xiàn)，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y；157A，C，D，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，R，T，V，W，Y；184A，C，D，E，F(xiàn)，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；185A，C，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；185eA，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，V，W，Y；186C，D，E，F(xiàn)，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；187A，C，E，F(xiàn)，G，H，I，L，M，N，P，Q，T，V，W，Y；187aA，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，W，Y；188C，D，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，R，T，W，Y；189A，C，D，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；195A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；199C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，Q，R，S，T，V，W，Y；204A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，M，P，Q，R，S，T，V，W，Y；207C，E，F(xiàn)，G，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；216A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，V，W，Y；217A，C，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；230A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；235eA，C，D，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，R，S，T，V，W，Y；248A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，K，L，M，N，P，Q，S，T，W，Y；286A，C，D，E，F(xiàn)，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W，Y；287A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，L，M，N，P，R，T，V，W，Y；288C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y；323A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；324C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y；327C，D，E，G，H，K，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；332A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W；333A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，Q，R，S，T，V，W，Y；344A，C，D，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W，Y；346A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，Q，S，T，V，W，Y；348A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，Y；349C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，T，W，Y；350A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，W，Y；和395A，C，D，F(xiàn)，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，V，W，Y。親代肌醇六磷酸酶的變體，包含選自如下至少一個(gè)位置的取代20；29；45；63；69；92；93；95；97；98；99；102；110；114；118；125；152；156；157；160；163；183；185；187；194；199；205；218；234；248；286；323；324；328；330；334；343；344；345；347；349；350；384；395；398；409；421；422；423；424；425；426；427；428；429；430；其中(a)所述變體具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每個(gè)位置對(duì)應(yīng)于SEQIDNO2一個(gè)位置；并且(c)所述變體與SEQIDNO2具有至少75％的百分比同一性；并且(d)附帶所述變體不是選自如下PeniophoralyciiCBS686.96肌醇六磷酸酶的變體D29S；T45R；A99N；L102V；H110S，V；G156P；E157Q，S；D185E；()185eT；D187R，K，S；()187aV，T；N199A，P；V248R，I；G286R，H；V3231；P324A；E344R；V349L，A，S；D350S，V；和E395K，T。親代肌醇六磷酸酶的變體，包含選自如下至少一個(gè)位置的取代20；29；45；63；69；92；93；95；97；98；99；102；110；114；118；125；152；156；157；160；163；183；185；187；194；199；205；218；234；248；286；323；324；328；330；334；343；344；345；347；349；350；384；395；398；409；421；422；423；424；425；426；427；428；429；430；其中(a)所述變體具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每個(gè)位置對(duì)應(yīng)于SEQIDNO2一個(gè)位置；并且(c)所述變體與SEQIDNO2具有至少75％的百分比同一性；并且其中在位置29，45，99，102，110；156；157；185；185e；187，187a，199，248，286；323，324，344，349，350，和395的所述變體選自29A，C，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；45A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，V，W，Y；99C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W，Y；102A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；110A，C，D，E，F(xiàn)，G，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，W，Y；156A，C，D，E，F(xiàn)，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y；157A，C，D，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，R，