專利名稱：參與油菜素類固醇合成的基因的制作方法
權(quán)利要求書(shū)(按照條約第19條的修改)1.(刪除)2.具有核苷酸序列(1)或(2)，及(3)或(4)的多核苷酸(1)SEQ ID NO1的核苷酸序列，(2)編碼以下蛋白質(zhì)之一的核苷酸序列，(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白質(zhì)，(b)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中缺失、取代或添加一或幾個(gè)氨基酸并且其表達(dá)刺激油菜素類固醇的生物合成，(3)SEQ ID NO3的#51到#1625的核苷酸序列，(4)編碼以下蛋白質(zhì)之一的核苷酸序列，(c)具有SEQ ID NO4氨基酸序列的蛋白質(zhì)，(d)具有SEQ ID NO4氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中缺失、取代或添加一或幾個(gè)氨基酸并且其表達(dá)刺激油菜素類固醇的生物合成。
3.(刪除)4.(刪除)5.一種包含一個(gè)啟動(dòng)子及權(quán)利要求2的多核苷酸的多核苷酸，其中所述兩個(gè)核苷酸序列以正向連接所述啟動(dòng)子。
6.一種包含一個(gè)啟動(dòng)子及權(quán)利要求2的多核苷酸或該多核苷酸一部分的多核苷酸，其中至少一個(gè)所述核苷酸序列或其一部分以反向連接所述啟動(dòng)子。
7.(修改)一種包含權(quán)利要求2、5和6任一項(xiàng)的基因或多核苷酸的質(zhì)粒。
8.(修改)一種用權(quán)利要求2、5和6任一項(xiàng)的基因或多核苷酸轉(zhuǎn)化的植物。
9.(修改)一種改變植物形態(tài)學(xué)的方法，所述方法包括如下步驟用權(quán)利要求2的多核苷酸轉(zhuǎn)化植物，并促進(jìn)或抑制所述基因或所述多核苷酸的表達(dá)。
10.(修改)一種改變植物形態(tài)學(xué)的方法，所述方法包括如下步驟刺激用權(quán)利要求5或6的基因或多核苷酸轉(zhuǎn)化的所述植物的啟動(dòng)子。
11.通過(guò)權(quán)利要求9或10的方法改變了形態(tài)學(xué)的植物。
12.(刪除)13.(修改)一種下述(a)或(b)的蛋白質(zhì)和下述(c)或(d)的蛋白質(zhì)的混合物或復(fù)合物(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白質(zhì)，(b)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中缺失、取代或添加一或幾個(gè)氨基酸并且其表達(dá)刺激油菜素類固醇的生物合成，(c)具有SEQ ID NO4氨基酸序列的蛋白質(zhì)，(d)具有SEQ ID NO4氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中缺失、取代或添加一或幾個(gè)氨基酸并且其表達(dá)刺激油菜素類固醇的生物合成。
換句話說(shuō)，在完整植物中只表達(dá)ROT3(＝CYP90C1)只對(duì)葉及花器官有效，特別在縱向上有效。花器官衍生自變形的葉，在它們間存在基因調(diào)節(jié)形態(tài)學(xué)的共同途徑。另一方面，ROT3(＝CYP90C1)和CYP90D1的組合對(duì)整體植物都有效。通過(guò)操縱ROT3(＝CYP90C1)和CYP90D1的核酸及這些基因編碼的蛋白質(zhì)，可以隨意及同時(shí)改變?nèi)~和花的形狀，并且還可以只改變花的形狀而不改變植物主要部分的高度及葉的形狀。
就是說(shuō)，本發(fā)明涉及具有核苷酸序列(1)或(2)的基因(A)(1)SEQ ID NO1的核苷酸序列，(2)編碼以下蛋白質(zhì)之一的核苷酸序列，(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白質(zhì)，(b)具有衍生自SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中缺失、取代或添加一或幾個(gè)氨基酸并且其表達(dá)刺激油菜素類固醇的生物合成。
而且，本發(fā)明也涉及具有核苷酸序列(1)或(2)，及(3)或(4)的多核苷酸(B)(1)SEQ ID NO1的核苷酸序列，(2)編碼以下蛋白質(zhì)之一的核苷酸序列，(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白質(zhì)，(b)具有SEQ ID NO2氨基酸的蛋白質(zhì)，其中缺失、取代或添加一或幾個(gè)氨基酸并且其表達(dá)刺激油菜素類固醇的生物合成，(3)SEQ ID NO3的#51到#1625的核苷酸序列，(4)編碼以下蛋白質(zhì)之一的核苷酸序列，(c)具有SEQ ID NO4氨基酸序列的蛋白質(zhì)，(d)具有SEQ ID NO4氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中缺失、取代或添加一或幾個(gè)氨基酸并且其表達(dá)刺激油菜素類固醇的生物合成。
而且，本發(fā)明涉及i)包含一個(gè)啟動(dòng)子及基因(A)的多核苷酸，所述基因的核苷酸序列以正向連接所述啟動(dòng)子，ii)包含一個(gè)啟動(dòng)子及基因(A)的基因或部分基因的多核苷酸，其核苷酸序列或部分所述核苷酸序列以反向連接所述啟動(dòng)子，iii)包含一個(gè)啟動(dòng)子及所述多核苷酸(B)的多核苷酸，其中上述兩個(gè)核苷酸序列以正向連接所述啟動(dòng)子，或者iv)包含一個(gè)啟動(dòng)子及多核苷酸(B)或其部分的多核苷酸，其中至少一個(gè)上述核苷酸的核苷酸序列或其部分以反向連接上述啟動(dòng)子。
