專利名稱：：克隆來自煙草的細(xì)胞色素p450基因的制作方法克隆來自煙草的細(xì)胞色素P450基因本發(fā)明涉及煙草(Nicotiana)植物中編碼細(xì)胞色素P450酶(下文中稱為P450和P450酶)的核酸序列以及使用這些核酸序列來改變植物表型的方法。背景細(xì)胞色素P450催化多范圍的化學(xué)上不同底物的酶反應(yīng)，包括內(nèi)源和生物異源底物的氧化、過氧化和還原代謝。在植物中，P450參與的生化途徑包括植物產(chǎn)物合成，如類苯丙醇(phenylpr叩anoid)、生物堿、類萜、脂類、生氰糖苷和硫配糖體(glycosinolate)(Chappel，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.198，49:311-343)。細(xì)胞色素P450也稱為P450-硫醇血紅素蛋白，通常作為多成分電子轉(zhuǎn)移鏈中的末端氧化酶，此轉(zhuǎn)移鏈稱為含P450的單加氧酶系統(tǒng)。特異催化反應(yīng)包括脫甲基、羥基化、環(huán)氧化、N-氧化、磺氧化、N-、S-和0-脫烷基、脫硫、脫氨基以及氮、硝基和N-氧化基團(tuán)的還原。煙草植物P450酶的不同作用包括影響多種植物代謝物如類苯丙醇、生物堿、類萜、脂類、氰糖苷、硫配糖體和其它化學(xué)實體的宿主。近幾年中，顯然一些P450酶可影響植物的植物代謝物組成。例如，長期以來需要改進(jìn)某些植物的風(fēng)味和香味，這是通過育種改變其所選脂肪酸的分布；然而對于參與控制這些葉組成水平的機制所知甚少。下調(diào)與脂肪酸修飾相關(guān)的P450酶可促進(jìn)所需脂肪酸的積聚，所需脂肪酸提供更優(yōu)選的葉表型品質(zhì)。P450酶的功能和它們在植物組成中的廣泛作用仍有待發(fā)現(xiàn)。例如，發(fā)現(xiàn)一類特殊P450酶催化脂肪酸分解成不穩(wěn)定的C6-和C9-醛和-醇，它們是水果和植物"清新(freshgreen)"氣味的主要貢獻(xiàn)者。可改變其它新靶向的P450水平以提高葉組成的性質(zhì)，這是通過修飾煙草葉中的脂類組合物和相關(guān)分解代謝物。一些這類葉組成受衰老影響，衰老刺激葉品質(zhì)性質(zhì)的成熟。其它報導(dǎo)顯示P450酶在改變脂肪酸中發(fā)揮功能性作用，這些脂肪酸參與植物-病原體相互作用和疾病抗性。在其它例子中，暗示P450酶參與生物堿的生物合成。降煙堿是煙草(7Wco"朋s"力3CW/7)中發(fā)現(xiàn)的次要生物堿。假定其生成是通過P450調(diào)節(jié)的煙堿脫甲基，接著在N位置?；蛠喯趸?，從而產(chǎn)生一系列N-?；禑焿A(acylnonicotine)和N-亞硝基降煙堿。認(rèn)為由推斷的P450脫甲基酶催化的N-脫甲基是煙草中降煙堿生物合成的主要來源。認(rèn)為酶是微粒體的，因此迄今為止沒有成功純化煙堿脫甲基酶，也沒有分離參與的基因。此外，假設(shè)但沒有證明P450酶的活性受遺傳控制并也受環(huán)境因素的強烈影響。例如，當(dāng)植物到達(dá)成熟階段時，認(rèn)為煙草中煙堿的脫甲基顯著增加。另外，認(rèn)為脫甲基酶基因包含轉(zhuǎn)座因子，轉(zhuǎn)座因子存在時可抑制RNA翻譯。在本發(fā)明前，P450酶的多樣性、它們不同的結(jié)構(gòu)和功能使煙草P450酶的研究很困難。此外，克隆P450酶至少部分受到阻礙，因為這些膜定位的蛋白質(zhì)一般存在豐度低且通常對于純化不穩(wěn)定。因此，需要鑒定植物中的P450酶和與這些P450酶相關(guān)的核酸序列。在煙草中僅特別報道了幾種細(xì)胞色素?zé)煵軵450蛋白。本文所述發(fā)明包括發(fā)現(xiàn)了大量細(xì)胞色素P450片段，它們在其序列同一性基礎(chǔ)上對應(yīng)于幾組P450種類。概述本發(fā)明涉及植物P450酶。本發(fā)明進(jìn)一步涉及來自煙草的植物P450酶。本發(fā)明也涉及在植物中表達(dá)受乙烯和/或植物衰老誘導(dǎo)的P450酶。本發(fā)明更涉及植物中有酶活性的核酸序列，例如加氧酶、脫甲基酶等或其它，以及使用這些序列以使這些酶的表達(dá)減少或沉默。發(fā)明同樣涉及植物中發(fā)現(xiàn)的P450酶，其所含降煙堿水平高于降煙堿水平較低的植物。一方面，發(fā)明涉及核酸序列，它們示于SEQ.ID.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145和147。在第二個相關(guān)方面中，這些核酸序列同一性超過75%的片段被分組，這取決于它們的區(qū)域同一性，區(qū)域?qū)?yīng)于細(xì)胞色素P450基序GXRXCX(G/A)后第一個核酸到終止密碼子。代表核酸組和各種類示于表I。第三方面，發(fā)明涉及氨基酸序列，它們示于SEQ.ID.2、4、6、8、10、12、14、16、18、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146和148。在第四個相關(guān)方面中，這些氨基酸序列同一性超過71%的片段被分組，這取決于它們彼此的區(qū)域同一性，區(qū)域?qū)?yīng)于細(xì)胞色素P450基序GXRXCX(G/A)后第一個氨基酸到終止密碼子。代表氨基酸組和各種類示于表n。發(fā)明的第五個方面是使用核酸序列，它們示于SEQ.ID.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145和147。在第六個相關(guān)方面中，減少或去除煙草植物中的P450酶可用RNA病毒系統(tǒng)暫時完成。評估所得轉(zhuǎn)化或感染植物的表型變化，包括但不限于分析內(nèi)源P450RNA轉(zhuǎn)錄本、P450表達(dá)肽和植物代謝物濃度，使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通?？捎玫募夹g(shù)。在第七個重要方面中，本發(fā)明也涉及產(chǎn)生P450酶活性水平改變的轉(zhuǎn)基因煙草品系。根據(jù)發(fā)明，這些轉(zhuǎn)基因品系包括核酸序列，序列有效使某些酶的表達(dá)減少或沉默，從而導(dǎo)致煙草中的表型效果。這種核酸序列包括SEQ.ID.l、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145和147。在發(fā)明非常重要的第八個方面中，植物栽培品種包括下調(diào)本發(fā)明核酸的性能，會改變相對對照植物的代謝物分布。第九方面，本發(fā)明涉及篩選植物，更優(yōu)選煙草，植物所含基因與教授的核酸序列有顯著的核酸同一性。使用發(fā)明的優(yōu)勢是鑒定和選擇植物，植物包含具精確或顯著同一性的核酸序列，其中這種植物是常規(guī)或轉(zhuǎn)基因品種育種程序、突變程序或天然產(chǎn)生的不同植物群的一部分。篩選有顯著同一性的植物可通過評估植物核酸物質(zhì)來完成，使用核酸探針，結(jié)合核酸檢測操作，包括但不限于核酸雜交和PCR分析。核酸探針可以由教授的核酸序列或其片段組成，它們對應(yīng)于SEQ.ID.l、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145和147。第十方面，本發(fā)明涉及鑒定植物基因，更優(yōu)選煙草，對應(yīng)教授的核酸序列具有顯著的氨基酸同一性。對植物基因的鑒定包括cDNA和那些cDNA的基因組克隆(genomicclans),基因組克隆(優(yōu)選來自煙草)可通過篩選植物cDNA文庫來完成，篩選使用核酸探針并結(jié)合核酸檢測操作，核酸監(jiān)測操作包括但不限于核酸雜交和PCR分析。核酸探針包括核酸序列或其片段，它們對應(yīng)于SEQ.ID.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145和147。在另外的第十一個方面中，可篩選表達(dá)肽的cDNA表達(dá)文庫，所用抗體針對部分或全部教授的氨基酸序列。這種氨基酸序列包括SEQ.ID.2、4、6、8、10、12、14、16、18、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146和148。附圖簡述圖1顯示核酸SEQ.ID.NO.圖2顯示核酸SEQ.ID.NO.圖3顯示核酸SEQ.ID.NO.圖4顯示核酸SEQ.ID.NO.圖5顯示核酸SEQ.ID.NO.圖6顯示核酸SEQ.ID.NO.:1和氨基酸SEQ.ID.NO.:2。:3和氨基酸SEQ.ID.NO.:4。:5和氨基酸SEQ.ID.NO.:6。:7和氨基酸SEQ.ID.NO.:8。:9和氨基酸SEQ.ID.NO.:10。:11和氨基酸SEQ.ID.NO.:12。圖7顯示核酸SEQ.ID.NO.:13和氨基酸SEQ.ID.NO.:14。圖8顯示核酸SEQ.ID.NO.:15和氨基酸SEQ.ID.NO.:16。圖9顯示核酸SEQ.ID.NO.:17和氨基酸SEQ.ID.NO.:18。圖10顯示核酸SEQ.ID.NO.:19和氨基酸SEQ.ID.NO.:20。