T，V，W，Y；185A，C，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；185eA，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，V，W，Y；187A，C，E，F(xiàn)，G，H，I，L，M，N，P，Q，T，V，W，Y；187aA，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，W，Y；199C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，Q，R，S，T，V，W，Y；248A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，K，L，M，N，P，Q，S，T，W，Y；286A，C，D，E，F(xiàn)，G，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W，Y；323A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；324C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y；344A，C，D，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W，Y；349C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，T，W，Y；350A，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，W，Y；和395A，C，D，F(xiàn)，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，V，W，Y。任何上述實(shí)施方案的所述變體，其含有至少一個(gè)選自如下的取代20R；29N，C，T；45A；63N；69A；92L；93I；95R，H，M，N，S，T；97V；98G；99D；102I；110Y，R，W；114A；118A；125D；152A；156C，R；160R；163P；183K，A，W，G；185A，H，N，P；187G；191L；194R；199S；205S；218T；234K，S；248A，C，D，E，G，H，S；286S；323A；324S，L；328T；330R；334E，D，G；343N；344A，V，S；345D，H；347Q，P；V349M；D350T；384S，A；395G；398T；409S；421R，S；422R；423N；424S；425L；426E；427G；428R；429I；和430M。任何上述實(shí)施方案的所述變體，其含有一個(gè)選自如下取代或取代組合的取代或取代組合20R+95R+97V+98G；29N+102I；29N+118A；29N+163P+324S；29N+163P+324S+395G；29N+234S；29N+324S；29S；29S+45A+69A+99D+110Y+125D+324A+334E+344S+350V；29S+63N+125D+183K+218T+324A+334E+350V+421S；29S+95H+110W+183W+324A+350V；29S+95M+110W+183W+324A+350V；29S+95N+110R+183W+324A+350V；29S+95R+110W+183W+324A+350V；29S+95S+110R+183W+324A+350V；29S+95S+110W+183W+324A+350V；29S+95T+110R+183W+324A+350V；29S+95T+110Y+125D+183W+286S+324A+350V；29S+95T+110Y+152A+156C+157Q+160R+183W+324A+350V；29S+95T+110Y+156R+157Q+183W+324A+350V；29S+95T+110Y+183W+185A+248A+324A+350V；29S+95T+110Y+183W+185A+248C+324A+350V；29S+95T+110Y+183W+185A+248E+324A+350V；29S+95T+110Y+183W+185A+248H+324A+350V；29S+95T+110Y+183W+185H+248G+324A+350V；29S+95T+110Y+183W+185P+248G+324A+350V；29S+95T+110Y+183W+185P+248S+324A+350V；29S+95T+110Y+183W+191L+324A+350V；29S+95T+110Y+183W+248D+324A+350V；29S+95T+110Y+183W+324A；29S+95T+110Y+183W+324A+350V；29S+99D+125D+324A+334E+350V；29S+110Y+183W+185N+324A+350V；29S+125D+218T+324A+344S+350V；29S+125D+234K+324A+330R；29S+125D+234K+324A+330R+395G；29S+125D+324A；29S+125D+324A+330R+395G；29S+125D+324A+350V；29S+183A+324A+350V；29S+183G+324A+334E+344S+350V；29S+183W+324A+350V；29S+205S；29S+324A+350V；29T+324L；45A+350V+421R+422R+423N+424S+425L+426E+427G+428R+429I+430M；69A+334E；99D+398T；114A+187G+194R+324S；218T+334G；323A+324S；324S；324S+328T；324S+345D+347Q；324S+395G；330R；334D+343N+344V；334E+344A；345H+347P+350V；和350V。實(shí)施例所用化學(xué)品至少是試劑級(jí)別的商品。實(shí)施例1制備PE-變體，篩選并分離熱穩(wěn)定性和/或比活性提高的變體一般原理用PeniophoralyciiCBS686.96肌醇六磷酸酶作為親代肌醇六磷酸酶，基于本文所需區(qū)域，構(gòu)建多個(gè)肌醇六磷酸酶變體文庫(kù)并于酵母(摻雜文庫(kù)，及摻入寡改組文庫(kù)，下述其實(shí)施例)中表達(dá)。篩選提高的熱穩(wěn)定性用首次篩選處理所述酵母文庫(kù)(如下述)(復(fù)制，單濾膜)來(lái)選擇在53℃顯示活性的那些菌落。將在53℃顯示活性的菌落二次篩選轉(zhuǎn)移到(也見下述)(24孔板培養(yǎng))來(lái)建立每個(gè)菌落的溫度曲線(在可用的37℃，60℃，62℃，64℃，66℃，68℃，70℃，72℃等的活性)。對(duì)于比野生型隔孢伏革菌親代肌醇六磷酸酶表現(xiàn)更好的菌落，將所述質(zhì)粒分離并重新轉(zhuǎn)化如酵母，并重復(fù)所述溫度曲線試驗(yàn)。從所述溫度曲線試驗(yàn)計(jì)算得到下述圖表“60℃/37℃的比活性”，和/或“62℃/37℃的比活性”，和/或“65℃/37℃的比活性”，和/或“68℃/37℃的比活性”，和/或“70℃/37℃的比活性”，和/或“72℃/37℃的比活性”，等等。以這些比率，可命名首次提及的溫度為“升高的所需溫度”。基于從二次篩選方法(溫度曲線測(cè)定)的上清所獲得的肌醇六磷酸酶活性值，將這些術(shù)語(yǔ)限定為所述肌醇六磷酸酶在升高的溫度(例如60或62℃)的活性相對(duì)在較低溫度(37℃)的肌醇六磷酸酶活性的比率。選擇比所述親代肌醇六磷酸酶的一或多個(gè)這些比活性提高的菌落，測(cè)序所需質(zhì)粒并將相應(yīng)變體鑒定為本發(fā)明改良的肌醇六磷酸酶變體。在第二輪篩選中，選擇熱穩(wěn)定的肌醇六磷酸酶變體作為新的親代肌醇六磷酸酶(骨架)并重復(fù)上述(基于新骨架的表現(xiàn)適當(dāng)調(diào)節(jié)溫度)。另外，構(gòu)建組合變體，并隨機(jī)化一些可能的熱突變點(diǎn)(hotspot)，并檢測(cè)變體。在第三輪篩選中，選擇新的熱穩(wěn)定更加提高的肌醇六磷酸酶變體作為新的骨架并重復(fù)上述(再次上(upward)調(diào)溫度)，例如現(xiàn)在將所述第一輪篩選溫度升高到63℃。