本文所用的啟動(dòng)子在后詳述，包括花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子、熱休克啟動(dòng)子、化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子等。另外，對(duì)將啟動(dòng)子與上述基因的連接方式?jīng)]有限制，連接可以使用遺傳工程常規(guī)技術(shù)適當(dāng)進(jìn)行。
另外，本發(fā)明涉及含有上述基因或上述多核苷酸之一的質(zhì)粒及上述基因或上述多核苷酸轉(zhuǎn)化的植物。
而且，本發(fā)明涉及含有上述多核苷酸的質(zhì)粒。本文所用質(zhì)粒包括雙元載體如pBI-121質(zhì)粒、Ti質(zhì)粒等。
而且，本發(fā)明可應(yīng)用的植物包括所有種子植物。
為轉(zhuǎn)化這些植物，本發(fā)明的基因插入可以使用常規(guī)遺傳工程方法轉(zhuǎn)化上述植物的上述質(zhì)粒中。
另外，本發(fā)明涉及改變植物形態(tài)學(xué)的方法，所述方法包括通過(guò)基因(A)或多核苷酸(B)轉(zhuǎn)化植物及增強(qiáng)或抑制上述基因或上述多核苷酸表達(dá)的步驟。而且，本發(fā)明涉及改變植物形態(tài)學(xué)的方法，所述植物被上述基因或多核苷酸任一所轉(zhuǎn)化，所述方法包括刺激轉(zhuǎn)化植物中相應(yīng)啟動(dòng)子的步驟。并且，本發(fā)明涉及通過(guò)上述方法任一項(xiàng)改變了形態(tài)學(xué)的植物。
而且，本發(fā)明涉及以下蛋白質(zhì)(a)或(b)(a)具有SEQ ID NO2氨基酸的蛋白質(zhì)，
(b)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中缺失、取代或添加一或幾個(gè)氨基酸并且其表達(dá)刺激油菜素類固醇的生物合成。
而且，本發(fā)明涉及上述蛋白質(zhì)及以下蛋白質(zhì)(c)或(d)的混合物或復(fù)合物(c)具有SEQ ID NO4氨基酸的蛋白質(zhì)，(d)具有SEQ ID NO4氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中缺失、取代或添加一或幾個(gè)氨基酸并且其表達(dá)刺激油菜素類固醇的生物合成。
可通過(guò)使用以下方法操縱CYP90D1及ROT3(＝CYP90C1)的核酸分子和其編碼的蛋白質(zhì)(1)包含以下步驟的方法將一可操縱的啟動(dòng)子與CYP90D1(SEQ ID NO1)和ROT3(＝CYP90C1，SEQ ID NO3的#51到#1625)的DNA分子連接，將其通過(guò)適當(dāng)?shù)某Ｒ?guī)方法如Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)入植物，并施加外部刺激使啟動(dòng)子調(diào)節(jié)上述基因的表達(dá)。此處使用的啟動(dòng)子例如如下*35S啟動(dòng)子(可以組成性表達(dá))*熱休克啟動(dòng)子(可以溫度依賴性表達(dá))*Dex-誘導(dǎo)啟動(dòng)子(可以通過(guò)暴露于地塞米松表達(dá))*矮牽牛(petunia)CHS-A啟動(dòng)子(彩色花瓣植物中花瓣特異表達(dá)并且在擬南芥中是糖依賴性表達(dá)，對(duì)花瓣非特異，但特異于葉芽)除了這些啟動(dòng)子，可以使用植物領(lǐng)域常規(guī)的其它啟動(dòng)子。
(2)抑制ROT3或CYP90D1功能的方法可通過(guò)反義RNA方法(一種轉(zhuǎn)導(dǎo)改變了的基因使得以反向被轉(zhuǎn)錄的方法)或通過(guò)RNAi方法(一種轉(zhuǎn)導(dǎo)改變了的基因使得以正向及反向串聯(lián)連接基因的一部分及因而被全部轉(zhuǎn)錄的方法)抑制特異基因的功能。本發(fā)明應(yīng)用了上述方法抑制基因表達(dá)。因?yàn)橐呀沂玖税谢駽YP90D1(SEQ ID NO1)及ROT3(＝CYP90C1，SEQ ID NO3的#51到#1625)，所以可進(jìn)行其表達(dá)的定向抑制。
(3)組合方法首先獨(dú)立制備單獨(dú)改變的CYP90D1及ROT3(＝CYP90C1，SEQID NO3的#51到#1625)的植株(strain)，然后可以使用兩種方法通過(guò)傳統(tǒng)遺傳學(xué)在它們之間雜交或直接轉(zhuǎn)導(dǎo)兩個(gè)改變的基因?qū)a(chǎn)生雙重改變的植株。
(4)前體發(fā)酵的方法存在至少部分負(fù)責(zé)油菜素類固醇生物合成的基因當(dāng)在酵母細(xì)胞中表達(dá)時(shí)顯示酶活性的成功例子。使用這些例子的方法及提供適當(dāng)?shù)那绑w，可在酵母細(xì)胞或真核細(xì)胞中人工合成油菜素甾酮或油菜素內(nèi)酯(最終及活性產(chǎn)物)，其中表達(dá)了ROT3及CYP90D1或上述基因之一的組合。
附圖簡(jiǎn)述


圖1示出了油菜素類固醇生物合成的完整途徑。
圖2示出了以下培養(yǎng)在相同條件下的擬南芥葉的形態(tài)學(xué)野生型(Ws-2)(No.1)，制造例1的植株(ROT3功能被抑制)(No.2)，制造例2的植株(ROT3及CYP90D1功能被抑制)(No.3和4)。No.3和No.4分別示出了部分有效及強(qiáng)烈有效的植株。