圖11顯示核酸SEQ.ID.NO.:21和氨基酸SEQ.ID.NO.:22。圖12顯示核酸SEQ.ID.NO.:23和氨基酸SEQ.ID.NO.:24。圖13顯示核酸SEQ.ID.NO.:25和氨基酸SEQ.ID.NO.:26。圖14顯示核酸SEQ.ID.NO.:27和氨基酸SEQ.ID.NO.:28。圖15顯示核酸SEQ.ID.NO.:29和氨基酸SEQ,ID.NO.:30。圖16顯示核酸SEQ.ID.NO.:31和氨基酸SEQ.ID.NO.:32。圖17顯示核酸SEQ.ID.NO.:33和氨基酸SEQ.ID.NO.:34。圖18顯示核酸SEQ.ID.NO.:35和氨基酸SEQ.ID.NO.:36。圖19顯示核酸SEQ.ID.NO.:37和氨基酸SEQ.ID.NO.:38。圖20顯示核酸SEQ.ID.NO.:39和氨基酸SEQ.ID.NO.:40。圖21顯示核酸SEQ.ID.NO.:41和氨基酸SEQ.ID.NO.:42。圖22顯示核酸SEQ.ID,NO.:43和氨基酸SEQ.ID,NO.:44。圖23顯示核酸SEQ.ID.NO.:45和氨基酸SEQ.ID.NO.:46。圖24顯示核酸SEQ.ID.NO.:47和氨基酸SEQ.ID.NO.:48。圖25顯示核酸SEQ.ID.NO.:49和氨基酸SEQ.ID.NO.:50。圖26顯示核酸SEQ.ID.NO.:51和氨基酸SEQ.ID.NO.:52。圖27顯示核酸SEQ.ID.NO.:53和氨基酸SEQ.ID.NO.:54。圖28顯示核酸SEQ.ID.NO.:55和氨基酸SEQ.ID.NO.:56。圖29顯示核酸SEQ.ID.NO.:57和氨基酸SEQ.ID.NO.:58。圖30顯示核酸SEQ.ID.NO.:59和氨基酸SEQ.ID.NO.:60。圖31顯示核酸SEQ.ID.NO.:61和氨基酸SEQ.ID.NO.:62。圖32顯示核酸SEQ.ID.NO.:63和氨基酸SEQ.ID.NO.:64。圖33顯示核酸SEQ.ID.NO.:65和氨基酸SEQ.ID.NO.:66。圖34顯示核酸SEQ.ID.NO.:67和氨基酸SEQ.ID.NO.:68。圖35顯示核酸SEQ.ID.NO.:69和氨基酸SEQ.ID.NO.:70。圖36顯示核酸SEQ.ID.NO.:71和氨基酸SEQ.ID.NO.:72。圖37顯示核酸SEQ.ID.NO.:73和氨基酸SEQ.ID.NO.:74。圖38顯示核酸SEQ.ID.NO.圖39顯示核酸SEQ.ID.NO.圖40顯示核酸SEQ.ID.NO.圖41顯示核酸SEQ.ID.NO.圖42顯示核酸SEQ.ID.NO.圖43顯示核酸SEQ.ID.NO.圖44顯示核酸SEQ.ID.NO.圖45顯示核酸SEQ.ID.NO.圖46顯示核酸SEQ.ID.NO.圖47顯示核酸SEQ.ID.NO.圖48顯示核酸SEQ.ID.NO.圖49顯示核酸SEQ.ID.NO.圖50顯示核酸SEQ.ID.NO.:圖51顯示核酸SEQ.ID.NO.:圖52顯示核酸SEQ.ID.NO.:圖53顯示核酸SEQ,ID.NO.:圖54顯示核酸SEQ.ID.NO.:圖55顯示核酸SEQ.ID.NO.:圖56顯示核酸SEQ.ID.NO.:圖57顯示核酸SEQ.ID.NO.:圖58顯示核酸SEQ.ID.NO.:圖59顯示核酸SEQ.ID.NO.:圖60顯示核酸SEQ.ID.NO.:圖61顯示核酸SEQ.ID.NO.:圖62顯示核酸SEQ.ID.NO.:圖63顯示核酸SEQ.ID.NO.:圖64顯示核酸SEQ.ID.NO.:圖65顯示核酸SEQ.ID.NO.:圖66顯示核酸SEQ.ID.NO.:圖67顯示核酸SEQ.ID.NO.:圖68顯示核酸SEQ.ID.NO,::75和氨基酸SEQ.ID.NO.:76。:77和氨基酸SEQ.ID.NO.:78。:79和氨基酸SEQ.ID.NO.:80。:81和氨基酸SEQ.ID.NO.:82。:83和氨基酸SEQ.ID.NO.:84。:85和氨基酸SEQ.ID.NO.:86。:87和氨基酸SEQ.ID.NO.:88。:89和氨基酸SEQ.ID.NO.:90。:91和氨基酸SEQ.ID.NO.:92。:93和氨基酸SEQ.ID.NO.:94。:95和氨基酸SEQ.ID.NO.:96。:97和氨基酸SEQ.ID.NO.:98。:99和氨基酸SEQ.ID.NO.:100。:101和氨基酸SEQ.ID.NO.:102。:103和氨基酸SEQ.ID.NO.:104。:105和氨基酸SEQ.ID.NO.:106。:107和氨基酸SEQ.ID.NO.:108。:109和氨基酸SEQ.ID.NO.:110。:111和氨基酸SEQ.ID.NO.:112。:113和氨基酸SEQ.ID.NO.:114。:115和氨基酸SEQ.ID.NO.:116。:117和氨基酸SEQ.ID.NO.:118。:119和氨基酸SEQ.ID.NO.:120。:121和氨基酸SEQ.ID.NO,:122。:123和氨基酸SEQ.ID.NO.:124。:125和氨基酸SEQ.ID.NO.:126。:127和氨基酸SEQ.ID.NO.:128。:129和氨基酸SEQ.ID.NO.:130。:131和氨基酸SEQ.ID.NO.:132。:133和氨基酸SEQ.ID.NO.:134。:135和氨基酸SEQ.ID.NO.:136。圖69顯示核酸SEQ.ID.NO.:137和氨基酸SEQ.ID.NO.:138。圖70顯示核酸SEQ,ID.NO.:139和氨基酸SEQ,ID.NO.:140。圖71顯示核酸SEQ.ID.NO.:141和氨基酸SEQ.ID.NO.:142。圖72顯示核酸SEQ.ID.NO.:143和氨基酸SEQ.ID.NO.:144。圖73顯示核酸SEQ.ID.NO.:145和氨基酸SEQ.ID.NO.:146。圖74顯示核酸SEQ.ID.NO.:147和氨基酸SEQ.ID.NO.:148。圖75顯示用于通過PCR克隆細(xì)胞色素P450cDNA片段的過程。顯示SEQ.ID.NO.149-156。圖76闡述組號的氨基酸同一性。詳細(xì)描述定義除非另有定義，本文所用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所述領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的意義相同。Singleton等，(1994)《微生物和分子生物詞典》Sons(NewYork)提供有許多本發(fā)明所用術(shù)語的綜合詞典給技術(shù)人員。本文所指的全部專利和出版物納入本文供參考。為了本發(fā)明目的，下面定義下列術(shù)語。"酶活性"用于包括脫甲基、羥基化、環(huán)氧化、N-氧化、磺氧化、N-、S-和O-脫垸基、脫硫、脫氨基以及氮、硝基和N-氧化基團(tuán)的還原。術(shù)語"核酸"指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，以單或雙鏈形式或者正義或反義，除非另有限制，包括天然核苷酸的已知類似物，其與核酸的雜合方式類似于天然產(chǎn)生的核苷酸。除非另有說明，特定核酸序列包括其互補序列。術(shù)語"可操作連接"、"可操作結(jié)合"和"以可操作順序"指核酸表達(dá)控制序列(如啟動子、信號序列或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位置的排列)與第2種核酸序列間的功能性連接，其中表達(dá)控制序列影響對應(yīng)于第2種序列的核酸轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。當(dāng)關(guān)于細(xì)胞使用時，術(shù)語"重組體"表示細(xì)胞復(fù)制異源核酸，表達(dá)所述核酸或表達(dá)肽、異源肽或由異源核酸編碼的蛋白質(zhì)。重組細(xì)胞可表達(dá)正義或反義形式的基因或基因片段，這些形式不在天然細(xì)胞形式(非重組)中發(fā)現(xiàn)。重組細(xì)胞也能表達(dá)天然細(xì)胞形式中發(fā)現(xiàn)的基因，但其中基因被修飾和通過人工方式再導(dǎo)入細(xì)胞。"結(jié)構(gòu)基因"是基因部分，包括編碼蛋白、多肽或其部分的DNA區(qū)段，去除推動轉(zhuǎn)錄起始的5'序列。結(jié)構(gòu)基因可另外編碼不能翻譯的產(chǎn)物。結(jié)構(gòu)基因可以是細(xì)胞中正常發(fā)現(xiàn)的或者細(xì)胞或其導(dǎo)入的細(xì)胞位置中不常發(fā)現(xiàn)的，在導(dǎo)入情況中它稱為"異源基因"。異源基因可全部或部分獲得自本領(lǐng)域已知的任何來源，包括細(xì)菌基因組或附加體，真核、核或質(zhì)粒DNA、cDNA、病毒DNA或化學(xué)合成的DNA。結(jié)構(gòu)基因可包含一種或多種修飾，修飾能影響生物活性或其特征、表達(dá)產(chǎn)物的生物活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)、表達(dá)速度或表達(dá)控制的方式。這種修飾包括但不限于突變、插入、缺失和一個或多個核苷酸的取代。結(jié)構(gòu)基因能構(gòu)成不間斷的編碼序列或它可包括一個或多個內(nèi)含子，由適當(dāng)剪接界結(jié)合。