另外，還構(gòu)建(construed)一些新的組合變體，并且隨機(jī)化其他明顯令人感興趣的位點(diǎn)來(lái)發(fā)現(xiàn)最適取代對(duì)。通常如上述進(jìn)一步制備變體。篩選提高的比活性在首次篩選中，將所述酵母文庫(kù)涂布在含肌醇六磷酸鈣的SC-葡萄糖平板，并在30℃培養(yǎng)3天。選擇暈圈(halo)較大的克隆并在含YPD培養(yǎng)基的24孔板培養(yǎng)。在二次篩選中，相對(duì)檢查所述孔中上清的活性并且選擇活性較高的克隆。在80℃，pH4培養(yǎng)30分鐘來(lái)去選擇(deselect)熱穩(wěn)定性較低的變體后，檢查平板上所選克隆的剩余活性。選擇熱穩(wěn)定性較高的克隆并再次在24孔板培養(yǎng)來(lái)進(jìn)行半純化(semi-purification)。進(jìn)行半純化可通過將肌醇六磷酸酶結(jié)合到conA-sepharose4B(ConcanavalinA在Amershambioscience，Cat.No.17-0440-01的Sepharose4B膠基質(zhì)中)并用0.5M甲基-α-D-甘露吡喃糖苷(mannopyranoside)在PBS+0.1％tween20(PBS為8g/lNaCl，0.2g/lKCl，2.68g/lNa2HPO4-7H2O，0.24g/lKH2PO4(pH7.4)中洗脫；tween20可購(gòu)自Bio-Rad，Cat.no.170-6531)。然后在已經(jīng)調(diào)節(jié)所述活性到30FYT/ml后將所述半純化上清上樣到火箭免疫電泳分析中。在火箭免疫電泳中使用兔中產(chǎn)生的(raised)的多克隆抗-純化隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶抗體。選擇所述信號(hào)較小的克隆作為比活性較高的變體(所述火箭電泳(rocket)的面積與所述抗原的濃度成比例(所述肌醇六磷酸酶)，即面積越小，肌醇六磷酸酶蛋白質(zhì)越少，所述比活性越高)。改良的變體實(shí)施例見下表1-5所示。這些變體比所述隔孢伏革菌親代肌醇六磷酸酶顯示出更高的比活性和/或熱穩(wěn)定性更高。具體，所述變體就熱穩(wěn)定性而言，“60℃/37℃的比活性”，和/或“62℃/37℃的比活性”，和/或“65℃/37℃的比活性”，和/或“68℃/37℃的比活性”，和/或“70℃/37℃的比活性”，和/或“72℃/37℃的比活性”，和/或“74℃/37℃的比活性”等的值更高。(這些結(jié)果見表6-1和6-2所示)。由比活性篩選方法得到的選擇變體見下表6-3所示。所有這些變體都期望比表8中命名為“N”的所述變體具有甚至更高的比活性。在公開于WO97/35956的米曲霉IFO4177中表達(dá)選擇的變體并在培養(yǎng)基MDU-2Bp在25℃以220rpm培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。從發(fā)酵液(fermentationbroth)純化所述肌醇六磷酸酶變體并進(jìn)一步如實(shí)施例2所述用熱穩(wěn)定性和/或比活性來(lái)對(duì)它定性，顯示見表7-8。表1表2表3表4表5表6-1表6-2表6-3菌株和質(zhì)粒將大腸桿菌DH12S(得自GibcoBRL)用于酵母質(zhì)粒復(fù)蘇(rescue)。pTMPP2ver2為在TPI啟動(dòng)子控制下的釀酒酵母(S.cerevisiae)和大腸桿菌穿梭(shuttle)載體，從WO00/10038所述的pJC039構(gòu)建。將它用于文庫(kù)構(gòu)建，酵母表達(dá)，篩選和測(cè)序。釀酒酵母YNG318將MATaDpep4[cir+]ura3-52，leu2-D2，his4-539用于構(gòu)建酵母文庫(kù)并表達(dá)所述肌醇六磷酸酶變體。見J.Biol.Chem.272(15)，9720-9727，1997)所述。培養(yǎng)基和底物10×基礎(chǔ)溶液66.8g/l酵母氮基無(wú)(w/o)氨基酸(DIFCO)100g/l琥珀酸鹽60g/lNaOHSC-葡萄糖100ml/l20％葡萄糖(即2％的終濃度＝2g/100ml)4ml/l5％蘇氨酸10ml/l1％色氨酸25ml/l20％水解酪蛋白氨基酸(casamionoacid)100ml/l10×基礎(chǔ)溶液用孔徑0.20μm的濾膜滅菌上述溶液。瓊脂和水(大約761ml)在一起高壓滅菌，并且將分開滅菌的SC-葡萄糖溶液加入所述瓊脂溶液。YPD20g/lBacto蛋白胨10g/l酵母提取物100ml/l20％葡萄糖(分開滅菌)肌醇六磷酸鈉平板100ml/l1M醋酸鈉緩沖液(pH5.5)5g/l肌醇六磷酸鈉30g/l瓊脂PEG/LiAc溶液50ml40％PEG4000(通過高壓滅菌)1ml5M醋酸鋰(通過高壓滅菌)痕量金屬溶液FeSO4×7H2O13.90g/lMnSO4×5H2O13.60g/lZnCl26.80g/lCuSO4×5H2O2.50g/lNiCI2×6H2O0.24g/l枸櫞酸×H2O3.00g/lMDU-2Bp麥芽糖×H2O45g/l酵母提取物7g/μlMgSO4×7H2O1g/lNaCl1g/lK2SO42g/lKH2PO412g/l痕量金屬溶液0.5ml/l方法肌醇六磷酸酶活性，首次篩選在SC-葡萄糖平板涂布酵母文庫(kù)并在30℃孵育3天。用硝化濾膜通過使用紫色布將其復(fù)制到新的SC-葡萄糖平板。在30℃孵育所述平板1天(或20℃過周末)轉(zhuǎn)移所述濾膜到預(yù)熱的0.5％肌醇六磷酸鈉平板(pH5.5)上。在預(yù)設(shè)的(prescribed)溫度，例如53℃，過夜(O/N)孵育所述平板。移去所述濾膜并且倒入0.5MCaCl2溶液。發(fā)現(xiàn)邊界清楚的所述酵母克隆。從所述主(master)平板分離侯選克隆并接種到新的SC-葡萄糖平板，并且24孔板中1mlYPD培養(yǎng)基。二次篩選方法在24孔板在25℃以180rpm培養(yǎng)YPD培養(yǎng)基3天。離心所述平板/或僅放置它們1小時(shí)。將5μl和10μl上清加到肌醇六磷酸鈉平板。在37℃和53℃孵育所述平板過夜。檢測(cè)清楚的邊界的直徑。用在下面實(shí)施例2描述(設(shè)定的試驗(yàn)溫度)所述肌醇六磷酸酶試驗(yàn)，檢測(cè)那些在53℃保留活性的克隆的上清的溫度曲線。構(gòu)建酵母文庫(kù)的方法混合0.5μl載體(用EcoRl-Notl消化)和1μlPCR片段。在冰上解凍YNG318感受態(tài)細(xì)胞。在12ml聚丙烯試管(Falcon2059)混合100μl所述細(xì)胞，所述DNA混合物和10μl載體DNA(Clontech)。加入0.6mlPEG/LiAc溶液并輕柔地混合。在30℃并且200rpm孵育30分鐘。在42℃(熱休克(heatshock)孵育30分鐘)。轉(zhuǎn)移到離心(eppendorf)管并離心5秒。去除所述上清并在3mlYPD溶解。在30℃以200rpm孵育所述細(xì)胞懸液45分鐘。將所述懸液倒在SC-葡萄糖平板來(lái)得到約300克隆/平板。文庫(kù)構(gòu)建通過SOE方法構(gòu)建摻雜文庫(kù)(通過重疊(Overlap)延伸來(lái)剪切，見“PCRApracticalapproach”，p.207-209，OxfordUniversitypress，eds.McPherson，Quirke，Taylor)，之后是酵母重組。其他方法進(jìn)行構(gòu)建文庫(kù)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化并通過電穿孔(BIO-RADGenePulser)亞克隆。通過堿法(MolecularCloning，ColdSpringHarbor)或用所述Qiagen_質(zhì)粒試劑盒制備DNA質(zhì)粒。用Qiagen膠提取試劑盒從瓊脂糖凝膠回收DNA片段。通過PTC-200DNAEngine進(jìn)行PCR。用ABIPRISMTM310遺傳分析儀來(lái)確定所有DNA序列。用醋酸鋰方法進(jìn)行酵母轉(zhuǎn)化。如Nucleicacidsresearchvol.20，No.14(1992)3790所述用RobzykandKassir′s方法提取酵母總DNA。