圖3示出了用油菜素類固醇生物合成中間體及油菜素內(nèi)酯處理后沒(méi)有ROT3及CYP90D1功能的植株葉的形態(tài)學(xué)。對(duì)照未處理，6-D-CT用以下物質(zhì)處理(下文同)6-Deoxocathasterone，6-D-TE6-Deoxoteasterone，6-D-3DT3-脫氫-6-deoxoteasterone，6-D-TY6-脫氧香蒲甾醇(6-Deoxotyphasterol)，6-D-CS6-脫氧油菜素甾酮(6-Deoxocastasterone)，CTCathasterone，TETeasterone，3DT3-Dehydroteasterone，TY香蒲甾醇(Typhasterol)，CS油菜素甾酮，BL油菜素內(nèi)酯。
發(fā)明效果以前的發(fā)明中對(duì)在植物中顯示獨(dú)特生理活性的類固醇的生物合成途徑的調(diào)節(jié)步驟有一些實(shí)際缺點(diǎn)。
即以前闡明的油菜素類固醇生物合成的調(diào)節(jié)因子涉及生物合成途徑的早期階段及在轉(zhuǎn)基因植物中增強(qiáng)因子的表達(dá)導(dǎo)致整體植物的細(xì)長(zhǎng)生長(zhǎng)及使植物增大。因此，除了特殊應(yīng)用外，上述調(diào)節(jié)因子沒(méi)有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。另一方面，在轉(zhuǎn)基因植物中停止生物合成途徑導(dǎo)致整體植物小型化，因而除了特殊應(yīng)用外沒(méi)有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。換句話說(shuō)，常規(guī)方法改變了植物的整體形狀，沒(méi)有實(shí)際價(jià)值。實(shí)際可用及有價(jià)值的轉(zhuǎn)基因植物如下實(shí)施例所示在園藝中，只有花器官的大小是大的或只有葉的大小是小的，或蔬菜改良中，只用葉的大小是大的。因此，常規(guī)方法在不組合特異表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)時(shí)進(jìn)行植物的生物設(shè)計(jì)是有困難的。相反，按照本發(fā)明，使用ROT3(＝CYP90C1)與CYP90D1的組合可以控制特異器官在特異方向上(特別是縱向)的大小及植物的整體大小。
而且，本發(fā)明闡明了ROT3(＝CYP90C1)與CYP90D1協(xié)同調(diào)節(jié)油菜素類固醇生物合成的最終步驟。因此，本發(fā)明可以用于作為油菜素類固醇化學(xué)合成的多種工業(yè)應(yīng)用。
以下實(shí)施例闡明了本發(fā)明，然而，其無(wú)限制本發(fā)明之意。
制造例1作為ROT3功能被抑制的植株，本發(fā)明人使用了擬南芥的無(wú)效突變體rot3-1，其是ROT3的功能缺陷型突變體(Tsgue等，Development1221589-1600(1996))。突變細(xì)胞系在無(wú)菌條件下接種并在連續(xù)照明下在23℃培養(yǎng)。
制造例2為得到ROT3和CYP90D1功能均被抑制的植株，本發(fā)明人首先從擬南芥中使用以下引物組分離了CYP90D1的cDNAROT3h-cDNA-for5’-GTTAAAACACTAATGGACAC-3’(SEQ IDNO5)；
ROT3h-cDNA-rev5’-TGATTTATATTCTTTTGATCC-3’(SEQ IDNO6)，其可以特異擴(kuò)增ROT3同源物(CYP90D1)。然后，上述CYP90D1(SEQ ID NO1)克隆插入通用載體pBI121以從花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子反向轉(zhuǎn)錄，其中插入潮霉素抗性基因作為選擇標(biāo)記并且除去GUS蛋白編碼區(qū)。將該構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)入農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)(C58C1 Rif-抗性)并通過(guò)in planta方法轉(zhuǎn)導(dǎo)入擬南芥rot3-1，使用農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)基的常規(guī)方式。通過(guò)潮霉素選擇轉(zhuǎn)化體后，具有純合插入基因的轉(zhuǎn)化體通過(guò)自花傳粉分離。然后，在無(wú)菌條件下接種植株并在連續(xù)照明下在23℃培養(yǎng)。
實(shí)施例1圖2示出了以下在相同條件下培養(yǎng)的擬南芥葉的形態(tài)學(xué)野生物種(Ws-2)(No.1)，制造例1的植株(ROT3功能被抑制)(No.2)，制造例2的植株(ROT3和CYP90D1功能被抑制)(No.3和4)。ROT3功能抑制的植株的葉(圖2-2)比野生型的葉(圖2-1)在縱向上短，ROT3和CYP90D1功能都被抑制的植株的葉(圖2-3&4)比以上植株的葉更短。簡(jiǎn)而言之，ROT3和CYP90D1是協(xié)同參與油菜素類固醇生物合成途徑的基因。
實(shí)施例2制造例2制備的ROT3和CYP90D1功能被抑制的植株在無(wú)菌條件下自種子開(kāi)始培養(yǎng)。上述植株的種子接種在補(bǔ)充了2％(w/v)蔗糖的MS培養(yǎng)基(通過(guò)0.2％脫乙酰吉蘭糖膠固化)中并在播種后在無(wú)菌條件下在連續(xù)照明下在23℃常規(guī)培養(yǎng)。