結(jié)構(gòu)基因可翻譯或不能翻譯，包括反義方向。結(jié)構(gòu)基因可以是區(qū)段組合，獲得自多種來源和基因序列組合(天然產(chǎn)生或合成，其中合成指化學(xué)合成的DNA)。"獲得自"用于指取、獲得、接受、追蹤、復(fù)制或遺傳自來源(化學(xué)和/或生物)。生成衍生物可通過化學(xué)或生物操作(包括但不限于取代、加入、插入、缺失、提取、分離、突變和復(fù)制)原始來源。涉及DNA序列的"化學(xué)合成"指部分組成核苷酸在體外裝配。手工化學(xué)合成DNA可用較好確立的過程(Caruthers，《DNA和RNA測序的方法》(MethodologyofDNAandRNASequencing)，(1983)，Weissman(編)，PraegerPublishers,NewYork,第1章)完成；自動化學(xué)合成能用一些商業(yè)購買的機器之一進(jìn)行。進(jìn)行用于比較的最佳序列比對可通過Smith和Waterman的局部同源性算法，Adv.Appl.Math.2:482(1981)、通過Needleman和Wunsch的同源性比對算法，J.Mol.Biol.48:443(1970)、通過Pearson和Lipman的檢索類似性方法，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85:2444(1988)、通過這些算法(WisconsinGenetics軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA禾口TFASTA，GeneticsComputerG扁p，575ScienceDr.，Madison,Wis.)的計算機化實現(xiàn)、或通過檢查進(jìn)行。NCBI局部序列比對基本檢索工具(BLAST)(Altschul等，1990)獲得自一些來源，包括國家生物信息中心(NCBI，Bethesda，Md.)和因特網(wǎng)，用于結(jié)合序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx。它可在http:〃ww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/訪問。如何用此程序確定序列同一性的描述可獲得自http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast.help,html。應(yīng)用于氨基酸序列和本文使用的術(shù)語"顯著的氨基酸同一性"或"顯著的氨基酸序列同一性"表示多肽特征，其中肽包括的序列與參考組相比，在對應(yīng)于細(xì)胞色素P450基序GXRXCX(G/A)后第一個氨基酸到翻譯肽終止密碼子的區(qū)域上具有至少百分之70的序列同一性，優(yōu)選百分之80的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選百分之90的氨基酸序列同一性，最優(yōu)選至少百分之99到100的序列同一性。應(yīng)用于核酸序列和本文使用的術(shù)語"顯著的核酸同一性"或"顯著的核酸序列同一性"表示多核苷酸序列特征，其中多核苷酸包括的序列與參考組相比，在對應(yīng)于細(xì)胞色素P450基序GXRXCX(G/A)后第一個核酸到翻譯肽終止密碼子的區(qū)域上具有至少百分之75的序列同一性，優(yōu)選百分之81的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選百分之91到99的序列同一性，最優(yōu)選至少百分之99到100的序列同一性。核苷酸序列顯著相同的另外指示是如果2個分子在嚴(yán)格條件下彼此雜交。嚴(yán)格條件取決于序列且不同環(huán)境下會不同。一般，嚴(yán)格條件選擇為約5'C到約20'C，通常約10,'C到約15°C，，低于特定序列在確定離子強度鄰pH的熱熔點(Tm)。Tra是50y。靶序列與匹配探針雜交的溫度(在確定離子強度和pH下)。通常，嚴(yán)格條件中鹽濃度在pH7約為0.02摩爾且溫度為至少約60'C。例如，在標(biāo)準(zhǔn)Southern雜交過程中，嚴(yán)格條件包括開始在6xSSC中42'C洗，接著于至少約55'C的溫度在0.2xSSC中另外洗一次或多次，一般約60'C且通常約65°C。當(dāng)多肽和/或它們編碼的蛋白質(zhì)顯著相同時，核苷酸序列也顯著相同，用于本發(fā)明目的。因此，一種核酸序列編碼與第2種核酸序列幾乎相同的多肽時，這兩種核酸序列顯著相同，即使它們由于遺傳密碼子允許的簡并性而在嚴(yán)格條件下不雜交(參見Darnell等，(1990)《分子細(xì)胞生物》(MolecularCellBiology),第2版，ScientificAmericanBooksW.H.Freeman禾口CompanyNewYork關(guān)于密碼子簡并性和遺傳密碼的解釋)。蛋白質(zhì)純度或均一性可通過本領(lǐng)域熟知的一些方法指示，如蛋白樣品的聚丙烯酰胺凝膠電泳，接著由染色呈現(xiàn)。為了某些目的，需要高分辨率并使用HPLC或類似純化方法。如本文所用，術(shù)語"載體"關(guān)于核酸分子使用，核酸分子將DNA區(qū)段轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。載體作用于復(fù)制DNA且可在宿主細(xì)胞中獨立復(fù)制。術(shù)語"媒介"有時與"載體"交換使用。如本文所用，術(shù)語"表達(dá)載體"指重組DNA分子，分子包含所需編碼序列和在特定宿主生物體中表達(dá)可操作連接編碼序列所需的適當(dāng)核酸序列。在原核生物中表達(dá)所需的核酸序列通常包括啟動子、操縱子(任選)、常與其它序列一起的核糖體結(jié)合位置。己知真核細(xì)胞使用啟動子、增強子、終止與聚腺苷酸化信號。'為了再生有根的完整遺傳工程植物，核酸可插入植物細(xì)胞，例如通過任何技術(shù)如體內(nèi)接種或任何己知體外組織培養(yǎng)技術(shù)以生成能在完整植物中再生的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。因此，例如插入植物細(xì)胞可通過體外接種致病或非致病根瘤土壤桿菌(A"/^/a"'朋S)。也能使用其它這種組織培養(yǎng)技術(shù)。"植物組織"包括植物的分化和未分化組織，但不限于根、莖干、葉、花粉、種子、腫瘤組織及多種培養(yǎng)細(xì)胞形式如單細(xì)胞、原生質(zhì)體、胚和愈合組織。植物組織可以在植物中或者在器官、組織或細(xì)胞培養(yǎng)中。如本文所用，"植物細(xì)胞"包括植物中的植物細(xì)胞及培養(yǎng)的植物細(xì)胞和原生質(zhì)體。"cDNA"或"互補DNA"—般指單鏈DNA分子，其核酸序列與RNA分子互補。cDNA通過反轉(zhuǎn)錄酶對RNA模板作用來形成。獲得核酸序列的方法根據(jù)本發(fā)明，RNA提取自轉(zhuǎn)變和非轉(zhuǎn)變煙草品系的煙草組織。隨后提取的RNA用于產(chǎn)生cDNA。然后本發(fā)明核酸序列用2種方法生成。在第一種方法中，多聚A豐富的RNA通過反轉(zhuǎn)錄PCR提取自植物組織和cDNA。隨后單鏈cDNA用于產(chǎn)生P450特異PCR群，使用簡并引物加寡d(T)反向引物。引物設(shè)計以P450的高保守基序為基礎(chǔ)。特定簡并引物的例子示于圖1。進(jìn)一步分析來自質(zhì)粒的序列片段，質(zhì)粒含適當(dāng)大小的插入。這些大小插入一般范圍從約300到約800個核苷酸，這取決于所用引物在第二種方法中，初始構(gòu)建了一個cDNA文庫。隨后質(zhì)粒中的cDNA用于產(chǎn)生P450特異PCR群，使用簡并引物加質(zhì)粒上的T7引物作為反向引物。如在第l種方法中，進(jìn)一步分析來自質(zhì)粒的序列片段，質(zhì)粒含適當(dāng)大小的插入。已知產(chǎn)生高水平降煙堿(轉(zhuǎn)變體)的煙草植物品系和降煙堿水平不能檢測的植物品系可用作起始材料。然后葉可從植物中取出并用乙烯處理以活化本文定義的P450酶活性?？俁NA用本領(lǐng)域已知技術(shù)提取。隨后cDNA片段用PCR(RT-PCR)和寡d(T)引物產(chǎn)生，如圖l所述。接著可構(gòu)建cDNA文庫，這在本文的例子中更充分描述。P450類酶的保守區(qū)能用作簡并引物的模板(圖75)。使用簡并引物，P450特異帶可通過PCR擴增。指示P450類似酶的帶可通過DNA測序鑒定。確定PCR片段特征能用BLAST檢索、比對或其它工具以鑒定適當(dāng)候選。來自鑒定片段的序列信息可用于發(fā)展PCR引物。這些引物用于從轉(zhuǎn)變和非轉(zhuǎn)變的乙烯處理植物組織的RNA中構(gòu)建定量PCR引物。僅來自轉(zhuǎn)變品系的適當(dāng)大小DNA帶(300-800bp)或具更高密度的帶用于進(jìn)一步特征確定，更高密度指示轉(zhuǎn)變品系中的更高表達(dá)。進(jìn)行大規(guī)模Southern反向分析以檢測所得全部克隆的不同表達(dá)。