專利名稱：免疫t－細(xì)胞刺激的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過天然產(chǎn)生的組合物來刺激或增強(qiáng)受體動(dòng)物中的免疫T-細(xì)胞活性的方法。更特別的，本發(fā)明涉及來自超免疫鳥類的卵或其級分的給藥，從而可刺激或增強(qiáng)動(dòng)物中免疫T-細(xì)胞的活性。
背景技術(shù)：
T-細(xì)胞的刺激和增強(qiáng)對免疫應(yīng)答的產(chǎn)生、成熟T-細(xì)胞的存活和胸腺細(xì)胞的發(fā)育具有重要作用。它是消滅被微生物感染的細(xì)胞的特異性獲得性免疫系統(tǒng)的一重要組成部分。它同時(shí)也構(gòu)成了宿主自身識別能力的基礎(chǔ)。T-細(xì)胞對其自身識別能力經(jīng)過了陽性和陰性選擇，其中MHCp復(fù)合體沒有被完全活化，從而阻止了針對宿主組織的免疫應(yīng)答。
T-細(xì)胞的刺激可增加細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)群體，其中CTL具有裂解靶細(xì)胞的能力，是T淋巴細(xì)胞的一種重要的效應(yīng)物活性。人T-細(xì)胞刺激是一種獲得對自體固有腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性的T-細(xì)胞類群的有效方法。這同樣可增加涉及人B淋巴細(xì)胞活化和免疫球蛋白產(chǎn)生的輔助T淋巴細(xì)胞的量。
原始T-細(xì)胞的抗原特異性免疫應(yīng)答涉及一系列非常復(fù)雜的協(xié)同事件。該活化包括T-細(xì)胞的分化、增殖和效應(yīng)物功能。共同支配該分化過程的各種參數(shù)已被確定，例如，抗原呈遞途徑和劑量、微環(huán)境、抗原呈遞細(xì)胞(APC)和抗原的特性。免疫T細(xì)胞活化的最初關(guān)鍵事件是由T細(xì)胞上的特異性T細(xì)胞受體(TCR)與同APC上的MHC分子結(jié)合的抗原性肽相互作用引起的。這些事件對于細(xì)胞因子如IL-2的產(chǎn)生以及細(xì)胞因子受體的表達(dá)是至關(guān)重要的。這又將決定T細(xì)胞增殖的程度和持續(xù)時(shí)間。由活化T-細(xì)胞對IL-2生產(chǎn)的調(diào)節(jié)是T細(xì)胞活化調(diào)節(jié)的重要特征之一。
鳥綱的各種屬，例如小雞(gallus domesticus)、火雞、和鴨，能在血液和卵中產(chǎn)生抗能導(dǎo)致鳥類疾病的免疫原的，和抗其他免疫原的抗體。例如，LeBacqVerheyden等(Immunology 27683(974))和Leslie，G.A.等(J.Med.1301337(1969))已對小雞的免疫球蛋白進(jìn)行了定量分析。Polson等(Immunological Communications9495-514(1980))對母雞進(jìn)行免疫使其抗許多蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的天然混合物，并在其卵黃中檢測到IgY抗體。Fertel等(Biochemicaland Biophysical Research Communications 10210281033(1981))免疫母雞使其能抗前列腺素，并在其卵黃中檢測到抗體。Jensenius等(Journal of Immunological Methods 4663-68(1981))提供了一種分離卵黃IgG用于免疫診斷應(yīng)用的方法。Polson等(Immunological Communications 9475-493(1980))描述了從被各種植物病毒免疫的母雞卵黃中分離的抗體。
目前已開發(fā)出超免疫的卵，并被證實(shí)其可超量產(chǎn)生抗體和一些生物因子。對于這類進(jìn)展的一些例子如下美國專利No.4,357,272中公開了從來源于超免疫母雞的卵黃中分離抗體的技術(shù)方案。所述的抗體應(yīng)答是通過反復(fù)注射來源于植物病毒、人IgG、破傷風(fēng)抗毒素、蛇抗蛇毒素和Serameba的免疫原引起的。
美國專利No.4,550,019中公開了從采用具有至少30,000的分子量或粒子重量的免疫原進(jìn)行超免疫的母雞的抗體產(chǎn)生的蛋黃中分離抗體的技術(shù)方案。用于超免疫雞的免疫原選自植物病毒、人免疫球蛋白、破傷風(fēng)毒素、和蛇毒液。
美國專利No.4,748,018中公開了被動(dòng)免疫哺乳動(dòng)物的方法，其包括胃腸外給藥來源于已經(jīng)用相應(yīng)抗原免疫的鳥類的卵的純化的抗體，并且所述哺乳動(dòng)物獲得了對上述卵的免疫性。