擴(kuò)增和測(cè)序的通常引物用下述引物制作通過所述SOE方法含任何突變片段的DNA片段，或只擴(kuò)增總肌醇六磷酸酶基因。SEQIDNO3620AM34GAGTACTATCTTGCATTTGTACTAGGAGTTTAGTGAACTTGCSEQIDNO4680AM35ATGGTTATGGATTTCGGGGATTCTTCGAGCGTCCCAAAACCSEQIDNO5AM34TAGGAGTTTAGTGAACTTGCSEQIDNO6AM35TTCGAGCGTCCCAAAACCSEQIDNO7620GAGTACTATCTTGCATTTGTACSEQIDNO8680ATGGTTATGGATTTCGGGGAT構(gòu)建摻雜文庫(kù)的引物實(shí)施例區(qū)域229-236與現(xiàn)有實(shí)踐一致，在下面pecified的核苷酸序列中，使用特定的核苷酸編碼。從例如，http//www.cs.pitt.edu/-vanathi/na.html)可清楚得到這些。例如K指G或T；Y指C或T；R指A或G；并且N指A，C，G或T。T229VNN核苷酸L230INMKR氨基酸S231TVN氨基酸S232VNN核苷酸G233VNN核苷酸N234VNN核苷酸A235VNN核苷酸S236AMK氨基酸或只是A(難以得到M和K)L2301NMKR的核苷酸分布在區(qū)域T229-S236靶向下述引物SEQIDNO9摻雜1(62mer)GATATGTGCCCGTTCGAC12K(11)(12)(13)(14)(15)T42K33K11532K5CCCCCTTCTGTGACCTATTTACSEQIDNO10摻雜1R(18mer)GTCGAACGGGCACATATC1A91G3T3C32C91G3A3T33G91C3A3T34T91G3A3C35T95G511C88A1212T90G3A713G47A8T4514G9A9115G83A4T9C4構(gòu)建摻入寡改組文庫(kù)的引物SEQIDNO11L102TI(43mer)AGTTCGGCGTCGCCGATCTGAYCCCGTTCGGGGCTAACCAATCSEQIDNO12VE248+251X(53mer)TATTTACCGCGGAGGAGTATVNNTCGTACVNNTACTACTATGACCTCGACAAGSEQIDNO13V271AI(45mer)CCGGGAACGCTCTCGGTCCTRYCCAGGGCGTCGGATACGTCAATGSEQIDNO14G286X(42mer)ATGAGCTGCTTGCACGCTTGACCVNNCAAGCCGTTCGAGACG通過摻雜構(gòu)建肌醇六磷酸酶變體用下述PCR反應(yīng)系統(tǒng)和條件，用2個(gè)引物對(duì)，620AM34及摻雜1R，和摻雜1和上述核苷酸混合物及680AM35進(jìn)行第一個(gè)PCR反應(yīng)用膠純化所得片段并用作所述模板進(jìn)行第二個(gè)PCR反應(yīng)。用620和680作為引物用下述PCR反應(yīng)系統(tǒng)和條件進(jìn)行第二個(gè)PCR摻入寡改組文庫(kù)如下構(gòu)建摻入文庫(kù)用KlenTaq聚合酶及如上述AM34和AM35作為引物進(jìn)行制備所述變體基因片段的PCR反應(yīng)，并膠純化所述片段。將約10μgDNA/250μl與0.8μlDNasel(GibcoBRL18068-015)及30μl10×緩沖液在25℃孵育7-10min。終加入濃度10mM的EDTA來(lái)終止所述反應(yīng)。用Whatman玻璃濾膜純化正確大小的DNA片段(50-150bp)。然后用下述PCR反應(yīng)系統(tǒng)和條件重新裝配所述DNase處理的片段用上述PCR混合物作為模板，用下述PCR反應(yīng)系統(tǒng)和條件進(jìn)行第二個(gè)PCR反應(yīng)實(shí)施例2肌醇六磷酸酶變體的純化和定性純化肌醇六磷酸酶變體其數(shù)個(gè)表達(dá)變體選自上表1-5的Asperillusoryzae的發(fā)酵物培養(yǎng)肉湯(用大寫字母A-M命名)，先用一系列Millipore的GF-濾膜然后用0.45μmHA-濾膜(Millipore)過濾。然后將硫酸銨(AMS)以濃度1.35M加入濾過液，并調(diào)節(jié)pH到pH6。再次濾過所述標(biāo)本(如上0.45μmHA-濾膜)并將其上樣到70ml(體積取決于上樣)在1.35MAMS，20mM琥珀酸鹽，pH6平衡的苯基(Phenyl)瓊脂糖凝膠(Sepharose)柱(XK26，Pharmacia)。用1.35MAMS，20mM琥珀酸鹽，pH6洗滌所述柱后，以線性梯度1.35-0MAMS在20mM琥珀酸鹽，pH6用10個(gè)柱體積洗脫所述肌醇六磷酸酶。將流速設(shè)定在6ml/min并收集10ml級(jí)分(fraction)。匯集含活性并足夠純(通過SDS-PAGE評(píng)估)的級(jí)分并用50mM醋酸鈉，pH5.5過夜透析。然后向所述含肌醇六磷酸酶的匯集物加入20mMTris-醋酸(aceticacid)，pH7.5并在用20mMTris-醋酸，pH7.5平衡的8mlMonoQ或較大Q-瓊脂糖凝膠柱(Pharmacia)中用陰離子交換層析處理。以線性梯度0-0.5MNaCl在20mMTris-醋酸，pH7.5用10個(gè)柱體積洗脫所述肌醇六磷酸酶。根據(jù)柱子刻度調(diào)節(jié)流出速率和級(jí)分大小。匯集含肌醇六磷酸酶活性并且純度足夠的級(jí)分并在用50mM醋酸鈉，pH5.5透析前在AmiconYM10膜上濃縮。SDS-PAGE用Novex4-20Tris-甘氨酸根據(jù)生產(chǎn)商說明進(jìn)行SDS-PAGE。從A.oryzae純化的所述肌醇六磷酸酶變體的分子量，MW，與大約25％碳水化合物(carbohydrate)相對(duì)應(yīng)大約65kDa。肌醇六磷酸酶活性試驗(yàn)，pH和溫度曲線，溫度穩(wěn)定性檢測(cè)將10μl稀釋的酶標(biāo)本(在0.1M醋酸鈉，0.01％Tween20，pH5.5稀釋)加入0.1M醋酸鈉，0.01％Tween20，pH5.5(在溶解所述肌醇六磷酸鈉后調(diào)節(jié)pH；預(yù)熱所述底物)中的250μl5mM肌醇六磷酸鈉(Sigma)并在37℃孵育30分鐘。加入250μl10％TCA來(lái)終止所述反應(yīng)并通過加入500μl100mlmolybdat試劑中的7.3gFeSO4(將8mlH2SO4中2.5g(NH4)6Mo7O24.4H2O稀釋到250ml)來(lái)測(cè)量游離(free)磷酸鹽。測(cè)量96孔微滴板中200μl標(biāo)本的750nm吸光度。包括底物和酶空白。也包括磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線(0-2mM磷酸鹽)。1FYT等于在已知條件釋放1μmol磷酸鹽/min的酶量。通過在50mM數(shù)個(gè)pH值pH3(甘氨酸-HCl)，pH4-5.5(醋酸鈉)，pH6(MES)，pH7-8(Tris-HCl)的緩沖液進(jìn)行上述試驗(yàn)來(lái)獲得所述pH-曲線。在不同溫度(預(yù)熱所述底物)進(jìn)行所述試驗(yàn)獲得溫度曲線?？赏ㄟ^在測(cè)量所述殘基活性前，在0.1M磷酸鈉，pH5.5在不同溫度預(yù)孵育肌醇六磷酸酶來(lái)調(diào)查溫度穩(wěn)定性。所述純化的變體與所述P.lycii親代肌醇六磷酸酶所顯示的pH-曲線(所有均具有在pH4-5左右的最適pH)相近。差示掃描量熱法(DSC)在不同pH值用MicroCal.的VP-DSC進(jìn)行DSC。從20-90℃以恒定掃描速率1.5℃/min進(jìn)行掃描。在進(jìn)行DSC之前，用在適當(dāng)緩沖液(例如0.1M甘氨酸-HCl，pH2.5或3.0；0.1M醋酸鈉，pH5.5；0.1MTris-HCl，pH7.0)中平衡的NAP-5柱(Pharmacia)脫鹽所述肌醇六磷酸酶。用MicroCalOrigin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。所得溶解溫度，Tm′s，見下表7所示。所述變體的熱穩(wěn)定性比所述隔孢伏革菌親代肌醇六磷酸酶顯著提高。所述熱穩(wěn)定性顯示為pH依賴性的。