在發(fā)明的此方面，可進(jìn)行這些大規(guī)模反向Southern分析，使用來自不同組織的標(biāo)記總cDNA作為與克隆DNA片段雜交的探針以篩選所有克隆插入。非放射性Northern印跡測定也用于確定克隆P450片段的特征。如上鑒定的核酸序列可用病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)檢測(VIGS，Baulcombe，《植物生物的當(dāng)前觀點》(CurrentOpinionsinPlantBiology),1999，2:109-113)。在發(fā)明的另一方面，干擾RNA技術(shù)(RNAi)用于進(jìn)一步確定本發(fā)明煙草植物中細(xì)胞色素P450酶活性的特征。下列描述此技術(shù)的參考文獻(xiàn)納入本文供參考，Smith等，Nature,2000，407:319-320;Fir等，Nature,1998，391:306-311;Waterhouse等，PNAS，1998，95:13959-13964;Setalberg等，PlantMolecularBiology,1993，23:671-683;Baul固be,《植物生物的當(dāng)前觀點》，1999，2:109-113;Brigneti等，EMB0Journal,1998，17(22):6739-6746。植物可用RNAi技術(shù)、反義技術(shù)或所述多種其它方法轉(zhuǎn)化。存在一些用于將外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入植物細(xì)胞、獲得穩(wěn)定維持和表達(dá)導(dǎo)入基因的植物。這種技術(shù)包括加速包被于微粒上的遺傳物質(zhì)直接進(jìn)入細(xì)胞(Cornell的美國專利4,945,050和DowElanco的5,141,131)。植物可用農(nóng)桿菌技術(shù)轉(zhuǎn)化，參見UniversityofToledo的美國專利5，177，010;TexasA&M的5，104，310;歐洲專利申i青0131624BK歐洲專利申i青120516、159418B1;歐洲專利申i青120516、159418B1和Schilperoot的176,112;美國專利5,149,645、5，469，976、5,464,763和4,940,838以及Schilperoot的4，693,976;MaxPlanck的歐洲專利申i胄116718、290799、320500;JapanNicotiana的歐洲專利申請604662和627752;CibaGeigy的歐洲專利申請0267159、0292435和美國專利5，231，019;Calgene的美國專利5,463，174和4,762，785以及Agracetus的美國專利5,004,863和5，159，135。其它轉(zhuǎn)化技術(shù)包括噬菌體頸須技術(shù)(whiskerstechnology),參見Zeneca的美國專利5，302，523和5，464,765。電穿孔技術(shù)也用于轉(zhuǎn)化植物，參見BoyceThompsonInstitute的W087/06614，Dekalb的5，742，869、5,384,253，PGS的W09209696和W09321335。所有這些轉(zhuǎn)化專利和出版物納入供參考。除了許多用于轉(zhuǎn)化植物的技術(shù)，接觸外源基因的組織類型也能變化。這種組織包括但不限于胚發(fā)生組織、愈合組織I和II型、胚軸、分裂組織等。幾乎所有植物組織可在去分化中轉(zhuǎn)化，使用技術(shù)人員掌握的合適技術(shù)。導(dǎo)入植物的外源遺傳物質(zhì)包括可選擇標(biāo)記。對特定標(biāo)記的優(yōu)選在于技術(shù)人員的判斷力，但任何下列可選擇標(biāo)記能與本文未列出但作為可選擇標(biāo)記能發(fā)揮功能的任何其它基因一起使用。這種可選擇標(biāo)記包括但不限于編碼對抗生素卡那霉素、新霉素和G418抗性的轉(zhuǎn)座子Tn5的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(AphII)以及編碼對草甘膦；潮霉素；氨甲蝶呤；膦絲菌素(bar);咪唑啉酮、磺脲和三唑嘧啶除草劑如chlorosuluron;溴苯腈、茅草枯等抗性或耐受的基因。除了可選擇標(biāo)記，需要使用報告基因。在一些情況中，可使用報告基因而沒有可選擇標(biāo)記。報告基因是一般不存在或表達(dá)于受體生物體或組織的基因。報告基因通常編碼提供一些表型變化或酶特性的蛋白質(zhì)。這種基因的例子提供于K.Weising等，Ann.Rev.Genetics,22,421(1988)，它納入本文供參考。優(yōu)選的報告基因沒有限制的包括葡糖苷酸酶(GUS)基因和GFP基因。一旦導(dǎo)入植物組織，結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)可用任何本領(lǐng)域已知方法測定，表達(dá)可測量為轉(zhuǎn)錄的mRNA、合成蛋白質(zhì)或產(chǎn)生的基因沉默量(參見美國專利號5,583,021，納入本文供參考)。技術(shù)已知用于體外培養(yǎng)植物組織，在一些情況中，用于在完整植物中再生(EP申請?zhí)?8810309.0)。將導(dǎo)入的表達(dá)復(fù)合體轉(zhuǎn)移到商業(yè)有用栽培品種的過程對本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。一旦獲得表達(dá)所需P450酶水平的植物細(xì)胞，植物組織和完整植物可由此再生，使用本領(lǐng)域熟知的方法和技術(shù)。隨后再生植物通過常規(guī)方法再生且導(dǎo)入基因能通過常規(guī)植物育種技術(shù)轉(zhuǎn)移到其它品系和栽培品種。下列例子闡述完成發(fā)明的方法并應(yīng)理解為闡明而非限制發(fā)明范圍，發(fā)明范圍在附加權(quán)利要求中定義。實施例實施例l:植物組織發(fā)育和乙烯處理植物生長植物接種于盆中并在溫室中生長4周。4周大的苗移植到單獨盆中并在溫室中生長2個月。植物在生長中每天澆2次水，水含150ppmNPK肥料。展開的綠葉與植物分離以進(jìn)行下述乙烯處理。細(xì)胞系78379煙草品系78379是由肯塔基大學(xué)(UniversityofKentucky)發(fā)表的伯萊芋葉品系，用作植物物質(zhì)來源。按煙草栽培領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)100株植物并以不同數(shù)(1-100)移植和標(biāo)記。施肥和田地管理如推薦進(jìn)行。100株植物中四分之三將20和100%間的煙堿轉(zhuǎn)變成降煙堿。100株植物中四分之一使小于5%的煙堿轉(zhuǎn)變成降煙堿。植物號87轉(zhuǎn)變最低(2%)而植物號21轉(zhuǎn)變100%。轉(zhuǎn)變小于3%的植物分類為非轉(zhuǎn)變體。植物號87和植物號21的自花授粉種子以及雜交(21x87和87x21)種子用于研究遺傳和表型差異。來自自花授粉21的植物是轉(zhuǎn)變體，9諷來自87的自花授粉體是非轉(zhuǎn)變體。來自87的其它1%顯示低轉(zhuǎn)變(5-15%)。來自正反交的植物都是轉(zhuǎn)變體。細(xì)胞系4407煙草品系4407是用作植物物質(zhì)來源的伯萊芋葉品系。選擇統(tǒng)一和代表性的植物(100)并標(biāo)記。100株植物中97株是非轉(zhuǎn)變體且3株是轉(zhuǎn)變體。植物號56轉(zhuǎn)變量最低(1.2%)且植物號58轉(zhuǎn)變水平最高(96%)。自花授粉種子和正反交種子用2種植物獲得。來自自花授粉-58的植物以約3:1的轉(zhuǎn)變體與非轉(zhuǎn)變體比例分離。58-33和58-25分別鑒定為純合轉(zhuǎn)變體和非轉(zhuǎn)變體植物品系。58-33的穩(wěn)定轉(zhuǎn)變通過分析其下一子代確定。乙烯處理過程綠葉從溫室生長2-3個月的植物中分離并用0.3先乙烯溶液(Pr印牌乙烯磷(Rhone-Poulenc))噴淋。各噴涂葉懸于晾架，晾架裝有增濕器且有塑料覆蓋。在處理中，樣品葉用乙烯溶液定期噴淋。乙烯處理后約24-48小時，收集葉用于RNA提取。取另一種小樣品用于代謝構(gòu)成分析以確定葉代謝物濃度和更特定的感興趣構(gòu)成如多種生物堿。例如，生物堿分析可如下進(jìn)行。樣品(O.lg)與0.5ml2NNa0H、5ml提取溶液在150rpin振蕩，提取溶液含作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的喹啉及甲基t-丁基醚。樣品在裝有FID檢測器的HP6890GC上分析。250°C的溫度用于檢測器和注射器。HP柱(30m-0.32nm-lm)由熔融石英組成，石英與5%苯酚和95%甲基硅交聯(lián)，柱在110-185r的溫度梯度以IO'C每分鐘使用。柱在IO(TC以1.7cm3分鐘-1的流速操作，分裂比例為40:1，注射體積為2.1，氦用作載體氣體。