另一方面，制備油菜素類固醇生物合成中間體(例如，6-D-CT6-Deoxocathasterone，6-D-TE6-Deoxoteasterone，6-D-3DT3-脫氫-6-deoxoteasterone，6-D-TY6-脫氧香蒲甾醇，6-D-CS6-脫氧油菜素甾酮，CTCathasterone，TETeasterone，3DT3-Dehydroteasterone，TY香蒲甾醇，CS油菜素甾酮)和油菜素內(nèi)酯(BL)(BL得自WAKO pharmaceutical Co.(Fujikagaku Industry，Co.制造)，Dr.ShouzouJujioka，RIKEN和Dr.Tohide Takatsu，Jouetsu University of Education惠贈(zèng)其它油菜素類固醇)的水溶液(0.1μM)。
將上述植物(ROT3和CYP90D1功能被抑制的植株)沒(méi)入所述溶液中并輕輕搖動(dòng)在上述水溶液中培養(yǎng)。當(dāng)葉子用上述中間體或油菜素內(nèi)酯處理時(shí)，取出無(wú)菌條件下的植物，用手術(shù)刀切掉葉柄并以相同方式處理。圖3示出了這些葉子的照片。
如圖3所示，每個(gè)油菜素類固醇中間體對(duì)沒(méi)有ROT3及CYP90D1功能的植物沒(méi)有作用，然而，終產(chǎn)物油菜素內(nèi)酯(BL)誘導(dǎo)了大的葉子并示出獨(dú)特的效果。即，ROT3和CYP90D1協(xié)同參與油菜素類固醇生物合成途徑的終產(chǎn)物油菜素內(nèi)酯的合成。
實(shí)施例3在以下擬南芥中確定油菜素類固醇的濃度野生株(Ws-2)，制造例1的植株(rot3-1和rot3-5，抑制了ROT3功能)及制造例3的植株(rot3/CYP90D1，抑制了ROT3及CYP90D1的功能)。在形成花結(jié)時(shí)通過(guò)收割、冷凍及干燥收集植物的地上部分并通過(guò)使用HPLC及GC-MS檢測(cè)確定所述濃度。結(jié)果示于表1。
表1
注表中(-)示出數(shù)值小于檢測(cè)界限(0.001ng/g)。
如表所示，抑制了ROT3的植株(rot3-1和rot3-5)中，油菜素內(nèi)酯的產(chǎn)生顯著降低，結(jié)果是前一步驟中的油菜素類固醇(特別是油菜素甾酮)產(chǎn)量增多。然而，抑制ROT3沒(méi)有完全阻遏油菜素內(nèi)酯的產(chǎn)生。換句話說(shuō)，ROT3自身不能完全調(diào)節(jié)油菜素內(nèi)酯的生物合成。
另一方面，抑制了ROT3及CYP90D1功能的植株(rot3/CYP90D1)中，油菜素類固醇生物合成中間體中油菜素內(nèi)酯的量急劇減少，這表明從油菜素甾酮合成油菜素內(nèi)酯的途徑完全被同時(shí)抑制ROT3及CYP90D1所阻遏。換句話說(shuō)，油菜素內(nèi)酯的產(chǎn)生完全受ROT3及CYP90D1的組合作用調(diào)節(jié)。
序列表<110>獨(dú)立行政法人 科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu)<120>參與油菜素類固醇合成的基因<130>FS03-311PCT<160>6<210>1<211>1473<212>DNA<213>Arabidopsis thaliana<400>1atggacactt cttcttcact tttgttcttc tccttcttct tctttatcat catcgtcatc 60ttcaacaaga tcaacggtct cagatcatcc ccagcttcaa agaaaaaact taatgatcat 120catgttacat cccagagtca cggaccaaag tttccacacg gaagcttggg atggcccgtc 180atcggtgaaa ccatcgagtt cgtctcttct gcttactcag accgtcctga gagtttcatg 240gacaagcgtc gtctcatgta tgggagagtg tttaagtcgc atatttttgg aacggcgacg 300atcgtgtcga cggatgctga agtgaacaga gccgttttac agagcgactc gacagctttc 360gtgccgtttt acccaaaaac ggtaagggag ctaatgggaa aatcgtcgat acttcttatc 420aacgggagtt tacatagacg gttccatgga ttagtcggtt ctttcttaaa gtcgccactt 480ctcaaagctc aaatcgttag agacatgcac aagtttttgt cggaatccat ggatctatgg 540tccgaggacc aacctgtgct cctccaagac gtctccaaga ctgttgcatt caaagtactt 600gccaaggcat tgataagtgt agagaaagga gaagatttag aagagctaaa gagagagttt 660gaaaatttca tatcaggact catgtcatta ccaattaact tccctggaac gcaactccat 720agatctctcc aagctaagaa gaatatggtg aagcaagttg aaagaatcat agaaggcaaa 780attaggaaaa caaagaacaa ggaggaagat gatgttattg caaaggatgt tgtggatgtg 840ttgcttaagg actcaagtga acatttaact cacaatttga ttgctaacaa tatgatcgac 900atgatgatcc ctggccacga ttctgtccct