表7實(shí)施例3比活性用在20mM乙酸鈉，pH5.5透析的高純度標(biāo)本測(cè)定選自表1-5(在此命名為N，O和P)變體的比活性。事前在SDS聚丙烯酰胺凝膠上檢測(cè)所述純度，顯示只存在一種成分。通過如下氨基酸分析測(cè)定所述蛋白質(zhì)濃度110℃在6NHCl，0.1％苯酚中在抽空(evacuated)的玻璃管中水解一等份(aliquot)樣品16小時(shí)。用AppliedBiosystems420A氨基酸分析系統(tǒng)根據(jù)制造商說明定量所得氨基酸。從所述氨基酸的總量總質(zhì)量(mass)-并從而也可計(jì)算出在在水解等份中的蛋白質(zhì)濃度。以單位FYT測(cè)定所述肌醇六磷酸酶活性，并用每mg肌醇六磷酸酶變體酶蛋白質(zhì)以單位FYT測(cè)定的肌醇六磷酸酶活性來(lái)計(jì)算比活性。所述結(jié)果見下表8所示。所述具體比活性數(shù)值是相對(duì)于設(shè)定為100％的所述隔孢伏革菌親代肌醇六磷酸酶的比活性。表8實(shí)施例4包含肌醇六磷酸酶變體的動(dòng)物飼料和動(dòng)物飼料添加劑動(dòng)物飼料添加劑將10g1938號(hào)肌醇六磷酸酶變體(以肌醇六磷酸酶酶蛋白質(zhì)計(jì)算)加入下述預(yù)混合物(premix)(每千克預(yù)混合物)5000000IE維生素A1000000IE維生素D313333mg維生素E1000mg維生素K3750mg維生素B12500mg維生素B21500mg維生素B67666mcg維生素B1212333mg煙酸(Niacin)33333mcg生物素/維生素H300mg葉酸3000mgCa-D-Panthothenate1666mg銅16666mg鐵16666mg鋅23333mg錳133mg鈷66mg碘66mg硒5.8％鈣25％鈉動(dòng)物飼料這是動(dòng)物飼料的實(shí)施例，其包含0.03g/kg(30ppm)的肌醇六磷酸酶變體E(以肌醇六磷酸酶酶蛋白質(zhì)計(jì)算)74.0％小麥20.7％烤豆(roastedsoy)蛋糕5.0％豆油0.3％上述預(yù)混合物?；旌纤龀煞郑⑶以谒铚囟?，例如65，75，80，或甚至85℃將所述飼料制成藥丸。本文公開的具體實(shí)施方案不會(huì)從范圍上限制在此描述和權(quán)利要求的發(fā)明，因?yàn)檫@些實(shí)施方案是為了闡述本發(fā)明的各個(gè)方面。任何等同實(shí)施方案都應(yīng)在本發(fā)明范圍。事實(shí)上，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員，從前述說明書得到在那些本文所示和描述之外的本發(fā)明的多種改進(jìn)是顯而易見的。這些改進(jìn)也應(yīng)落入追加的(appended)權(quán)利要求的范圍。如有沖突，以本文公開包括限定為準(zhǔn)。本文引用多個(gè)參照，全文引入其公開作為參考。序列表<110>諾維信公司(NovozymesA/S)<120>肌醇六磷酸酶變體<130>10261<160>14<170>PatentInversion3.2<210>1<211>1320<212>DNA<213>Peniophoralycii<220><221>sig_peptide<222>(1)..(48)<220><221>CDS<222>(49)..(1320)<400>1atggtttcttcggcattcgcaccttccatcctacttagcttgatgtcgagtcttgct57SerLeuAla1ttgagcacgcagttcagctttgttgcggcgcagctacctatccccgca105LeuSerThrGlnPheSerPheValAlaAlaGlnLeuProIleProAla51015caaaacacaagtaattgggggccttacgatcccttctttcccgtcgaa153GlnAsnThrSerAsnTrpGlyProTyrAspProPhePheProValGlu20253035ccgtatgcagctccgccggaagggtgcacagtgacacaggtcaacctg201ProTyrAlaAlaProProGluGlyCysThrValThrGlnValAsnLeu404550attcagaggcacggcgcgcgttggcccacatccggcgcgcggtcgcgg249IleGlnArgHisGlyAlaArgTrpProThrSerGlyAlaArgSerArg556065caggtcgccgccgtagcgaagatacaaatggcgcgaccattcacggat297GlnValAlaAlaValAlaLysIleGlnMetAlaArgProPheThrAsp707580cccaagtatgagttcctcaacgacttcgtgtacaagttcggcgtcgcc345ProLysTyrGluPheLeuAsnAspPheValTyrLysPheGlyValAla859095gatctgctaccgttcggggctaaccaatcgcaccaaaccggcaccgat393AspLeuLeuProPheGlyAlaAsnGlnSerHisGlnThrGlyThrAsp100105110115atgtatacgcgctacagtacactatttgagggcggggatgtacccttt441MetTyrThrArgTyrSerThrLeuPheGluGlyGlyAspValProPhe120125130gtgcgcgcggctggtgaccaacgcgtcgttgactcctcgacgaactgg489ValArgAlaAlaGlyAspGlnArgValValAspSerSerThrAsnTrp135140145acggcaggctttggcgatgcttctggcgagactgttctcccgacgctc537ThrAlaGlyPheGlyAspAlaSerGlyGluThrValLeuProThrLeu150155160caggttgtgcttcaagaagaggggaactgcacgctctgcaataatatg585GlnValValLeuGlnGluGluGlyAsnCysThrLeuCysAsnAsnMet165170175tgcccgaatgaagtggatggtgacgaatccacaacgtggctgggggtc633CysProAsnGluValAspGlyAspGluSerThrThrTrpLeuGlyVal180185190195tttgcgccgaacatcaccgcgcgattgaacgctgctgcgccgagtgcc681PheAlaProAsnIleThrAlaArgLeuAsnAlaAlaAlaProSerAla200205210aacctctcagacagcgacgcgctcactctcatggatatgtgcccgttc729AsnLeuSerAspSerAspAlaLeuThrLeuMetAspMetCysProPhe215220225gacactctcagctccgggaacgccagccccttctgtgacctatttacc777AspThrLeuSerSerGlyAsnAlaSerProPheCysAspLeuPheThr230235240gcggaggagtatgtgtcgtacgagtactactatgacctcgacaagtac825AlaGluGluTyrValSerTyrGluTyrTyrTyrAspLeuAspLysTyr245250255tatggcacgggccccgggaacgctctcggtcctgtccagggcgtcgga873TyrGlyThrGlyProGlyAsnAlaLeuGlyProValGlnGlyValGly260265270275tacgtcaatgagctgcttgcacgcttgaccggccaagccgttcgagac921TyrValAsnGluLeuLeuAlaArgLeuThrGlyGlnAlaValArgAsp280285290gagacgcagacgaaccgcacgctcgacagcgaccctgcaacattcccg969GluThrGlnThrAsnArgThrLeuAspSerAspProAlaThrPhePro295300305ctgaaccgtacgttctacgccgacttctcgcatgataacaccatggtg1017LeuAsnArgThrPheTyrAlaAspPheSerHisAspAsnThrMetVal310315320cccatctttgcggcgctcgggctcttcaacgccaccgccctcgacccg1065ProIlePheAlaAlaLeuGlyLeuPheAsnAlaThrAlaLeuAspPro325330335ctgaagcccgacgagaacaggttgtgggtggactctaagctggtaccg1113LeuLysProAspGluAsnArgLeuTrpValAspSerLysLeuValPro340345350355ttctctggacatatgacggtcgagaagctggcatgttctgggaaggag1161PheSerGlyHisMetThrValGluLysLeuAlaCysSerGlyLysGlu360365370gcggtcagggtgctcgtgaacgacgcggtgcagccgctggagttctgc1209AlaValArgValLeuValAsnAspAlaValGlnProLeuGluPheCys375380385ggaggtgttgatggggtgtgcgagctttcggctttcgtagagagccag1257GlyGlyValAspGlyValCysGluLeuSerAlaPheValGluSerGln390395400acgtatgcgcgggagaatgggcaaggcgacttcgccaagtgcggcttt1305ThrTyrAlaArgGluAsnGlyGlnGlyAspPheAlaLysCysGlyPhe405410415gttccgtcggaatag1320ValProSerGlu420<210>2<211>423<212>PRT<213>Peniophoralycii<400>2SerLeuAlaLeuSerThrGlnPheSerPheValAlaAlaGlnLeuPro151015IleProAlaGlnAsnThrSerAsnTrpGlyProTyrAspProPhePhe202530ProValGluProTyrAlaAlaProProGluGlyCysThrValThrGln354045ValAsnLeuIleGlnArgHisGlyAlaArgTrpProThrSerGlyAla505560ArgSerArgGlnValAlaAlaValAlaLysIleGlnMetAlaArgPro65707580PheThrAspProLysTyrGluPheLeuAsnAspPheValTyrLysPhe859095GlyValAlaAspLeuLeuProPheGlyAlaAsnGlnSerHisGlnThr100105110GlyThrAspMetTyrThrArgTyrSerThrLeuPheGluGlyGlyAsp115120125ValProPheValArgAlaAlaGlyAspGlnArgValValAspSerSer130135140ThrAsnTrpThrAlaGlyPheGlyAspAlaSerGlyGluThrValLeu145150155160ProThrLeuGlnValValLeuGlnGluGluGlyAsnCysThrLeuCys165170175AsnAsnMetCysProAsnGluValAspGlyAspGluSerThrThrTrp180185190LeuGlyValPheAlaProAsnIleThrAlaArgLeuAsnAlaAlaAla195200205ProSerAlaAsnLeuSerAspSerAspAlaLeuThrLeuMetAspMet210215220CysProPheAspThrLeuSerSerGlyAsnAlaSerProPheCysAsp225230235240LeuPheThrAlaGluGluTyrValSerTyrGluTyrTyrTyrAspLeu245250255AspLysTyrTyrGlyThrGlyProGlyAsnAlaLeuGlyProValGln260265270GlyValGlyTyrValAsnGluLeuLeuAlaArgLeuThrGlyGlnAla275280285ValArgAspGluThrGlnThrAsnArgThrLeuAspSerAspProAla290295300ThrPheProLeuAsnArgThrPheTyrAlaAspPheSerHisAspAsn305310315320ThrMetValProIlePheAlaAlaLeuGlyLeuPheAsnAlaThrAla325330335LeuAspProLeuLysProAspGluAsnArgLeuTrpValAspSerLys340345350LeuValProPheSerGlyHisMetThrValGluLysLeuAlaCysSer355360365GlyLysGluAlaValArgValLeuValAsnAspAlaValGlnProLeu370375380GluPheCysGlyGlyValAspGlyValCysGluLeuSerAlaPheVal385390395400GluSerGlnThrTyrAlaArgGluAsnGlyGlnGlyAspPheAlaLys405410415CysGlyPheValProSerGlu420<210>3<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物620AM34<220><221>misc_feature<223>引物<400>3gagtactatcttgcatttgtactaggagtttagtgaacttgc42<210>4<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物680AM35<220><221>misc_feature<223>引物<400>4atggttatggatttcggggattcttcgagcgtcccaaaacc41<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物AM34<220><221>misc_feature<223>引物<400>5taggagtttagtgaacttgc20<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物AM35<220><221>misc_feature<223>引物<400>6ttcgagcgtcccaaaacc18<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物620<220><221>misc_feature<223>引物<400>7gagtactatcttgcatttgtac22<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物680<220><221>misc_feature<223>引物<400>8atggttatggatttcggggat21<210>9<211>62<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物Dope1<220><221>misc_feature<222>(19)..(19)<223>N在位點(diǎn)19是91％A，3％G，3％T，3％C<220><221>misc_feature<222>(20)..(20)<223>N在位點(diǎn)20是91％C，3％G，3％A，3％T<220><221>misc_feature<222>(21)..(21)<223>N在位點(diǎn)21是G或T<220><221>misc_feature<222>(22)..(22)<223>N在位點(diǎn)is88％C，12％A<220><221>misc_feature<222>(23)..(23)<223>N在位點(diǎn)23是90％T，3％G，7％A<220><221>misc_feature<222>(24)..(24)<223>N在位點(diǎn)24是47％G，8％A，45％T<220><221>misc_feature<222>(25)..(25)<223>N在位點(diǎn)25是9％G，91％A<220><221>misc_feature<222>(26)..(26)<223>N在位點(diǎn)26是83％G，4％A，9％T，4％C<220><221>misc_feature<222>(27)..