實施例2:RNA分離對于RNA提取，來自2個月大溫室生長植物的中等葉用所述乙烯處理。0和24-48小時樣品用于RNA提取。在一些情況中，衰老過程下的葉樣品取自去除頭花序10天后的植物。這些樣品也用于提取?？俁NA用Rneasy植物小型試劑盒(Qiagen，Inc.，Valencia,California)遵循廠商操作分離。組織樣品在液氮下研磨至精細(xì)粉末，使用DEPC處理的研缽和杵。約100mg碾碎的組織轉(zhuǎn)移到無菌1.5ml離心管。此樣品管置于液氮直到收集了所有樣品。隨后，試劑盒中提供的45(^1緩沖液RLT(加有e-巰基乙醇)加入各單獨管。樣品充分渦旋并在56'C孵育3分鐘。然后裂解物應(yīng)用到置于2-ml收集管中的QIAshredder旋轉(zhuǎn)柱，以最高速離心2分鐘。收集通過的流且0.5體積乙醇加入清澈裂解物中。樣品較好的混合并轉(zhuǎn)移到置于2-ml收集管中的Rneasy微旋轉(zhuǎn)柱。樣品以10，000rpm離心1分鐘。接著，700nl緩沖液RW1吸到新收集管中的Rneasy柱上且以10,000rpm離心1分鐘。再次加入緩沖液RPE到Rneasy旋轉(zhuǎn)柱并以最高速離心2分鐘以干燥膜。為去除任何乙醇攜帶，膜置于單獨的收集管中且以最高速另外離心1分鐘。Rneasy柱轉(zhuǎn)移到新的1.5ml收集管，4(^1無RNA酶的水直接吸到Rneasy膜上。此終洗脫管以10，000rpm離心1分鐘?？俁NA的性質(zhì)和量通過變性甲醛膠和分光光度計分析。多聚(A)RNA用Oligotex多聚ARNA純化試劑盒(QiagenInc.)遵循廠商操作分離。使用250nl最大體積中的約200ng總RNA。250nl體積的緩沖液0BB和15plOligotex懸液加入250nl總RNA。通過抽吸充分混合內(nèi)含物并在加熱塊上7(TC孵育3分鐘。然后樣品置于室溫約20分鐘。oligotex:mRNA復(fù)合體通過最高速離心2分鐘來沉淀。除了50pl懸液，所有都從微離心管中取出。樣品進(jìn)一步用0BB緩沖液處理。0ligotex:mRNA沉淀通過渦旋重懸浮于400pl緩沖液0W2。此混合物轉(zhuǎn)移到置于新管中的小旋轉(zhuǎn)柱并以最高速離心1分鐘。旋轉(zhuǎn)柱轉(zhuǎn)移到新管且另外加入40(Hd緩沖液0W2到柱中。隨后管以最高速離心l分鐘。旋轉(zhuǎn)柱轉(zhuǎn)移到最終的1.5ml微離心管。樣品用60^1熱(70C)緩沖液0EB洗脫。多聚A產(chǎn)物通過變性甲醛膠和分光光度計分析。實施例3:反轉(zhuǎn)錄-PCR第1條cDNA鏈用Superscript反轉(zhuǎn)錄酶遵循廠商操作(Invitrogen，Carlsbad,California)生成。多聚A豐富的RNA/寡dT引物混合物由少于5pg的總RNA、lpl10mMdNTP混合物、1^1寡(dT)12-18(0.5嗎/pl)和多至10plDEPC-處理水組成。各樣品在65'C孵育5分鐘，然后置于冰上至少1分鐘。制備反應(yīng)混合物通過順序加入下列各成分2^110XRT緩沖液、4^125mMMgC12、2^10.1MDTT和lpl去除RNA酶的重組RNA酶抑制劑。加入9^1反應(yīng)混合物，吸到各RNA/引物混合物上并溫和混合。它在42。C孵育2分鐘且lnlS叩erScriptIIRT加入各管。管在42'C孵育5分鐘。反應(yīng)在72'C終止15分鐘并在冰上冷凍。樣品由離心收集，lplRNA酶H加入各管且在37'C孵育20分鐘。完成第2次PCR用200皮摩爾正向引物(圖75中的簡并引物，SEQ.ID.149-156)和100皮摩爾反向引物(18個核苷酸寡d(T)的混合物，接著是l個隨機堿基)。反應(yīng)條件是94'C2分鐘，隨后進(jìn)行40個PCR循環(huán)94°C1分鐘、45到6CTC2分鐘、72°C3分鐘，72'C另外延伸IO分鐘。擴增樣品微升通過電泳用1%瓊脂糖膠分析。正確大小的片段從瓊脂糖膠純化。實施例4:產(chǎn)生PCR片段群來自實施例3的PCR片段遵循廠商說明連接到pGEM-TEasy載體中(Promega，Madison,Wisconsin)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入JM109感受態(tài)細(xì)胞且在LB平板上培養(yǎng)用于藍(lán)/白選擇。選擇菌落并在有1.2mlLB培養(yǎng)基的96孔板中37'C過夜生長。產(chǎn)生冷凍儲存液用于所有選擇的菌落。來自平板的質(zhì)粒DNA用BeckmanBiomeck2000minipr印機器人技術(shù)和WizardSVMinipr印試劑盒(Promega)純化。質(zhì)粒DNA用lOOpl水洗脫并保存于96孔板。質(zhì)粒用EcoRl消化且通過1%瓊脂糖膠分析以確定DNA量和插入大小。含400-600bp插入的質(zhì)粒用CEQ2000測序儀(Beckman,Fullerton，California)測序。序列用GenBank數(shù)據(jù)庫通過BLAST檢索比對。鑒定了P-450相關(guān)片段且進(jìn)一步分析。實施例5:構(gòu)建CDNA文庫cDNA文庫通過如下從乙烯處理葉中制備總RNA來構(gòu)建。首先，總RNA提取自煙草品系58-33的乙烯處理葉，使用修改的酸性苯酚和氯仿提取操作。修改操作以使用l克組織，組織被研磨且隨后在5ml提取緩沖液(100mMTris-HC1，pH8，5;200mMNaCl;lOmMEDTA;0.5SDS)中渦旋，緩沖液加入5ml苯酚(pH5.5)和5ral氯仿。離心提取樣品，保存上清。此提取步驟再重復(fù)2-3次直到上清呈現(xiàn)清澈。加入約5ml氯仿以去除痕量苯酚。RNA從混合上清部分沉淀，這是通過加入3倍體積ETOH和1/10體積3MNa0Ac(pH5.2)并在-2(TC保存1小時。轉(zhuǎn)移到Corex玻璃容器后，它在4r以9,000RPM離心45分鐘。沉淀用70%乙醇洗，在4'C以9,000RPM旋轉(zhuǎn)5分鐘。沉淀干燥后，沉淀的RNA溶于0.5ml無RNA酶的水。總RNA的性質(zhì)和量分別通過變性甲醛膠和分光光度計分析。所得總RNA通過下列操作分離多聚A+RNA，使用寡d(T)纖維素操作(Invitrogen)和微離心旋轉(zhuǎn)柱(Invitrogen)。約20mg總RNA進(jìn)行2次純化以獲得高質(zhì)量多聚A+RNA。分析多聚A+RNA產(chǎn)物，通過變性甲醛膠和隨后RT-PCR已知全長基因以確保高質(zhì)量mRNA。另外，對來自乙烯處理非轉(zhuǎn)變體葉、零小時乙烯處理轉(zhuǎn)變體葉和乙烯處理轉(zhuǎn)變體葉的多聚A+RNA進(jìn)行Northern分析，使用全長p450作為探針。方法以廠商說明提供的操作(KPLRNA檢測器Northern印跡試劑盒，Gaithersburg，Maryland)為基礎(chǔ)，各樣品使用1.8pg多聚A+RNA。含膠的RNA過夜轉(zhuǎn)移，使用20XSSC作為轉(zhuǎn)移緩沖液。其次，多聚A+RNA用作模板以生成cDNA文庫，使用cDNA合成試劑盒、ZAP-cDNA合成試劑盒、ZAP-cDNAGigapackIII金克隆試劑盒(Stratagene，LaJolla，California)。方法包括遵循詳細(xì)說明的廠商操作。約8網(wǎng)多聚A+RNA用于構(gòu)建cDNA文庫。分析初級文庫顯示約2.5X106-lX107pfu。文庫的質(zhì)量背景測試通過互補測定完成，使用IPTG和X-gal，其中重組斑以高于背景反應(yīng)100倍表達(dá)。通過隨機PCR定量分析文庫顯示插入cDNA的平均大小約為1.2kb。方法使用如下的兩步驟PCR方法。對于第l個步驟，設(shè)計反向引物是以獲得自P450片段的初步序列信息為基礎(chǔ)。設(shè)計的反向引物和T3(正向)引物用于從cDNA文庫擴增對應(yīng)基因。PCR反應(yīng)進(jìn)行瓊脂糖電泳，對應(yīng)高分子量的帶被切下、純化、克隆和測序。在第2個步驟中，如正向引物從P4505'UTR或起始編碼區(qū)設(shè)計的新引物與反向引物(從P4503，UTR設(shè)計)一起用于隨后的PCR以獲得全長P450克隆。P450片段通過PCR擴增從構(gòu)建的cDNA文庫中生成，如實施例3所述，除了反向引物不同。位于cDNA插入下游質(zhì)粒的T7引物(見圖5)用作反向引物。PCR片段被分離、克隆和測序，如實施例4所述。預(yù)期本領(lǐng)域技術(shù)人員在實踐發(fā)明中會根據(jù)上述發(fā)明的詳細(xì)說明作出許多修改和變化。結(jié)果，這些修改和變化包括在下列權(quán)利要求范圍中。實施例6:確定克隆片段的特征-反向SOUTHERN印跡分析對上面例子中鑒定的所有P450克隆進(jìn)行非放射性大規(guī)模反向southern印跡分析以檢測差異表達(dá)。觀察到不同P450簇間的表達(dá)水平很不同。對高表達(dá)的進(jìn)行進(jìn)一步實時檢測。非放射性southern印跡過程如下進(jìn)行。