美國專利No.5,772,999公開了通過對受體給藥超免疫的卵和/或乳或其級分來預(yù)防、抑制或降低受體中的慢性腸胃病癥或非甾類消炎藥導(dǎo)致的(NSAID-導(dǎo)致的)腸胃損傷的方法。
美國專利No.6,420,337公開了分離自超免疫卵的新的細(xì)胞因子活化因子(CAF)，其能上調(diào)一些促炎細(xì)胞因子，包括TNFα，IL-6和IL-1β，并能下調(diào)TGFβ。
但是這些參考文獻(xiàn)中沒有一篇公開或啟發(fā)了當(dāng)將所述卵或其級分給藥至動(dòng)物，具有刺激或增強(qiáng)所述動(dòng)物中的免疫T-細(xì)胞活性的能力。這些參考文獻(xiàn)中也沒有公開或啟發(fā)了這樣一種提供了合理的預(yù)期的方法，其中采用非特異性疫苗超免疫鳥類可誘導(dǎo)鳥類產(chǎn)下具有這種當(dāng)給藥至受體動(dòng)物時(shí)的能力的卵。
發(fā)明簡述本發(fā)明的目的是提供通過對所述動(dòng)物給藥有效量的卵產(chǎn)物來刺激動(dòng)物中免疫T-細(xì)胞產(chǎn)生的方法。
本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供通過對所述動(dòng)物給藥有效量的卵產(chǎn)物來增加動(dòng)物中免疫T-細(xì)胞產(chǎn)生的方法。
附圖簡述


圖1為一曲線圖，其描述了與超免疫卵的小于3000道爾頓的級分一起培養(yǎng)的各種時(shí)間階段的Jurkat細(xì)胞的刺激指數(shù)。
圖2為一曲線圖，其描述了與超免疫卵的小于3000道爾頓的級分一起培養(yǎng)的各種時(shí)間階段的Daudi細(xì)胞的刺激指數(shù)。
發(fā)明詳述本發(fā)明采用新的途徑來刺激或增強(qiáng)動(dòng)物中的免疫T-細(xì)胞的活性。本發(fā)明包括來源于經(jīng)一種或多種免疫原超免疫的鳥類的卵或其級分。動(dòng)物對有效量的超免疫卵或其級分的攝入可導(dǎo)致所述動(dòng)物中T-細(xì)胞類群的顯著刺激。
本發(fā)明中的卵產(chǎn)物是具有特別吸引力的產(chǎn)品，因?yàn)樗峭耆烊坏模⑶?，其本身可?jīng)給藥來刺激或增強(qiáng)動(dòng)物中的T細(xì)胞活性，而無需擔(dān)心許多目前采用的免疫刺激產(chǎn)物通常伴隨的負(fù)作用。很明顯，對卵有變應(yīng)性或具有對卵的耐受性的動(dòng)物不能攝入一些給藥形式中的超免疫蛋產(chǎn)物。
發(fā)明人相信，上述有益特性(即T細(xì)胞刺激和增強(qiáng))是由于經(jīng)超免疫過程引發(fā)或增強(qiáng)的一些免疫因子造成的。這些免疫因子不被認(rèn)為是抗體，因?yàn)槿鐚?shí)施例所述，超免疫卵的大小小于3000道爾頓的級分比全卵本身在刺激和增強(qiáng)免疫T-細(xì)胞活性方面更有效。很明顯，小于3000道爾頓大小的級分不含抗體。因此，發(fā)明人認(rèn)為這些因子代替了某些免疫調(diào)節(jié)因子類型，有效誘導(dǎo)了免疫應(yīng)答的細(xì)胞臂，導(dǎo)致了免疫T-細(xì)胞的刺激。
定義術(shù)語“卵”或“全卵”均表示任何的完整的卵，無論是食用卵還是超免疫卵或其他的卵。
術(shù)語“卵產(chǎn)物”或“其級分”分別表示來源于卵的任何產(chǎn)物或級分。
術(shù)語“食用卵”或“食用卵產(chǎn)物”或“其級分”分別表示完整的卵，或其來源的任何產(chǎn)物或級分，這些均來源于保持在非超免疫狀態(tài)的產(chǎn)卵動(dòng)物。
術(shù)語“超免疫卵”或“超免疫卵產(chǎn)物”或“其級分”分別表示完整的卵，或其來源的任何產(chǎn)物或級分，這些均來源于保持在超免疫狀態(tài)的產(chǎn)卵動(dòng)物。
術(shù)語“免疫原”是指能誘導(dǎo)體液抗體和/或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答并能與其產(chǎn)生的產(chǎn)物，如抗體，發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)。
術(shù)語“免疫調(diào)節(jié)因子”是指除了抗體以外的能影響免疫系統(tǒng)的物質(zhì)。
術(shù)語“組合來源的免疫原”是指通過組合合成的方式在免疫原間產(chǎn)生分子多樣性的新方法。
術(shù)語“生物工程免疫原”是指通過允許可產(chǎn)生具有免疫原性的表位的編碼核苷酸的插入的基因克隆技術(shù)和遺傳操作的方法所獲得的免疫原。
術(shù)語“基因疫苗”是指通常通過重組技術(shù)生產(chǎn)的并可引起免疫應(yīng)答的核酸疫苗。