(27)<223>N在位點(diǎn)27是T<220><221>misc_feature<222>(28)..(28)<223>N在位點(diǎn)28是91％T，3％G，3％A，3％C<220><221>misc_feature<222>(29)..(29)<223>N在位點(diǎn)29是91％C，3％G，3％A，3％T<220><221>misc_feature<222>(30)..(30)<223>N在位點(diǎn)30是G或T<220><221>misc_feature<222>(31)..(31)<223>N在位點(diǎn)31是91％G，3％C，3％A，3％T<220><221>misc_feature<222>(32)..(32)<223>N在位點(diǎn)32是91％G，3％C，3％A，3％T-<220><221>misc_feature<222>(33)..(33)<223>N在位點(diǎn)33是G或T<220><221>misc_feature<222>(34)..(34)<223>N在位點(diǎn)34是91％A，3％G，3％T，3％C<220><221>misc_feature<222>(35)..(35)<223>N在位點(diǎn)35是91％A，3％G，3％T，3％C<220><221>misc_feature<222>(36)..(36)<223>N在位點(diǎn)36是95％T，5％G<220><221>misc_feature<222>(37)..(37)<223>N在位點(diǎn)37是91％G，3％C，3％A，3％T<220><221>misc_feature<222>(38)..(38)<223>N在位點(diǎn)38是91％C，3％G，3％A，3％T<220><221>misc_feature<222>(39)..(39)<223>N在位點(diǎn)39是G或T<220><221>misc_feature<222>(40)..(40)<223>N在位點(diǎn)40是95％T，5％G<400>9gatatgtgcccgttcgacnnnnnnnntnnnnnnnnnnnnncccccttctgtgacctattt60ac62<210>10<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物Dope1R<220><221>misc_feature<223>引物<400>10gtcgaacgggcacatatc18<210>11<211>43<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物L(fēng)102TI<220><221>misc_feature<222>(22)..(22)<223>N在位點(diǎn)22是C或T<400>11agttcggcgtcgccgatctgancccgttcggggctaaccaatc43<210>12<211>53<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物VE248+251X<220><221>misc_feature<222>(21)..(21)<223>N在位點(diǎn)21是A或C或G<220><221>misc_feature<222>(22)..(22)<223>N在位點(diǎn)22是A或C或G或T<220><221>misc_feature<222>(23)..(23)<223>N在位點(diǎn)23是A或C或G或T<220><221>misc_feature<222>(30)..(30)<223>N在位點(diǎn)30是A或C或G<220><221>misc_feature<222>(31)..(31)<223>N在位點(diǎn)31是A或C或G或T<220><221>misc_feature<222>(32)..(32)<223>N在位點(diǎn)32是A或C或G或T<400>12tatttaccgcggaggagtatnnntcgtacnnntactactatgacctcgacaag53<210>13<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物V271AI<220><221>misc_feature<222>(21)..(21)<223>N在位點(diǎn)21是A或G<220><221>misc_feature<222>(22)..(22)<223>N在位點(diǎn)22是C或T<400>13ccgggaacgctctcggtcctnnccagggcgtcggatacgtcaatg45<210>14<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物G286X<220><221>misc_feature<222>(24)..(24)<223>N在位點(diǎn)24是A或C或G<220><221>misc_feature<222>(25)..(26)<223>N在位點(diǎn)25和26獨(dú)立地是A或C或G或T<400>14atgagctgcttgcacgcttgaccnnncaagccgttcgagacg4權(quán)利要求1.親代肌醇六磷酸酶的變體，包含選自如下區(qū)域的至少一個(gè)區(qū)域的至少一個(gè)位置的取代20；26；28-31；37-48；55-69；73-83；91-119；123-126；135-142；152-163；169-199；204-222；229-238；248-266；284-289；300-308；321-335；343-350；384-398；407-412；和419-430；其中(a)所述變體具有肌醇六磷酸酶活性；和(b)每個(gè)位置對(duì)應(yīng)于SEQIDNO2的位置；和(c)所述變體與SEQIDNO2具有至少75％的百分比同一性；和(d)附帶條件是所述變體不是選自如下的PeniophoralyciiCBS686.96肌醇六磷酸酶的變體G26S；Y28N；D29S；F31Y；E42D，K，A；T45R；V46I；W59F；S62D；A64K；R65Q，E，G，A；S66T；R67A，I，Q，K；Q68Y，V，1；K74R，A；A99N；D100S；L102V；P103E；F104L；N107Y，Q；S109M；H110S，V；Q111E，N；T112A，S；M116F，I，L；A135S；D137Y；Q138D，S，G；D142A；()154fH；S155N；G156P；E157Q，S；E169S；E170A，P；G171A；()171aS；T174P，A；N177S；N178S，T；M179T，V，L；N182A，V；V184G；D185E；()185eT；G186S，A；D187R，K，S；()187aV，T；E188Q，S，A，V；S189E；V195L；N199A，P；L204N；A207D，H；S216T；D217E；L219Y，T；T220Y，N；L221F；M222L；L230V；()235eE，Q；V248R，I；S249Q，A；E251D；Y254A，L，G；D255N；D257K；Y259F；T262H；P264A；G286R，H；Q287K，S；A288P；T321Q，S，G；M322I；V323I；P324A；A327S，F(xiàn)，I，L；F332Y；N333P；E344R；R346P；W348F；V349L，A，S；D350S，V；G388A；V393R；E395K，T；和L396R。2.