1)總RNA提取自乙烯處理轉(zhuǎn)變體(58-33)和非轉(zhuǎn)變體葉，使用QiagenRnaeasy試劑盒，如實施例2所述。2)探針通過生物素末端標(biāo)記單鏈cDNA來生成，cDNA獲得自上面步驟的多聚A豐富的RNA。產(chǎn)生此標(biāo)記單鏈cDNA是通過RT-PCR轉(zhuǎn)變體和非轉(zhuǎn)變體總RNA(Invitrogen)，如實施例3所述，除了使用生物素化的寡dT作為引物(Promega);這些用作探針以與克隆DNA雜交。3)質(zhì)粒DNA用限制性酶EcoRl消化且跑瓊脂糖膠。膠同時干燥并轉(zhuǎn)至2張尼龍膜(BiodyneB)。1張膜與轉(zhuǎn)變體探針雜交，另1張膜與非轉(zhuǎn)變體探針雜交。雜交前UV-交聯(lián)膜(自動交聯(lián)設(shè)置，254nm,Stratagene，Stratalinker)。另外，插入從各質(zhì)粒PCR擴增，使用位于p-GEM質(zhì)粒、T3和SP6兩臂的序列作為引物。PCR產(chǎn)物通過跑96孔現(xiàn)成(ready-to-run)瓊脂糖膠分析。確認(rèn)的插入點在2張尼龍膜上。l張膜與轉(zhuǎn)變體探針雜交，另1張膜與非轉(zhuǎn)變體探針雜交。4)雜交膜并遵循廠商說明洗，修改了洗的嚴(yán)格性(EnzoDiagnostics,Inc，F(xiàn)armingdale，NY)。膜用雜交緩沖液(2xSSC緩沖甲酰胺，含去垢劑和雜交增強劑)在42'C預(yù)雜交30分鐘且用1(^1變性探針在42'C雜交。隨后膜在IX雜交洗滌緩沖液中室溫洗1次10分鐘和在65'C洗4次15分鐘。膜可用于檢測。5)檢測洗過的膜，這是通過堿性磷酸酶標(biāo)記，接著NBT/BCIP比色(？colometric)檢測，如廠商檢測過程所述(EnzoDiagnostics,Inc.)。膜用lx封閉溶液室溫封閉1小時，用IX檢測試劑洗3次10分鐘，用lx預(yù)顯色反應(yīng)緩沖液洗2次5分鐘，然后在顯色溶液中顯色印跡30-45分鐘直到出現(xiàn)點。所有試劑由廠商提供(EnzoDiagnostics,Inc.)。在一些情況中，1步驟RT-PCR(Gibco試劑盒，Carlsbad,California)在來自非轉(zhuǎn)變體(58-25)和轉(zhuǎn)變體(58-33)系的總RNA上進(jìn)行，使用特異于P-450片段的引物。比較RT-PCR如下進(jìn)行1)提取來自乙烯處理轉(zhuǎn)變體(58-33)和非轉(zhuǎn)變體(58-25)植物葉的總RNA,如實施例2所述。2)來自總RNA的多聚(A)RNA用Qiagen試劑盒提取，如實施例2所述。3)1步驟RT-PCR用特異于克隆P-450的引物遵循廠商過程(Invitrogen)進(jìn)行。多聚A豐富的RNA加入反應(yīng)混合物，與之一起的是25nl2X反應(yīng)混合物、1^110mM正義引物、1^110^M反義引物、lplRT/Platinumtaq混合物和補至50^1的水。反應(yīng)條件是5(TC20分鐘，隨后94。C2分鐘，進(jìn)行40個PCR循環(huán)94°C30秒、55'C30秒、70'C1分鐘，72'C另外延伸10分鐘。10微升擴增樣品通過電泳用1%瓊脂糖膠分析。實施例7:確定克隆片段的特征-NORTHERN印跡分析除了Southern印跡分析，雜交一些膜并如Northern印跡分析的例子所述來檢測。Northern雜交用于如下檢測煙草中差異表達(dá)的mRNA。第1步，探針制備隨機引物方法用于從克隆p450DNA片段中制備探針(隨機引物DNA生物素化的試劑盒，KPL)?；旌舷铝谐煞?.5網(wǎng)DNA模板(在水浴中煮沸5-10分鐘且使用前冰上冷凍)；1X隨機引物溶液；1XdNTP混合物；10單位Klenow和水加入以使反應(yīng)達(dá)到50pl?；旌衔镌?7'C孵育1-4小時。反應(yīng)用2^1200mMEDTA終止。探針通過在使用前95。C孵育5分鐘來變性。第2步，樣品制備RNA樣品制備自乙烯處理和非處理的新鮮葉及衰老葉。在一些情況中，使用多聚A豐富的RNA。約15pg總RNA或1.8嗎mRNA(RNA和mRNA的提取方法描述于實施例5)用DEPCH20(5-l(^l)變成等體積。加入相同體積的上樣緩沖液(lxM0PS;18.5%甲醛；50%甲酰胺；4%Ficoll400;溴酚藍(lán))和0.5^1EtBr(0.5pgAi1)。樣品在9(TC加熱5分鐘，冰上冷凍。第3步，通過電泳分離RNA:樣品在甲醛膠(1%瓊脂糖，lxM0PS，0.6M甲醛)上進(jìn)行電泳，用1XM0P緩沖液(0.4M嗎啉代丙垸磺酸；0.1M乙酸鈉-3xH20;10mMEDTA;用Na0H調(diào)至pH7.2)。RNAs轉(zhuǎn)至Hybond-N+膜(尼龍，AmershamPharmaciaBiotech),這是通過毛細(xì)管方法在10XSSC緩沖液(1.5MNaCl;0.15檸檬酸鈉)中轉(zhuǎn)移。有RNA樣品的膜在雜交前UV-交聯(lián)(自動交聯(lián)設(shè)置，254nm，Stratagene，Stratalinker)。第4步，雜交膜用5-10ml預(yù)雜交緩沖液(5xSSC;50%甲酰胺；5xDenhardt溶液；1%SDS;100Hg/ml熱變性剪切的非同源DNA)在42'C預(yù)雜交1-4小時。棄去舊的預(yù)雜交緩沖液，加入新的預(yù)雜交緩沖液和探針。雜交在42。C過夜完成。膜用2xSSC室溫洗15分鐘，接著用2xSSC、0.1%SDS在65。C洗2次，最后用0.lxSSC洗，或用O.1SDS在65'C再洗(任選)。第5步，檢觀ij:AP-鏈霉抗生物素蛋白和CDP-Star用于檢測雜交信號(KPLDNA檢測器Northern印跡試劑盒)。膜用IX檢測器封閉溶液室溫封閉30分鐘。棄去封閉緩沖液且膜在有1:10，000AP-SA的新IX檢測器封閉溶液中室溫孵育1小時。膜在IX磷酸酶洗液中洗3次，接著用IX磷酸酶測定緩沖液洗2次。信號用CDP-Star化學(xué)發(fā)光底物檢測。濕的膜在莎倫TM包裝膜下對X光膠片曝光。分析結(jié)果并記錄。發(fā)明的主要焦點是發(fā)現(xiàn)了新基因，基因可由乙烯處理而導(dǎo)入或在煙草葉性質(zhì)和構(gòu)成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。如下表所示，Northern印跡用于確定相對非誘導(dǎo)植物，哪些基因被乙烯處理誘導(dǎo)。有趣的是，不是所有片段在轉(zhuǎn)變體和非轉(zhuǎn)變體中所受影響類似。部分測序感興趣的細(xì)胞色素P450片段以確定它們的結(jié)構(gòu)相關(guān)性。此信息用于隨后分離和測序全長基因克隆。用下調(diào)方法的功能分析在有片段基因的完整植物中進(jìn)行。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>實施例8:分離核酸片段的核酸同一性和結(jié)構(gòu)相關(guān)性超過100個克隆P450片段結(jié)合Northern印跡分析測序以確定它們的結(jié)構(gòu)相關(guān)性。所用方法使用正向引物，引物以位于P450基因羧基末端附近的2個共同P450基序之一為基礎(chǔ)。正向引物對應(yīng)于細(xì)胞色素P450基序FXPERF或GRRXCP(A/G)，如圖1所示。反向引物使用來自質(zhì)?；蚨嗑跘尾部的標(biāo)準(zhǔn)引物，質(zhì)粒SP6或T7位于pGEM質(zhì)粒兩臂。所用操作如下所述。分光光度測定法用于估計起始雙鏈DNA濃度，遵循廠商操作(BeckmanCoulter)。模板用水稀釋到合適濃度，95'C加熱2分鐘來變性，隨后置于冰上。測序反應(yīng)在冰上準(zhǔn)備，使用0.5到10pl變性DNA模板、2^11.6皮摩爾正向引物、8^1DTCSQuickStartMaster混合物，總體積用水加至20pl。熱循環(huán)程序由30個下列循環(huán)組成96°C20秒，5(TC20秒，60'C4分鐘，接著保持于4。C。終止序列通過加入5^1終止緩沖液(等體積3MNaOAc和100mMEDTA和1^120mg/ml糖原)。樣品用6(^1冷的95%乙醇沉淀并在6000g離心6分鐘。棄乙醇。沉淀用200^1冷的70%乙醇洗。沉淀干燥后，加入40plSLS溶液且重懸浮沉淀。覆蓋一層礦物油。隨后樣品置于CEQ8000自動測序儀上用于進(jìn)一步分析。為檢驗核酸序列，核酸序列以2個方向重測序，使用相對P450基因FXPERF或GRRXCP(A/G)區(qū)的正向引物和相對質(zhì)?；蚨嗑跘尾部的反向引物。所有測序以2向方面至少進(jìn)行2次。相互比較細(xì)胞色素P450片段核酸序列的編碼區(qū)，編碼區(qū)對應(yīng)于編碼GRRXCP(A/G)基序的區(qū)后第一個核酸到終止密碼子。選擇此區(qū)作為P450蛋白間遺傳多樣性的指示。觀察到大量遺傳不同的P450基因類似于其它植物屬的基因，超過70個基因。在比較核酸序列上，發(fā)現(xiàn)基因可在其序列同一性基礎(chǔ)上置于不同序列組。發(fā)現(xiàn)P450成員的最佳獨特分組確定為核酸同一性為75%或更高的序列(示于表1)。