術(shù)語“給藥”是指對個(gè)體給予物質(zhì)的任何的方法，其包括口服的、鼻內(nèi)的、眼內(nèi)的、胃腸外的(靜脈內(nèi)的、肌內(nèi)的、或皮下的)、直腸的或局部的給藥。
術(shù)語“動(dòng)物”表示動(dòng)物界的定義。
術(shù)語“目標(biāo)動(dòng)物”是指具有產(chǎn)卵或產(chǎn)卵產(chǎn)物功能的動(dòng)物。
術(shù)語“受體動(dòng)物”是指對其給藥由目標(biāo)動(dòng)物產(chǎn)生的卵或卵產(chǎn)物的動(dòng)物。
“T-細(xì)胞”或“T-淋巴細(xì)胞”是指在胸腺中成熟的，并在免疫應(yīng)答中具有重要作用的一類淋巴細(xì)胞。其分為許多的亞類殺傷T-細(xì)胞負(fù)責(zé)殺死受病毒感染的細(xì)胞；輔助T-細(xì)胞誘導(dǎo)其他的細(xì)胞(B-淋巴細(xì)胞)產(chǎn)生抗體。
超免疫卵產(chǎn)物的制備應(yīng)當(dāng)牢記超免疫處理既可以在鳥類中進(jìn)行，從而其卵可含有超免疫處理獲得的有效成分；也可以在牛中進(jìn)行，從而其乳可含有超免疫處理獲得的有效成分。雖然已構(gòu)思了相同的技術(shù)方案也適用于牛的超免疫同時(shí)可收集其超免疫乳，但如下說明僅限于鳥類的超免疫。
所述的超免疫卵產(chǎn)物可通過任何的產(chǎn)卵動(dòng)物來生產(chǎn)。優(yōu)選所述動(dòng)物選自鳥綱，或者換句話說，是一種鳥類。在鳥綱中，優(yōu)選馴養(yǎng)的家禽，但是本綱中的其他物種，例如火雞、鴨子和鵝也是超免疫卵產(chǎn)物的合適來源。
所述的超免疫卵產(chǎn)物以噴霧干燥的卵粉末提供，其來源于采用了一組人腸道病原體進(jìn)行疫苗接種的產(chǎn)卵母雞(參見實(shí)施例1)。可以認(rèn)為任何的免疫原或免疫原集合可用于本發(fā)明的超免疫過程。噴霧干燥經(jīng)巴氏滅菌的卵液的過程可將卵中的抗體和免疫調(diào)節(jié)因子的損傷最小化，從而獲得一種具有高營養(yǎng)值、并能對可能的腸道感染產(chǎn)生被動(dòng)保護(hù)從而顯示出可降低炎癥的能力的產(chǎn)物。抗體，作為一類群，對常規(guī)酶的降解具有特別的抗性，并且經(jīng)口服攝入消化后，重要的級分可完整和具有活性的通過腸道途徑。許多研究報(bào)道，口服攝入消化的抗體能針對特定的腸道病原產(chǎn)生防護(hù)保護(hù)。
此外，當(dāng)使這種產(chǎn)卵動(dòng)物通過如下途徑，例如抗原周期性的加強(qiáng)免疫，處于特定的免疫狀態(tài)時(shí)，該動(dòng)物將產(chǎn)下具有刺激受體動(dòng)物T-細(xì)胞增加的有益特性的卵，當(dāng)所述卵被受體動(dòng)物攝入時(shí)。
在已知發(fā)展和保持超免疫狀態(tài)的必要條件方面的知識的情況下，本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員知曉可根據(jù)所采用的產(chǎn)卵動(dòng)物的種屬來調(diào)整給藥的免疫原量，從而使動(dòng)物保持于超免疫狀態(tài)。
優(yōu)選的通過任何免疫原或免疫原的組合來產(chǎn)生超免疫狀態(tài)。優(yōu)選的通過多次暴露于多重免疫原、多次暴露于單一免疫原、或單次暴露于免疫原庫來實(shí)現(xiàn)超免疫。
除了通過天然存在的免疫原來進(jìn)行免疫之外，也可通過組合化學(xué)過程合成得到的免疫原來實(shí)現(xiàn)免疫。其基本策略是集合多種化學(xué)結(jié)構(gòu)基團(tuán)的組合從而產(chǎn)生具有多樣性的分子集合。近來，發(fā)展了許多方法用于低聚物(Fodor，S.等，Science 251767(1991)；Houghton，R.等，Nature 35482(1991))以及小的有機(jī)分子庫(Bunin，B.&Ellman，J.，J.Am.Chem.Soc.11410997(1992))的固相和液相組合合成?？焖俚亩喾N肽和低聚物合成可作為組合衍生免疫原的來源。此外，可選的策略將允許有機(jī)結(jié)構(gòu)基團(tuán)以組合的方式添加至主鏈分子上從而提高免疫原性。