gtcctcatta cccttgccgt caaattcctc 960tctgattctc ctgctgccct caatctccta acgaaaaaca tgaagctgaa aagtttgaag1020gaattgacag gagagccact atattggaat gactacttgt cgttaccttt aacacaaaag1080gtgattacag agacactgag aatgggaaat gttataattg gagtgatgag aaaggcgatg1140aaagatgttg aaataaaagg atatgtgata ccaaaaggat ggtgtttctt ggcctatctc1200agatcagttc atcttgatga agcttattat gagtctccgt acaaatttaa tccctggaga1260tggcaagaaa gggacatgaa cacgagtagt ttcagtcctt ttggaggtgg tcagagattg1320tgccctggtc tcgatttggc tcgtcttgaa acttcagttt ttcttcacca tcttgtcact1380cgcttcagat ggatagcaga agaagacaca atcataaact tcccaacggt gcatatgaag1440aacaaattac ccatttggat caaaagaata taa 1473<210>2<211>490<212>PRT<213>Arabidopsis thaliana<400>2Met Asp Thr Ser Ser Ser Leu Leu Phe Phe Ser Phe Phe Phe Phe Ile1 5 10 15Ile Ile Val Ile Phe Asn Lys Ile Asn Gly Leu Arg Ser Ser Pro Ala20 25 30Ser Lys Lys Lys Leu Asn Asp His His Val Thr Ser Gln Ser His Gly35 40 45Pro Lys Phe Pro His Gly Ser Leu Gly Trp Pro Val Ile Gly Glu Thr50 55 60Ile Glu Phe Val Ser Ser Ala Tyr Ser Asp Arg Pro Glu Ser Phe Met65 70 75 80Asp Lys Arg Arg Leu Met Tyr Gly Arg Val Phe Lys Ser His Ile Phe85 90 95Gly Thr Ala Thr Ile Val Ser Thr Asp Ala Glu Val Asn Arg Ala Val100 105 110Leu Gln Ser Asp Ser Thr Ala Phe Val Pro Phe Tyr Pro Lys Thr Val115 120 125Arg Glu Leu Met Gly Lys Ser Ser Ile Leu Leu Ile Asn Gly Ser Leu130 135 140His Arg Arg Phe His Gly Leu Val Gly Ser Phe Leu Lys Ser Pro Leu145 150 155 160
Leu Lys Ala Gln Ile Val Arg Asp Met His Lys Phe Leu Ser Glu Ser165 170 175Met Asp Leu Trp Ser Glu Asp Gln Pro Val Leu Leu Gln Asp Val Ser180 185 190Lys Thr Val Ala Phe Lys Val Leu Ala Lys Ala Leu Ile Ser Val Glu195 200 205Lys Gly Glu Asp Leu Glu Glu Leu Lys Arg Glu Phe Glu Asn Phe Ile210 215 220Ser Gly Leu Met Ser Leu Pro Ile Asn Phe Pro Gly Thr Gln Leu His225 230 235 240Arg Ser Leu Gln Ala Lys Lys Asn Met Val Lys Gln Val Glu Arg Ile245 250 255Ile Glu Gly Lys Ile Arg Lys Thr Lys Asn Lys Glu Glu Asp Asp Val260 265 270Ile Ala Lys Asp Val Val Asp Val Leu Leu Lys Asp Ser Ser Glu His275 280 285Leu Thr His Asn Leu Ile Ala Asn Asn Met Ile Asp Met Met Ile Pro290 295 300Gly His Asp Ser Val Pro Val Leu Ile Thr Leu Ala Val Lys Phe Leu305 310 315 320Ser Asp Ser Pro Ala Ala Leu Asn Leu Leu Thr Lys Asn Met Lys Leu325 330 335Lys Ser Leu Lys Glu Leu Thr Gly Glu Pro Leu Tyr Trp Asn Asp Tyr340 345 350Leu Ser Leu Pro Leu Thr Gln Lys Val Ile Thr Glu Thr Leu Arg Met355 360 365Gly Asn Val Ile Ile Gly Val Met Arg Lys Ala Met Lys Asp Val Glu370 375 380Ile Lys Gly Tyr Val Ile Pro Lys Gly Trp Cys Phe Leu Ala Tyr Leu385 390 395 400Arg