減少同一性百分比產(chǎn)生顯著更大的組。對核酸同一性為81%或更高的序列觀察到優(yōu)選分組，更優(yōu)選分組為91%核酸同一性或更高，最優(yōu)選分組為99%核酸同一性或更高。大部分組包含至少2個成員且常為3個或多個成員。沒有重復(fù)發(fā)現(xiàn)其它，暗示采用的方法能分離所用組織中的低和高表達(dá)mRNA。在75%核酸同一性或更高的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)2個細(xì)胞色素P450組包含相對前面煙草細(xì)胞色素基因的核酸序列同一性，煙草細(xì)胞色素基因與組間基因在遺傳上不同。組23分別顯示與前面Czernic等的GenBank序列GI:1171579(CAA64635)和Ralston等的GI:14423327(或AAK62346)的核酸同一性，在表I所用參數(shù)內(nèi)。GI:1171579與組23成員的核酸同一性范圍從96.9%到99.5%,而GI:14423327與此組的同一性范圍從95.4%到96.9%。組31成員與Ralston等報導(dǎo)的GenBank序列GI:14423327(AAK62346)的核酸同一性范圍從76.7%到97.8%。沒有其它表1的P450同一性組包含相對煙草P450s基因的參數(shù)同一性，如表1所用，煙草P450s基因由Ralston等、Czernic等、Wang等或LaRosa和Smigocki報導(dǎo)。如圖76所示，能獲得具適當(dāng)核酸簡并探針的共有序列，用于組以優(yōu)選鑒定和分離來自煙草植物各組的另外成員。表I:煙草P450核酸序列同一性組組片段_1D58-BG7(SEQIDNO.:1)，D58-ABl(SEQIDNO.:3)，D58-BE4(SEQIDNO.:7)2D56-AH7(SEQIDNO.:9);D13a-5(SEQIDNO.:11)3D56-AG10(SEQIDNO.:13);D35-33(SEQIDNO.:15);D34-62(SEQIDNO.:17)4D56-AA7(SEQIDNO.:19);D56-AEl(SEQIDNO.:21);185-BD3(SEQIDNO.:143)5D35-BB7(SEQIDNO.:23);D177-BA7(SEQIDNO.:25);D56A-AB6(SEQIDNO.:27);D144-AE2(SEQIDNO.:29)6D56-AG11(SEQIDNO.:31);D179-Ml(SEQIDNO.:33)7D56-AC7(SEQIDNO.:35);D144-AD1(SEQIDNO.:37)8D144-AB5(SEQIDNO.:39)9D181-AB5(SEQIDNO.:41);D73-Ac9(SEQIDNO.:43)10D56-AC12(SEQIDNO.:45)11D58-AB9(SEQIDNO.:47);D56-AG9(SEQIDNO.:49);D56-AG6(SEQIDNO.:51);D35-BG11(SEQIDNO.:53);D35-42(SEQIDNO.:55);D35-BA3(SEQIDNO.:57);D34-57(SEQIDNO.:59);D34-52(SEQIDNO.:61);D34-25(SEQIDNO,:63)12D56-ADIO(SEQIDNO.:65)1356-Mil(SEQIDNO.:67)14D177-BD5(SEQIDNO.:69);D177-BD7(SEQIDNO.:83)15D56A-AGIO(SEQIDNO.:71);D58-BC5(SEQIDNO.:73);D58-AD12(SEQIDNO.:75)16D56-ACll(SEQIDNO.:77);D35-39(SEQIDNO.:79);D58-BH4(SEQIDNO.:81);D56-AD6(SEQIDNO.:87)17D73A-AD6(SEQIDNO.:89);D70A-BAll(SEQIDNO.:91〉；D70A-BB5(SEQIDNO,:93)18D70A-AB5(SEQIDNO.:95);D70A-M8(SEQIDNO.:97)19D70A-AB8(SEQIDNO.:99);D70A-BH2(SEQIDNO.:101);D70A—AA4(SEQIDNO.:103)20D70A-BAl(SEQIDNO.:105);D70A-BA9(SEQIDNO.:107);D176-BG2(SEQIDNO.:141)21D70A-BD4(SEQIDNO.:109)22D18卜AC5(SEQIDNO.:111);D144-AHl(SEQIDNO.:113);D34-65(SEQIDNO.:115)23D35-BG2(SEQIDNO.:117)24D73A-AH7(SEQIDNO.:119)25D58-AA1(SEQIDNO.:121);D185-3C1(SEQIDNO.:133);D185-BG2(SEQIDNO.:135)26D73-AE10(SEQIDNO.:123)27D56-AC12(SEQIDNO.:125)28D177-BF7(SEQIDNO.:127);D185-BE1(SEQIDNO.:137);185-BD2(SEQIDNO.:139)29D73A-AG3(SEQIDNO.:129)30D70A-AA12(SEQIDNO.:131):D176-BF2(SEQIDNO.:85)31D176-BC3(SEQIDNO.:145)32D176-BB3(SEQIDNO.:147)33D186-AH4(SEQIDNO.:5)實施例9:分離核酸片段的氨基酸序列同一性推斷來自實施例8細(xì)胞色素P450片段核酸序列的氨基酸序列。推斷區(qū)對應(yīng)于GXRXCP(A/G)序列基序后緊接的氨基酸到羧基末端或終止密碼子。在比較片段序列同一性上，對氨基酸同一性為70%或更高的序列觀察到獨特分組。對氨基酸同一性為80%或更高的序列觀察到優(yōu)選分組，更優(yōu)選90%氨基酸同一性或更高，最優(yōu)選分組為99%氨基酸同一性或更高。組和組成員的對應(yīng)氨基酸序列示于圖2。發(fā)現(xiàn)一些獨特核酸序列與其它片段有完全的氨基酸同一性，因此僅報導(dǎo)了1個有相同氨基酸的成員。表II組19的氨基酸同一性在其核酸序列基礎(chǔ)上對應(yīng)于3個不同組。各組成員的氨基酸序列和其同一性示于圖77。氨基酸區(qū)別被適當(dāng)標(biāo)記。各氨基酸同一性組的至少1個成員被選擇用于基因克隆和使用植物的功能研究。另外，受乙烯處理影響不同的組成員或其它由Northern和Southern分析評估的生物差異被選擇用于基因克隆和功能研究。為協(xié)助基因克隆，表達(dá)研究和完整植物評估、肽特異抗體在序列同一性和差異序列基礎(chǔ)上制備。表II:煙草P450氨基酸序列同一性組組片段_1D58-BG7(SEQIDNO.:2),D58-AB1(SEQIDNO.:4)2D58-BE4(SEQIDNO.:8)3D56-AH7(SEQIDNO.:10);D13a-5(SEQIDNO.:12)4D56-AGIO(SEQIDNO.:14);D34-62(SEQIDNO.:18)5D56-AA7(SEQIDNO.:20);D56-AE1(SEQIDNO.:22);185-BD3(SEQIDNO.:144)6D35-BB7(SEQIDNO.:24);D177-BA7(SEQIDNO.:26);D56A-AB6(SEQIDNO.:28);D144-AE2(SEQIDNO.:30)7D56-AGll(SEQIDNO.:32);D179-AAl(SEQIDNO.:34)8D56-AC7(SEQIDNO.:36);D144-ADl(SEQIDNO.:38)9D144-AB5(SEQIDNO.:40)10D181-AB5(SEQIDNO.:42);D73-Ac9(SEQIDNO.:44)11D56-AC12(SEQIDNO.:46)12D58-AB9(SEQIDNO.:48);D56-AG9(SEQIDNO.:50);D56-AG6(SEQIDNO.:52);D35-BG11(SEQIDNO.:54);D35-42(SEQIDNO,:56);D35-BA3(SEQIDNO.:58);D34-57(SEQIDNO.:60);D34-52(SEQIDNO.:62)13D56AD10(SEQIDNO.:66)1456-Mil(SEQIDNO.:68)15D177-BD5(SEQIDNO.:70);D177-BD7(SEQIDNO.:84)16D56A-AGIO(SEQIDNO.:72);D58-BC5(SEQIDNO.:74);D58-AD12(SEQIDNO,:76)17D56-ACll(SEQIDNO.:78);D56-AD6(SEQIDNO.:88)18D73A-AD6(SEQIDNO.:90);D70A-BB5(SEQIDNO.:94)19D70A-AB5(SEQIDNO.:96);D70A-AB8(SEQIDNO.:100);D70A-BH2(SEQIDNO.:102);D70A-AA4(SEQIDNO.:104);D70A-BAl(SEQIDNO.:106);訓(xùn)A-BA9(SEQIDNO.:108);D176-BG2(SEQIDNO.:142)20D70A-BD4(SEQIDNO.:110)21D181-AC5(SEQIDNO.:112);D144-AH1(SEQIDNO.:114);D34-65(SEQIDNO.:116)22D35-BG2(SEQIDNO.:118)23D73A-AH7(SEQIDNO,:120)24D58-AA1(SEQIDNO.:122);D185-BCl(SEQIDNO.:134);D185-BG2(SEQIDNO.:136)25D73-AEIO(SEQIDNO.:124)26D56-AC12(SEQIDNO.:126)27D177-BF7(SEQIDNO.:128);185-BD2(SEQIDNO.:140)28D73A-AG3(SEQIDNO.:130)29D70A-AA12(SEQIDNO.:132);D176-BF2(SEQIDNO.:86)30D176-BC3(SEQIDNO.:146)31D176-BB3(SEQIDNO.:148)32D186-AH4(SEQIDNO.:6)實施例10:克隆全長cDNAP450克隆cDNA文庫通過如下從乙烯處理葉中制備總RNA來構(gòu)建。