權(quán)利要求1的變體，其含有的取代或取代的組合選自下述取代和取代的組合(i)20R+95R+97V+98G；(ii)29N+102I；(iii)29N+118A；(iv)29N+163P+324S；(v)29N+163P+324S+395G；(vi)29N+234S；(vii)29N+324S；(viii)29S；(ix)29S+45A+69A+99D+110Y+125D+324A+334E+344S+350V；(x)29S+63N+125D+183K+218T+324A+334E+350V+421S；(xi)29S+95H+110W+183W+324A+350V；(xii)29S+95M+110W+183W+324A+350V；(xiii)29S+95N+110R+183W+324A+350V；(xiv)29S+95R+110W+183W+324A+350V；(xv)29S+95S+110R+183W+324A+350V；(xvi)29S+95S+110W+183W+324A+350V；(xvii)29S+95T+110R+183W+324A+350V；(xviii)29S+95T+110Y+125D+183W+286S+324A+350V；(xix)29S+95T+110Y+152A+156C+157Q+160R+183W+324A+350V；(xx)29S+95T+110Y+156R+157Q+183W+324A+350V；(xxi)29S+95T+110Y+157K+183W+185H+187R+190S+191R+248G+324A+350V；(xxii)29S+95T+110Y+183W+185A+248A+324A+350V；(xxiii)29S+95T+110Y+183W+185A+248C+324A+350V；(xxiv)29S+95T+110Y+183W+185A+248E+324A+350V；(xxv)29S+95T+110Y+183W+185A+248H+324A+350V；(xxvi)29S+95T+110Y+183W+185E+248S+324A+350V；(xxvii)29S+95T+110Y+183W+185H+248G+321A+323A+324A+350V；(xxviii)29S+95T+110Y+183W+185H+248G+324A+350V；(xxix)29S+95T+110Y+183W+185H+187S+190K+191S+210G+222I+248G+324A+350V；(xxx)29S+95T+110Y+183W+185K+248G+324A+349K+350L；(xxxi)29S+95T+110Y+183W+185K+248S+324A+350V；(xxxii)29S+95T+110Y+183W+185K+248T+324A+349A+350L；(xxxiii)29S+95T+110Y+183W+185K+248T+324A+349L+350I；(xxxiv)29S+95T+110Y+183W+185K+248T+324A+349L+350M；(xxxv)29S+95T+110Y+183W+185K+248T+324A+350V；(xxxvi)29S+95T+110Y+183W+185P+248G+324A+350V；(xxxvii)29S+95T+110Y+183W+185P+248S+324A+350V；(xxxviii)29S+95T+110Y+183W+191L+324A+350V；(xxxix)29S+95T+110Y+183W+248D+324A+350V；(xl)29S+95T+110Y+183W+324A；(xli)29S+95T+110Y+183W+324A+350V；(xlii)29S+99D+125D+324A+334E+350V；(xliii)29S+110Y+183W+185N+324A+350V；(xliv)29S+125D+218T+324A+344S+350V；(xlv)29S+125D+234K+324A+330R；(xlvi)29S+125D+234K+324A+330R+395G；(xlvii)29S+125D+324A；(xlviii)29S+125D+324A+330R+395G；(xlix)29S+125D+324A+350V；(l)29S+183A+324A+350V；(li)29S+183G+324A+334E+344S+350V；(lii)29S+183W+324A+350V；(liii)29S+205S；(liv)29S+324A+350V；(Iv)29T+324L；(Ivi)45A+350V+421R+422R+423N+424S+425L+426E+427G+428R+429I+430M；(Ivii)69A+334E；(Iviii)99D+398T；(lix)114A+187G+194R+324S；(Ix)218T+334G；(Ixi)323A+324S；(Ixii)324S；(Ixiii)324S+328T；(Ixiv)324S+345D+347Q；(Ixv)324S+395G；(Ixvi)330R；(Ixvii)334D+343N+344V；(Ixviii)334E+344A；(Ixix)345H+347P+350V；和(Ixx)350V。3.分離的核酸序列，其包含編碼權(quán)利要求1-2任一變體的核酸序列。4.核酸構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求3的核酸序列，其可操縱連接到一或多個(gè)指導(dǎo)在適宜表達(dá)宿主生產(chǎn)所述多肽的可控序列。5.重組表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求4的核酸構(gòu)建體。6.重組宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求4的核酸構(gòu)建體和/或權(quán)利要求5的表達(dá)載體。7.生產(chǎn)權(quán)利要求1-2任一的變體的方法，其包含(a)培養(yǎng)權(quán)利要求6的宿主細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)包含所述變體的上清；和(b)回收所述變體。8.轉(zhuǎn)基因植物，或植物部分，其能表達(dá)權(quán)利要求1-2任一的肌醇六磷酸酶變體。9.轉(zhuǎn)基因，非人動(dòng)物，或產(chǎn)物，或其元件，其能表達(dá)權(quán)利要求1-2任一的肌醇六磷酸酶變體。10.包含權(quán)利要求1-2任一的至少一個(gè)肌醇六磷酸酶變體的組合物，和(a)至少一種脂肪可溶維生素；(b)至少一種水溶維生素；和/或(c)至少一種痕量礦物質(zhì)。11.權(quán)利要求10的組合物，其還包含至少一個(gè)選自下述酶的酶木聚糖酶，葡聚糖內(nèi)切酶，內(nèi)切-1，3(4)-β葡聚糖酶，和蛋白酶。12.權(quán)利要求10-11任一的組合物，其為動(dòng)物飼料添加劑。13.動(dòng)物飼料組合物，其粗制蛋白質(zhì)含量為50-800g/kg，并包含權(quán)利要求1-2任一的變體或權(quán)利要求10-12任一的組合物。14.提高動(dòng)物飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的方法，其中將權(quán)利要求1-2任一的變體或權(quán)利要求10-12任一的組合物加到所述飼料。15.降低動(dòng)物糞便中肌醇六磷酸鹽水平的方法，包含喂給動(dòng)物有效量的權(quán)利要求13的飼料。16.處理植物蛋白質(zhì)的方法，包含將權(quán)利要求1-2任一的變體或權(quán)利要求10-12任一的組合物加到至少一個(gè)植物蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)源的步驟。17.權(quán)利要求1-2任一的變體或權(quán)利要求10-12任一的組合物在如下的用途在動(dòng)物飼料中；在動(dòng)物飼料制備中；為提高動(dòng)物飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值；降低動(dòng)物糞便中肌醇六磷酸鹽水平；處理植物蛋白質(zhì)；或從肌醇六磷酸酶底物釋放磷。全文摘要本發(fā)明涉及的肌醇六磷酸酶變體來(lái)自與Peniophoralycii肌醇六磷酸酶同源的親代肌醇六磷酸酶，并包括在對(duì)應(yīng)于Peniophoralycii肌醇六磷酸酶位置的數(shù)個(gè)位置中的至少一個(gè)上的至少一個(gè)取代。所述變體的性質(zhì)改進(jìn)，具體為比活性和/或熱穩(wěn)定性比親代肌醇六磷酸酶高，例如通過DSC測(cè)定，在pH5.5Tm最多為82℃，和/或雙倍比活性。本發(fā)明也涉及編碼所述肌醇六磷酸酶變體的DNA，它們的生產(chǎn)方法，及其，例如在動(dòng)物飼料和動(dòng)物飼料添加劑中的用途。文檔編號(hào)A01H5/00GK1630719SQ03803578公開日2005年6月22日申請(qǐng)日期2003年2月4日優(yōu)先權(quán)日2002年2月8日發(fā)明者松井知子,克勞斯·C·富格爾桑,阿倫·斯文德森,福山志朗申請(qǐng)人:諾維信公司