超免疫卵生產(chǎn)動(dòng)物的另一模型可用于替代免疫原性疫苗，包括基因疫苗的應(yīng)用。特別的，任何DNA構(gòu)建體(通常包括一啟動(dòng)子區(qū)域和一免疫原編碼序列)均可引發(fā)免疫應(yīng)答?；蛞呙绨庖咴幋a載體、裸露的DNA片段、質(zhì)粒DNA、DNA-RNA抗原、DNA-蛋白結(jié)合體、DNA-脂質(zhì)體結(jié)合體、DNA表達(dá)文庫、和導(dǎo)入的用于產(chǎn)生免疫應(yīng)答的病毒和細(xì)菌DNA。DNA導(dǎo)入的方法包括粒子轟擊、直接注射、病毒載體、脂質(zhì)體和噴射注射、及其他的方法。當(dāng)采用這些導(dǎo)入方法時(shí)，只需要較少的量并且常常導(dǎo)致更持續(xù)的免疫原產(chǎn)生。當(dāng)采用這種遺傳操作時(shí)，向鳥類導(dǎo)入DNA的優(yōu)選方法為通過肌內(nèi)注射的方式將DNA注入其胸肌。
優(yōu)選的超免疫操作如下為一用于使產(chǎn)卵動(dòng)物處于免疫升高狀態(tài)優(yōu)選操作實(shí)例的步驟列表1.選擇一種或多種免疫原。
2.通過初次免疫在產(chǎn)卵動(dòng)物中引起免疫應(yīng)答。
3.給藥適當(dāng)劑量免疫原的加強(qiáng)免疫疫苗用于誘導(dǎo)和保持超免疫狀態(tài)。
步驟1可采用任何免疫原或免疫原的組合作為疫苗。其中免疫原可以是細(xì)菌、病毒、原生動(dòng)物、真菌、細(xì)胞、或能引發(fā)產(chǎn)卵動(dòng)物的免疫系統(tǒng)發(fā)生應(yīng)答的其他的任何物質(zhì)。本步驟的關(guān)鍵點(diǎn)在于免疫原必須能在產(chǎn)卵動(dòng)物中誘發(fā)免疫和超免疫狀態(tài)。雖然在本發(fā)明的方法中僅有單一的抗原起了疫苗的作用，但優(yōu)選的疫苗為選自如下抗原族的多價(jià)細(xì)菌和病毒抗原的混合物腸道桿菌和擬桿菌、肺炎球菌(Pneumococci)、假單胞菌(Pseudomonas)、沙門氏菌(Salmonella)、鏈球菌(Streptococci)、桿菌(Bacilli)、葡萄球菌(Staphylococci)、奈瑟氏菌(Neisseria)、梭狀芽孢桿菌(Clostridia)、分枝桿菌(Mycobacteria)、放線菌(Actinomycetes)、衣原體(Chlamydiae)和支原體(Mycoplasma)。雖然其他的病毒抗原族也有效果，但病毒抗原優(yōu)選的選自如下抗原族腺病毒、小RNA病毒和皰疹病毒。在一特定優(yōu)選實(shí)施方案中，采用了稱為PL-100的多價(jià)疫苗。包括在PL-100疫苗中的細(xì)菌列于實(shí)施例1的表1中。
步驟2所述的疫苗既可以為滅活疫苗也可以是減毒疫苗，并可通過能引起免疫應(yīng)答的任何方法來給藥。優(yōu)選的通過經(jīng)肌內(nèi)注射的方式給藥免疫原來實(shí)現(xiàn)免疫。在鳥類中優(yōu)選的用于注射的肌肉為胸肌?？刹捎玫钠渌o藥方法包括靜脈內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、真皮內(nèi)的、直腸栓劑、噴霧劑或口服給藥。當(dāng)DNA技術(shù)用于超免疫操作時(shí)，將需要更少的量，通常為1-100微克。
可通過免疫領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員熟知的許多方法來確定是否在產(chǎn)卵動(dòng)物中引起了免疫應(yīng)答。其例子包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，刺激性抗原的抗體存在的檢測，用于評價(jià)宿主中免疫細(xì)胞對抗原的應(yīng)答能力的實(shí)驗(yàn)。誘導(dǎo)免疫應(yīng)答所需的免疫原的最小劑量取決于所采用的疫苗接種操作，其包括佐劑的類型和所采用的免疫原制劑以及作為宿主的產(chǎn)卵動(dòng)物的類型。
步驟3通過在固定的時(shí)間間隔重復(fù)加強(qiáng)給藥合適的劑量可優(yōu)選的在目標(biāo)動(dòng)物誘導(dǎo)和保持超免疫狀態(tài)。時(shí)間間隔優(yōu)選的為在6-12個(gè)月的期間內(nèi)2-8周的間隔。優(yōu)選劑量為0.05-5毫克的免疫原性疫苗。但是，加強(qiáng)免疫必須不會導(dǎo)免疫原性耐受。本領(lǐng)域熟知這類操作。
還可以采用其他的超免疫保持操作步驟或操作步驟的組合，例如，肌內(nèi)注射進(jìn)行初次免疫，靜脈內(nèi)注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫。另外的步驟包括同時(shí)給藥微包囊的和液體免疫原，或肌內(nèi)注射進(jìn)行初次免疫，并且通過口服給藥或經(jīng)微包囊途徑胃腸外給藥的方式來給藥加強(qiáng)劑量。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員已知許多的初次和超免疫的組合方式。