首先，總RNA提取自乙烯處理葉，使用修改的酸性苯酚和氯仿提取操作。修改操作以使用1克組織，組織被研磨且隨后在5ml提取緩沖液(100mMTris-HCl，pH8.5;200raMNaCl;10mMEDTA;0.5%SDS)中渦旋，緩沖液加入5ml苯酚(pH5.5)和5ml氯仿。離心提取樣品，保存上清。此提取步驟再重復(fù)2-3次直到上清呈現(xiàn)清澈。加入約5ml氯仿以去除痕量苯酚。RNA從混合上清部分沉淀，這是通過加入3倍體積ETOH和1/10體積3MNaOAc(pH5.2)并在-2(TC保存1小時。轉(zhuǎn)移至ljCorex玻璃容器后，它在4'C以9,000RPM離心45分鐘。沉淀用70%乙醇洗，在4'C以9，000RPM旋轉(zhuǎn)5分鐘。沉淀干燥后，沉淀的RNA溶于0.5ml無RNA酶的水?？俁NA的性質(zhì)和量分別通過變性甲醛膠和分光光度計分析。所得總RNA通過下列操作分離多聚A+RNA，使用寡d(T)纖維素操作(Invitrogen)和微離心旋轉(zhuǎn)柱(Invitrogen)。約20mg總RNA進(jìn)行2次純化以獲得高質(zhì)量多聚A+RNA。分析多聚A+RNA產(chǎn)物，通過變性甲醛膠和隨后RT-PCR已知全長基因以確保高質(zhì)量mRNA。另外，對來自乙烯處理非轉(zhuǎn)變體葉、零小時乙烯處理轉(zhuǎn)變體葉和乙烯處理轉(zhuǎn)變體葉的多聚A+RNA進(jìn)行Northern分析，使用全長p450作為探針。方法以廠商說明提供的操作(KPLRNA檢測器Northern印跡試劑盒)為基礎(chǔ)，各樣品使用1.8pg多聚A+RNA。含膠的RNA過夜轉(zhuǎn)移，使用20XSSC作為轉(zhuǎn)移緩沖液。其次，多聚A+RNA用作模板以生成cDNA文庫，使用cDNA合成試劑盒、ZAP-cDNA合成試劑盒、ZAP-cDNAGigapackIII金克隆試劑盒(Stratagene)。方法包括遵循詳細(xì)說明的廠商操作。約8ng多聚A+RNA用于構(gòu)建cDNA文庫。分析初級文庫顯示約2.5X106-lX107pfu。文庫的質(zhì)量背景測試通過a-互補完成，使用IPTG和X-gal，其中重組斑以高于背景反應(yīng)100倍表達(dá)。通過隨機PCR更定量分析文庫顯示插入cDNA的平均大小約為1.2kb。方法使用如下的兩步驟PCR方法。對于第l個步驟，設(shè)計反向引物是以獲得自P450片段的初步序列信息為基礎(chǔ)。設(shè)計的反向引物和T3(正向)引物用于從cDNA文庫擴增對應(yīng)基因。PCR反應(yīng)進(jìn)行瓊脂糖電泳，對應(yīng)高分子量的帶被切下、純化、克隆和測序。在第2個步驟中，如正向引物從P4505，UTR或起始編碼區(qū)設(shè)計的新引物與反向引物(從P4503'UTR設(shè)計)一起用于隨后的PCR以獲得全長p450克隆。全長p450基因通過PCR方法從構(gòu)建的cDNA文庫中分離。2個PCR步驟用于克隆全長基因。在第1個PCR步驟中，非特異反向引物(T3)和特異正向引物(產(chǎn)生自P450s下游序列)用于從cDNA文庫克隆P450s的5'末端。PCR片段被分離、克隆和測序，用于設(shè)計下一步PCR的正向引物。2個特異引物用于在第2個PCR步驟中克隆全長p450克隆。隨后測序克隆。預(yù)期本領(lǐng)域技術(shù)人員在實踐發(fā)明中會根據(jù)上述發(fā)明的詳細(xì)說明作出許多修改和變化。結(jié)果，這些修改和變化包括在下列權(quán)利要求范圍中。權(quán)利要求1.一種分離的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括的核酸序列選自SEQ.ID.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147或149。2.如權(quán)利要求1所述的分離核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括細(xì)胞色素P450基因的片段。3.—種分離的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子與權(quán)利要求1所述的核酸分子有至少75%的同一性。4.一種分離的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子與權(quán)利要求1所述的核酸分子有至少91%的同一性。5.—種分離的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子與權(quán)利要求1所述的核酸分子有至少99%的同一性。6.—種轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因植物包括權(quán)利要求l、2、3、4或5所述的核酸分子。7.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，所述植物是煙草植物。8.—種制造轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟-(i)將權(quán)利要求1、2、3、4或5所述核酸分子與所述植物中有功能的啟動子可操作連接以產(chǎn)生植物轉(zhuǎn)化載體；和(ii)用步驟(i)的所述植物的轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化所述植物；(iii)選擇被所述轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；以及(iv)從步驟(m)的所述植物細(xì)胞再生植物。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述核酸分子為反義方向。10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述核酸分子為正義方向。11.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述核酸分子是以RNA干擾方向。12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述核酸分子表達(dá)為雙鏈RNA分子。13.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述雙鏈RNA分子長度約為15到25個核苷酸。14.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述植物是煙草植物。15.—種選擇含核酸分子的植物的方法，其特征在于，分析所述植物核酸序列的存在情況，其中所述核酸序列選自SEQ.ID.l、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145或147。16.如權(quán)利要求15所述的選擇植物的方法，其特征在于，所述植物通過DNA雜交分析。17.如權(quán)利要求15所述的選擇植物的方法，其特征在于，所述植物通過PCR檢測分析。18.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述DNA雜交包括核酸探針，所述核酸探針選自SEQ.ID.l、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145或147。19.如權(quán)利要求15所述的選擇植物方法，其特征在于，所述植物是轉(zhuǎn)基因植物。20.如權(quán)利要求15所述的選擇植物方法，其特征在于，所述植物選自突變?nèi)后w。21.如權(quán)利要求15所述的選擇植物方法，其特征在于，所述植物選自繁殖種群。全文摘要本發(fā)明涉及煙草的P450酶和編碼P450酶的核酸序列以及使用這些酶和核酸序列來改變植物表型的方法。文檔編號A01H1/00GK101166824SQ03805747公開日2008年4月23日申請日期2003年3月12日優(yōu)先權(quán)日2002年3月12日發(fā)明者D·徐申請人:美國無煙煙草公司