Ser Val His Leu Asp Glu Ala Tyr Tyr Glu Ser Pro Tyr Lys Phe405 410 415Asn Pro Trp Arg Trp Gln Glu Arg Asp Met Asn Thr Ser Ser Phe Ser420 425 430Pro Phe Gly Gly Gly Gln Arg Leu Cys Pro Gly Leu Asp Leu Ala Arg435 440 445Leu Glu Thr Ser Val Phe Leu His His Leu Val Thr Arg Phe Arg Trp450 455 460Ile Ala Glu Glu Asp Thr Ile Ile Asn Phe Pro Thr Val His Met Lys465 470 475 480Asn Lys Leu Pro Ile Trp Ile Lys Arg Ile485 490<210>3<211>1934<212>DNA<213>Arabidopsis thaliana<400>3tgtgcttagg catatagtta ttcccaagaa accggtttaa ctgtttacgt atgcaacctc 60cggcaagcgc aggacttttc cggtcgccgg aaaatctccc ttggccttat aattacatgg120attatttggt cgctggtttc ttggttttga cggccggaat acttctccgt ccatggctct180ggtttcgtct acgaaactcg aaaacgaaag atggagatga agaagaagat aatgaggaga240agaagaaggg aatgattcca aacggaagct taggctggcc ggtgatcgga gaaaccctaa300acttcatcgc ttgtggttat tcttctcggc ctgttacctt catggacaaa cgaaagtctt360tatacgggaa agtgttcaaa acgaacataa tagggacacc aatcataata tcaaccgatg420cagaggtgaa taaagtggtg ctccaaaacc atgggaacac atttgtccct gcatacccta480aatcaattac ggaactactt ggagaaaact ctattctcag catcaatgga cctcatcaaa540aaaggcttca cacgctcatt ggcgcgttcc tcagatctcc tcacctcaaa gaccggatca600ctcgagacat tgaggcctcg gttgttctca ctttggcgtc ttgggctcaa cttccattgg660ttcatgttca ggatgagatc aaaaagatga cgtttgagat attagtaaaa gtgttgatga720gcacatctcc tggtgaagat atgaacattc tcaaacttga gttcgaagaa ttcatcaaag780
gtttgatttg tatcccaatc aaattccctg gcactagact ctacaaatcc ttaaaggcga 840aagagaggtt aataaagatg gtaaaaaagg ttgtggagga gagacaagtg gcgatgacaa 900cgacgtctcc ggcaaatgac gtggtggacg tacttctaag agacggtggt gattcagaga 960agcaatctca accgtcagat ttcgtcagcg gaaagatcgt agagatgatg atacccggag1020aggaaacaat gccaacggcg atgaccttgg ctgtcaaatt cttaagtgac aaccccgtcg1080ctctagccaa actcgtggag gagaatatgg agatgaagag gcgtaaattg gaattgggag1140aagaatacaa gtggaccgat tatatgtctc tctcttttac tcaaaatgtg ataaacgaaa1200cgcttagaat ggctaacatt attaacgggg tgtggaggaa agctctcaag gatgtagaaa1260ttaaaggtta cttaataccg aaaggatggt gtgtattggc atcattcata tcggttcaca1320tggatgaaga catttatgat aatccctatc aattcgatcc gtggagatgg gacagaatta1380atggatcggc aaacagcagt atttgcttca caccctttgg tggtgggcaa aggctatgtc1440ctggtttaga gctgtcgaag ctcgaaatat ccatctttct tcaccacctt gtaacccggt1500acagttggac ggctgaggaa gacgagatag tgtcatttcc gactgtgaag atgaagcgga1560ggctcccgat ccgagtggct actgtagatg atagtgcttc tccgatctca cttgaagatc1620attaatagat catttcaaag aacaaaactg tttgtgcaaa gaggaagcag agaagtaaac1680aaatgatctt attaacaaat agtagagaag agaagcaaac aagattggtg ggtaagacag1740aaagaacnaa acgtacagct agtgatggct caaagatgag agattctaat tataattttt1800tttgtttgtc