超免疫卵的加工和給藥一旦產(chǎn)卵動(dòng)物經(jīng)充分的超免疫后，優(yōu)選的收集這些動(dòng)物的卵并進(jìn)行加工產(chǎn)生超免疫卵產(chǎn)物。隨后，可將超免疫卵產(chǎn)物給藥至受體動(dòng)物。
將本發(fā)明的卵和/或卵產(chǎn)物通過可刺激或增強(qiáng)受體動(dòng)物中免疫T-細(xì)胞活性的任何方式給藥至受體動(dòng)物。優(yōu)選的通過直接飼喂卵或其任何有效成分來進(jìn)行給藥。卵和卵黃是天然的食品成分，并且除了對那些過敏者外，其本身無毒并且安全。
一種加工卵的優(yōu)選的方法涉及將卵干燥成為卵粉。雖然已知各種干燥卵的方法，不過噴霧干燥為優(yōu)選的方法。噴霧干燥卵的方法是本領(lǐng)域已知的方法。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，超免疫卵與含有許多營養(yǎng)成分如維生素和礦物質(zhì)的食品產(chǎn)品或食品補(bǔ)充劑一起給藥。雖然這么說，但干的卵粉也可摻入飲料中，其中飲料呈如下形式例如，蛋白粉、粉末成分的飲料、蛋白補(bǔ)充劑和任何其他的營養(yǎng)、運(yùn)動(dòng)相關(guān)的產(chǎn)品。
在另一實(shí)施方案中，所述的卵粉可用于烘焙混合物、粉末棒、糖果、餅干等中。卵加工的其他例子包括制成蛋煎餅、煮軟或煮硬的蛋、烤蛋，或如果愿意的話，所述的卵可以生吃或加工成卵液。
最后，本領(lǐng)域公知卵黃和/或卵清部分含有起上述觀察到的或提到的有益作用的成分。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員很明確的認(rèn)識通過進(jìn)一步分離可提供更有效力的級分或除去不理想的成分，并且也允許其他的給藥方式，例如經(jīng)胃腸外的、皮下的、靜脈內(nèi)的、肌內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、鼻內(nèi)的、口服的或局部的方式給藥卵產(chǎn)物。這種進(jìn)一步的分離將提供采用所述卵或其級分來制備膠囊產(chǎn)物和藥物組合物的能力。
對受體動(dòng)物給藥一定量的超免疫卵產(chǎn)物從而能免疫有效的刺激或增強(qiáng)免疫T-細(xì)胞是十分重要的。如上文所述，大小小于3000道爾頓的超免疫卵級分(參見實(shí)施例2的制備)被證實(shí)最有效?？紤]到這一點(diǎn)，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)根據(jù)受體動(dòng)物的大小和體重，每受體動(dòng)物給藥從0.1μg/mL至1000mg/mL的任何劑量的小于3K的超免疫卵級分可有效的刺激或增強(qiáng)T-細(xì)胞。不過，更優(yōu)選的每動(dòng)物給藥約0.2μg/mL至約200μg/mL、進(jìn)一步優(yōu)選0.5μg/mL至20μg/mL的小于3K的超免疫卵級分。治療持續(xù)的時(shí)間和強(qiáng)度將根據(jù)受體動(dòng)物的身體狀況、是否表現(xiàn)出疾病或病癥、和如果表現(xiàn)出則該疾病或病癥的發(fā)展?fàn)顩r等來決定。考慮到這些，超免疫卵產(chǎn)物將以能有效刺激或增強(qiáng)T-細(xì)胞活性從而增強(qiáng)免疫系統(tǒng)戰(zhàn)勝疾病或病癥的量來進(jìn)行給藥。應(yīng)當(dāng)明確，雖然優(yōu)選小于3K的超免疫卵級分，但較大的級分和全卵也同樣有效?？筛鶕?jù)受體動(dòng)物的特定狀況來確定給藥的日常量，其中日常量為從小于1個(gè)到幾個(gè)完整的超免疫卵(或含有與小于一個(gè)到幾個(gè)完整的超免疫卵等價(jià)的超免疫卵產(chǎn)物)的范圍內(nèi)。根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法可分離和濃縮更有效的級分。
通過參考如下的用于說明本發(fā)明的實(shí)施例可進(jìn)一步體現(xiàn)出本發(fā)明的有益特性。
實(shí)施例實(shí)施例1PL-100疫苗的制備如表1所示的稱為PL-100的含有細(xì)菌的多價(jià)疫苗(來源于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection))采用15ml的培養(yǎng)基重配并在37℃下培養(yǎng)過夜。一旦獲得良好生長，取大約一半的細(xì)菌懸浮液用于接種至1升的肉湯培養(yǎng)基中并隨后在37℃下培養(yǎng)。剩下的懸浮液轉(zhuǎn)移至滅菌的乙二醇試管并在-20℃下保存最長達(dá)6個(gè)月。
當(dāng)培養(yǎng)物中可見良好生長時(shí)，通過離心收獲細(xì)菌。將細(xì)菌沉淀物重懸于無菌生理鹽溶液中并將細(xì)菌樣品離心3次以洗掉細(xì)胞部分。在第三次洗滌后，獲得的沉淀物重懸于少量的雙蒸水中。
通過將玻璃燒瓶中的懸浮液置于80℃的水中溫育過夜來加熱滅活不含培養(yǎng)基的細(xì)菌懸浮液。采用少量的加熱滅活的細(xì)菌來檢測肉湯培養(yǎng)基的活力。采用加熱滅活的細(xì)菌來接種肉湯，在37℃下培養(yǎng)5天，并每天檢測其生長，因?yàn)樗龅募?xì)菌必須被滅活作為疫苗。
加熱滅活的細(xì)菌經(jīng)冷凍至完全干燥。隨后，將干燥的細(xì)菌與無菌鹽水溶液混合至2.2×108個(gè)細(xì)菌細(xì)胞/ml鹽水(在660nm下1.0的光學(xué)密度)。
表1PL-100疫苗中的抗原
超免疫卵產(chǎn)物的免疫過程如上文所述制備滅活的病原體。作為第一次接種，所述細(xì)菌與完全Freund′s佐劑混合，并將5.6mg的細(xì)菌物質(zhì)注射入雞胸部肌肉中。對于剩下的疫苗，將細(xì)菌制備產(chǎn)物與不完全Freund′s佐劑混合并在6個(gè)月中以兩周的間隔注射入雞體內(nèi)。
收集超免疫母雞產(chǎn)下的卵，并將其噴霧干燥成粉末狀形式。在噴霧干燥過程中，入口處溫度不超過320華氏度，排出的溫度與以3.0至4.0百分比的終濕度產(chǎn)生的粉末保持一致，泵送壓力保持在2500至4000P.S.I左右。采用了100-160F范圍內(nèi)的低溫，并且在干燥過程中監(jiān)測樣品的濕度含量從而使終產(chǎn)物獲得任何理想的稠度。
實(shí)施例2制備卵的部分純化級分的優(yōu)選方法如下實(shí)施例記載了一種獲得具有較低分子量、且呈非聚集形式的部分純化的蛋級分的方法(適合于大規(guī)模純化)。超免疫的和對照的食用卵的全卵經(jīng)破碎后將卵清和卵黃分離并分別噴霧干燥。按如實(shí)施例1所述的方法獲得超免疫卵。單獨(dú)加工卵清粉從而獲得其含水級分用于超濾。
進(jìn)行全部的純化步驟從而使細(xì)菌或熱原的感染最小化。采用無菌水來配制溶液并且所有的玻璃器皿均經(jīng)去熱原化。此外，將溶液進(jìn)行無菌過濾。
來源于卵黃的制品溶劑提取將如實(shí)施例1所述制備的干燥卵黃用丙烷或丁烷進(jìn)行液體溶劑提取從而從含水的卵黃級分中分離脂質(zhì)成分。簡單的說，將500克干燥卵黃粉置于柱中，并向其中加入4升液體丙烷溶劑。取出溶劑上清和提取的脂質(zhì)?？偣擦沃|(zhì)提取從而進(jìn)行了六次另外的溶劑提取步驟。
起濾采用4升的無菌蒸餾水稀釋400克的干燥去脂卵黃，并采用Virtis(handishear)使其勻化。對于卵黃混合物既可以在24RPM的速度下進(jìn)行離心，又可以允許其保持冷凍直至不溶解的卵黃顆粒沉淀。采用裝有3000道爾頓攔截螺旋纏繞膜的Amicon RA1000超濾系統(tǒng)來超濾獲得的含水級分。保持泵送速度，入口壓力為20psi，出口壓力為15psi。采用0.45μm的一次性無菌Nalgene濾器無菌過濾＜3,000道爾頓分子量的滲透物并冷凍干燥或冷凍用于儲存、生物測定或進(jìn)一步的純化。
卵黃中小于3000道爾頓的分子類型包括具有低分子量的且呈非聚集形式的部分純化的卵級分。從400克的起始物質(zhì)開始，＜3K道爾頓的部分純化的級分的產(chǎn)量約為12克或占總量的3％。
來源于卵清的制品采用4升的去離子水稀釋從如實(shí)施例1所述的超免疫卵和對照的食用卵中分離得到的400克卵清。使混合物混合勻化并經(jīng)40μm的濾器過濾并經(jīng)3KDa MW C0超濾系統(tǒng)進(jìn)行超濾。從400g的卵清粉中，可回收8.6g或2.15％的小于3K道爾頓的部分純化的卵級分。
實(shí)施例3免疫細(xì)胞系中的免疫刺激活性所有的細(xì)胞系均來自ATCC，并在其推薦的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。這些細(xì)胞均在96孔板中培養(yǎng)并使其達(dá)到對數(shù)生長期。適當(dāng)稀釋3k級分，并加入各自的孔中培養(yǎng)24-96小時(shí)。通過采用Alamar藍(lán)染色細(xì)胞，并在520nm的激發(fā)波長通過自動(dòng)微量培養(yǎng)板讀取器來讀取其熒光強(qiáng)度從而來確定細(xì)胞活力。刺激指數(shù)(SI)表示經(jīng)處理的細(xì)胞比未刺激對照組的細(xì)胞的相對數(shù)目。
圖1為一曲線圖，其表示與超免疫卵的小于3K的級分共同培養(yǎng)的各個(gè)階段(從24至96小時(shí))的Jurkat細(xì)胞(T-細(xì)胞白血病細(xì)胞系)的刺激指數(shù)(SI)。在5.5-50μM的濃度范圍內(nèi)SI值顯著增加，這表示了Jurkat細(xì)胞的超免疫刺激。在細(xì)胞活化的48、72和96小時(shí)階段中這是一致的。
圖2為一曲線圖，其表示與超免疫卵的3K的級分共同培養(yǎng)的各個(gè)階段(從24至48小時(shí))的Daudi細(xì)胞(B成淋巴細(xì)胞系)的刺激指數(shù)(SI)。結(jié)果表明，在3k級分的1.24-300μM的濃度下培養(yǎng)24小時(shí)后觀察到超免疫刺激發(fā)生。
因此，超免疫卵的3k級分對Jurkat和Daudi細(xì)胞系的影響結(jié)果表明了強(qiáng)的免疫刺激活性。這提示我們在PHA介導(dǎo)的T細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行3H-胸苷摻入，如如下實(shí)施例4所述。
實(shí)施例4采用PHA處理的外周淋巴細(xì)胞的體外增殖實(shí)驗(yàn)采用來源于健康自愿捐贈(zèng)者的外周淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物來進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)。采用不同濃度的PHA處理淋巴細(xì)胞，并將其生長動(dòng)力學(xué)與添加生理鹽水溶液的細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)相比較。
結(jié)果表明，與對照相比(外周淋巴細(xì)胞加生理鹽水溶液)以在低濃度，包括0.1％、0.5％、1.0％和2.5％，處理的外周淋巴細(xì)胞中可觀察到促有絲分裂作用。相應(yīng)于這些濃度的刺激指數(shù)分別為1.6、3.02、2.83和1.8，這表明在實(shí)驗(yàn)條件下，細(xì)胞總數(shù)分別增加了160％、302％、283％和180％。
T-細(xì)胞的母細(xì)胞轉(zhuǎn)化按1∶100至1∶1000的比例制備PHA稀釋液，并將稀釋液加入淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)板系統(tǒng)中。加入植物血凝素、Pockeweed抗原和A伴刀豆球蛋白來鑒定培養(yǎng)孔。在培養(yǎng)階段后，通過放射性胸苷摻入實(shí)驗(yàn)來確定T-淋巴細(xì)胞的增殖。
PHA強(qiáng)烈的增加了游離促細(xì)胞分裂淋巴細(xì)胞的增殖。
本研究比較了完整的超免疫卵和超免疫卵的部分純化的級分(如實(shí)施例2所述的小于3K的級分)與單獨(dú)對照培養(yǎng)基中的促有絲分裂作用。在包括0.24、0.98、3.9、15.6、62.5和250μg/ml的各種濃度下檢測完整的超免疫卵。在0.1、0.2、0.7、2.0、6.1、18.4、55.3和166.0μg/ml的濃度下檢測超免疫卵的純化的小于3K的級分。
與上述濃度相對應(yīng)的超免疫全卵的刺激指數(shù)分別為0.9、0.8、0.9、0.9、0.8，這在實(shí)驗(yàn)條件下分別相應(yīng)于90％、80％、90％、90％、80％和80％的細(xì)胞總數(shù)增加。與上述濃度相對應(yīng)的3K純化級分的刺激指數(shù)分別為1.1、1.2、1.5、1.7、1.4、1.3、1.0和1.2(參見表2)，這在實(shí)驗(yàn)條件下分別相應(yīng)于110％、120％、150％、170％、140％、130％、100％和120％的細(xì)胞總數(shù)增加。
這些結(jié)果表明在0.24-250μg/ml的濃度范圍內(nèi)，完整的超免疫卵不能顯著刺激體外T-細(xì)胞。另一方面，超免疫卵的小于3K的純化級分在0.7μg/ml-20.0μg/ml的濃度下顯示出顯著刺激T-細(xì)胞。表1表明了每孔中刺激的細(xì)胞的實(shí)際數(shù)目。
超免疫卵的純化級分的這種活性可能是由能特異性誘導(dǎo)涉及刺激免疫系統(tǒng)的細(xì)胞臂的細(xì)胞因子的細(xì)胞因子活化因子引起的。
重復(fù)相同的實(shí)驗(yàn)。如下，表3和4為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。觀察到T-細(xì)胞刺激的類似增加。
雖然本文中結(jié)合了特定實(shí)施方案來描述和舉例說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受所示的具體細(xì)節(jié)的限定。反而，可在權(quán)利要求的等價(jià)物的主旨和范圍內(nèi)進(jìn)行各類修改而不背離本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.通過對所述動(dòng)物給藥有效量的卵產(chǎn)物來刺激動(dòng)物中的免疫T-細(xì)胞的方法。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述卵產(chǎn)物包括來源于鳥類的卵或卵級分，其中所述的鳥類采用至少一種免疫原進(jìn)行超免疫。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的免疫原選自模仿葡萄球菌；表皮葡萄球菌；膿鏈球菌；大腸埃希氏菌；腸沙門氏菌；銅綠假單胞菌；肺炎克雷伯氏菌；鼠傷寒沙門氏菌；流感嗜血菌；緩癥鏈球菌；普通變性菌；痢疾志賀氏菌；肺炎雙球菌；瘡皰棒桿菌；血鏈球菌；唾液鏈球菌；變異鏈球菌；無乳鏈球菌。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中卵產(chǎn)物經(jīng)口服給藥。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中卵產(chǎn)物包括全卵的級分。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的級分包括大小約是或小于3000道爾頓的級分。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中卵產(chǎn)物的有效量在約0.1μg/mL至約2000mg/mL的范圍內(nèi)。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中卵產(chǎn)物的有效量在約0.2μg/mL至約200μg/mL的范圍內(nèi)。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中卵產(chǎn)物的有效量在約0.5μg/mL至約20μg/mL的范圍內(nèi)。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中鳥類包括馴養(yǎng)的家禽。
11.通過對所述動(dòng)物給藥有效量的卵產(chǎn)物來增強(qiáng)動(dòng)物中的免疫T-細(xì)胞的方法。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述卵產(chǎn)物包括來源于鳥類的卵或卵級分，其中所述的鳥類采用至少一種免疫原進(jìn)行超免疫。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的免疫原選自模仿葡萄球菌；表皮葡萄球菌；膿鏈球菌；大腸埃希氏菌；腸沙門氏菌；銅綠假單胞菌；肺炎克雷伯氏菌；鼠傷寒沙門氏菌；流感嗜血菌；緩癥鏈球菌；普通變性菌；痢疾志賀氏菌；肺炎雙球菌；瘡皰棒桿菌；血鏈球菌；唾液鏈球菌；變異鏈球菌；無乳鏈球菌。
14.如權(quán)利要求11所述的方法，其中卵產(chǎn)物經(jīng)口服給藥。
15.如權(quán)利要求11所述的方法，其中卵產(chǎn)物包括全卵的級分。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的級分包括大小約是或小于3000道爾頓的級分。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中卵產(chǎn)物的有效量在約0.1μg/mL至約2000mg/mL的范圍內(nèi)。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中卵產(chǎn)物的有效量在約0.2μg/mL至約200μg/mL的范圍內(nèi)。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中卵產(chǎn)物的有效量在約0.5μg/mL至約20μg/mL的范圍內(nèi)。
20.如權(quán)利要求11所述的方法，其中鳥類包括馴養(yǎng)的家禽。
全文摘要
本發(fā)明涉及刺激或增強(qiáng)動(dòng)物中的免疫T－細(xì)胞的新方法。特別的，本發(fā)明涉及來源于采用一種或多種免疫原超免疫的鳥類的卵，更特別是小于3000道爾頓的卵級分。動(dòng)物對有效量的超免疫卵或其級分的攝入可導(dǎo)致動(dòng)物中整個(gè)T－細(xì)胞類群的顯著增加。
文檔編號A01N37/18GK1744818SQ03811104
公開日2006年3月8日 申請日期2003年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月16日
發(fā)明者S·耶爾, R·邢 申請人:阿基昂生命科學(xué)有限責(zé)任公司