atgtcaaatt ataagcgttg gttaggttgt ccctttctct tttatttatc1860gtaccaaacg caagttgaga tatgattcca tatatatgga tgatagatat gtatattaat1920atatagcggc cggg 1934<210>4<211>524<212>PRT<213>Arabidopsis thaliana<400>4Met Gln Pro Pro Ala Ser Ala Gly Leu Phe Arg Ser Pro Glu Asn Leu1 5 10 15Pro Trp Pro Tyr Asn Tyr Met Asp Tyr Leu Val Ala Gly Phe Leu Val20 25 30Leu Thr Ala Gly Ile Leu Leu Arg Pro Trp Leu Trp Phe Arg Leu Arg35 40 45Asn Ser Lys Thr Lys Asp Gly Asp Glu Glu Glu Asp Asn Glu Glu Lys50 55 60Lys Lys Gly Met Ile Pro Asn Gly Ser Leu Gly Trp Pro Val Ile Gly65 70 75 80Glu Thr Leu Asn Phe Ile Ala Cys Gly Tyr Ser Ser Arg Pro Val Thr85 90 95Phe Met Asp Lys Arg Lys Ser Leu Tyr Gly Lys Val Phe Lys Thr Asn100 105 110Ile Ile Gly Thr Pro Ile Ile Ile Ser Thr Asp Ala Glu Val Asn Lys115 120 125Val Val Leu Gln Asn His Gly Asn Thr Phe Val Pro Ala Tyr Pro Lys130 135 140Ser Ile Thr Glu Leu Leu Gly Glu Asn Ser Ile Leu Ser Ile Asn Gly145 150 155 160Pro His Gln Lys Arg Leu His Thr Leu Ile Gly Ala Phe Leu Arg Ser165 170 175Pro His Leu Lys Asp Arg Ile Thr Arg Asp Ile Glu Ala Ser Val Val180 185 190Leu Thr Leu Ala Ser Trp Ala Gln Leu Pro Leu Val His Val Gln Asp195 200 205Glu Ile Lys Lys Met Thr Phe Glu Ile Leu Val Lys Val Leu Met Ser210 215 220Thr Ser Pro Gly Glu Asp Met Asn Ile Leu Lys Leu Glu Phe Glu Glu225 230 235 240Phe Ile Lys Gly Leu Ile Cys Ile Pro Ile Lys Phe Pro Gly Thr Arg245 250 255Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Ala Lys Glu Arg Leu Ile Lys Met Val Lys260 265 270Lys Val Val Glu Glu Arg Gln Val Ala Met Thr Thr Thr Ser Pro Ala
275 280 285Asn Asp Val Val Asp Val Leu Leu Arg Asp Gly Gly Asp Ser Glu Lys290 295 300Gln Ser Gln Pro Ser Asp Phe Val Ser Gly Lys Ile Val Glu Met Met305 310 315 320Ile Pro Gly Glu Glu Thr Met Pro Thr Ala Met Thr Leu Ala Val Lys325 330 335Phe Leu Ser Asp Asn Pro Val Ala Leu Ala Lys Leu Val Glu Glu Asn340 345 350Met Glu Met Lys Arg Arg Lys Leu Glu Leu Gly Glu Glu Tyr Lys Trp355 360 365Thr Asp Tyr Met Ser Leu Ser Phe Thr Gln Asn Val Ile Asn Glu Thr370 375 380Leu Arg Met Ala Asn Ile Ile Asn Gly Val Trp Arg Lys Ala Leu Lys385 390 395 400Asp Val Glu Ile Lys Gly Tyr Leu Ile Pro Lys Gly Trp Cys Val Leu405 410 415Ala Ser Phe Ile Ser Val His Met Asp Glu Asp Ile Tyr Asp Asn Pro420 425 430Tyr Gln Phe Asp Pro Trp Arg Trp Asp Arg Ile Asn Gly Ser Ala Asn435 440 445Ser Ser Ile Cys Phe Thr Pro Phe Gly Gly Gly Gln Arg Leu Cys Pro450 455 460Gly Leu Glu Leu Ser Lys Leu Glu Ile Ser Ile Phe Leu His His Leu465 470 475 480Val Thr Arg Tyr Ser Trp Thr Ala Glu Glu Asp Glu Ile Val Ser Phe485 490 495Pro Thr Val Lys Met Lys Arg Arg Leu Pro Ile Arg Val Ala Thr Val500 505 510Asp Asp Ser Ala Ser Pro Ile Ser Leu Glu Asp His515 520<210>5<211>20<212>DNA<213>Artificial sequence<400>5gttaaaacac taatggacac20<210>6<211>21<212>DNA<213>Artificial sequence<400>6tgatttatat tcttttgatc c 2權(quán)利要求
1.一種具有核苷酸序列(1)或(2)的基因(1)SEQ ID NO1的核苷酸序列，(2)編碼以下蛋白質(zhì)之一的核苷酸序列，(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白質(zhì)，(b)具有衍生自SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中缺失、取代或添加一或幾個(gè)氨基酸并且其表達(dá)刺激油菜素類固醇的生物合成。
2.一種具有核苷酸序列(1)或(2)以及(3)或(4)的核苷酸序列的多核苷酸(1)SEQ ID NO1的核苷酸序列，(2)編碼以下蛋白質(zhì)之一的核苷酸序列，(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白質(zhì)，(b)具有SEQ ID NO2的氨基酸的蛋白質(zhì)，其中缺失、取代或添加一或幾個(gè)氨基酸并且其表達(dá)刺激油菜素類固醇的生物合成，(3)SEQ ID NO3的#51到#1625的核苷酸序列，(4)編碼以下蛋白質(zhì)之一的核苷酸序列，(c)具有SEQ ID NO4氨基酸序列的蛋白質(zhì)，(d)具有SEQ ID NO4氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中缺失、取代或添加一或幾個(gè)氨基酸并且其表達(dá)刺激油菜素類固醇的生物合成。
3.一種包含一個(gè)啟動(dòng)子及權(quán)利要求1的基因的多核苷酸，其中所述基因以正向連接所述啟動(dòng)子。
4.一種包含一個(gè)啟動(dòng)子及權(quán)利要求1的基因或該基因一部分的多核苷酸，其中所述基因以反向連接所述啟動(dòng)子。
5.一種包含一個(gè)啟動(dòng)子及權(quán)利要求2的多核苷酸的多核苷酸，其中所述兩個(gè)核苷酸序列以正向連接所述啟動(dòng)子。
6.一種包含一個(gè)啟動(dòng)子及權(quán)利要求2的多核苷酸或該多核苷酸一部分的多核苷酸，其中至少一個(gè)所述核苷酸序列或其一部分以反向連接所述啟動(dòng)子。
7.一種包含權(quán)利要求1到6任一項(xiàng)的基因或多核苷酸的質(zhì)粒。
8.一種用權(quán)利要求1到6任一項(xiàng)的基因或多核苷酸轉(zhuǎn)化的植物。
9.一種改變植物形態(tài)學(xué)的方法，所述方法包括如下步驟用權(quán)利要求1的基因或權(quán)利要求2的多核苷酸轉(zhuǎn)化植物，并促進(jìn)或抑制所述基因或所述多核苷酸的表達(dá)。
10.一種改變植物形態(tài)學(xué)的方法，所述方法包括如下步驟刺激用權(quán)利要求3到6任一項(xiàng)的基因或多核苷酸轉(zhuǎn)化的所述植物的啟動(dòng)子。
11.通過(guò)權(quán)利要求9或10的方法改變了形態(tài)學(xué)的植物。
12.下述(a)或(b)中的一種蛋白質(zhì)(a)具有SEQ ID NO2氨基酸的蛋白質(zhì)，(b)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中缺失、取代或添加一或幾個(gè)氨基酸并且其表達(dá)刺激油菜素類固醇的生物合成。
13.一種權(quán)利要求12的蛋白質(zhì)和下述(c)或(d)的蛋白質(zhì)的混合物或復(fù)合物(c)具有SEQ ID NO4氨基酸的蛋白質(zhì)，(d)具有SEQ ID NO4氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中缺失、取代或添加一或幾個(gè)氨基酸并且其表達(dá)刺激油菜素類固醇的生物合成。
全文摘要
本發(fā)明涉及廣泛發(fā)生在植物中的一種植物激素及在極低的濃度下顯示生理作用如細(xì)胞擴(kuò)散或細(xì)胞分裂的油菜素類固醇，控制其合成最終步驟的最重要的合酶蛋白及編碼其的核酸分子還不知道。將一已知ROT3基因(＝CYP90C1，SEQ ID NO3的51到1625位，登錄號(hào)AB008097)進(jìn)行同源搜索而發(fā)現(xiàn)了與其具有51％同源性的堿基序列。檢測(cè)這個(gè)序列的結(jié)果發(fā)現(xiàn)這個(gè)序列是控制具有調(diào)節(jié)植物大小等生理作用的油菜素類固醇合成步驟的一個(gè)新基因(CYP90D1，SEQ IDNO1)。還發(fā)現(xiàn)這個(gè)基因CYP90D1與上述ROT3基因(＝CYP90C1)一起控制油菜素類固醇合成的最終步驟。
文檔編號(hào)A01H5/00GK1643150SQ03805868
公開(kāi)日2005年7月20日 申請(qǐng)日期2003年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月12日
發(fā)明者塚谷裕一, 金炅泰 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu)